MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN MÔN HỌC: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

LOGO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

E.coli là trực khuẩn Gram âm Kích thước trung bình

từ 2 đến 3µm x 0,5µm; trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh)

vi khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ Rất ít chủng

E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng

di động.

Escherichia coli do Theodore Escherich

(1857-1911), một nhà vi khuẩn học người Đức, phát hiện

lần đầu tiên năm 1885 Chi Escherichia thuộc họ vi

khuẩn đường ruột Trong các loài thuộc chi này,

E.coli được chọn làm điển hình và có vai trò quan

trọng nhất trong y học.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

Tính chất hóa sinh

E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có

sinh hơi Hầu hết E.coli đều lên men lactose và sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) không hoặc lên men rất

chậm

E.coli có khả năng sinh indole Không sinh H2S

Không sử dụng được nguồn carbon của citrate

trong môi trường Simmons Thử nghiệm VP

(Voges Proskauer) sau 24 giờ âm tính, sau 48 giờ

có thể dương tính

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

Tính chất nuôi cấy

 E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi

cấy thông thường Một số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng Hiếu, kỵ khí tùy ý Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-50 0 C

Nhiệt độ thích hợp xung quanh 37 0 C.

 Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 đến 10 giờ, dung kính lúp đã có thể quan sát được khuẩn lạc Trên môi trường phân lập, tùy theo chất chỉ thị màu,

E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như trên thạch

lactose) hoặc màu đỏ (như trên thạch MacConkey)

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

THẠCH MACONKEY

THẠCH MACONKEY

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

GIỚI THIỆU VỀ E.COLI

Khả năng gây bệnh

 E.coli là 1 vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng

đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết, là căn nguyên thường gặp trong viêm màng não, viêm phổi ở trẻ

mới sinh E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại

khoa, nhiễm trùng trong bỏng

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

PHƯƠNG PHÁP MPN

Nguyên tắc

 Phương pháp MPN ( Most Probable Number) dựa vào

nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có

độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham.

 Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện

là các ống dương tính (+) Ghi nhận số ống nghiệm dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện

trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

 Bước 6: Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên

môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB/ Endo ủ các đĩa 37 0 C, 24 giờ.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

 Bước 7: Chọn khuẩn lạc E Coli giả định trên EMB/ Endo

cấy vào TSA/ BHI Ủ qua đêm.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

QUY TRÌNH THỰC HIỆN

 Bước 8: Cấy chuyền từ môi trường TSA/ BHI vào các môi

trường thử nghiệm sinh hóa Trypton Broth, MR-VP , SC ủ 44,5

± 0,2 0 C, 24 giờ.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

- Thực hiện: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa

5ml Trypton broth, ủ 37 0 C trong 24h

- Thuốc thử: Kovaes hoặc Erlich.( nhỏ 5 giọt vào mỗi ống

nghiệm sau khi ủ)

- Kết quả:

+ dương tính nếu dung dịch môi trường xuất hiện vòng màu đỏ  có sự hiện diện của indole

+ âm tính nếu dung dịch môi trường không đổi màu

 không có sự hiện diện của indole

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

- Thuốc thử : Methyl Red ( nhỏ 5 giọt vào mỗi ống nghiệm sau khi ủ)

pH < 4,4 ( môi trường có màu đỏ)

4,5 < pH < 5,8 ( môi trường có màu cam.)

pH > 5,8 ( môi trường có màu vàng.)

- Kết quả:

+ dương tính nếu dung dịch môi trường có màu đỏ  vi sinh vật có

khả năng tạo sản phẩm biến dưỡng có tính acid.

+ âm tính nếu dung dịch chuyển sang màu vàng  vi sinh vật không

có khả năng tạo sản phẩm biến dưỡng có tính acid.

*LƯU Ý: nếu môi trường xuất hiện màu cam chúng ta cần ủ thêm

thời gian, nếu từ màu cam chuyển sang màu đỏ ta kết luận kết quả

dương tính, còn nếu vẫn màu cam thì kết luận kết quả âm tính.

- Phản ứng thử VP dùng để phân biệt các vi sinh vật có khả năng

sinh Acetoin ( môi trường trung tính).

- Cho vào ống nghiệm chứa môi trường MRVP khoảng 0,6ml dung dịch α-napthol và 0,2ml dung dịch kalihydroxyt 40%, lắc đều, để yên trong 2h.

