FLAVONOID VÀ DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID

Các tính chất căn bản của flavonoid 3.. Nguyên tắc chiết xuất, định tính, định lượng flavonoid 4.. Với kiềm đặc-nóngPhá vỡ Cấu trúc → phloroglucinol dùng để xác định cấu trúc flavonoi

FLAVONOID VÀ DƯỢC LIỆU

CHỨA FLAVONOID

Phần 1 – 2h

Sinh viên phải trình bày được:

1 Cấu trúc cơ bản của 3 nhóm Flavonoid.

2 Các tính chất căn bản của flavonoid

3 Nguyên tắc chiết xuất, định tính, định lượng

flavonoid

4 Tác dụng & công dụng của flavonoid

5 Một số dược liệu chứa flavonoid: Hòe, cúc gai,

bạch quả, râu mèo, artiso, hoàng cầm, dây

mật, tô mộc, citrus, diếp cá

Mục tiêu học tập

I Mở đầu

3https://www.youtube.com/watch?v=ufG3UUUHr0M

Cấu trúc chung nhóm / polyphenol

eu-flavonoid iso-flavonoid neo-flavonoid

là glycosid = đường + genin

benzo pyrilium

pyran

dihydr

o pyran

dihydroγ-pyron

5

4

3 2

5 1

tăng dần

Flavonol (tính Oxy hóa mạnh nhất)

Anthocyanidin, Flavon,

Flavanonol, Flavanon, LAC,

Catechin (tính Oxy hóa yếu nhất)

9

1.EU-FLAVONOID

OH O1.1 Flavon

1.EU-FLAVONOID

OH O

O

OH O

OH HO

OH

O HO

OH O

OH

OH OH

OH

OH HO

13

1.3 Flavanon

1.EU-FLAVONOID

OH O

O

OH HO

OH

O HO

OH O

OH

OH OH

O HO

OH

OH OH

15

1.4 Flavanonol

1.EU-FLAVONOID

OH HO

OH O

OH

OH

OH HO

OH O

OH

OH HO

O

OH O

OH HO

O HO

OH

OH OH

OH

O HO

OH

OH

OH

O HO

OH

OH

OH OH

OH

O HO

OH OH HO

- Là Các dẫn chất 3-phenyl chromon.

- đến 1988 : 12 phân nhóm = 629 chất

- Phân nhóm lớn nhất : isoflavon (# 234 aglycon)

- Trong phân nhóm isoflavon, 4 aglycon thường gặp :

- daidzein - genistein

- formononetin - biochanin A

OR

O RO

O

3

23

2 ISO-FLAVONOID

O

O

coumestanpterocarpan

O O

OH O

glc

O O

OH glc

O HO

OH O

O HO

PHÂN BỐ ISOFLAVONOID TRONG TỰ NHIÊN

Thực vật bậc cao là chủ yếu : đặc biệt là Fabaceae

Tác dụng sinh học của isoflavonoid

(ruồi, muỗi, ong)

• giải độc nọc rắn, nọc nhện (maackiain)

Tác dụng kiểu estrogen (phytoestrogen):

- ngừa loãng xương,

- ngừa nguy cơ ung thư vú,

- giảm các triệu chứng tiền mãn kinh

2 ISO-FLAVONOID

HO

O H

inophyllolid (dầu mù u)

29

IV Phân loại

- Ít quan trọng, chủ yếu gặp / ngành Hạt trần.

