TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VỎ VP19, VP26 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG HỆ THỐNG TẾ BÀO VI KHUẨN E.coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VỎ VP19, VP26 CỦA VIRUS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VỎ VP19, VP26 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV)

TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG HỆ THỐNG

TẾ BÀO VI KHUẨN E.coli

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: HAM MÁT

Niên khóa: 2006 - 2010

Tháng 07 năm 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO PROTEIN VỎ VP19, VP26 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV)

TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG HỆ THỐNG

TẾ BÀO VI KHUẨN E.coli

Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện:

ThS LÂM VỸ NGUYÊN HAM MÁT

ThS NGUYỄN VŨ PHONG

Tháng 07 năm 2010

LỜI CẢM ƠN

Chân thành cảm ơn:

• Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

• Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học

• Ban Giám Đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh

• Các anh chị công tác tại phòng Công Nghệ Sinh Học Thủy Sản và phòng Công

Nghệ Sinh Học Y Dược của Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí

Minh

Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:

• ThS Lâm Vỹ Nguyên đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn em thực hiên đề tài

• ThS Trần Vân Anh, ThS Trần Hạnh Triết…đã giúp đỡ và truyền đạt cho em

những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

• ThS Nguyễn Vũ Phong công tác tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học

Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

• Xin chân thành cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong

suốt quá trình thực hiện khóa luận

• Con xin gởi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ và

luôn bên con trong mọi thời điểm

HAM MÁT

TÓM TẮT

Ngành nuôi tôm tại Việt Nam đang phải đối mặt với các dịch bệnh của tôm, nhất là các loại bệnh do virus, virus gây bệnh đốm trắng làm tôm chết sau 3 – 7 ngày bị nhiễm bệnh gây ra tổn thất nặng nề cho người nuôi trồng cũng như cho nền kinh tế.Việc chẩn đoán nhanh bệnh virus của tôm và đưa ra thị trường các kit test nhanh bằng giấy thử (phương pháp miễn dịch học: kháng nguyên – kháng thể) thì rất cần thiết

Nghiên cứu được thực hiện dựa trên sự tạo dòng của gen vp19 và gen vp 26, sau đó

thông qua sự biểu hiện của protein do hai gen này mã hóa để bước đầu tạo ra một bộ kháng nguyên và kháng thể đa dòng chống lại virus WSSV gây nguy hiểm trên tôm sú ở Việt Nam nhằm thử nghiệm khả năng sử dụng các kháng thể này vào trong các nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng dụng trên virus tôm và nhằm sản xuất ra những kit kiểm tra hiện diện virus trong tôm với giá thành rẻ Mặt khác, chúng ta có thể sử dụng các kháng thể này cho các nghiên cứu chuyên sâu về virus tôm sau này

Những kết quả đạt được:

chúng tôi đã thu thập được mẫu tôm nhiễm bệnh WSSV và từ đó tạo dòng thành

công dòng gen vp19 và vp26 Tiến hành biến nạp được gen này vào vi khuẩn E.coli BL21

DE3 và cuối cùng thì chúng tôi đã biểu hiện được các protein VP19, VP26 mặc dù hàm lượng vẫn chưa cao

SUMMARY

“CLONING AND EXPRESSION THE ENVELOPE PROTEINS VP19 AND VP26

OF THE WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) INFECTED IN SHRIMP

(Penaeus monodon) USING THE E.coli SYSTEM”

Shrimp culture industry in Vietnam is facing shrimp epidemic diseases, especially viral diseases, cause severe loss for farmer, as well as for the economics, typically shrimps infected with WSSV died after 3 – 7 days after that Quick diagnosis of viral diseases on shrimps is one of the issues that shrimp culturing centers especially pay attention to However, in Vietnam, there are just some detection kits by PCR and one kind of kit based on immunology used for white spot virus detection Performing PCR tests needs appropriate equipments and some knowledge of molecular biology, and just can only be done in provincial laboratories Bringing out to the market kits for quick test using test strip (immunology method: antigen – antibody) or ELISA kit (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) is not only the dream of shrimp producers but also the dream of detection kit manufacturers

