Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase từ nấm trichoderma

Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase từ nấm trichoderma

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN BẢO HƯNG

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN CHITINASE

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS NGUYỄN HOÀNG LỘC

Huế, 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

Người cam kết Nguyễn Bảo Hưng

Lời cảm ơn

Trong suốt quá trình làm việc, ngoài sự nổ lực của bản thân, em đã nhận được sự giúp đở nhiệt tình của quý thầy cô, anh chị kỹ thuật viên ở Viện Tài nguyên Môi trường và Công Nghệ Sinh Học, em xin chân thành cảm ơn Đặc biệt, em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành nhất đến thầy PGS.TS Nguyễn Hoàng Lộc, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên, giúp em vững tin trên con đường mình đang đi

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân của mình đã khích lệ, động viên tinh thần cho em trong suốt thời gian học tập và làm việc

Trong quá trình làm việc, bước đầu làm quen với chuyên môn có thể mắc nhiều sai sót, em sẽ cố gắng hoàn thiện mình để ngày một trưởng thành hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Huế, tháng 11 năm 2010

Nguyễn Bảo Hưng

1.1.1 Giới thiệu chitinase

1.1.2 Tình hình nghiên cứu chitinase

1.1.3 Khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại thực vật của chitinase

1.2 Tổng quan về nấm Trichoderma

1.2.1 Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma

1.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Trichoderma

1.2.3 Khả năng kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng và cơ chế tác

động của nấm đối kháng Trichoderma

1.2.3.1 Hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh

cây trồng

1.2.3.2 Cơ chế tác động của nấm Trichoderma lên các tác nhân gây bệnh

cây trồng

1.3 Tổng quan về công nghệ DNA tái tổ hợp

1.3.1 Giới thiệu chung

1.3.2 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất enzyme

1.4 Tình hình nghiên cứu về chitinase tái tổ hợp

1.5 Tạo dòng và biểu hiện gene trong E.coli

1.6 Tạo dòng và biểu hiện gen trong nấm men

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.Xác định chủng Trichoderma sinh chitinase ngoại bào mạnh

2.2.5.3 Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase

2.2.6 Các phương pháp thống kê sinh học

Chương 3 Kết quả và thảo luận

3.1 Tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma tiết chitinase ngoại bào mạnh

3.2 Xác định hoạt độ chitinase bằng phương pháp quang phổ 3.3 Xác định khối lượng phân tử của enzyme chtinase

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

CS: cộng sự

IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

BMV: brome mossaic virus

TMV: Tobacco mosaic virus

RT-PCR: reverse transcription-polymerase chain reaction PCR: Polymerase Chain Reaction

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

Hình 3.1 Vòng phân giải chitin của các chủng nấmTrichoderma spp

Hình 3.2 Điện di SDS và điện di cơ chất

Hình 3.3 Phản ứng PCR với cặp mồi ITS1 và ITS4

Hình 3.4 So sánh trình tự ITS của chủng SH16 với chủng ZJPH0810 Hình 3.5 Phản ứng PCR với cặp mồi C42R và C42F

Hình 3.6 So sánh trình tự các gen chitinase phân lập được và gen ech42

Dấu

* thể hiện sự giống nhau trong trình tự của các gen

Hình 3.7 Vector pYES2/NT A có mang gen chi42-SH16

Hình 3.8 Kiểm tra sự hiện diện của gen chi42-SH16 trong nấm men tái tổ hợp

Hình 3.9 Hoạt tính chitinase tái tổ hợp theo thời gian cảm ứng

MỞ ĐẦU

Cây trồng nông nghiệp bao gồm các loại rau và ngũ cốc như: rau ăn lá, ăn quả, củ, đậu đỗ, lúa, ngô, khoai, sắn… giữ vai trò quan trọng trong bữa ăn hàng ngày của từng gia đình và là nguồn hàng xuất khẩu có giá trị Tuy nhiên, đây là loại cây trồng có những đặc điểm hình thái và sinh trưởng thuận lợi cho các loại sâu và nấm bệnh sống ký sinh Sức tàn phá của các loại sâu và nấm bệnh này nhiều khi rất lớn, gây tổn thất nghiêm trọng về năng suất và chất lượng của cây trồng [15]

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới, vì thế thích hợp cho nhiều loại sâu

và nấm bệnh gây hại cây trồng nông nghiệp phát triển Các loại nấm bệnh gây

hại thường gặp ở cây trồng như Rhizoctonia gây bệnh thối gốc (lở cổ rễ),

Fusarium gây bệnh héo rũ, thối khô, Alternaria gây bệnh đốm vòng… Để hạn

chế tác hại của nấm bệnh, một trong những phương pháp có hiệu quả là sử dụng hóa chất và thuốc trừ sâu bệnh Tuy nhiên, việc làm này gây tác hại lâu dài với môi trường và sức khoẻ của cộng đồng [10] Hiện nay, công nghệ sinh học ngày càng phát triển đã mở ra một hướng đi mới trong việc ngăn ngừa tác hại của sâu và bệnh hại cây trồng nhưng vẫn bảo vệ được môi trường như tạo

ra các cơ thể tái tổ hợp có khả năng kháng lại các loại sâu bệnh [74], [75] Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen)

là một bộ phận quan trọng và là công nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học Công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng trong sự phát triển của sinh học Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển

nó vào trong một cơ thể sinh vật khác Cải thiện hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi [69], trong đó có tạo dòng và sản xuất chitinase [43], [64], [56]

Chitinase là một enzyme glycosyl hydrolase xúc tác thủy phân chitin, có trong nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xương sống, thực vật và động vật có xương sống Chitinase thực vật là các enzyme xúc tác thủy phân chitin của nấm bệnh Tuy nhiên, không phải cây trồng nào cũng có khả năng sản xuất chitinase, hoặc hoạt tính chitinase của chúng đủ cao để kháng lại nấm bệnh, vì vậy việc tạo ra một chủng sinh vật có khả năng sản xuất enzyme này với lượng lớn và hoạt tính cao là có ý nghĩa rất lớn [46]

Đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen

chitinase trong Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiea và các loại vi

khuẩn khác đã được công bố, như nghiên cứu của Boer và cộng sự (2007) về

biểu hiệu gen chit33 và chit42 của Trichoderma harzianum trong E coli [32], biểu hiện gen chitinase của Serratia marcescens trong các chủng

Sinorhizobium fredii USDA191 và S meliloti RCR2011 (Krishnan và cs

1999), biểu hiện gen chitinase của T aureoviride trong nấm men S cerevisiae

(Jinzhu và cs 2005)

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tạo dòng và

biểu hiện gen chitinase từ nấm Trichoderma ” nhằm mục đích sản xuất

enzyme này với hiệu suất cao hơn các sinh vật truyền thống, từ đó áp dụng vào sản xuất nông nghiệp phòng trừ nấm bệnh trên một số cây trồng kinh tế

như rau, quả hoặc các loại ngũ cốc

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITINASE

1.1.1 Giới thiệu chitinase

Chitinase (poly (1,4-N-acetyl-β-glucosaminide) glucanhydrolase) là enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase thủy phân liên kết 1,4-N-acetyl-β-glucosaminide (β-1,4-GlcNAc) của chitin Chitinase được tạo ra từ nhiều sinh vật, từ những loài có thành phần cấu trúc là chitin như nấm, côn trùng, giáp xác, đến những loài không có chitin như vi khuẩn, thực vật Ở những sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò chính trong quá trình phát sinh hình thái và phân chia tế bào Các sinh vật khác tổng hợp chitinase với các mục đích khác nhau Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân hủy chitin tạo ra nguồn carbon Ở thực vật và động vật chitinase nằm trong hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh như nấm bằng cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin của nấm [46]

Cơ chất của chitinase là chitin và một số dẫn xuất của nó Chitin là polysaccharide được tạo thành nhờ liên kết β-1,4 của các đơn phân N-acetylglucosamine, một trong những dạng polysaccharide phổ biến trong tự nhiên Chitin là thành phần chủ yếu trong cấu trúc bộ xương ngoài của các loài côn trùng, vỏ giáp xác và thành tế bào nấm [46]

Chitin có hoạt tính hóa học thấp, màu trắng, cứng và có chứa nitrogen Chitin không tan trong nước và hầu hết các dung môi hữu cơ, tan trong hexa fluro isopropanol, hexa fluroacetone Hàm lượng nitrogen của chitin chiếm

từ 5-8%, khối lượng phân tử trung bình từ 1,03×106

-2,5×106 Da Trong môi trường base, chitin bị deacetyl tạo thành chitosan (-NHCOCH3→ -NH2) [50]

1.1.2 Tình hình nghiên cứu chitinase

Chitinase lần đầu tiên được mô tả bởi Bernad (1911) trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến chitinase và khả năng khuếch tán nhân tố kháng nấm ở cây hoa phong lan [12] Năm 1929, Karrer và Hofmann đã nghiên cứu đặc tính của enzyme này trong ốc sên [38] Sau này, những khảo

sát của Jeuniaux (1966) đã mở ra những hướng nghiên cứu mới về chitinase [34]

Năm 1991, Henrissat dựa trên sự tương đồng trình tự amino acid ở vùng xúc tác đã phân loại nhóm protein glycosyl hydrolases thành hơn 50 họ trong

đó chitinase được chia thành hai họ 18 và 19 (gồm những enzyme thuộc EC 3.2.1.14 và EC 3.2.1.52) [35]

Năm 1993, Henrissat và Bairoch phân loại thêm những enzyme từ các loài

Flavobacterium, endo-N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.96) vào họ 18

Những protein này phân cắt liên kết β 1,4-N-GlcNAc thành các manosyl glycoprotein Các protein thuộc hai họ 18 và 19 hoàn toàn khác nhau về cơ chế xúc tác, trình tự amino acid cũng như cấu trúc không gian do đó chúng được cho là có nguồn gốc tiến hóa khác nhau Hai họ này chứa cả endochitinase và exochitinase [36]

Chitinase họ 18 bao gồm những chitinase từ thực vật (Arabidopsis, dưa leo, cây họ đậu, thuốc lá ), nấm (Aphanocladium, Rhizopus,

Streptomyces ), virus và động vật… Các chitinase họ 18 thủy phân các liên

kết GlcNAc-GlcNAc, GlcNAc-GlcN bằng cơ chế giữ nguyên cấu hình anomeric Hoạt tính của các chitinase họ 18 bị ức chế bởi allosamidin [36]

Ở Việt Nam, gần đây chitinase mới được quan tâm nghiên cứu do những ứng dụng của nó trong việc xử lý môi trường và khả năng ức chế chống lại nấm bệnh hại cây trồng Một số công trình đã được công bố như: Nghiên cứu

chitinase và β-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp và khả năng kiểm soát

sinh học đối với một số nấm gây bệnh ở thực vật [9]; Khảo sát hoạt tính các

hệ enzyme thủy phân chiết tách từ môi trường nuôi cấy Trichoderma sp và

thử nghiệm ứng dụng chế biến phân hữu cơ vi sinh [13] Tuy nhiên, nghiên cứu về chitinase vẫn còn là vấn đề mới mẻ tại Việt Nam

1.1.3 Khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại thực vật của chitinase

Đặc tính sinh học của chitinase đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau Nhiều công trình trên thế giới cho thấy chitinase có khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại thực vật [44], [51], [60]

Ở thực vật, việc sản xuất chitinase được xác định là một cơ chế bảo vệ cây trồng trước những nhân tố gây bệnh Đối với các tác nhân gây bệnh như nấm hay côn trùng chứa chitin, phản ứng tự vệ chính của thực vật là tạo ra chitinase Hầu hết chitinase được tạo ra tại cơ quan bị nhiễm nấm hay côn