- Cấu trúc: Flavonoid – Flavonoid (dimer)

- Đại đa số : Flavon(ol) – Flavon(ol)

(apigenin – apigenin)

- thường : nối C-C (~120 chất), C-O-C (~20 chất)

4 BI-FLAVONOID

C4’ - C6 : robusta-flavonC6 - C6 : cupressu-flavonC3' - C8 : amento-flavonC6 - C8 : agathis-flavon 30

3 ' 8

OH

proanthocyanidin

trimere

OH OMe

C H 2 OH O

5 CẤU TRÚC KHÁC

OH

OH O

OH O

HO

3 S O 3 K

O HO

CH 2 OH O

CH 2 OH

M e

-D-glc -D-gal -L-rha

Các OSE thường gặp

neohesperidose (R1 → 2G)

1 6

O

C H2OH

O Genin

O Me

O

1 2

O Me

O

O

Genin O

rutinose (R1 → 6G) 35

Ð Ð

Ð Ð

Ð

Ð

Ð Ð

7

3’

4’

1 Màu sắc

- flavanon(ol), DHC : không màu

- catechin, LAC : không màu

Trong cùng nhóm : càng ít OH → màu càng nhạt

37

VI Lý tính Flavonoid

2 Độ bền

- dạng genin :

flavon(ol) > flavanon(ol), chalcon, auron, DHC >

> AC, catechin, LAC (kém bền nhất)

- dạng glycosid :

C-glycosid > O-glycuronid > O-glycosid

- polymere > monomere

VI Lý tính Flavonoid

3 Độ tan

a Độ tan của genin

- càng nhiều OH → càng khó tan / d.môi kém ph.cực

- càng nhiều OMe → càng dễ tan / d.môi kém ph.cực

- tan / kiềm loãng, kém tan / dung dịch acid

39

VI Lý tính Flavonoid

4 Độ tan

b Độ tan của glycosid

- tan trong MeOH, EtOH

- mạch đường dài / nhiều : có thể tan / nước nóng

- AC (ion, glycosid) : dễ tan / nước, cồn loãng

kém tan /cồn cao độ

- OH/C-7: tính acid → tan / NaOH, Na2CO3, NaHCO3

VI Lý tính Flavonoid

1.1 Với kiềm đặc-nóng

Phá vỡ Cấu trúc (→ phloroglucinol)

dùng để xác định cấu trúc flavonoid

1.2 Với kiềm loãng

Flavonoid tăng màu (Tạo phenolat, Δ’ có Δ liên hợp)

Th.khảo các bảng màu chuẩn → Cấu trúc flavonoid

OH OH OH

Trên giấy lọc, sắc đồ, dùng hơi NH : Flavonoid sẽ tăng màu.

trước khi + kiềm sau khi + kiềm

42

1 Phản ứng với kiềm (KOH, NaOH)

isoflavonoid Φ màu / vàng nhạt → vàng nhạt/vàng sậm

2 Phản ứng với acid

AC

→ đỏ(chỉ thị màu)

flavon, flavonol

→ vàng sậm, cam

(huỳnh quang !)

chalcon

→ mất màu(flavanon)

isoflavon isoflavanon → vàng

LAC → đỏ (AC)

-flavanon-catechin-LAC

-chalcon-auron

43

VII Định tính Flavonoid

3 Phản ứng Cyanidin (Shinoda, Shibata, Pew)

a Với Mg* / HCl đ.đặc

Flavon(ol),Flavanon(ol)Chalcon

b Với Zn* / HCl đ.đặc

Chỉ Flavanonol → đỏ đậm / magenta Flavanon → không màu / Hồng nhạt

Flavonoid

+EtOH

VII Định tính Flavonoid

lắc sản phẩm của Phản ứng Cyanidin với octanol

- dạng glycosid : dịch màu đỏ / lớp EtOH (dưới)

- dạng aglycon : dịch màu đỏ / lớp octanol (trên)

PHÂN BIỆT GENIN / GLYCOSID

octanol

glycosid aglycon

45

VII Định tính Flavonoid

4.1 Với d.dịch FeCl 3 loãng

Flavonoid + FeCl3 → phức xanh (nâu, lá, đen)

O HO

OH

OH

OH

OH O

- để sơ bộ nhận định số lượng nhóm OH / phân tử

- càng nhiều OH (đ.biệt là o-di-OH): màu càng đậm

- Các dẫn chất 3',4',5' tri-OH : Tạo màu xanh đen

4 Phản ứng tạo phức màu với muối kim loại

VII Định tính Flavonoid

Tạo phức tủa có màu

- dd acetat chì kiềm : → tủa vàng nhạt đến sậmvới hầu hết Các flavonoid (và cả Các polyphenol)

