tách dòng và biểu hiện gen pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh pseudoalteromonas haloplanktis ant505 trong e. coli và nghiên cứu tính chất của chúng

Tuy nhiên, đối với một số ngành công nghiệp như ngành công nghiệp gỗ, bơ sữa, phản ứng với enzyme phải thực hiện ở nhiệt độ thấp chính vì vậy mà việc sử dụng enzyme lạnh đóng vai trò qua

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE TỪ

VI KHUẨN CHỊU LẠNH PSEUDOALTEROMONAS

HALOPLANKTIS ANT/505 TRONG E COLI VÀ

NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA CHÚNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2011

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN PECTINASE TỪ

VI KHUẨN CHỊU LẠNH PSEUDOALTEROMONAS

HALOPLANKTIS ANT/505 TRONG E COLI VÀ

NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA CHÚNG

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ DI TRUYỀN HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Văn Trường

Thái Nguyên, năm 2011

Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn

chân thành và sâu sắc tới TS Lê Văn Trường - phó trưởng phòng Di truyền

vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị cán bộ phòng Di truyền

vi sinh vật đã giúp đỡ, truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Sinh, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này

Tác giả

Đỗ Thị Thu Hằng

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng

sự nghiên cứu phòng Di truyền vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học thực hiện từ tháng 9 năm 2010 tới tháng 8 năm 2011

Thái Nguyên, ngày 24 tháng 09 năm 2011

Tác giả

Đỗ Thị Thu Hằng

MỤC LỤC

Trang Trang bìa phụ

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi khuẩn ưa lạnh 3

1.2 Nơi sống của vi khuẩn ưa lạnh 4

1.3 Enzyme thích ứng lạnh 4

1.4 Ứng dụng của enzyme thích ứng lạnh vào sản xuất công nghiệp 6

1.5 Pectin và pectinase 8

1.5.1 Pectin 8

1.5.2 Pectinase 9

1.5.2.1 Phân loại pectinase 9

1.5.2.2 Sự phân cắt cơ chất pectin bằng pectinase 11

1.6 Ứng dụng pectinase trong công nghiệp 14

1.6.1 Ứng dụng pectinase trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây 14

1.6.2 Ứng dụng pectinase trong công nghiệp dệt may 14

1.6.3 Ứng dụng pectinase trong công nghệ sinh học 14

1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

1.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

2.1 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 17

2.1.1 Chủng vi khuẩn và plasmid 17

2.1.2 Hóa chất, máy móc và thiết bị 17

2.2 Địa điểm nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp tách DNA tổng số của chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 18

2.3.2 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 19

2.3.3 Phương pháp PCR khuếch đại gen 20

2.3.4 Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 21

2.3.5 Phương pháp giải trình tự gen 25

2.3.6 Phương pháp biểu hiện gen 25

2.3.7 Phương pháp thu enzyme ngoại bào, nội bào 25

2.3.8 Phương pháp thử hoạt tính enzyme pectinase 26

2.3.9 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 26

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 29

3.2 Kết quả khuyếch đại gen pelC tách chiết từ chủng vi khuẩn Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505 29

3.3 Kết quả tách dòng gen pelC trong E Coli 30

3.4 Kết quả đọc trình tự gen pelC 31

3.5 Thiết kế vector biểu hiện gen pelC 33

3.5.1 Chuẩn bị vector pET43b và gen biểu hiện pelC 33

3.5.2 Phản ứng gắn đoạn gen pelC vào pET43b và biến nạp vào chủng E coli BL21 34

3.5.3 Kiểm tra hoạt tính pectinase của các thể biến nạp trên môi trường thạch 34

3.5.4 Kiểm tra sự có mặt pelC trong các thể biến nạp BL21/pET43pelC 35

3.6 Biểu hiện enzyme tái tổ hợp PelC (rPelC) trong môi trường lỏng 36

3.7 Nghiên cứu một số tính chất của rPelC 37

3.7.1 Hoạt tính pectate lyase của rPelC 37

3.7.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới hoạt tính của enzyme 38

