Quy trình định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí

I.Tình hình ngộ độc thực phẩm hiện nay:Trên thế giới:Các bệnh do thực phẩm gây ra hàng năm tới 600 triệu vụ và 42.000 ca tử vong trên thế giới. Nguyên nhân lớn nhất gây ra bệnh từ thực phẩm là: Norovirus, Campylobacter, Salmonella và E.coli. Ở miền Bắc của Đức, chủng E.coli gây ra bùng nổ nghiêm trọng bệnh từ thực phẩm từ tháng 562011. Bệnh được phát hiện bởi triệu chứng tiêu chảy ra máu ở tần suất cao và biến chứng nghiêm trọng. Hoa quả tươi là nguồn bị nhiễm chủng này mang gen sinh độc tố Shiga. Tổng cộng có 3.950 người bị ảnh hưởng, 53 người chết, 51 người ở Đức. 800 người bị ure huyết tán huyết có thể dẫn đến suy thận. Một số ít các trường hợp ở các quốc gia: Thụy Sĩ, Ba Lan, Canada, Hoa Kỳ….chủ yếu là Đức và Pháp.Việt Nam:Theo thống kê, hàng năm Việt Nam có khoảng 250500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.00010.000 nạn nhân và 100200 ca tử vong. Cụ thể gần đây nhất là ngày 75 tại Đà Nẵng có 230 người bị ngộ độc thực phẩm tại xã Hòa Phong, Hòa Khương, Hòa Nhơn, Hòa Tiến và Hòa Phú (Đà Nẵng).

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH iii

DANH MỤC BẢNG iv

I. Tình hình ngộ độc thực phẩm hiện nay: 1

II. Đặc điểm về tổng số vi sinh vật hiếu khí: 3

III.Định nghĩa và nguyên tắc: 4

3.1 Chuẩn bị mẫu: 4

3.2 Pha loãng mẫu: 5

3.3 Cấy và ủ mẫu: 6

3.4 Đếm khuẩn lạc: 7

IV.Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất: 8

V. Quy trình phân tích: 10

TÀI LIỆU THAM KHẢO 18

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1: Các bệnh nhân đang được điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Đà Nẵng 2Hình 1 2: Công nhân đang được điều trị tại bệnh viện 3Hình 1 3: Tủ ấm vi sinh 15

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1: Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất 6Bảng 1 2: Kết quả thí nghiệm: 13

I Tình hình ngộ độc thực phẩm hiện nay:

 Trên thế giới:

Các bệnh do thực phẩm gây ra hàng năm tới 600 triệu vụ và 42.000 ca tử vong trên

thế giới Nguyên nhân lớn nhất gây ra bệnh từ thực phẩm là: Norovirus,

Campylobacter, Salmonella và E.coli

Ở miền Bắc của Đức, chủng E.coli gây ra bùng nổ nghiêm trọng bệnh từ thực phẩm

từ tháng 5-6/2011 Bệnh được phát hiện bởi triệu chứng tiêu chảy ra máu ở tần suấtcao và biến chứng nghiêm trọng Hoa quả tươi là nguồn bị nhiễm chủng này mang gensinh độc tố Shiga Tổng cộng có 3.950 người bị ảnh hưởng, 53 người chết, 51 người ởĐức 800 người bị ure huyết tán huyết có thể dẫn đến suy thận Một số ít các trườnghợp ở các quốc gia: Thụy Sĩ, Ba Lan, Canada, Hoa Kỳ….chủ yếu là Đức và Pháp

 Việt Nam:

Theo thống kê, hàng năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với7.000-10.000 nạn nhân và 100-200 ca tử vong

Cụ thể gần đây nhất là ngày 7/5 tại Đà Nẵng có 230 người bị ngộ độc thực phẩmtại xã Hòa Phong, Hòa Khương, Hòa Nhơn, Hòa Tiến và Hòa Phú (Đà Nẵng)

Hình 1 1: Các bệnh nhân đang được điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Đà Nẵng

Thời gian xảy ra là lúc 15h với các triệu chứng sốt, đau đầu, buồn nôn, nôn mửa,đau bụng và tiêu chảy Nguyên nhân chính gây ra ngộ độc thực phẩm là do người dân

đã ăn phải các món ăn bị nhiễm vi sinh vật vượt mức cho phép Các món ăn chayngười dân sử dụng hôm đó gồm nem chay, mỳ căn, đậu khuôn chiên, cá kho chay,sườn xá xíu, chả chay kho, mì căn xào thịt bò, chả phù chúc, nui xào Các vi sinh vật

có trong thức ăn vượt mức cho phép và gây ngộ độc là Bacillus cereus, Escherichia

coli, Staphylococus aureus

Sau bửa ăn tối ngày 14/10/2014 tại công ty TNHH MTA DHA ở huyện Lương Tàitỉnh Bắc Ninh công nhân có dấu hiệu ngộ độc thực phẩm và được đưa đi cấp cứu.Tính đến ngày 16/10 có 371 công nhân được xác định là bị ngộ độc thực phẩm vớitriệu chứng: chóng mặt, đau bụng quằn quại, tiêu chảy cấp nhiều lần và buồn nôn.