Ở mô bị thương, nhiễm vi sinh vật và nhiễm nấm người ta cũng thấy có sự xuất hiện chitinase Theo nghiên cứu của Hedrick và cs (1988), trong tế bào hạt đậu nuôi cấy huyền phù và trong đoạn trụ dưới mầm, chitinase được tổng

hợp sau khi được gây nhiễm với nấm bệnh [20] Khi bị kích thích 10 lần trong

5 phút gen chitinase phiên mã rất nhanh chóng Ở cây đậu Hà Lan sau khi bóc sạch vỏ hạt bị nhiễm nấm, người ta đã thu được 2 loại chitinase Hai loại chitinase này tương ứng với những enzyme mà Bernasconi và cs (1987) tìm

thấy trong Parthenocissus bởi [51]

Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng chitinase có khả năng phân hủy thành

tế bào sợi nấm, ngăn cản sự nảy mầm và phát triển của sợi nấm trong điều

kiện phòng thí nghiệm Nấm Trichoderma tiết ra ngoại bào enzyme chitinase tấn công trực tiếp nhiều loài nấm gây bệnh như Rhizotonia solani, Fusarium

solani [59] Hai enzyme CHIT42 và CHIT33 từ nấm T harzianum là yếu tố

cơ bản trong quá trình đối kháng với các loại nấm khác Hệ thống gen mã hóa

cho chitinase từ các loài Trichoderma đã được giải mã, tạo dòng và chuyển

vào cây trồng [60]

Theo Jollès và Muzzarelli (1999), các loài nấm mốc như Trichoderma,

Gliocladium cho hàm lượng chitinase cao Nấm Trichoderma khi ký sinh

trên nấm gây bệnh sẽ tiết ra hệ enzyme phân hủy chitin của thành tế bào nấm gây bệnh bao gồm 6 enzyme: 2 enzyme β-1,4-N-acetylglucosaminidase và 4 enzym endochitinase Robert và Selitrennikoff (1988) cũng đã nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của chitinase thực vật và chitinase vi khuẩn, các tác giả cho rằng chitinase phân lập từ hạt cây lúa mì, lúa mạch và ngô có hoạt tính phân cắt nội mạch phân tử cơ chất và ức chế sự kéo dài sợi nấm Trái lại,

chitinase phân lập từ nấm men Saccharomyces marcescens, S griseus và vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có hoạt tính phân cắt cơ chất từ đầu không khử, không ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm Tetranichus reesei và

Phycomyces blackesleeanus [59] Tuy nhiên, theo Ordentlich và cs (1988),

khi có sự hiện diện của S marcescens, bệnh do nấm Sclerotium rolfsii trên hạt đậu phát triển chậm hơn Shapira (1991) đã tạo dòng gen chitinase từ S

marcescens và nhận thấy trong điều kiện nhà kính chitinase tạo ra có tác dụng

kìm hãm sự phát triển của bệnh do nấm S rolfsii gây ra trên cây đậu và nấm

R solani trên cây bông

1.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM TRICHODERMA

1.2.1 Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma

Khái niệm sử dụng nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh hại cây trồng

có từ những năm 1930, người đầu tiên đề xuất vấn đề này là Weinding

(Seiketov, 1982) Tác giả này đã đề nghị dùng nấm Trichoderma để trừ nấm

Rhizoctonia gây bệnh thối cây con mới mọc ở cam quýt Weinding đã ghi

nhận rằng xử lý đất bằng nấm Trichoderma có thể bảo vệ được cây con mới mọc từ hạt không bị bệnh Từ đó, các nghiên cứu về nấm Trichoderma nhằm

sử dụng chúng để trừ bệnh hại cây trồng đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Cho đến nay, có khoảng 30 nước nghiên cứu sử dụng nấm

Trichoderma để trừ bệnh hại cây trồng như Nga, Mỹ, Anh, Pháp, Đức,

Hungary, Ấn Độ, Thái Lan, Philippines, Malaysia [18]

Nhiều nước Châu Âu đã nghiên cứu sản xuất và sử dụng nấm Trichoderma

để phòng chống hơn 150 loài bệnh hại trên 40 loại cây trồng khác nhau [2]

Ở Việt Nam, nhóm nấm này đã được quan tâm nghiên cứu đầu tiên trong việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng với sinh vật gây bệnh trên cây trồng Công việc này được bắt đầu từ năm 1987 tại Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ thực vật, sau đó các nghiên cứu này cũng được tiến hành tại Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội [2] Từ năm 1990, nguồn nấm Trichoderma bản địa đã được

phân lập để nghiên cứu cơ chế đối kháng, điều kiện ảnh hưởng đến sinh

trưởng phát triển của chúng Những chủng nấm Trichoderma bản địa có hiệu quả ức chế khá cao (67,8-85,5 %) đối với các nấm gây bệnh như Rhizoctonia

solani, Sclerotium rolfsii, Boytrytis cinerea, Aspergillus niger, Fusarium sp

Nấm Trichoderma cho hiệu quả ức chế nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh héo

rũ gốc mốc trắng ở lạc và nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn trên ngô

tương ứng đạt hơn 90% và 42,2-45,3% (thí nghiệm ô nhỏ) Trong vụ đông,

nấm Trichoderma làm giảm 51,3-59,8 % cây ngô bị khô vằn (thí nghiệm ô

ruộng) [2]

Hiện nay, việc phân loại nấm Trichoderma vẫn chưa được thống nhất Theo Esposito và Silva (1998), Trichoderma thuộc lớp Ascomycetes, họ

Hypocreaceae và gồm 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum,

Satunisporum, Pachybarium và Hypocreanum Theo Samuels (2004), nấm Trichoderma thuộc lớp Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae

Theo Agrios (2001) thì nấm Trichoderma thuộc ngành phụ 4 Deuteromycota,

lớp Hyphomycotes, bộ Hyphales (Moniliales) [14] Cho đến nay có ít nhất 33

loài Trichoderma đã được tìm thấy

1.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Trichoderma

Trichoderma là một loại nấm đất, chúng phát triển tốt trên các loại đất giàu

dinh dưỡng hoặc trên tàn dư thực vật Do đó, Trichoderma có khả năng sử

dụng hỗn hợp carbon và nitrogen làm nguồn dinh dưỡng Nguồn carbon và

năng lượng Trichoderma sử dụng được là đường đơn và đường đa, cùng với

hỗn hợp polysaccharide, amino acid… Đặc biệt acid béo, methanol methylamine và NH3 là nguồn đạm bắt buộc phải có trong môi trường nuôi

cấy Trichoderma Muối, các nguồn sulfur và các hỗn hợp vitamin cũng có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma Tuy nhiên, muối

sodium chloride làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một số loài