3.7.3 Ảnh hưởng của ion Ca²+ và Na+ đến hoạt tính pectinase của rPelC 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Ứng dụng công nghiệp các enzyme ở nhiệt độ thấp (Ohgiya, 1999) 7

Bảng 1.2 Phân loại các pectinolytic enzyme (Whitaker, 1990) 10

Bảng 2.1 Chu kỳ phản ứng PCR 20

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 21

Bảng 2.3 Công thức pha gel tách (12%) 27

Bảng 2.4 Công thức pha gel cô (5%) 27

Bảng 3.1 Hoạt tính pectinase của rPelC khi biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau 36

Bảng 3.2 Phát hiện liên kết đôi trong sản phẩm sau phản ứng phân cắt pectin acid của rPelC 38

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Ba nhóm enzyme thích ứng lạnh của VSV 5

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin 9

Hình 1.3 Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases 11

Hình 1.4 Thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase 12

Hình 2.2 Sơ đồ vector tách dòng pJET1.2/blunt 21

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số của chủng Psedoalteromonas haloplanktis ANT/505 29

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pelC 30

Hình 3.3 Hình ảnh khuẩn lạc các thể biến nạp E.coli DH5α trên môi trường chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicilin 31

Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid chứa gen pelC 31

Hình 3.5 Trình tự nucleotide và amino acid của gen pelC 32

Hình 3.6 Kết quả điện di plasmid pET43b sau khi cắt bằng các enzym hạn chế 33

Hình 3.7 Kết quả biến nạp vector biểu hiện pET43/pelC vào tế bào E coli BL21(DE3) 34

Hình 3.8 Kết quả kiểm tra khả năng tạo vòng thủy phân pectin của các thể biến nạp 35

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra sự có mặt của pelC trong các chủng BL21/pET43pelC 35

Hình 3.10 Kết quả biểu hiện rPelC trong E coli BL21(DE3) ở 30o C 37

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme rPelC 39

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme rPelC 39

Hình 3.13 Ảnh hưởng của ion Ca²+ đến hoạt tính enzyme rPelC 40

Hình 3.14 Ảnh hưởng của ion Na+ đến hoạt tính enzyme rPelC 40

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Pectinase là một thuật ngữ chung cho các enzyme có khả năng phân hủy cơ chất pectin, một loại polysaccharide có nhiều trong tế bào thực vật Enzyme pectinase thường được sử dụng trong các quá trình liên quan đến sự biến đổi của nguyên liệu thực vật như đẩy nhanh tiến độ khai thác nước ép trái cây từ trái cây chín và được sử dụng trong sản xuất rượu vang từ những năm 1960 Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều ứng dụng của enzyme pectinase trong các ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp dệt may, đặc biệt thể hiện rõ trong ngành công nghiệp tẩy trắng sợi bông [45]

Tuy nhiên, đối với một số ngành công nghiệp như ngành công nghiệp

gỗ, bơ sữa, phản ứng với enzyme phải thực hiện ở nhiệt độ thấp chính vì vậy

mà việc sử dụng enzyme lạnh đóng vai trò quan trọng giúp nâng cao chất lượng sản phẩm Một trong những enzyme lạnh được các nhà công nghệ quan tâm là pectinase từ các vi sinh vật sinh trưởng ở nhiệt độ thấp do các ưu điểm

C) nên không cần phải tốn năng lượng ủ ấm; bảo vệ được các chất dễ phân hủy trong dịch quả như vitamin, hương vị; dễ biến tính bởi nhiệt độ

Gen mã hóa cho pectinase (pelC) là một trong những gen có nguồn gốc từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505

đã được TS Lê Văn Trường và cộng sự (Viện Công nghệ Sinh học) tạo dòng và giải trình tự trong những nghiên cứu trước đây Tuy nhiên cho đến nay enzyme này vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ tính chất cũng như khả năng xúc tác phân hủy cơ chất pectin Chính vì vậy, để hiểu rõ tính chất của

enzyme này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng và biểu hiện

gen pectinase từ vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 trong E coli và nghiên cứu tính chất của chúng”