- dd acetat chì trung tính: → tủa vàng nhạt đến sậm

với các flavonoid có ortho-di-OH phenol

màu tủa thay đổi tùy số lượng và vị trí các nhóm thế

nghiên cứu Flavonoid → không dùng chì acetat để loại tạp47

4.2 Với d.dịch Chì acetat

4 Phản ứng tạo phức màu với muối kim loại

VII Định tính Flavonoid

4.3 Với dung dịch AlCl 3 / ROH

-Là thuốc thử tăng màu (shift reagent), dùng để khảo sát cấu trúc flavonoid bằng quang phổ UV

-dựa vào Δmax, → số lượng & vị trí các nhóm -OH / khung

Chú ý : Thuốc thử này chỉ quan sát rõ dưới UV 365 nm.

Dưới ánh sáng thường: không thấy rõ sự th.đổi

flavon → tủa màu vàng đến cam chalcon → tủa màu đỏ đếntím

4 Phản ứng tạo phức màu với muối kim loại

VII Định tính Flavonoid

Flavonoid / Na2CO3 + th’.thử diazonium → đỏ cam / đỏ(hay dùng p-nitroanilin đã được diazo-hóa)

- Khi có -OH /C7 → sẽ ghép vào vị trí 6 hay 8

- không đặc hiệu : (+) với nhiều polyphenol khác

49

5 Phản ứng với thuốc thử diazonium

VII Định tính Flavonoid

VII Định tính Flavonoid

6 Phương pháp sắc ký (SKG, SKLM)

Phát hiện :

- Vis hoặc UV 365 nm (not 254 nm) trước / sau khi

phun thuốc thử (kiềm, AlCl3/HCl, NaBH4 /MeOH )

- Các thuốc thử khác : FeCl3 , Chì acetat, diazo cũng đượcdùng (kém đặc hiệu)

- Chú ý sử dụng thuốc thử vanillin – HCl, FBS No 15 và

NP/PEG No 28

- So màu, Rf với Các chất trong tài liệu tham khảo có thể xác

định được flavonoid cần nghiên cứu

51

VII Định tính Flavonoid

7 Phương pháp HPLC

Tin cậy và thông dụng nhất hiện nay Nguyên tắc : Trong cùng

1 điều kiện, mẫu M chứa X cho peak có cùng thời gian lưu.chuẩn X

Hàm lượng chất X sẽ tỷ lệ thuận với diện tích peak

với nồng độ chuẩn biết trước, từ diện tích peak đo được ở X chuẩn và X/mẫu → X% trong mẫu

VII Định tính Flavonoid

8 Các phương pháp vật lý khác

- Cộng hưởng từ Hạt nhân (NMR)

1 Dùng ROH + nước

-thường : MeOH, EtOH (70-90%) nóng hoặc nguội (thu được Các glycosid + genin ph.cực + tạp ph.cực)

-Loại tạp kém phân cực bằng các d.môi kém ph.cực

-kết tinh / tủa trong Các dung môi thích hợp

2 Dùng d.môi ph.cực trung bình (Cf, DCM )

-Thu được genin + tạp kém ph.cực (ch’ béo, chlorophyll)

→ loại tạp tiếp bằng các phương pháp thích hợp

-thường áp dụng với các polymethoxy flavonoid

VIII Chiết xuất Flavonoid

3 Dùng dãy dung môi

- Ngấm kiệt với (ROH + H2O),

- Cô, loại tạp kém phân cực bằng cách lắc với EP

lớp nước chứa flavonoid + tạp phân cực (đường )

- lắc lớp nước này với Et2O rồi với EtOAc,

- Tiếp tục phân lập bằng các kỹ thuật khác (SKC…)

- Áp dụng với các glycosid phân cực 55

VIII Chiết xuất Flavonoid

4 Dùng cồn acid

-Ngấm kiệt bằng ROH loãng chứa 0.1% - 1% acid (HCl,

AcOH, tartric, citric )