This study perform cloning and expression the envelope proteins vp19 and vp26 of the white spot syndrome virus (wssv) as the first step to initially create an ELISA kit for quick detection of dangerous viral diseases on shrimp (White Spot Syndrome) in Vietnam

in order to test the capacity of applying these antibodies into basic research as well as applied research on shrimp virus and to produce virus detection kits for shrimps with cheap price On the other hand, we can also use these antibodies for further study of virus

on shrimps

Results:

Successfully cloning vp19 and vp26, transformed these genes into E.coli BL21

DE3 and over-expressed protein VP19, VP26, although the concentration of these protein

is low

MỤC LỤC

Nội dung trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Summary iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Chương 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tình hình sản xuất tôm trong nước 3

2.2 Các bệnh thường gặp trên tôm 5

2.2.1 Cơ chế lây nhiễm chung của virus 6

2.2.2 Một số loại virus gây bệnh trên tôm 6

2.3 Đặc điểm sinh học của WSSV 9

2.3.1 Hình thái cấu trúc 9

2.3.2 DNA bộ gen 11

2.3.3 Protein cấu trúc 12

2.4 Protein VP19 12

2.5 Protein VP26 12

2.6 Một số phương pháp phát hiện bệnh WSSV 13

2.6.1 phương pháp chẩn đoán mô học 13

2.6.2 Các phương pháp lai 14

2.6.3 phương pháp PCR 14

2.6.4 Phương pháp miễn dịch 15

2.7 Sự tạo dòng 15

2.8 Kỹ thuật điện di 17

2.9 Plasmid 19

2.9.1 Plasmid pET30a+ 20

2.9.2 Hệ thống T7 21

2.10 Sự biến nạp ở vi khuẩn E.coli 21

2.11 Chọn lọc vi khuẩn đã được biến nạp 22

2.12 Giải trình tự 22

Chương 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 24

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 24

3.2 Vật liệu 24

3.3 Dụng cụ và hóa chất 24

3.3.1 Dụng cụ 24

3.3.2 Hóa chất 24

3.3.3 Các dung dịch 25

3.4 Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1 Thu thập mẫu virus 25

3.4.2 Quy trình tạo dòng các đoạn gen mục tiêu 25

3.4.2.1 Tạo dòng các đoạn gen mục tiêu 26

3.4.2.2 Biến nạp các gene mục tiêu vào E.coli DH5 α 27

3.4.2.3 Kiểm tra kết quả biến nạp bằng PCR khuẩn lạc 28

3.4.2.4 Kiểm tra kết quả biến nạp bằng cắt enzyme giải trình tự 30

3.4.2.5 Chuyển gene mục tiêu vào pET30a+ và biến nạp vào E.coli BL21 DE3 33

3.4.2.6 Cảm ứng biểu hiện các gene mục tiêu 35

Chương 4 Kết quả và thảo luận 37

4.1 Thu thập mẫu tôm bệnh 37

4.2 Tạo dòng gen mã hóa cho protein vỏ VP19, VP26 của WSSV 37

4.2.1 Gen mục tiêu 38

4.2.2 Thiết kế mồi và khuếch đại gen mục tiêu 38

4.2.3 Tạo dòng gen mục tiêu vào vector pGEMT Easy 39

4.3 Tạo dòng gen mục tiêu vào vector biểu hiện pET30a+ 41

4.4 Biểu hiện các gen mục tiêu 43

Chương 5 Kết luận và đề nghi 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Đề nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp Ampicillin

Bp base pair BLAST Basic Local Alignment Search Tool CBB Coomassie brilliant blue dNTP deoxynucleoside triphosphate ELISA Enzyme linked immunosorbent assay E.coli Escherichia coli EtBr ethidium bromide EDTA ethylen diamine tetraacetic acid

G gram HPV Hepatopancreatic parvovirus IHHNV Infectious Hypodermal And Hematopoietic Necrosis Virus IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Sự phân tách DNA trong gel acrylamine 18

Bảng 2.2 Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agrose 18

Bảng 3.1 Thành phần PCR xác định nhiệt độ tối ưu cho từng cặp mồi 26

Bảng 3.2 Chu trình PCR xác định nhiệt độ tối ưu từng cặp mồi 27

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng nối 28

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc kiểm tra kết quả biến nạp 29