Mục tiêu, nội dung nghiên cứu của đề tài

- Biểu hiện được enzyme pectinase PelC tái tổ hợp hoạt động ở nhiệt

độ thấp, phân lập từ chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas

haloplanktis ANT/505 và nghiên cứu được tính chất của pectinase tái tổ hợp

Nội dung nghiên cứu:

1 Tách dòng gen pectinase (pelC) từ chủng vi khuẩn chịu lạnh

Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505

2 Thiết kế vector biểu hiện gen pelC trong E coli

3 Biểu hiện gen pelC trong chủng vi khuẩn E coli BL21

4 Nghiên cứu tính chất của PelC tái tổ hợp

Ý nghĩa của đề tài:

Ý nghĩa khoa học: Làm sáng tỏ tính chất của enzyme pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật chịu lạnh khi tham gia xúc tác phản ứng phân hủy cơ chất pectin

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Thuật ngữ “sinh vật ưa lạnh” được nhắc đến lần đầu tiên năm 1902 bởi

Trong thực tế, không có nguyên do cụ thể nào để giới hạn việc sử dụng thuật ngữ ưa lạnh hay chịu lạnh đối với vi khuẩn hay sinh vật nhân sơ Sinh vật ưa lạnh có thể là nhiều loài nấm, tảo [20], [23], côn trùng [22], cá [12] và có thể cả thực vật, nếu chúng trải qua điều kiện sống ở nhiệt độ thấp, ví dụ ở mức nào đó

phải phân biệt sinh vật ưa lạnh với sinh vật chịu lạnh bởi vì sự khác biệt trong phân bố sinh thái và sự thích nghi sinh hóa của cả hai nhóm [33], [34] Khái niệm được Morita đề xuất như sau: sinh vật ưa lạnh là những vi sinh vật có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ dưới 0oC, và nhiệt độ sinh trưởng tối ưu dưới 15o

C Sinh vật ưa lạnh không có khả năng sinh trưởng ở mức 20oC trở lên Trong khi

C và có thể có giới hạn sinh trưởng trên ở mức 40o

C [27]

Khái niệm cổ điển đó của Morita được sử dụng thường xuyên trong nhiều tài liệu Tuy nhiên, định nghĩa này không được rõ ràng ở ba điểm chính Thứ nhất, mức nhiệt độ giới hạn được lựa chọn khá tùy ý và không tương ứng với sự phân chia rõ ràng của bất kỳ quá trình sinh học hoặc điều kiện môi trường nào Thứ hai, định nghĩa của Morita không thể áp dụng được với hầu hết các sinh vật nhân chuẩn Cuối cùng, VSV giống như các đơn vị nhiệt động:

nhiệt độ nuôi cấy tăng thì tốc độ phản ứng tăng và tốc độ sinh trưởng tăng [13]

Vì những nguyên do đó, các tác giả gần đây bắt đầu sử dụng thuật ngữ chung sinh vật ưa lạnh đối với tất cả các VSV mà sinh trưởng tốt ở mức nhiệt độ quanh điểm đóng băng của nước thay vì sử dụng thuật ngữ vi sinh vật ưa lạnh

và chịu lạnh riêng rẽ [10], [35]

1.2 Nơi sống của vi khuẩn ƣa lạnh

VSV ưa lạnh đã thống trị thành công các môi trường lạnh vĩnh cửu từ biển sâu cho tới vùng núi và vùng cực Hoạt động của vi khuẩn ở nhiệt độ trên rất hạn chế bởi chỉ lượng nhỏ nước không bị đông cứng bên trong tầng đất bị đóng băng vĩnh cửu hoặc lớp băng, và bởi các dòng biển Ở những nơi đó có