Hình 1 2: Công nhân đang được điều trị tại bệnh viện

Chi cục VSATTP tỉnh Bắc Ninh đã lấy mẫu bệnh phẩm và mẫu thức ăn đưa đi kiểmtra làm rõ Theo quá trình phân tích nguyên nhân gây ngộ độc là do món cá mối khô

chiên có chứa độc tố của E.coli hoặc Shigella.

II Đặc điểm về tổng số vi sinh vật hiếu khí:

Vi sinh vật trên đĩa thạch còn được gọi là tổng số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếmtrên đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa

Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trongđiều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử Nhưng lại yêu cầu lượng phần trăm oxytrong môi trường sống ít hơn trong khí quyển thông thường (>21% O2 nó sẽ không tồntại được, thường sống ở khoảng 2-10% O2) Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diệntrong mẫu phản ánh vệ sinh chế biến, độ tươi mới hay nguy cơ cơ hỏng của thựcphẩm Tổng số vi sinh vật hiếu khí còn có thể chỉ thị chất lượng vệ sinh sinh của thựcphẩm Các nghiên cứu đã chỉ rõ tổng số vi sinh vật hiếu khí có tác dụng nhất trongviệc đánh giá chất lượng vệ sinh của các loại thực phẩm không thuận lợi cho vi sinhvật phát triển như thực phẩm khô hay thực phẩm đông lạnh Với các loại thực phẩm

này, tổng số vi sinh vật hiếu kí được sử dụng để đánh giá vệ sinh trong quá trình sảnxuất, vận chuyển và bảo quản thực phẩm Đối với các thực phẩm tươi sống, ngoài cácgiá trị như trên, tổng số vi sinh vật hiếu khí chỉ ra rằng có thể tồn tại những vi sinh vậtgây bệnh trong thực phẩm tươi sống Số lượng vi sinh vật hiếu khí thấp thường không

đi đôi với thực phẩm an toàn Các thực phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh về chỉ tiêu tổng số

vi sinh vật hiếu khí vẫn có thể nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác Do đó, chỉ tiêu tổng

số vi sinh vật hiếu khí được sử dụng để đánh giá chất lượng vệ sinh hơn là độ an toàncủa thực phẩm Một nghiên cứu về sản xuất trứng đông lạnh thương phẩm đã cho thấy

trứng bị nhiễm Salmonella, Coliform cho dù có chỉ tiêu vi khuẩn hiếu khí an toàn

 Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môitrường thạch dinh dưỡng, từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mộtkhuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và đượcbiểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit,CFU) trong một đơn vị khối lượng hay thể tích thực phẩm và có một số tên gọikhác nhau như:

 Số vi sinh vật hiếu khí( Aerobic Count_ APC)

 Tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count_ TPC)

 Tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count_ TVC)

 Số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count_ SPC)

Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về visinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời gian bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quátrình chế biến, bản quản sản phẩm

Tổng số vi khuẩn hiếu khí cho phép có mặt trong sản phẩm có thể thay đổi, caonhất là 5.104 khuẩn lạc/g sản phẩm

III Định nghĩa và nguyên tắc:

3.1 Chuẩn bị mẫu:

Định nghĩa: Huyền phù, dung dịch hoặc nhũ tương thu được, sau khi cân hoặc đong

một lượng sản phẩm xác định cần kiểm tra (hoặc của mẫu thử đã chuẩn bị từ sản

phẩm) được trộn với một lượng dung dịch pha loãng thường là gấp 9 lần để đồng nhấtmẫu.

Nguyên tắc:

Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6507-1:2005 (ISO 6887-1 : 1999) về Vi sinh vậttrong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và cácdung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật

Cân một lượng m g với sai số cho phép ±5% hoặc đong một thể tích V ml với sai sốcho phép ±5% (tối thiểu là 10 g hoặc 10 ml, trừ khi có qui định khác), của phần mẫuthử đại diện cho vào một chén đựng vô trùng hoặc túi bằn chất dẻo vô trùng

Để vi sinh vật không bị tổn thương do thay đổi nhiệt độ đột ngột, thì nhiệt độ củadịch pha loãng trong suốt quá trình thao tác mô tả dưới đây phải giữ xấp xỉ bằng nhiệt

độ phòng, trừ trường hợp đối với sản phẩm cụ thể (xem tiêu chuẩn riêng)

Đồng hóa hỗn hợp theo các khuyến cáo trong TCVN 6404 (ISO 7218)