Bảng 3.5 Chu trình phản ứng PCR khuẩn lạc kiểm tra kết quả biến nạp 30

Bảng 3.6 Thành phần phản ứng cắt enzyme cắt hạn chế 32

Bảng 3.7 Thành phần phản ứng nối bằng enzyme T4 ligase 35

Bảng 4.1 Trình tự các cặp mồi gen vp19 và vp26 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cơ chế lây nhiễm chung của virus 6

Hình 2.2 Tôm bệnh đốm trắng WSSV 6

Hình 2.3 Tôm bệnh còi MBV 7

Hình 2.4 Tôm bệnh đầu vàng YHV 8

Hình 2.5 Virus WSSV dưới kính hiển vi điện tử 10

Hình 2.6 Virus nhuộm gram âm trong huyết tương tôm sú nhiễm WSSV 10

Hình 2.7 DNA genome của WSSV 11

Hình 2.8 Plasmid pET30a(+) 20

Hình 4.1 Kết quả kiểm tra sự hiện diện của WSSV bằng PCR 37

Hình 4.2 Kết quả kiểm tra các cặp mồi tạo dòng cho vp19, vp26 38

Hình 4.3 Kết quả PCR khuẩn lạc kiểm tra sự hiện diện vp19, vp26 39

Hình 4.4 Kết quả kiểm tra pGEMT::vp19, pGEMT::vp26, bằng BamHI, HindIII 40

Hình 4.5 Kết quả cắt pGEMT ::vp19, pGEMT ::vp26 pET30a+ bằng BamHI, HindIII 42 Hình 4.6 Kiểm tra kết quả biến nạp vào pET30a+ dùng mồi clone 42

Hình 4.7 Kiểm tra kết quả biến nạp vào plasmid pET30a+ sử dụng mồi T7 42

Hình 4.8 Kết quả cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp 43

Hình 4.9 Kết quả kiểm tra khả năng hòa tan của các protein tái tổ hợp 44

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ngành nuôi tôm tại Việt Nam đang phải đối mặt với các dịch bệnh của tôm, nhất là các loại bệnh do virus, gây ra tổn thất nặng nề cho người nuôi trồng cũng như cho nền kinh tế Tại hội thảo về bệnh trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là bệnh ở tôm sú nuôi, được tổ chức tại Trạm nghiên cứu nuôi trồng thủy sản nước lợ ở Quý Kim, Hải Phòng vào cuối tháng 2/2004, các báo cáo kết qủa nghiên cứu thủy sản năm 2003 đã nêu một vài con

số như sau: cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha Các tỉnh thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm nuôi bị chết trong cả nước (http://vietlinh.com.vn/kithuat/benhthuysan/banvebenhtom.htm) Các bệnh của tôm nuôi chủ yếu là bệnh do virus đốm trắng (WSSV), do virus còi MBV

(Monodon Baculovirus), virus Taura (TSV) và virus đầu vàng (YHV)

Virus gây Hội chứng Đốm trắng trên tôm (Virus Đốm trắng – WSSV) là loại virus gây hại rất nguy hiểm cho tôm nuôi Tôm có thể chết hàng loạt chỉ sau 3 - 7 ngày nhiễm bệnh Việc chẩn đoán nhanh bệnh đốm trắng trên tôm nhằm kịp thời xử lý ao nuôi là một trong những vấn đề được các cơ sở nuôi tôm đặc biệt quan tâm Song, trên thị trường Việt Nam hiện tại chỉ tồn tại một số kit chẩn đoán bệnh bằng PCR và một loại kit chẩn đoán bệnh bằng miễn dịch học cho virus đốm trắng Việc thực hiện các test bằng PCR cần có những trang thiết bị và hiểu biết về sinh học phân tử nhất định, chỉ thực hiện được trong các phòng thí nghiệm cấp tỉnh Việc đưa ra thị trường các kit test nhanh bằng phương pháp miễn dịch học: kháng nguyên – kháng thể hoặc kit ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) không chỉ là mơ ước của các nhà sản xuất tôm mà còn của các nhà sản xuất các kit chẩn đoán

Đề tài này được đề ra nhằm bước đầu tạo ra kháng thể đa dòng kháng virus WSSV để

từ đó tạo kit ELISA giúp chẩn đoán nhanh loại virus gây bệnh nguy hiểm trên tôm này