-Cô dịch chiết ở nhiệt độ thấp hoặc đông khô

-Loại tạp, rồi tinh chế bằng các ph.pháp thích hợp

-Áp dụng đối với các flavonoid kém bền

57

VIII Chiết xuất Flavonoid

5 Dùng cồn kiềm

- Chiết dược liệu với (ROH + H2O) + NaOH

- Trung hòa dịch (= acid vô cơ loãng), cô dung môi,

- acid hóa, Flavonoid (glycosid & aglycon) sẽ tủa

- Tinh chế bằng (C* + ROH nóng) thu dịch cồn nóng

- để nguội, để lạnh → Flavonoid sẽ kết tinh

- kết tinh lại lần 2, nếu cần

- thường áp dụng với Các Citro-Flavonoid / chi Citrus

VIII Chiết xuất Flavonoid

Nói chung, Flavonoid là các hợp chất phân cực, khó phlập

Độ phân cực Flavonoid thì :

•kém hơn đường, tannin

•xấp xỉ saponosid, anthraglycosid

•mạnh hơn sapogenin > anthraquinon > phytosterol

> coumarin, tinh dầu, chất béo

Trong Flavonoid, độ phân cực giảm dần theo dãy:

•glycuronid glycosid > glycosid

•bidesmosid > monodesmosid; polymer > monomer

•tri-OH > di-OH > mono-OH (aglycon)

IX Phân lập Flavonoid

Để phân lập 1 hỗn hợp Flavonoid → Các Flavonoid tinh

khiết, có thể dùng Các kỹ thuật :

G, Sephadex LH-20)

Đáng chú ý là SKC với Diaion HP-20 và các Sephadex

Trên cột Si-gel pha thuận, Nhôm oxid; với d.môi phân cực kém / trung bình : Flavonoid thường bị giữ lại ở đầu cột !

61

IX Phân lập Flavonoid

Nguyên tắc chung

-chiết kiệt flavonoid, loại tối đa tạp chất

-chọn ph.pháp định lượng thích hợp tùy theo

• đối tượng chiết xuất (genin hay glycosid),

• yêu cầu (F toàn phần hay 1 chất cụ thể) vài phươngpháp định lượng flavonoid

1 Phương pháp cân

Sai số cao, áp dụng với dược liệu nhiều flavonoid, ví dụrutin # 30% trong nụ Hòe

X Định lượng Flavonoid

nụ hoa Hòe

làm lạnh, lắng lọc thu tủa

cân

63

X Định lượng Flavonoid

• cho flavonoid tinh khiết + thuốc thử tăng màu

(diazonium, NaOH, AlCl3/HCl ),

• đo độ hấp thu A ở max của các dẫn chất màu

• So với mẫu chuẩn → [flavonoid] / mẫu.

• với những chất đã biết A1 :

từ A tại  tương ứng → nồng độ C trong mẫu thử

1

2 Định lượng bằng quang phổ UV

X Định lượng Flavonoid

3 Định lượng bằng HPLC (thường kết hợp với SPE)

• Là phương pháp thông dụng, tin cậy Nên chú ý

• Áp dụng đối với dược liệu, chế phẩm, dịch sinh học

65

X Định lượng Flavonoid

1 Vai trò của flavonoid đối với thực vật

-Dẫn dụ côn trùng, giúp cho sự thụ phấn

-bảo vệ cây / tia UV từ mặt trời,

-bảo vệ cây / côn trùng, nấm mốc, vi sinh vật

-ức chế enzym, điều hòa sinh trưởng,

↑ Tạo nốt sần cố định đạm / họ Fabaceae

2 Đối với cơ thể động vật

quercitrin / Diếp cá; F / Lespedeza (Lespenephrin*) 67

chống xuất huyết mao mạch )

Đặc biệt : nhóm flavon, flavonol (rutin, diosmin)