Trichoderma Do vậy, trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma

không được có mặt của loại muối này [9]

Hầu hết các loài Trichoderma phát triển mạnh ở nhiệt độ 24-280C, một số

loài phát triển tốt ở 350

C, thậm chí ở 400C [11]

Theo Nguyễn Đăng Diệp và cộng sự (2004), nhiệt độ ảnh hưởng đến lên

men sinh khối của Trichoderma, nhiệt độ thích hợp là 28-340C, tối ưu là

30-320C pH thích hợp để nấm Trichoderma phát triển là 5-6, khi pH > 6 sinh

trưởng của nấm sẽ yếu dần, pH < 4 sinh trưởng của nấm rất yếu [9]

1.2.3 Khả năng kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng và cơ chế tác động của nấm đối kháng Trichoderma spp

1.2.3.1 Hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma spp đối với nấm gây bệnh cây trồng

Nhóm nấm Trichoderma là một trong những nhóm nấm có khả năng đối

kháng với các vi sinh vật khác thông qua việc tiết ra các chất kháng sinh, men rượu, các chất có hoạt tính sinh học cao tạo khả năng ức chế các nấm hại phát

sinh từ đất như Sclerotium, Phytophthora, Fusarium, Pythium, Rhizoctonia

gây bệnh trên các loại cây họ đậu, cây ăn trái, cây hòa thảo, cây công nghiệp

và cây hoa cảnh [2]

Với nguồn tài liệu chưa đầy đủ, Trần Thị Thuần (1996) đã thống kê được khoảng 150 loài vi sinh vật (chủ yếu là nấm) gây bệnh trên gần 40 loại cây

trồng đã được nghiên cứu phòng trừ bằng nấm Trichoderma Các nghiên cứu

này được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính, nhà lưới và

ngoài đồng ruộng [13]

Nhiều nghiên cứu trên đồng ruộng đã cho thấy hiệu quả trừ bệnh của nấm

Trichoderma Ở Nam Mỹ, nấm T harzianum có hiệu quả cao trong phòng trừ

các loài nấm Pythium spp., R solani gây bệnh chết héo đậu đỗ và củ cải (Chet

và cs, 1981) Hiệu quả ức chế bệnh do R solani gây trên khoai tây của nấm T

harziamun đạt tới 89% tại Ấn Độ (Singh và cộng sự, 1995) Nấm T viride

làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh thán thư (do C truncatum gây ra) trên cây đậu đũa ở Nigeria (Bankole và cộng sự, 1996) Cũng tại Ấn Độ, nấm T viride có thể ức chế sự phát triển của bệnh do R solani gây ra trên khoai tây, hiệu quả

ức chế đạt tối đa là 83,4% (Singh và cộng sự, 1995) [13]

Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thiên Trang (2004) [6]

cho thấy các loài T harzianum, T minutisporum, T koningii, T viride và T

asperellum phân lập tại một số điểm điều tra của tỉnh Đak Lak đều có tính đối

kháng với nấm bệnh hại cây như Fusarium solani, Fusarium sp1, Fusarium sp2, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia sp1, Rhizoctonia sp2 Trong đó có T

harzianum là loài có khả năng đối kháng mạnh nhất đối với một số loài nấm

bệnh

Đỗ Tấn Dũng (2006) tiến hành khảo sát hiệu lực đối kháng của nấm T viride

với bệnh héo rũ gốc mốc trắng hại đậu tương và cây lạc trong điều kiện thí

nghiệmnhận thấy nấm T viride có thể sử dụng để phòng trừ bệnh héo rũ gốc

mốc trắng hại cây trồng cạn, hiệu quả phòng trừ bệnh rất cao, đạt tới 86,5% (trên cây lạc) và 94,4% (trên cây đậu tương) [3]

Ngoài ra nấm Trichoderma còn có khả năng phòng trừ một số bệnh như T

harzianum trừ bệnh mốc xám (Botrytis cinera), bệnh gỉ sắt (Puccinia arachidis), bệnh thối hạch (Sclerotinia sclerotiorum) và bệnh đốm vòng

(Aternaria solani); T viride phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc đen (A niger), bệnh thối đọt mía (Ceratocystis paradoxa) và bệnh héo cây mía (F

moniliforme) Bên cạnh đó, nấm T viride còn có tác dụng trong khống chế

sinh họcvới một số loại tuyến trùng như Meloidogyne và Heterodera Nấm T

viride có khả năng hạn chế tuyến trùng trong tự nhiên với cơ chế cạnh tranh

thức ăn và vị trí nơi chúng sinh sống [2]

Tóm lại, những kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhà lưới, nhà

kính và ở ngoài đồng ruộng về hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đã

cho thấy nhóm nấm Trichoderma rất có triển vọng trong phòng trừ nhiều loại

bệnh hại cây trồng

1.2.3.2 Cơ chế tác động của nấm Trichoderma spp lên các tác nhân gây bệnh cây trồng

Sự đối kháng của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng thông qua

nhiều cơ chế Cơ chế thường xuyên nhất được đề xuất bao gồm khả năng ký sinh, các sản phẩm kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào, cạnh tranh

dinh dưỡng và không gian [47], [54]

Weidling (1932) là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm trao đổi của

Trichoderma Khi dùng Trichoderma chống R solani, Weidling và Emerson

(1946) đã phân lập được chất kết tinh từ chất trao đổi hữu cơ rất độc khi pha loãng nhiều lần, chất này có tên là gliotoxin Chất độc thứ hai do Brian và Mc