1.2 Mục tiêu đề tài

Nhân dòng và biểu hiện được các protein vỏ VP19 và VP26 của virus WSSV ở dạng hòa tan và hàm lượng cao

1.3 Nội dung thực hiện

Trước hết ta thu nhận mẫu tôm bị nhiễm bệnh WSSV Tiến hành tạo dòng các đoạn gen mục tiêu , biến nạp các gen mục tiêu vào vector nhân dòng, sau đó kiểm tra kết quả biến nạp

Biến nạp gen mục tiêu vào vector biểu hiện và chuyển vào tế bào E.coli BL21 DE3,

sau đó tiến hành cảm ứng và biểu hiện gen mục tiêu

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình sản xuất tôm trong nước

Tôm là một trong những hải sản quan trọng nhất, có giá trị kinh tế cao trên thế giới (25% tổng thu nhập từ thuỷ sản), với sản lượng tăng 175% trong hai thập kỷ qua (1980 - 1998) và đạt đến 35 triệu tấn vào năm 2000 Tại Việt Nam, nhờ các điều kiện địa lý phù hợp, nuôi tôm đang là một mũi nhọn không chỉ trong ngành thuỷ sản nói riêng mà trong

sự phát triển của nền kinh tế nói chung Năm 2004, sản lượng nuôi tôm của Việt Nam đứng thứ hai trên thế giới (350.000 tấn, tương đương khoảng 1,7 tỷ USD) với thu nhập ngoại tệ từ tôm ước tính trên nửa tỷ USD

Đầu năm 2008, xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái Xuất khẩu trong tháng 10 đạt 124.328 tấn, trị giá 478,23 triệu USD, tăng 30% về khối lượng và giá trị so với tháng 10/2007 Tôm đông lạnh, cá tra, basa và mực, bạch tuộc đông lạnh - 3 mặt hàng chính - vẫn duy trì tốc độ tăng trưởng cao Tôm đông lạnh chiếm tỷ trọng cao nhất 35,4% với 158.527 tấn, trị giá 1,354 tỷ USD trong 10 tháng đầu năm, tăng 22,5% và

10,4% so với cùng kỳ (http://www.agro.gov.vn/news/newsdetail.aspx?targetid=11965)

Hiện diện tích nuôi ở Việt Nam đã lên trên 600.000 ha, trong đó Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đã chiếm gần 90% diện tích nuôi tôm của cả nước, nhiều gấp đôi năm 1995 Trong đó, tôm sú có 538.800 ha, tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Kiên

Giang… (http://nhanong.net/?nn=view&action=showid&id=2578&page=8)

Tuy nhiên, ngành nuôi tôm tại Việt Nam đang phải đối mặt với các dịch bệnh của tôm, nhất là các loại bệnh do virus, gây ra tổn thất nặng nề cho người nuôi trồng cũng như cho nền kinh tế Tại hội thảo về bệnh trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là bệnh ở tôm sú nuôi, được tổ chức tại Trạm nghiên cứu nuôi trồng thủy sản nước lợ ở Quý Kim vào cuối

tháng 2/2004, các báo cáo kết qủa nghiên cứu thủy sản năm 2003 đã nêu một vài con số như sau: cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083ha Các tỉnh thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm nuôi bị chết trong cả

nước (http://vietlinh.com.vn/kithuat/benhthuysan/banvebenhtom.htm) Các bệnh của tôm

nuôi chủ yếu là bệnh do virus đốm trắng (WSSV), do virus còi MBV (Monodon

Baculovirus), virus Taura (TSV) và virus đầu vàng (YHV)

Báo cáo của ngành thủy sản các tỉnh ĐBSCL cho biết, tôm sú hiện vẫn tiếp tục chết tại nhiều tỉnh ven biển trên diện tích hàng ngàn hécta, nâng diện tích tôm chết từ đầu năm đến nay trên 120.000 ha, nhiều gần 3 lần tháng 3 - 2008, tập trung tại Cà Mau với 57.789

ha, Kiên Giang 40.000 ha, Bạc Liêu 19.000 ha Tỷ lệ tôm chết từ 20% – 75%, làm người nuôi thiệt hại hàng chục tỷ đồng (http://www.sggp.org.vn/kinhte/2008/9/165267/)