được duy trì bởi chênh lệch nồng độ và nhiệt độ Mặc cho các khó khăn đó, sự sống vẫn phát triển mạnh trong những môi trường đó với sự đa dạng sinh học đáng chú ý của chính các vi khuẩn, nấm (đặc biệt là nấm men) và vi tảo Trong

số các vi khuẩn đã được tìm thấy, thường gặp nhất là các vi khuẩn Gram âm α-,

β-, γ-proteobacteria (Pseudomonas spp và Vibrio spp.) và ngành

Cytophaga-Flavobacterium-Bacteriodes Các chủng vi khuẩn Gram dương thường được

phát hiện là vi khuẩn họ Coryne (Arthrobacter sp và Micrococus sp.) [29]

Hầu hết chúng được phân lập dễ dàng từ môi trường lạnh giá tự nhiên và được nuôi cấy với methanogen trong phòng thí nghiệm Chúng được phân lập từ một

hồ ở Nam cực [15], [16], hồ nước ngọt ở Thụy Sỹ [40], lớp trầm tích đại dương

ở Alaska [9] và ở biển Baltic [41], [46]

Để có thể sinh trưởng, các vi sinh vật ưa lạnh phải có các enzyme có hoạt tính sinh học cao trong điều kiện nhiệt độ thấp Những enzyme đó được gọi là enzyme thích ứng lạnh

1.3 Enzyme thích ứng lạnh

Enzyme thích ứng lạnh là những enzyme có hoạt tính sinh học cao ở nhiệt độ thấp Hoạt tính riêng biệt của enzyme thích ứng lạnh ở khoảng nhiệt

độ 0-30oC cao hơn hoạt tính của các enzyme ưa nhiệt trung bình ở cùng nhiệt

độ Các enzyme thích ứng lạnh bị biến tính ở mức nhiệt độ cao hơn [17] Jones và cs đã có báo cáo rằng fructose-1,6-bisphosphate aldolase và gluco-6-

phosphate dehydrogenase của Vibrio marinus sẽ mất 100% hoạt tính sau 30

phút ở 35-36oC [21] Theo Morita, malic dehydregenase bán tinh sạch của

C, trong khi nhiệt độ hoạt động tối ưu là khoảng 15-20oC [27] Hay như lactate

C và mất hoạt tính ở 40o

(A) Nhóm I, (B) Nhóm II (C) Nhóm III Đường gạch đứt: enzyme của VSV

ưa nhiệt trung bình, VSV ưa nhiệt Đường gạch liền: enzyme của VSV ưa

lạnh (Theo Ohgiya và cs, 1999)

1.4 Ứng dụng của enzyme thích ứng lạnh vào sản xuất công nghiệp

Phần lớn các enzyme ứng dụng trong công nghiệp là có nguồn gốc từ VSV Hầu hết các enzyme của vi khuẩn dùng trong công nghiệp được sản sinh bởi các sinh vật ưa nhiệt trung bình Các enzyme sinh vật ưa nóng có vai trò quan trọng trong công nghiệp bởi vì với tính bền nhiệt biến chúng thành chất xúc tác sinh học lý tưởng cho nhiều phản ứng Tuy nhiên, trong một vài trường hợp (ví dụ như công nghiệp gỗ và bơ sữa), phản ứng với enzyme phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp Ứng dụng enzyme thích ứng lạnh sẽ mang lại nhiều lợi ích hơn enzyme từ sinh vật ưa nhiệt trung bình Ứng dụng sinh học của enzyme thích ứng lạnh còn rất nhiều tiềm năng, bởi vì:

- Tiết kiệm năng lượng: Sử dụng enzyme hoạt tính lạnh giúp tiết kiệm

năng lượng

- Hạn chế sử dụng các hợp chất dễ bay hơi, không bền: Sử dụng các

enzyme thích ứng lạnh ở nhiệt độ thấp giúp tiết kiệm sử dụng các hợp chất không bền hay dễ bay hơi ở quá trình chuyển hóa sinh học trong sản xuất thực phẩm

- Ngăn ngừa nhiễm khuẩn: Sản xuất thực phẩm ở nhiệt độ thấp giúp

ngăn chặn sự phát triển của các sinh vật ưa nhiệt trung bình gây hại

- Bất hoạt enzyme: Điều chỉnh nhiệt độ để bất hoạt các enzyme nhạy

nhiệt một cách dễ dàng

Một vài ứng dụng điển hình của enzyme thích ứng lạnh được tóm tắt trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Ứng dụng công nghiệp các enzyme ở nhiệt độ thấp