- Thuốc thử: -Naphtho (6 giọt), NaOH 40% hoặc KOH 40% (2 giọt)

- Kết quả:

+ dương tính nếu dung dịch môi trường có màu đỏ  vi sinh vật có thể tạo ra Acetoin.

+ âm tính nếu dung dịch môi trường không đổi màu đỏ  không có

vi sinh vật có thể tạo ra Acetoin.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

Nguyên tắc: Những vi sinh vật có khả năng sử dụng muối

Citrate và Amonium sẽ tạo ra các sản phẩm biến dưỡng CO2,

NH2, Na2CO3 làm kiềm hóa môi trường  chuyển chỉ thị

Bromothymol Blue từ màu xanh lá cây sang xanh dương.

- Chất chỉ thị: Bromothymol Blue có trong môi trường

Phản ứng Citrat

KẾT LUẬN

www.themegallery.com

Sau 4 thử nghiệm kiểm tra E.coli:

• Thử nghiệm khả năng sinh Indole : dương

tính(+)

• Thử nghiệm khả năng sinh Acid : dương tính(+)

• Thử nghiệm Voges – Proskauer (VP) : âm tính

THỬ PHẢN ỨNG SINH HOÁ

Kết quả:

Ống nghiệm cho kết quả EC (+), và khuẩn lạc

E Coli giả định trên môi trường EMB cho kết quả

thử nghiệm IMViC (++ ) là ống nghiệm có chứa

E Coli (+) Từ số lượng các ống có E Coli (+) ở

mỗi độ pha loãng của mẫu tra bảng MPN để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng

trị số MPN/g hay MPN/ml.

ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

Lấy mẫu nước giải khát vào buổi sáng tại các quán nước giải khát tại địa bàn thành phố Hồ Chí Minh, các loại nước đóng chai và không đóng chai được cho vào bao nilon vô trùng, sau đó mang về phòng thí nghiệm

Tiến hành phân tích định lượng theo qui trình

phương pháp MPN

www.themegallery.com

ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG E COLI TRONG

NƯỚC GiẢI KHÁT

www.themegallery.com

Bước 1: Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng để có

các nồng độ pha loãng là 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 .

Bước 2: Chuyển 1ml dung dịch pha loãng ở 3 nồng độ liên tiếp

vào ống nghiệm có 10ml canh LSB, mỗi nồng độ lặp lại 3

ống, ủ ở 37 ± 1 0 C, 48 giờ Mỗi ống nghiệm cho 1 ống

Durham.

ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG E COLI

TRONG NƯỚC GiẢI KHÁT

Bước 3: Ghi nhận các ống sinh hơi và canh trường đục

Kết luận các ống LSB (+).

ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG E COLI

TRONG NƯỚC

www.themegallery.com

Bước 6: Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+)

trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa

EMB/ Endo ủ các đĩa 37 0 C, 24 giờ.

Bước 7: Chọn khuẩn lạc E Coli giả định trên EMB/

Endo cấy vào TSA/ BHI Ủ qua đêm.

Bước 8: Cấy chuyền từ môi trường TSA/ BHI vào các

môi trường thử nghiệm sinh hóa Trypton Broth, MR-VP ,

Mật độ nhiễm (CFU/100ml) Mật độ phát hiện (MPN/ 100ml)

Mật độ nhiễm (CFU/100ml) Mật độ phát hiện (MPN/ 100ml)

Mật độ nhiễm (CFU/100ml) Mật độ phát hiện (MPN/ 100ml)

Từ các kết quả trên cho thấy hầu hết mật độ càng

cao thì khả năng phát hiện càng lớn Do nguyên

nhân là do khi gây nhiễm ở mật độ cao thì sự phân

bố vi khuẩn trong 100ml mẫu càng đồng đều Còn khi gây nhiễm ở mật độ thấp thì sự phân bố mẫu

không đồng đều, có nơi có, có nơi không, nên khi hút cũng sẽ có khi có, có khi không

Những kết quả khảo sát trên là bước đầu phản ánh tình trạng ô nhiễm vi sinh vật trong các loại nước

giải khát trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh đã

đến mức báo động

www.themegallery.com

ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG E COLI TRONG

NƯỚC GiẢI KHÁT

Thank You !