Trong năm 2007, Trung tâm Khuyến ngư tỉnh Bạc Liêu đã xét nghiệm 10.737 mẫu tôm giống nhưng phát hiện đến 6.176 mẫu nhiễm bệnh (trên 60%) Trong đó, có gần 5.000 mẫu bị nhiễm bệnh còi (virus MBV, 81%), 579 mẫu bị bệnh đốm trắng (9%) (http://tintuc.xalo.vn/00543725685/tom_chua_kiem_soat_duoc_chat_luong_nuoi.html)

Từ kết quả này cho thấy tỷ lệ tôm giống lưu thông trên thị trường bị nhiễm bệnh rất cao, chưa được kiểm soát chặt chẽ Chính tôm giống kém chất lượng là một trong những nguyên nhân làm cho người nuôi tôm bị lỗ Trong 9 tháng đầu năm 2008, người nuôi tôm tại Bạc Liêu tự lấy hơn 1.762 mẫu tôm, gần 2.000 mẫu nước nuôi tôm đưa đi xét nghiệm Kết quả có 25% số mẫu tôm nhiễm bệnh đốm trắng, trên 50% mẫu nhiễm bệnh MBV (còi), gần 25% nhiễm đầu vàng và 1.040 mẫu nước nhiễm khuẩn

(http://www.sggp.org.vn/kinhte/2008/9/165267/) Tỷ lệ tôm nhiễm bệnh ngày càng cao

cho thấy tình hình dịch bệnh do virus gây ra cho tôm đang ngày càng lan rộng và gây thiệt hại lớn cho người nuôi tôm

Ngoài ra, bệnh của tôm không chỉ tồn tại ở tôm thương phẩm mà còn hiện diện ngay

cả trong tôm giống và tôm bố mẹ Việc chẩn đoán nhanh bệnh virus của tôm trong suốt

quá trình nuôi là một trong những vấn đề được các cơ sở nuôi tôm đặc biệt quan tâm Trên thị trường Việt Nam hiện tại chỉ tồn tại một số kit chẩn đoán bệnh bằng PCR và một loại kit chẩn đoán bệnh bằng miễn dịch học cho virus đốm trắng Việc thực hiện các test bằng PCR cần có những trang thiết bị và hiểu biết về sinh học phân tử nhất định, chỉ thực hiện được trong các phòng thí nghiệm cấp tỉnh ELISA là phương pháp ưu việt cho virus RNA Việc xét nghiệm mẫu bệnh do virus RNA bằng phản ứng RT-PCR đòi hỏi chi phí

cao cho bước tách chiết RNA và sử dụng enzyme reverse trancriptase có giá thành cao

Phản ứng ELISA với giá thành rẻ và độ nhạy đủ cao để phát hiện virus gây bệnh trong mẫu xét nghiệm Việc đưa ra thị trường các kit test nhanh bằng giấy thử (phương pháp miễn dịch học: kháng nguyên – kháng thể) hoặc kit ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) không chỉ là mơ ước của các nhà sản xuất tôm mà còn của các nhà sản xuất các kit chẩn đoán

2.2 Các bệnh thường gặp trên tôm

Bệnh do môi trường: như bệnh chậm lột xác do pH và độ mặn thấp, bệnh bọt khí …

Bệnh do Vi khuẩn: bệnh Vibriosis do vi khuẩn Vibrio gây ra, làm tổn thương và hoại

tử mô, dị dạng ở tôm, chậm phát triển

Bệnh do nấm: như bệnh đen mang, tổn thương mô do nấm Fusarium solani trên tôm

P vannamei và P stylirostris hay do nấm Fusarium oxysporum trên tôm P duodarum

Bệnh do Protozoa: Một vài loại protozoa phổ biến là: Zoothanmium, Voricela,

Anophrys, acineta sp Epistylic, lagenophrys

Bệnh do nguyên sinh động vật sống bám: nhớt thân, đóng rong hay mang bẩn, bệnh

viêm gan do bào tử đơn bội Haplsporidium, bệnh trắng lưng do Agmasoma penaei

Ngoài ra còn có bệnh do một số virus gây ra rất nguy hiểm làm tôm chết nhanh sau vài ngày bị nhiễm bệnh