(Ohgiya, 1999)

Chất giặt tẩy Protease, lipase,

Công nghiệp thực

phẩm

phẩm

- Gạn lọc nước ép trái

Tổng hợp enzyme Lipase, Nitrit hydratase Với nguyên liệu nhạy nhiệt,

dễ bay hơi

Xử lý nước thải Catalase Tiêu tốn ít năng lượng hơn

Công nghệ sinh học

Những enzyme dùng trong công nghiệp giặt tẩy là protease, lipase, α-amylase và cellulase Lợi ích nó mang lại là giảm tiêu tốn năng lượng và giảm hư hỏng, hao mòn khi giặt giũ Hạn chế của enzyme thích ứng lạnh là chúng không bền khi được thêm vào sản phẩm cuối cùng sau thời gian dài lưu kho Tuy nhiên, những enzyme đó thường là enzyme tái tổ hợp và tính ổn định của enzyme thích ứng lạnh ngày càng tăng bởi vì chúng ta ngày càng

hiểu biết rõ hơn về cấu trúc cơ bản enzyme và kỹ thuật gây đột biến điểm định hướng, cũng như tạo đột biến ngẫu nhiên có thể thực hiện được [28], [43] Trong sản xuất tơ sợi, các sợi bông thường nhô ra khỏi sợi chính, làm giảm độ mượt mà và thay đổi diện mạo trang phục [17] Sử dụng các enzyme cellulase thích ứng lạnh có thể làm tăng độ mượt và mềm của vải bằng cách loại bỏ các sợi bông thừa và có thể nhanh chóng bất hoạt các enzyme này sau khi dùng Để làm giảm hàm lượng lactose trong sữa, người ta có thể sử dụng enzyme β-galactosidase thích ứng lạnh Ứng dụng pectinase trong sản xuất nước ép trái cây giúp nâng cao hiệu quả quá trình tách chiết và giảm độ sệt của sản phẩm Pectinase thích ứng lạnh cũng tạo điều kiện cho phép quá trình sản xuất nước ép diễn ra ở nhiệt độ thấp Điều đó giúp giữ chất lượng nước ép và cho phép bất hoạt enzyme bằng cách điều chỉnh nhiệt độ thích hợp sau xử lý

là chất đa phân tử gồm hai hoặc vài galacturonate, có thể một phần hoặc hoàn toàn bị methyl hóa với C-6 [48]

Hợp chất pectin tiêu biểu cho nhóm polysaccharide có mối liên hệ gần gũi với nhau [18] Hai thành tố cơ bản tạo thành hợp chất pectic là galacturonan và rhamnogalacturonan trong đó carbon ở vị trí C-6 của galactose bị

oxy hóa tạo nhóm carboxyl, ngoài ra còn có arabinan, galactan và arabinogalactan I Rhamnogalacturonan là thành phần chính trong hợp chất pectin Chuỗi sơ cấp gồm các đơn vị α-D-galacturonate liên kết (1-4) với 2-4% L-rhamnose liên kết β-(1-2) và β-(1-4) với D-galacturonate Chuỗi bên của rhamnogalacturonan có thành phần và độ dài đa dạng Chuỗi bên kéo dài thường

là các polymer đồng nhất của axit D-galacturonic hoặc L-arabinose [48]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin

Cấu trúc hóa học đặc trưng của pectin được thể hiện ở hình 1.2 Các đơn vị D-galactorunate liên kết với nhau bằng các liên kết α-1-4 glycosidic

Một số D-galacturonate bị methyl-este hóa vị trí O-6 của nhóm carboxyl hoặc acetyl-este hóa ở vị trí O-2 hoặc O-3 của nhóm hydroxyl [11], một số khác bị

biến đổi thành dạng COO

hoặc –COOH phụ thuộc vào độ pH Mức độ methyl hóa và acetyl hóa rất đa dạng, phụ thuộc vào nguồn pectin [36]