XI Tác dụng sinh học

Một số ví dụ thực tế

- Rotenon : độc / cá, dùng để bắt cá, trừ cá / hồ nuôi tôm

Rotenon còn diệt ấu trùng muỗi Aedes aegypta

- Maackiain : giải nọc độc của rắn và nhện

- eupatorin, eupatoretin, centaureidin: antitumour in vitro

Tính antioxidant, tính ức chế gốc tự do, bảo vệ gan (của

flavonoid); tính phytoestrogen (của isoflavonoid) hiện đang được quan tâm

69

Daidzein, Genistein

3 Sử dụng flavonoid trong ngành dược

-TDSH : rộng rãi

-Tác dụng chú ý nhất : vit P, antioxidant, estrogen

-Dạng chú ý nhất : glycosid (t.phần/riêng lẻ)

-nhóm chú ý nhất : flavon(ol) và flavanon

flavolignan / Cúc gai isoflavonoid / Đậu nành

- chất chú ý nhất : Diosmin, Hesperidin, Rutin,

Troxerutin, Silybin, Ginkgetin,

70

B Dược liệu chứa

FLAVONOID

Khoa Dược – Bộ môn Dược liệu

71

I Hoa hòe

7 3

I Hoa hòe

Sophora japonica L = Styphnolobium japonicum Schott

Sophora japonica L = Styphnolobium japonicum Schott

I Hoa hòe

7 5

- Mọc nhiều ở Trung quốc, Hàn, Nhật, cũng thấy ở

châu Âu.

- Việt Nam cũng có trồng (từ cành, hạt)

- Cây ≥ 3 tuổi sẽ cho hoa (hoa Hòe)

- Cắt chùm hoa, tuốt lấy hoa, phơi/sấy ngay

- hoa chưa nở (Hòe mễ) >> hoa đã nở (Hòe hoa)

I Hoa hòe

I Hoa hòe

trên 90% là nụ hoa chưa nở (DĐVN V)

c gỗ, thân, hạt : Flavonoid (ít, không quan trọng)

7 7

I Hoa hòe

Thành phần hóa học

(C27H30O16 = 610.51)

O H

O

O

OH O

O H

O H

Rutinos e

Đầu tiên: từ Ruta graveolens Hiện nay: chủ yếu từ

- làm bền và giảm tính thấm của mao mạch, hồng cầu

- chống co thắt, giảm trương lực cơ tim

- phòng chứng xơ vữa động mạch,

- trị xuất huyết (chảy máu cam, băng huyết, ho ra máu)

- trị các rối loạn về vận mạch

(trĩ, chân nặng, dị cảm đầu chi, đau nhức chi, phù chi,

đốm xuất huyết dưới da, rối loạn tuần hoàn võng mạc )

- trị các thương tổn ngoài da do bức xạ, giúp mau lành sẹo

79

I Hoa hòe

Công dụng

II Artichaut

II Artichaut

Cynara scolymus L , Asteraceae

Bộ phận dùng:

Lá / cụm hoa đã phơi / sấy

Cynara scolymus L.

Asteraceae

II Artichaut

# 1.000.000 tấn

Châu Âu : 85% Trong đó, Italia

100.000 tấn500.000 tấn

Spain 300.000 tấnPháp 50.000 tấn

(2005)

(10%)(50%)

(30%)(05%)

Ở VN, chủ yếu trồng ở Sapa, Lâm Đồng (vô tính)

dùng làm thực phẩm và làm thuốc

(cao đặc, cao lỏng, trà thuốc, viên bao đường)

Trồng bằng chồi non Thu hoạch lá sau khi hái cụm hoa

(nhưng khi chưa ra hoa, thu hoạch lá tốt nhất)

Lá mọng nước : Tránh ủ đống Cần loại bỏ sống lá, chỉ giữphiến lá (lá non tốt hơn lá già)

Sau đó:

-Chiết cao hay bột đông khô Artisô ngay, hoặc

-Bảo quản lá tươi ở nhiệt độ lạnh 4OC, hoặc

-Diệt men oxydase + phơi khô nhanh (hoặc sấy < 40OC)

