tạo dòng và biểu hiện enzymelipase từ bacillus subtilis trong tế bào chủ escherichia coli

Bộ giáo dục và đào tạo Trường Đại Học Mở Tp.HCMKhoa công nghệ sinh họcChủ đê Tạo dòng và biểu hiện enzyme Lipase từ Bacillus subtilis trong tế bào chủ Escherichia coli... • Ứng dụn

Bộ giáo dục và đào tạo Trường Đại Học Mở Tp.HCMKhoa công nghệ sinh học

Chủ đê

Tạo dòng và biểu hiện enzyme

Lipase từ Bacillus subtilis trong tế

bào chủ Escherichia coli

ĐẶT VẤN ĐÊ

Enzyme Lipase được ứng dụng rộng rãi

trong tất cả các ngành công nghiệp: chế

biến thực phẩm, dược phẩm, hóa dầu

Enzyme Lipase được tìm thấy ở một số

loài thực vật, động vật, đặc biệt hiện diện ở

nhiều loài vi sinh vật (Candida Sp,

Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis…)

Giới thiệu về enzyme Lipase

• Lipase: có trọng lượng phân tử từ 19-20 kDa,

hoạt động thủy phân liên kết ester carboxyl của acylglycerols để giải phóng các axit béo và

glycerol

• Phản ứng thủy phân triacylglycerol

• Sự hoạt động của lipase phụ thuộc vào pH

• Lipase không cần cofactor nhưng các cation

hóa trị 2 như Ca 2+ thì kích thích lipase hoạt động Lipase bị ức chế mạnh bởi CO 2+ , Ni 2+ ,

Hg 2+ và Sn 2+ và bị ức chế yếu bởi Zn 2+ , Mg 2+ , EDTA và SDS.

• Hoạt động tối ưu của lipase khoảng 30-35 0 C

• Ứng dụng của lipase:

- Công nghệ chế biến thực phẩm: tăng hương vị

trong sản phẩm sữa và các loại thực phẩm khác như thịt, rau, trái cây, sản phẩm sữa và bia.

- Công nghiệp chất béo và dầu.

- Trong dược phẩm, sản xuất dầu sinh học, sản

xuất vật liệu sinh học, công nghiệp chất tẩy rửa, tổng hợp hữu cơ, công nghiệp giấy và bột

giấy, sản xuất hóa chất nông nghiệp, và trong

quản lí môi trường…

Lipase được tìm thấy nhiều trong tự nhiên,

nhưng lipase từ vi khuẩn thì có ý nghĩa thương mại hơn vì giảm chi phí sản xuất, ổn định cao,

sẵn có hơn lipase thực vật và động vật

Aspergillus oryzae : Tổng hợp acid béo.

Aspergillus sp: Tổng hợp hương vị.

Bacillus subtilis: Sản xuất bánh mì.

Candida rugosa: Tổng hợp hương vị.

•Kĩ thuật tạo dòng:

Hệ thống tế bào chủ E.coli

BÀI BÁO 1Nôôi dung nghiên cứu:

- Phân lâôp các chủng vi khuẩn có trong các

mẫu đất ở vùng quanh sông Zayande-rood của Isfahan, Iran

- Xác định đăôc điểm các chủng dự tuyển:

- Hoạt tính thủy phân lipid: nuôi trên môi

trường có egg-yolk, tạo vòng tan xung quanh khuẩn lạc

- Nhuôôm Gram, thử các phản ứng sinh

hóa

• Phương pháp PCR nhằm khuếch đại vùng

gene mã hóa cho lipase: sử dụng 2 cặp mồi

Mồi xuôi L1 - mồi ngược L2 Mồi xuôi LG1 - mồi ngược LG2

• Biến nạp vào tế bào E.coli

• Phân tích trình tự

• Kết quả

Bảng 1: Tóm tắt kết quả xét nghiệm sinh hóa:

Số mẫu Maltose Citrate Proskauer Voges- Nitrate Lecithinase Catalase

• Các sản phẩm khuếch đại dùng mồi L1 và

L2 có chiều dài 371 bp

• Kết quả: biểu hiện tối đa tương ứng với

nhóm I.4 của enzyme lipase của bacillus

với giá trị tin cậy nhất cho lipase từ chủng B.subtilis.

• PCR lần 2 :sản phẩm với kích thước tương

ứng khoảng 600-700bp

• Các sản phẩm khuếch đại PCR thứ 2 được

tinh sạch từ gel và nối vào vector tạo dòng Các vector tái tổ hợp là pTZGHlip và có

đoạn mồi promoter T7

Hình 2 Trình tự Nucleotide của GHlip lipase (số nhập liệu FJ481899).

BIỆN LUẬN

• Nuôi cấy thành công các chủng vi khuẩn đã

phân lập được; tạo ra các khuẩn lạc đơn và khảo sát được khả năng phân giải lipid.

• Các chủng vi khuẩn phân lập có đặc điểm:

Gram(+), nội bào tử, hình que như đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus.

• Trình tự aa được so sánh với trình tự protein

trên NCBI cho thấy: 98% giống với lipase của các chủng B subtilis, 68% giống với

esterase của B subtilis.

• GHlip được xem là dạng biến thể từ lipase

của B.subtilis

- Gen LipA được tách ra từ pBRLipA chèn vào

Ye [pACT1-T] tạo plasmid tái tổ hợp

YE[pACT1-LipA-T], sau đó biến nạp vào E

coli 5K và S cerevisiae

- Các gen LipA chèn vào pRB473

[pSPO2-T]-SmaI, tạo plasmid tái tổ hợp pRB473 [pSPO2-Lipa-T] và biến nạp vào các chủng B Subtilis khác.