Growan (1944) công bố là viridin thu nhận từ T viride Tùy thuộc vào loài nấm mà tạo ra các loại kháng sinh và enzyme khác nhau Nấm T viride sinh

ra các kháng sinh như viridin, trichodermin, xosukacylin, almatecin hoặc các vitamin, cacbohydrate, nitrogen nhờ vậy làm đất tốt Ngoài các kháng sinh,

nhiều nghiên cứu cho thấy Trichoderma còn có khả năng sinh ra các enzyme

phân hủy thành tế bào nấm gây bệnh như chitinase [18], [22], [38],

β-1,3-glucanase [50], protease [27], [34], mannase và hydrolase [45], [58]

Theo Nguyễn Đức Lượng và cs (2003), Trichoderma có thể đối kháng với

nhiều loại vi sinh vật nhờ nhiều cơ chế khác nhau như cạnh tranh dinh dưỡng

và không gian, ký sinh hoặc quấn lấy sợi nấm gây bệnh, tạo ra kháng sinh hay tiết ra các enzyme hoặc quấn lấy sợi nấm gây bệnh tạo chitinase, β-1,3-glucanase Nhóm nghiên cứu đã chứng minh được rằng các chitinase và

cellulase của nấm T harzianum có tác động phân hủy thành sợi nấm

Sclerotium rolfsii, sợi nấm nhăn nheo, đứt rạn và biến dạng Theo các tác giả,

ngoài khả năng kiểm soát mầm bệnh thực vật Trichoderma còn có khả năng

cải tạo đất trồng làm tăng độ phì nhiêu cho đất nhờ khả năng phân giải một số phân lân khó hòa tan do nhiều enzyme phân hủy ngoại bào như cellulase Dưới tác động của các enzyme, chất dinh dưỡng dưới dạng dễ hấp thu cho cây trồng, tạo điều kiện cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt [31]

1.3 TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP

1.3.1 Giới thiệu chung

Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ sự phát triển các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trình sinh học ở mức độ phân tử Từ đó cho phép phân lập, phân tích và thao tác trên các gen theo nhiều phương thức khác nhau, giúp hiểu biết sâu sắc các lĩnh vực mới của sinh học như công nghệ sinh học, bào chế các loại thuốc mới, y học phân tử và liệu pháp gen [8]

Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ gen hay kỹ thuật gen…) là tập hợp các kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn DNA Thuật ngữ tái tổ hợp được dùng thường xuyên do mục tiêu của nó là kết hợp DNA từ hai nguồn xa nhau Ví dụ: các gen từ hai nguồn vi khuẩn khác nhau có thể được liên kết lại, hoặc một gen người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn [7]

Mục đích việc tạo dòng và biểu hiện các gen là nhằm tạo ra các sản phẩm đúng như trong cơ thể với số lượng lớn và có giá trị thương mại Sự biểu hiện của các gen trong tế bào vi khuẩn nhiều khi gặp trở ngại, do đó cần phải thiết

kế các vector biểu hiện thích hợp cho phép gen ngoại lai biểu hiện ở mức độ

cao [49]

Ở Việt Nam, gần đây cũng có một số thành tựu nổi bật nghiên cứu về gen như Nguyễn Quỳnh Anh và cs (2003) đã thành công trong việc tạo dòng và

biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP19 của virus WSSV gây hội chứng đốm trắng ở tôm sú tại Việt Nam, góp phần trong việc giám sát, phòng ngừa dịch bệnh do WSSV gây ra [1] Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã biểu hiện

thành công gen protease trung tính (nprC10) của chủng B subtilis C10 trong

E coli BL21 (DE3) sử dụng vector biểu hiện pET200/D-TOPO [49]

1.3.2 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất enzyme

Công nghệ DNA tái tổ hợp hiện nay có rất nhiều ứng dụng trong đời sống các ứng dụng này bao gồm sản xuất dược phẩm, các loại hóa chất khác và các cây trồng nông nghiệp quan trọng…[7], trong đó có ứng dụng để sản xuất enzyme tái tổ hợp như glucose oxidase [53], endochitinase [16], [56]

Vào những năm 1990, nhiều enzyme đã được sản xuất bởi công nghệ DNA tái tổ hợp Năm 1993, hơn 50% thị trường enzyme công nghiệp được cung cấp bởi các quá trình tái tổ hợp [37], với doanh thu đạt 140 triệu USD

[65] Phytase thực vật sản xuất bởi A niger tái tổ hợp được sử dụng như một

loại thức ăn cho khoảng 50% tổng số lợn ở Hà Lan Nhờ công nghệ DNA tái

tổ hợp mà việc sản xuất phytase ở A niger đã tăng 1000 lần so với phương

pháp sản xuất truyền thống [33] Hơn 60% các loại enzyme được sử dụng trong các ngành công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm và tinh bột là các sản phẩm tái tổ hợp [24]

Năm 2002, có khoảng 140 protein được dùng để chữa bệnh có nguồn gốc

từ các quá trình tạo dòng và biểu hiện gen được thừa nhận ở Mỹ và châu Âu, trong đó chủ yếu là các enzyme [17] Protein không glycosyl hóa thường

được sản xuất bởi E coli và nấm men, chúng góp phần tạo ra 40% protein trị

liệu trên thị trường Protein glycosyl hóa được tổng hợp trong tế bào động vật

có vú Vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và các tế bào côn trùng nói chung không

có khả năng glycosyl hóa như tế bào động vật có vú Tuy nhiên, hiện nay

nhiều chủng đã được biến đổi di truyền để sản xuất các protein được glycosyl hóa như ở người [26]

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE TÁI TỔ HỢP

Từ lâu, gen chitinase của nhiều đối tượng sinh vật khác nhau như thực vật,

vi sinh vật, nấm… đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Việc tạo dòng và biểu hiện gen này trong một đối tượng khác nhằm khai thác tối đa hiệu suất của gen chitinase đã được nghĩ tới từ lâu Các vật chủ thường được các nhà nghiên cứu chọn để biểu hiện gen này là các vi sinh vật có khả năng

sinh trưởng và phát triển nhanh như E coli, nấm men (Saccharomyces,

Pichia) [30], [64], [56]