để bảo quản

II Artichaut

Thu hái – chế biến

acid 4-caffeoyl-quinic = acid iso-chlorogenic

acid 5-caffeoyl-quinic = acid neo-chlorogenic

acid 1-caffeoyl-quinic, acid caffeic, acid cichoric

II Artichaut

Thành phần hóa học

(Luteolin 7-O-glc)(Luteolin 7-O-rut)(Luteolin 7-O-rut; 4’-O-glc)

- phytosterol (-sitosterol, stigmasterol)

- triterpenoid (taraxerol, cynarogenin)

- chất đắng (cynaropicrin)

II Artichaut

Thành phần hóa học

3 4

HO 5 6 OH

6 5

4

3

2 COOH 1

O OH

CaffeoylCynarin = acid 1,3-dicaffeoyl-quinic

COOH

H O

H O

COOH OH

OH

HO OH 2

1

3 4

6 5

4 3

2 1

COOH O

OH

Caffeoyl Caffeoyl

6 5

4 3

2

COOH

1

O OH

CO

OH OH

Dịch cồn nước Dịch nước

Phương pháp Fratianni (2007)

(dùng để chuẩn bị mẫu định lượng, mẫu thử sinh học)

• Lá Artisô đông lạnh được ngâm 1 giờ với 5 V dung môi

Me2CO – EtOH – MeOH (70 : 15 : 15) ở 4OC

• Cô thu hồi dung môi, lắc với 5 V EtOAc ở 4OC

• Cô dịch EtOAc đến khô, hòa vào MeOH ( mẫu thử)

II Artichaut

Chiết xuất

III Hoàng cầm

Scutellaria baicalensis Georgi ,

Lamiaceae

Rễ đã phơi hay sấy khôcủa cây hoàng cầm

(Scutellaria baicalensis)

-Khô cầm (rễ già)

-Điều cầm (rễ con)

93

III Hoàng cầm

O

OH O HO

OH glcA O

• Kháng khuẩn, hạ nhiệt

• Tăng co bóp, làm chậm nhịp tim

• giảm co thắt cơ trơn ruột

• chữa cao huyết áp, nhức đầu, mất ngủ

• Baicalin ester phosphat : kháng dị ứng

95

III Hoàng cầm

Tác dụng - công dụng

Bộ phận dùng

Toàn cây trừ rễ

Thu hái khi cây bắt đầu ra hoa

Orthosiphon stamineus Benth , Lamiaceae

IV Râu mèo

1 Các Flavonoid

Chủ yếu: sinensetin, eupatorin, tetramethyl-scutellarein

(~ 10 chất thuộc nhóm polymethoxy-flavon (PMF)

ngoài ra còn các glycosid của kaempferol, quercetin

2 Các dẫn chất của acid caffeic

Chủ yếu : acid rosmarinic, acid cichoric

(nhóm này được gọi là các tannin của họ Lamiaceae)

97

IV Râu mèo

Thành phần hóa học

- triterpenoid (acid oleanolic, ursolic, betunilic)

- phytosterol, (-sitosterol, stigmasterol, campesterol)

- carotenoid, coumarin (esculetin)

IV Râu mèo

Thành phần hóa học

O

OMe OMe

OMe MeO

• Râu mèo có tác dụng lợi tiểu,

10 1

V Cúc gai

Silybum marianum , Asteraceae

• Cỏ 1-2 năm, cao 0.2 – 1.5 m, mọc hoang và trồng nhiều ởchâu Âu, từ lâu đã được dùng làm thuốc bảo vệ gan

• Đã di thực vào VN (2000, Trại dược liệu Lâm Đồng)

• Bộ phận dùng : Quả (Semen Silibi)

• Hoạt chất chính : Silymarin = hỗn hợp 3 flavolignan

(silybin + silychrystin + silydianin)

• Silymarin: antioxidant, bảo vệ gan, phục hồi gan, chữa

các chứng bệnh về gan mật (LEGALON !)

V Cúc gai