Kết quả:

b, Thảo luận

Theo kết quả thu được, hoạt tính lipase

lớn hơn 183 lần ở tế bào tái tổ hợp E Coli 5K/pBRLipA so với chủng gốc B subtilis MB216.

 Sự gia tăng hoạt tính lipase trong tế bào tái tổ hợp E coli 5K/pBRLipA là do có một số lượng lớn bản sao của gen mã hóa cho lipase được tạo trong tế bào chủ tái tổ hợp.

+ Mồi xuôi PB36 - Mồi ngược PB38

- DNA được tách từ B.pumilis và dầu oliu có trong tự nhiên.

Cặp mồi khuếch đại vùng gene lipase từ

B.pumilis : BPUM1F - BPUM1R

- Cặp mồi khuếch đại vùng gene lipase gen

lipase từ dầu ô liu:

+ Mồi xuôi OPL1- Mồi ngược OPL1R

- Thu nhận trình tự gen mã hóa cho

enzyme lipase từ dầu oliu, chèn gen này vào plasmid Oli-pET26b và cho biến nạp vào tế bào chủ E.coli BL21-SI

• Kết quả:

- Trình tự khuếch đại DNA của B.pumilis không có ORFs  thoái hóa mồi gây khó khăn cho việc thực hiện PCR.

- Đối với gen Oli-lipase, không dễ dàng tạo

dòng vào vector tạo dòng PCR vì có tính độc với tế bào chủ E.coli.

Bài báo Cặp mồi sử dụng

Bài báo 1 - Cặp mồi 1:

Mồi xuôi L1 5'-atggttcacggtattggagg-3' Mồi ngược L2 5'-ctgctgtaaatggatgtgta-3 Cặp mồi 2:

Mồi xuôi LG1 5'-ggaattccatatgaaatttgtaaaaagaagg-3'

Mồi ngược LG2 5'-cgcggatccattaattcgtattctggcc-3'.

Bài báo 2 -Cặp mồi thu nhận gen lipA từ B.subtilis 168

FWBSLA 5'-TCT AGA GGA GGA TAT TAT GAA ATT TG BKBSLA 5'-GCA TGC CAT TAA TTC GTA TTC TGG CC

Bài báo 3 - Cặp mồi thu nhận gen lipase từ B.pumilis

BPUM1F-GAGTCGTATAAGATGAATAAGGGGG AATG

BPUM1R- TTAATTCGTATTTTGTCCTCCGCCGTTC

- Cặp mồi thu nhận gen lipase từ dầu oliu Mồi xuôi OPL1F-GAATTTTTTTAGGAGGACACTAT GAGTG

Mồi ngược OPL1RCCCTGCAGCTTATTTACCCCCA TTATAAGTGGTTTGATTTTAGGCC

KẾT LUÂÂN

• Bài báo 1: Phân lâ Âp các chủng vi khuẩn phân lập từ

đất thuộc giống Bacillus và có đặc điểm giống chính xác với B subtilis, bằng kỹ thuâ Ât PCR thu nhận đoạn gene mã hóa cho lipase, đạt được mục tiêu tạo

protein tái tổ hợp lipase trong tế bào E.coli.

• Bài báo 2: Bằng kĩ thuật PCR thu nhâ Ân gen lipA và tạo

dòng và biểu hiện gen lipA trong nhiều hệ thống tế

bào chủ khác nhau: E.coli, S.cerevisiae, Bacillus

subtilis Hiệu suất sản xuất lipase cao nhất ở hệ thống tế bào chủ E.coli

• Bài báo 3: Gene mã hóa cho enzyme lipase từ các

nguồn sinh vật khác nhau có thể được tạo dòng

nhưng hiệu suất thu hồi còn thấp và có thể gây độc.

– Sử dụng phần mềm để thiết kế cặp mồi.

– Tự thiết kế lại

– Tìm chủng B.subtilis: chủng chuẩn, chủng

trong tự nhiên

Các bước thí nghiê Âm dự kiến

– Tách chiết để thu nhận DNA bộ gen của

B.subtilis, thu nhận vector

– Sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại DNA mục tiêu

– Chuẩn bị enzyme cắt giới hạn, enzyme nối ligase

– Tạo vector tái tổ hợp

– Biến nạp vào tế bào chủ

– Phát hiện dòng tế bào có mang vector tái tổ hợp, biểu hiện gen mục tiêu và kiểm tra

hoạt tính protein tái tổ hợp

Tài liệu tham khảo

1 Phạm Thành Hổ, 2007 Di truyền học Nxb giáo dục.

2 giáo trình Công nghệ gen.ĐH Mở tp.Hồ Chí Minh.

3 http://www.immuneweb.com Recombinant DNA Technology.

4 R Aravindan*, P Anbumathi, T Viruthagiri, Lipase applications in food industry, Indian Journal of Biotechnology Vol 6, April 2007, pp 141-158

5 Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002 Sinh học phân tử Nxb giáo dục.

6 M Rabbani, H MirMohammad Sadeghi, M Ani, K Goodarzvand

Chegini, Z.Etemadifar and F Moazen1, Cloning and nucleotide

sequence of a lipase gene from a soil isolate, Research in

Pharmaceutical Sciences, April 2009; 4(1)[]: 25-32

7 Marta Sánchez, Núria Prim, Francisca Randez-Gil, F I Javier Pastor, Pilar Diaz Engineering of Baker’s Yeasts, E.coli and Bacillus Hosts for the Production of Bacillussu ilis Lipase A 2002 Wiley Periodicals, Inc.

8 Philip J L Bell, Anwar Sunna, Moreland D Gibbs, Natalie C Curach, Helena Nevalainen, Peter L Bergquist Prospecting for novel lipase genes using PCR Microbiology (2002), 148, 2283-2291.

CHÂN THÀNH CẢM ƠN!!!