Ping và cs (2008) đã tạo dòng, phân tích trình tự và biểu hiện gen

endochitinase của Trichoderma sp vào E coli BL21, DNA và cDNA của gen

này sau khi phân tích trình tự có kích thước tương ứng là 1.476 và 1.275 bp,

trình tự cDNA sau đó được tạo dòng vào vector pET-28a+ và chuyển vào E

coli BL21 Sau đó dòng E coli mang vector pET biến nạp được phân lập,

nuôi 300C để cảm ứng sinh enzyme Băng enzyme được phát hiện bằng điện

di SDS-PAGE và phân tích hoạt tính đạt 70,2 U/mg protein Quá trình tối ưu

sự biểu hiện của enzyme này cho thấy enzyme này hoạt động tốt ở pH 7 và nhiệt độ 350

C, sự có mặt của các ion Mg2+, Fe2+ làm tăng khả năng hoạt động của enzyme này [56]

Một nghiên cứu khác của Shimosaka và cs (2001) đã tạo dòng và biểu hiện

2 gen chiA và chiB mã hóa cho 2 enzyme chitinase A và B (ChiA và ChiB) được phân lập từ vi khuẩn Burkholderia gladioli CHB101 vào E coli, 2

enzyme này có độ dài tương ứng là 343 và 307 amino acid và thuộc 2 họ 18

và 19 của nhóm enzyme thủy phân (glycosyl hydrolases) [61] Một gen

chitinase dài 1.047 bp đã được phân lập từ hệ gen của Beauveria bassiana

BCC3653 bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi có trình tự cắt hạn chế của 2

enzyme 5’-EcoRI và 3’-HindIII Sản phẩm PCR sau đó được tạo dòng và biểu hiện bằng vector pSE420, plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào chủng E coli

TOP10 và sử dụng IPTG để cảm ứng cho quá trình biểu hiện Enzyme tái tổ hợp sau đó được phân tích hoạt tính bằng phương pháp phân giải glycol chitin [64] Ngoài các nghiên cứu đơn lẻ về chitinase tái tổ hợp thì một số nước quan tâm nhiều đến vấn đề nông nghiệp có các chương trình riêng cho việc nghiên cứu về enzyme này Như ở Ai Cập, chính phủ đã giao cho nhóm Hamshary và

cs (2008 ) đã chủ trì chương trình sàng lọc gen chitinase từ các đối tượng như

B thuringiensistenebrionis (tt4); B thuringiensisisrae-lensis (NRRL

HD-522); B thuringiensis Berliner ACCC 10061…Người ta đã sàng lọc được gen

này từ 66 mẫu phân lập, kết quả cho thấy trình tự gen phân lập được giống

96% so với chủng B thuringiensis Hakam (mã số: ABK86590) và được đăng

ký trên GenBank với mã số EU734811 [30]

Bên cạnh việc phân lập gen chitinase từ những vi sinh vật có trong đất hoặc trong các giá thể ở trên cạn, Các nhà nghiên cứu ở Nhật Bản đã phân lập gen này từ môi trường nước Shimosaka và cs (2006) đã phân lập gen

chitinase từ chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila SUWA-9 trong nước hồ

Lake Suwa (Nagano Prefecture, Nhật Bản) Kết quả cho thấy gen này thuộc

nhóm endochitinase (chiA), có trình tự mã hóa 865 amino acid và có khối

lượng phân tử là 91,6 kDa thuộc họ 18 của nhóm glycosyl hydrolases,

enzyme này được biểu hiện trong E coli BL21 (DE3), Shimosaka và cs

(2006) không phân tích trình tự gen mã hóa cho protein mà trực tiếp phân tích trình tự amino acid và so sánh với cơ sở dữ liệu protein Kết quả cho thấy nó

giống 98% so với chủng A caviae CB101 CHI1 (mã số AJ534329) và A

hydrophila JP101 CHI92, giống 75% so với chủng Enterobacter sp CHIA

(U35121)… tất cả đều thuộc họ 18 của nhóm glycosyl hydrolases [72]

Alias và cs (2009) biểu hiện và phân tích tính chất của một endochitinase

được phân lập từ Trichoderma virens UKM-1 trong E coli BL21 (DE3), gen

này dài 1.690 bp mã hóa cho protein có 430 amino acid có khối lượng 42 kDa Phân tích sự biểu hiện của enzyme này người ta thấy enzyme này hoạt động tốt nhất ở pH 6.0 và nhiệt độ 500C, enzyme này bền khi bảo quản trong phạm vi pH 3.0 đến 6.0 và nhiệt độ 30 đến 600

C, ion Mg2+ và Ca2+ làm tăng

sự hoạt động của enzyme lên thêm 20% so với bình thường [16]

Một nghiên cứu khác tạo dòng và biểu hiện gen chitinase từ vi khuẩn sống trong môi trường nước, nhưng ở công trình này Tsujibo và cs (1993) đã phân lập gen từ vi sinh vật sống ở môi trường biển, gen chitinase của chủng

Alterromonas sp mã số 0-7 đã được tạo dòng trong E coli JM109 sử dụng

vector pUC18, ở nghiên cứu này enzyme không tiết trực tiếp ra môi trường nuôi cấy mà tiết vào chu chất Đoạn gen mã hóa cho enzyme tái tổ hợp dài