Để các hạt to lắng xuống trong 15 phút, nếu cần Có thể sử dụng các hệ thống lọc

để có kết quả tương đương

3.2 Pha loãng mẫu:

Định nghĩa: Pha loãng mẫu là làm giảm số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể

tích

Nguyên tắc:

Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4884-2:2015 (ISO 4833-2: 2013) về Vi sinh vậttrong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩathạch – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.℃ do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.Dùng pipet vô trùng lấy 1 ml huyền phù ban đầu với sai số đo ±5% cho vào mộtống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng vô trùng ở nhiệt độ thích hợp

Chú thích: Nếu cần một thể tích lớn hơn, thì có thể thêm một thể tích xác định (lớn

hơn 1ml) huyền phù ban đầu với sai số đo ±5%, vào ống nghiệm chứa một thể tíchdịch pha loãng vô trùng gấp chín lần

Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn 1cm.

Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng

Trộn kỹ, tốt nhất dùng máy khuấy cơ để trộn trong 5 giây đến 10 giây để thu đượcdung dịch pha loãng 10-2

Nếu cần, lặp lại các thao tác này sử dụng dung dịch pha loãng 10−2 và các dungdịch pha loãng tiếp theo, thì dùng một pipet vô trùng mới ở mỗi độ pha loãng để thuđược các dung dịch pha loãng 10-3, 10-4,…cho đến khi thu được số lượng vi sinh vậtthích hợp

Chú ý: Thời gian kể từ khi chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi bắt đầu chuẩn bị các

dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo không được vượt quá 30 phút, trừ khi có quiđịnh khác trong tiêu chuẩn riêng

3.3 Cấy và ủ mẫu:

Định nghĩa: Cấy là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang

môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng

Nguyên tắc:

Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4884-2:2015 (ISO 4833-2: 2013) về Vi sinh vậttrong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩathạch – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.℃ do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.Lấy hai đĩa Petri vô trùng Dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử nếusản phẩm là chất lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác(độ pha loãng 10−1).

Lấy hai đĩa Petri vô trùng khác Dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1 ml dịch phaloãng 10−1 (nếu sản phẩm là chất lỏng) hoặc 1 ml dung dịch pha loãng 10−2 (nếu cácsản phẩm ở dạng khác)

Lặp lại trình tự này với các dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet mới vô trùng đốivới mỗi dung dịch pha loãng thập phân, nếu cần

Nếu thích hợp và nếu có thể, chỉ chọn các bước pha loãng tới hạn (ít nhất hai dungdịch pha loãng thập phân liên tiếp) để cấy các đĩa Petri sao cho thu được số đếm từ 15khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên mỗi đĩa Petri

Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng 12 ml đến 15 ml môi trường thạch đếm đĩa ở 44℃ do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.đến 47 Thời gian từ khi chuẩn bị xong huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha℃ do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.loãng 10−1 nếu sản phẩm là chất lỏng) đến khi rót môi trường vào các đĩa không đượcvượt quá 45 phút

Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa Petri và để cho hỗn hợpđông đặc lại bằng cách đặt các đĩa Petri trên bề mặt nằm ngang, mát

Sau khi đông đặc hoàn toàn và chỉ khi nào nghi ngờ sản phẩm cần kiểm tra có chứacác vi sinh vật mà khuẩn lạc của chúng có thể mọc lan trên khắp bề mặt của môitrường, thì rót khoảng 4 ml môi trường phủ ở 44 đến 47 lên bề mặt môi trường℃ do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành ℃ do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành

đã cấy mẫu Để cho đông đặc như mô tả ở trên

Lật ngược các đĩa đã cấy mẫu và đặt vào tủ ấm ở 30℃ do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành ± 1℃ do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành trong 72 h ±3 h.Không xếp chồng cao quá sáu đĩa Các chồng đĩa cần được tách khỏi nhau và cách xathành và nóc tủ

3.4 Đếm khuẩn lạc:

Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4884-2:2015 (ISO 4833 -2: 2013) về Vi sinh vậttrong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩathạch – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.℃ do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.Sau giai đoạn ủ qui định, đếm các khuẩn lạc trên đĩa sử dụng dụng cụ đếm khuẩnlạc, nếu cần Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu Điều quan trọng là các khuẩn lạcchính phải được đếm và tránh đếm nhầm với các hạt không hòa tan hoặc chất kết tủatrên đĩa Kiểm tra cẩn thận các khuẩn lạc nghi ngờ, khi cần nên dùng kính lúp có độkhuếch đại lớn hơn để phân biệt các khuẩn lạc với tạp chất lạ