1.5.2 Pectinase

1.5.2.1 Phân loại pectinase

Các enzyme xúc tác phân hủy pectin được gọi chung là pectinase Dựa vào cơ chế tác động và cơ chất chúng tham gia xúc tác phân cắt mà pectinase được phân chia thành các loại như sau: (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Phân loại các pectinolytic enzyme (Whitaker, 1990)

- Pectin acid

- Pectin acid

- Digalacturonates không no

- Phân cắt chuyển liên kết

- Phân cắt chuyển liên kết

- Phân cắt chuyển liên kết

- Phân cắt chuyển liên kết

1.5.2.2 Sự phân cắt cơ chất pectin bằng pectinase

Pectinase có hai cơ chế phản ứng cơ bản: thủy phân và phân cắt chuyển

liên kết (trans –element) (bảng 1.2) Cơ chế thủy phân đòi hỏi sự có mặt của

nước Ngược lại, cơ chế chuyển liên kết diễn ra trong điều kiện không cần nước và tạo ra sản phẩm có một nối đôi [48]

Pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) tác động vào pectin để loại bỏ

nhóm methoxyl từ nhóm carboxyl C-6 của galacturonate bằng con đường thủy phân (hình 1.3) Sản phẩm cuối cùng của phản ứng là axit pectin,

carboxyl mới hình thành sẽ làm giảm độ pH của môi trường phản ứng Do vậy, có thể tiến hành đo pH của dung dịch sau phản ứng để xác định hoạt tính pectin methylesterase [48]

methylesterases 2

Polymethylgalacturonates + nH O   oligogalacturonates galacturonate 

Hình 1.3 Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases Pectin acetylesterase thủy phân pectin bằng cách loại bỏ nhóm acetyl

khỏi nhóm hydroxyl C-2 và C-3 của đơn vị galacturonate Searle-van Leeuwen, Vincken và cs 1996 lần đầu phát hiện pectin acetylesterase ở

Aspergillus niger [38] Shevchik và Hugouvieux-Cotte-Pattat (1997) tìm thấy

hai pectin acetylesterase khác ở Erwinia chrysanthemi 3937 [39] Tuy nhiên,

các nghiên cứu về pectin acetylesterase còn rất hạn chế

Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) và exopolygalacturonase (EC

3.2.1.67) thủy phân liên kết glycosid bên trong polygalacturonate (hình 1.4) Sản phẩm phản ứng là một loạt polygalacturonate cỡ trung bình (đối với endopolygalacturonate) hoặc galacturonate (với exopolygalacturonate) Hoạt tính của hai enzyme này có thể được đo bằng cách xác định mức độ hình thành nhóm khử với 3,5-dinitrosalycylate [7]

endopolygalacturonase 2

  exopolygalacturonase  

2

Hình 1.4 Thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase Endopolymethylgalacturonase thủy phân polymethylgalacturonate

ngẫu nhiên thành oligomethylgalacturonate [5], [14] Phản ứng được xúc tác bởi lớp enzyme bên dưới:

  Endopolymethylgalacturonase

2 n

Hoạt tính của endopolymethylgalacturonase cũng có thể được đo bằng cách xác định tỷ lệ nhóm khử hình thành bởi sự thủy phân các liên kết glycosid

Endopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.2), chỉ được tìm thấy ở VSV,

nó khác với endogalacturonase pH tối ưu trong khoảng 8-10, cao hơn nhiều

so với các enzyme phân giải pectin khác Để hoạt động chúng cần sự có mặt của Ca2+

và chúng phân cắt liên kết glycosid bằng cơ chế trans tạo thành liên

kết đôi giữa C-4 và C-5 của galacturonate [48] Phương pháp tốt nhất để xác

định hoạt tính enzyme này là phân tích liên kết đôi với máy đo quang phổ ở bước sóng 232nm [25] Cũng có thể xác định hoạt tính bằng phương pháp đường khử [42], [7] Phản ứng xúc tác bởi endopolygalacturnate lyase như sau:

Endopolygalacturonate lyase

Exopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.9) được phát hiện chỉ ở một vài

loài vi khuẩn Clostridium multifermentans [24], [25]; Erwinia aroideae [31], [32]; Erwinia disolvens [8] Cơ chất ưa thích không phải polymethylgalacturonate

mà là polygalacturonate Sản phẩm tạo thành thường là Δ4:5 digalacturonate không no Độ pH tối ưu của các enzyme này trong khoảng 8,0 – 9,5 Hoạt tính của exopolygalacturonate lyase có thể được xác định giống với cách tiến hành đối với endopolygalacturonate lyase Phản ứng xúc tác bởi enzyme exopolygalacturonate lyase như trong hình 1.5

Endomethylpolygalacturonate lyase

Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định bằng phương pháp đường khử [42], [7], hoặc đo quang phổ phát hiện các liên kết nối đôi ở bước sóng 232nm [25]

1.6 Ứng dụng pectinase trong công nghiệp

1.6.1 Ứng dụng pectinase trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây

Trái cây có thể được dùng để sản xuất nước ép thường hoặc nước ép cô đặc Thêm pectinase giúp quá trình tách chiết nước ép sẽ dễ dàng hơn Người

ta thêm pectinase vào hỗn hợp trái cây (khoảng 40-200g enzyme/tấn) trong

tăng hiệu suất Pectinase cũng được thêm vào nước ép sau quá trình ép để khử pectin Pectinase thủy phân pectin và hemicellulose thừa, phản ứng này tạo

Brix, cũng như tăng khả năng bảo quản và tránh xâm nhiễm của vi sinh vật [18]

1.6.2 Ứng dụng pectinase trong công nghiệp dệt may

Sợi bông chín có thành tế bào gồm vách sơ cấp mỏng và vách thứ cấp dày Mục tiêu của quá trình xử lý bông là loại bỏ vách sơ cấp thành tế bào Thành phần hóa học của sợi bông gồm ~95% cellulose và ~5% không phải cellulose Phần lớn các hợp chất không phải cellulose thuộc vách sơ cấp, có cấu tạo gồm một hệ thống lưới pectin phức tạp (một phần axit methoxylate polygalacturonic), protein, cellulose, hemicellulose, và chất sáp Vách sơ cấp thành tế bào gần như toàn bộ là cellulose [6], [37] Enzyme phân giải chính xác pectin sợi bông giúp làm giảm hoặc loại bỏ việc sử dụng các chất hóa học độc hại, giảm gánh nặng môi trường trong khi vẫn đảm bảo tính nguyên vẹn

và độ chắc chắn của sợi bông

1.6.3 Ứng dụng pectinase trong công nghệ sinh học

Trong chu trình sinh sản của thực vật, người ta không thể dùng phương pháp thao tác gen truyền thống để đưa nhiều tổ hợp các đặc tính mong muốn vào tế bào Ngày nay, người ta sử dụng một phương pháp hiệu quả đối với thực vật bậc cao là dung hợp giữa các tế bào trần (protoplast) cô lập từ tế bào sinh dưỡng (tế bào soma) trong điều kiện in vitro và sau đó phát triển nó

thành thực vật lai Đây có thể là một công cụ hữu hiệu để làm tăng sự đa dạng gen và tổ hợp các đặc điểm không có trong tự nhiên Chính vì vậy mà việc sử dụng enzyme pectinase thích ứng lạnh tác động loại bỏ thành tế bào thực vật

để tạo ra tế bào trần (protoplast) có ứng dụng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật [30]

1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng pectinase vào việc xử lí vỏ cà phê để sản xuất thức ăn cho gia súc, ứng dụng lên men tạo

phân bón, sản xuất hương thơm tự nhiên

Ứng dụng pectinase vào việc xử lí phế thải vì pectin là thành phần quan trọng trong rác thải hữu cơ Trên cơ sở lựa chọn 100.000 gen khác nhau của nấm

(Fungus) Aspergillus japonicus người ta đã tách được các enzyme phân giải pectin

pectinolytic enzyme) như Pectinase, Pectinesterase (Pectinmethylesterase 3.1.1.11)