3.394 bp nằm giữa 2 enzyme cắt hạn chế SphI và HindIII, trình tự chỉ giống 33,4% so với chitinase A và 15,3% so với chitinase B của loài Seratia

marcescens [66] Mã hóa cho protein dài 820 amino acid và có khối lượng

phân tử 87 kDa Chitinase tái tổ hợp này có tính chất tương tự chitinase của

chủng Alterromonas sp mã số 0-7

Trong nông nghiệp, nấm bệnh hại cây là một vấn đề rất được quan tâm vì

nó ảnh hưởng đến cuộc sống của người dân cũng như an ninh lương thực của quốc gia đó Vấn đề sử dụng thuốc hóa học để trừ nấm bệnh đã và đang bị phản đối do nó ảnh hưởng đến môi trường sống và con người (theo FAO, 2004) Vậy nên, việc nghiên cứu các sinh vật đối kháng với nấm bệnh hiện nay được quan tâm nhiều hơn trước Lin và cs (2004) đã phân lập được gen

chitinase của Bacillus thuringiensis có tính đối kháng cao với côn trùng gân hại và tạo dòng vào E coli [48] Một nghiên cứu khác của Corona và cs (2003) đã biểu hiện được gen Chitinase chiA74 của cùng đối tượng như trên,

vật chủ được sử dụng là E coli DH5αF’ Enzyme tái tổ hợp có kích thước 676

amino acid và khối lượng là 74 kDa, trình tự amino acid này tương đồng 98%

với trình tự CHIB của Bacillus cereus, và 70% với trình tự CHIA71 của

Bacillus thuringiensis serovar Pakistani [23]

Chitinase sinh bởi Bacillus subtilis CHU26 được phân lập từ cánh đồng

khoai tây ở Đài Loan Chủng này thể hiện hoạt tính chitinase ngoại bào mạnh trên đĩa agar có bổ sung cơ chất chitin, cho thấy hoạt tính đối kháng với

nguồn bệnh thực vật Rhizoctonia solani Gen mã hóa cho chitinase (chi18) được tạo dòng từ thư viện hệ gen của B subtilis CHU26 Gen chi18 bao gồm

khung đọc mở gồm 1.791 bp và mã hóa cho 595 amino acid với khối lượng phân tử 64 kDa, gần vùng promoter chứa 1 trình tự lặp trực tiếp gồm 9 bp

(ATTGATGAA) Trình tự amino acid của chitinase từ B subtilis CHU26 cho thấy sự tương đồng là 62% so với B circulans WL-12 và 81% so với B

Licheniformis Gen chi18 được chuyển vào vector pGEM3Z và pYEP352 để

hình thành plasmid tái tổ hợp pGCHI18 và pYCHI18 Hoạt tính chitinase có

thể được quan sát trên đĩa thạch có bổ sung chitin đối với các thể E coli có mang plasmid tái tổ hợp Dịch nuôi cấy vô tế bào của E coli chuyển gen có mang pYCHI18 làm giảm hoạt tính gây bệnh củ R solani hơn 90% trong kiểm tra đối kháng trên các cây củ cải (Raphanus sativus Linn.) [74]

Plasmid pUC19 mang gen mã hóa cho họ gen chitinase 19 của

Streptomyces sp J-13-3 được chuyển vào tế bào E coli JM109 Chitinase tái

tổ hợp được tinh sạch từ dịch chiết tế bào nhờ sắc kí cột trên Sepharose, CM- Sepharose, Bio-Gel P-100 Dịch cuối cùng được điện di trên gel polyacrylamide Khối lượng phân tử của enzyme tinh sạch là 32 kDa Chitinase tái tổ hợp có khả năng thủy phân N-acetylglucosamine Sự sinh trưởng của nấm (200 µl dịch nuôi cấy) được xác định bởi độ hấp thụ quang ở

DEAE-bước sóng 595 nm cho thấy rằng chitinase (10 µg) ức chế hoàn toàn và phân

nữa sự sinh trưởng của T reesei và A niger [75]

Gen mã hóa chitinase từ Aeromonas sp mã số 10S-24 được tạo dòng trong

E coli DH5a sử dụng pUC19 Khung đọc mở pCA8 gồm 1.482 bp mã hóa

cho 494 amino acid có khối lượng phân tử là 51 kDa Trình tự gen pCA8 tương

đồng 30% với chitinase II của Aeromonas sp mã số 10S-24 và tương đồng 29% với chitinase của Saccharopolyspora erythraea [67]

1.5 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN TRONG E coli

Theo Baneyx (1999), E coli là một trong những vật chủ được sử dụng rộng rãi để biểu hiện các sản phẩm protein ngoại lai từ các sinh vật khác [17] Hiện nay việc tạo dòng và biểu hiện gen trong E coli được rất nhiều nhà khoa

học trên thế giới thực hiện, Guang và cs (2004) đã tạo dòng gen B7-H3 vào

vector pGEX-5X-3 và biến nạp vào E coli để nghiên cứu chức năng sinh học

của protein B7-H3 trong việc hoạt hóa tế bào lympho T [28] Human defensin-4 (hBD4) là một protein có tác dụng chống nhiễm khuẩn ở người, Zhinan và cs (2006) đã thành công trong việc tạo dòng và biểu hiện gene này

beta-vào E coli, sử dụng vector biểu hiện pET32-smhBD4, phân tích sự biểu hiện

của gen hBD4 thành protein hBD4 đạt 1,9 g/l và protein này đạt 2,68 g/l khi

nuôi E coli mang vector pET32-smhBD4 trong môi trường MBL ở 340C, cảm ứng IPTG nồng độ 0,4 mM và thu sinh khối phân tích sau 6h nuôi cấy

[76] Jinshu và cs (2006) đưa được gen mã hóa GnRH vào hệ thống biểu hiện

dựa trên T7 RNA polymerase trong vector pED-GnRH3, GnRH là hormone điều hòa quá trình tiết hormone kích thích nang trứng (FSH) và hormone kích

thích thể vàng (LH), do vậy việc biểu hiện được gen mã hóa GnRH trong E

coli có ý nghĩa rất lớn trong việc điều trị bệnh liên quan đến hormone này [41]

Protein hALR tái tổ hợp đã biểu hiện thành công trong hệ thống biểu hiện

pET28a(+) của E coli BL21, vector pET28a (+)/hALR mang đoạn cDNA đầy

đủ của hALR được khuếch đại bằng phương pháp RT-PCR và chứa trình tự

mã hóa cho đuôi His, quá trình tiết hALR được cảm ứng bằng IPTG 2h ở

370C [39] Đoạn gen mã hóa cho enzyme catalase được Yang và cs (2003)

phân lập từ Helicobacter pylori bằng PCR sau đó tạo dòng vào vector 22b (+) và được biểu hiện trong E coli BL21 (DE3), kết quả cho thấy enzyme

pET-catalase tái tổ hợp chiếm 24,4% hàm lượng protein tổng số sau khi cảm ứng bằng IPTG trong 3 giờ ở 370