Các khuẩn lạc mọc lan rộng được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ Nếu ít hơn một phần

tư đĩa mọc dày lan rộng, thì đếm các khuẩn lạc trên phần đĩa còn lại và tính số tươngứng cho cả đĩa Nếu quá một phần tư đĩa bị mọc dày lan rộng thì loại bỏ đĩa và khôngđếm

IV Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất:

Bảng 1 1: Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hóa chất

Môi trường, hóa chất

Tên môi trường, hóa chất Quy cách Số lượng/đơn vị tính

Bình tam giác hoặc bao nylong vô

Môi trường PCA

- Principle And Interpretation

Plate Count Agar is formulated as described by Buchbinder et al (2) which isrecommended by APHA (1,6,7) and FDA (3) Tryptone provides nitrogenous andcarbonaceous compounds, long chain amino acids, and other essential nutrients Yeastextract supplies Vitamin B complex APHA recommends the use of pour platetechnique The samples are diluted and appropriate dilutions are added in Petri plates.Sterile molten agar is added to these plates and plates are rotated gently to ensureuniform mixing of the sample with agar The poured plate count method is preferred

to the surface inoculation method, since it gives higher results Plate Count Agar isalso suitable for enumerating bacterial count of sterile rooms

- Nguyên tắc và giải thích ( theo HIMEDIA)

Plate Count Agar được bào chế theo mô tả của Buchbinder và đồng đội (2) đượcAPHA (1,6,7) và FDA (3) khuyến nghị Tryptone cung cấp các hợp chất nitơ vàcarbonat, axit amin chuỗi dài và các chất dinh dưỡng cần thiết khác Men chiết xuấtcung cấp Vitamin B phức tạp APHA khuyến nghị sử dụng kỹ thuật hộp đổ Các mẫuđược pha loãng và pha loãng thích hợp được thêm vào trong đĩa Petri Agar nóng chảy

vô trùng được thêm vào các đĩa này và các đĩa được xoay nhẹ nhàng để đảm bảo trộnđều mẫu với thạch Phương pháp đếm hộp đổ được ưa thích hơn đối với bề mặt cấy

phương pháp, vì nó cho kết quả cao hơn Plate Count Agar cũng thích hợp để liệt kê

số lượng vi khuẩn trong phòng vô trùng

V Quy trình phân tích:

10g/25g đối với mẫu rắn hoặc 10ml/25ml đối với mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone Water

Đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 60 giây

Dịch mẫu 10-1 Pha loãng Dịch mẫu 10-2

Xoay nhẹ trộn đều mẫu, ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông

đặc, lật ngược đĩa và ủ ở tủ ấm 300C trong 72 ± 6 giờ

Đọc kết qủa chọn các đĩa mọc lớn hơn hoặc bằng 15 và nhỏ

hơn hoặc bằng 300 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả

 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Ví dụ để giải thích quy trình

Quy trình định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm được tóm tắt:

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãngmẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3

Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp,chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vô trùng

(mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)

Rót vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trườngPCA đã được làm nguội đến 450C, lắccho mẫu phân tán đều vào môi trường, ủ

ở 300C trong 72 giờ

Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trongkhoảng 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa để đếm

Tính kết quả: tổng vi sinh vật hiếu khí

trong mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml)

Bước 1: Đồng nhất và pha loãng mẫu

Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùngcho tới khi được thể đồng nhất Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặchút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình tam giác có chứa 90 ml đệm pepton, lắc đều2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1 Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1

cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml đệm pepton, đều 2-3 phút thu được dung dịch

mẫu thử 10-2 Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo.

Bước 2: Cấy và ủ mẫu

Dùng pipet vô trùng hút mẫu thử và cho vào 2 đĩa petri vô khuẩn, mỗi đĩa 1ml nếumẫu thử là chất lỏng hoặc 1ml huyền phù nếu mẫu thử ở các dạng khác Lặp lại quátrình này ở các dịch pha loãng tiếp theo Đổ vào mỗi đĩa 12-15ml môi trường thạch đểđếm đĩa ở 44-470C Trộn đều dịch nuôi cấy với môi trường thạch bằng cách xoay nhẹđĩa petri theo hai chiều trái, phải Để đĩa trên mặt phẳng cho thạch đông đặc lại Nếu

dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môitrường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên bề mặt Để thạch đông, lật ngược đĩa

và ủ ấm ở 300C ±1oC trong thời gian 72 giờ ± 3 giờ Thời gian bắt đầu pha loãng đếnkhi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút

Bước 3: Đếm khuẩn lạc

Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩanuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghinhận kết quả chính thức Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý Độpha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hànhlại các bước nuôi cấy

Sử dụng dụng cụ đếm khuẩn lạc (nếu cần) Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu,điều quan trọng là các khuẩn lạc chính phải được đếm và tránh đếm nhầm với các hạtkhông hòa tan hoặc các chất kết tủa trên đĩa Kiểm tra cẩn thận các khuẩn lạc nghi