Pectinase kiềm tổng hợp từ vi khuẩn Bacillus subtillis đã thay thế các

chất hóa học trong quá trình tẩy trắng giấy và bột giấy, giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường và cải thiện chất lượng giấy [4]

Ứng dụng pectinase và cellulase xử lý rễ của cây con Lotus

corniculatus phóng thích các tế bào trần của đầu rễ lông hút để thu nhận tế

bào trần, dùng trong sinh học phân tử Xử lý rễ của cây con Lotus

corniculatus với cellulase và pectinase phóng thích các tế bào trần của đầu rễ

lông hút khi ủ trong môi trường có enzym khoảng 1 phút 10% của tế bào trần phân chia để tạo ra một tập đoàn tế bào mà sau đó tạo được chồi non Cây tái tạo có kiểu hình và tế bào bình thường

1.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu về enzyme pectinase ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như các nghiên cứu ứng dụng các enzym pectinase vào công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Nghiên cứu của TS Lại Mai Hương (Đại học Bách khoa Thành Phố

Hồ Chí Minh) về ứng dụng của pectinase và cellulase trong phá vỡ cấu trúc sợi của bã đậu nành, làm giảm kích thước hạt nghiền xuống còn 25-53 µm, làm tăng đáng kể tỉ lệ xơ hòa tan/xơ không hòa tan Bã đậu nành qua xử lý

Nghiên cứu của ThS Lê Hồng Phú trường Đại học Bách khoa Thành Phố Hồ Chí Minh về tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ vi khuẩn

Aspergillus niger và ứng dụng của 2 enzyme này trong việc biến vỏ cà phê

thành phân hữu cơ, khắc phục tình trạng ô nhiễm do vỏ cà phê không được

xử lý ở nước ta [3]

Nghiên cứu ứng dụng pectinase trong sản xuất bột chanh dây cho hiệu suất cao và khả năng hòa tan trong nước lạnh tốt của TS Tôn Nữ Minh Nguyệt và cộng sự [2]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi khuẩn và plasmid

- Chủng vi khuẩn chịu lạnh Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505

được Weyland phân lập từ biển Nam cực [47], do TS Lê Văn Trường (Viện Công nghệ sinh học) cung cấp

- Tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng DH5α và BL21 được sử dụng

cho mục đích tách dòng và biểu hiện protein PelC, vector pJET1.2/blunt sử dụng làm vector tách dòng và vector pET43b (Novagen) được sử dụng làm vector biểu hiện

2.1.2 Hóa chất, máy móc và thiết bị

- Hóa chất: Pepton, yeast extract, NaCl, agarose, glucose, trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, cồn tuyệt đối, ethanol 70%, các dung dịch đệm muối phosphate, nước khử ion Kháng sinh ampicillin và các loại hóa chất thông dụng khác (ethidium bromide, v.v.), các

loại enzym cắt giới hạn (EcoRI, HindIII, XbaI, XhoI, NdeI) và Taq DNA

polymerase được mua từ các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham

- Máy móc và thiết bị: Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Di truyền vi

sinh vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học

2.2 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Di truyền vi sinh vật, phòng Thí nghiệm trọng điểm, Viện Công nghệ sinh học, 18- Hoàng Quốc Việt- Cầu Giấy- Hà Nội

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tách DNA tổng số của chủng vi khuẩn chịu lạnh

Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505

+ Chuẩn bị đệm CTAB buffer: Total: 100ml

- Vi khuẩn Pseudoalteromonas haloplanktis ANT/505 từ đĩa thạch

môi trường Zobell, đem cấy chuyển sang 2ml môi trường LB nuôi lắc trong tủ lạnh, 200 vòng, qua đêm

- Dịch nuôi được ly tâm 5000 vòng/ phút trong 5 phút thu tế bào

- Cho 500 µl CTAB buffer, dung dịch β- mercaptoethanol 2%, proteinase K 0,1mg/ml vào ống effpendort chứa tế bào vi khuẩn ANT/505

- Ủ trong 1giờ ở 60oC