C Như vậy, enzyme này đã có hoạt tính cao khi

biểu hiện trong E coli [73]

Trình tự cDNA mã hóa cho quinone reductase của chuột bị viêm gan được

phân lập, tạo dòng trong vector pKK 233.2 và biến nạp vào chủng E coli

JM109 Sau đó, enzyme này được Shiuan và cs phân tích trình tự amino acid, kết quả cho thấy đây là một protein dài 273 amino acid, nó có trình tự tương đồng với protein có chức năng tương tự ở người [62]

Ở một hướng nghiên cứu khác, trình tự RNA đối mã của rpoS với tác dụng

ức chế sự biểu hiện của gen rpoS đã được Guozhu và cs (2003) tạo dòng

thành công Kết quả này đã chứng minh rằng việc sử dụng một trình tự làm ức chế sự biểu hiện của gen là hiệu quả, mở ra một hướng mới trong việc tạo ra các tác nhân kháng khuẩn hiệu quả [29] Wu và cs (2008) cũng chỉ ra rằng việc sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong nghiên cứu các tác nhân để

kháng bệnh là rất có triển vọng Gen tương đồng thanatin (th1) mã hóa đoạn peptide dài 20 amino acid được biến nạp vào E coli nhờ vector pET32a-TH1

đã biểu hiện protein với hàm lượng 0,416 g/L, đem đến một triển vọng lớn trong việc điều trị bệnh bằng sản phẩm của công nghệ DNA [68]

Protein porcine zona pellucida 3β (pZP30 β) được tạo dòng và biểu hiện

vào E coli BL21 (DE3) pLysS sử dụng vector pET-3c Protein tái tổ hợp

được phát hiện bằng phương pháp Western blot, sau khi phân tích hoạt tính

cho thấy nó chiếm 10% protein tổng số [70] Gen gdhA mã hóa cho hexaneric glutamate dehydrogenase (GDH) của Pyrococcus furiosus được tạo dòng bằng vector pET11-d và biểu hiện vào E coli Ở hệ thống này enzyme này

biểu hiện với lượng chiếm 15% so với protein tổng số [42]

Toxoplasmosis là bệnh gây ra bởi loài kí sinh trùng Toxoplasma gondii,

còn biết đến như là hiện tượng nhiễm một loại giun sán ở người nói riêng và các động vật máu nóng nói chung Bệnh này ảnh hưởng đến sức khỏe của con

người và nhất là đối với thai nhi GRA2 của Toxoplasma gondii gây đáp ứng

miễn dịch ở người và chuột làm tăng lượng kháng thể sản sinh ra để chống lại

sự phát triển của loài kí sinh trùng này Majid Golkar và cs (2004) đã nghiên

cứu tạo ra được protein GRA2 tái tổ hợp trong chủng E coli BL21 pLysS

Sau khi phân tích sự biểu hiện của protein này bằng Western blot và xem khả

năng gây đáp ứng miễn dịch ở chuột bằng thử nghiệm in vivo trên chuột, kết

quả cho thấy lượng kháng thể thuộc loại IgG2a và IgG1 đều tăng lên, có tác dụng chống lại sự có mặt của TRX-GRA2 [52]

1.6 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN TRONG NẤM MEN

Trong việc tạo dòng và biểu hiện gen vào một đối tượng khác thì vật chủ

là một yếu tố quyết định đến sự thành công cũng như hiệu suất của quá trình

Bên cạnh những ưu điểm của E coli như vòng đời ngắn, khả năng sinh trưởng

và phát triển mạnh, nó cũng có nhược điểm như không có quá trình hậu dịch

mã Từ đó, việc biểu hiện các gen được phân lập từ sinh vật nhân chuẩn sẽ gặp nhiều khó khăn Để khắc phục nhược điểm này người ta đã chọn những vật chủ khác có nguồn gốc là sinh vật nhân chuẩn làm vật chủ biểu hiện như

nấm men S cerevisiae hay Pichia pastoris [43]

Một nghiên cứu của Rashed và cs (2010) đã biểu hiện endochitinase, cht2 của Trichoderma virens UKM1 và nấm men Pichia pastoris, gen cht2 và trình

tự cDNA của nó được tạo dòng và giải trình tự, kết quả có thể gen cht2 dài

1169 bp, mã hóa cho protein dài 321 amino acid, sau đó trình tự cDNA được

tạo dòng vào vector biểu hiện pPICZαC và biến nạp vào nấm men P pastoris

X33 sử dụng promoter cảm ứng methanol, protein tái tổ hợp được sản xuất ra

có khối lượng phân tử 35 kDa khi cảm ứng 0,5% methanol Để phân tích xem enzyme tái tổ hợp có chức năng sinh học hay không, Rashed đã thử hoạt tính phân giải colloidal chitin của enzym này, kết quả cho thấy hoạt độ riêng của enzyme đạt 1,34 U/mg, enzyme hoạt động tốt nhất ở pH 6.0 và nhiệt độ 350

S cerevisiae Tám trong số các gen taxoid này được biểu hiện chức năng

trong nấm men từ các vector episome chứa 1 hoặc nhiều cassett liên kết chặt chẽ với với các đuôi epitope khác nhau cho phép giám sát và phân biệt protein của những enzyme có cùng kích thước Cả tám loại protein tái tổ hợp được phát hiện bằng kĩ thuật immunoblotting sử dụng những kháng thể đơn dòng đặc hiệu và mỗi protein biểu hiện được xác định có chức năng bằng phân tích

enzyme in vitro, hoạt độ có sự khác nhau đáng kể giữa các loại enzyme Các

bước phân tích chỉ ra rằng, những tiền chất isoprenoid từ nấm men có thể được sử dụng trong con đường cấu thành lại bởi vì các sản phẩm tích lũy từ 2