2.2.1 Cơ chế lây nhiễm chung của virus

LÂY NHIỄM BIỂU HIỆN

Bệnh

Ăn thịt lẫn nhau

Ký chủ trung gian

LÂY NHIỄM TIỀM ẨN

Bố mẹ

Tôm giống

Tôm bột

Ấu trùng

Hình 2.1 Cơ chế lây nhiễm chung của virus

2.2.2 Một số loại virus gây bệnh trên tôm

a Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV – White Spot Syndrome Virus):

WSSV thuộc họ Nimaviridae, có cấu trúc virion có dạng hình trụ đến elip hoặc

hình trứng, rộng khoảng 121 ± 9 nm, dài khoảng 276 ± 26 nm, có vỏ bọc, không có thể vùi Bộ gen của virus này là DNA sợi đôi với kích thước khoảng 305 kb

Hình 2.2 Tôm bện đ m rắn

Đây là loại virus gây chết tôm nhiều nhất, nhanh nhất và có khả năng lây nhiễm cao

Khi thâm nhập vào cơ thể vật chủ, virus này cư trú ở nhiều bộ phận như mô nội bì, mô dạ

dày, mang, buồng trứng (hay tinh hoàn), hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi … Khi nhiễm bệnh, tôm có màu đỏ hồng, đốm trắng ở vỏ giáp đầu ngực, với tỷ lệ tôm chết khi nhiễm bệnh lên đến 80 - 100%

b Virus gây bệnh còi (MBV – Monodon Baculovirus)

MBV thuộc nhóm Baculovirus, có kích thước khoảng 70 x 300 nm, có vỏ bao nucleocapsid Vật liệu di truyền của virus này là DNA sợi đôi

MBV gây nhiễm ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm.Bệnh còi không gây tôm chết ồ ạt nhưng làm cho tôm chậm lớn

c Virus gây bệnh gan tụy (HPV – Hepatopancreatic parvovirus)

HPV thuộc họ Parvoviridae, với cấu trúc hình khối 20 mặt, không có màng bao với kích thước 18 x 26 nm Bộ gen của loại virus này là DNA sợi đơn (3,9 – 5,9 kb)

IHHNV và HPV là 2 loại virus cùng thuộc 1 họ, có sự tương tự nhau về cấu trúc và hình

dạng virion, nhưng chúng có vị trí xâm nhiễm khác nhau HPV cư trú ở tế bào biểu bì gan

Hình 2.3 Tôm bện còiMBV

Tôm giai đoạn mid-juvenile rất dễ nhiễm HPV Tôm nhiễm HPV có gan teo, hoại tử, tăng trưởng chậm, biếng ăn, nhiều vi khuẩn và nấm bám bên ngoài và ở mang, có thể chết 100% trong vòng 4 – 8 tuần

d Virus gây bệnh đầu vàng (YHV – Yellow Head Virus)

YHV thuộc họ Roniviridae, giống Okavirus YHV có cấu trúc hình que với kích

thước 173 x 44 nm Vật liệu di truyền là RNA sợi đơn dương (ssRNA (+)) với kích thước khoảng 22 kb

Sau khi được phát hiện lần đầu tiên ở Thái Lan (1993), YHV đã gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm ở Châu Á YHV xâm nhiễm ở nhiều loài, nhưng chủ

yếu là Penaeus monodon Tôm nhiễm YHV có các triệu chứng gan tụy sưng to, xuất hiện

màu vàng ở phần vỏ đầu ngực và phần mang, gây chết cấp tính 100% từ 5 đến 7 ngày sau khi nhiễm

e Virus gây hội chứng Taura (TSV – Taura Syndrome Virus)

Thuộc nhóm Picornavirus, họ Picoranviridae Bộ gen ssRNA, chiều dài 10,2 kb,

cấu trúc capsid có 3 phần (55, 40 và 24 kDa) và một đoạn polypeptide phụ (58 kDa)

Hình 2.4 Tôm bện đầu vàn YHV

Hội chứng virus Taura (TSV) hay còn gọi là bệnh đỏ đuôi được các nhà khoa học đưa ra năm 1992 khi bệnh này xuất hiện tại châu Mỹ- quê hương của con tôm thẻ chân trắng Bệnh TSV trên tôm thẻ chân trắng rất khó phát hiện bằng mắt thường do đường kính của bệnh phẩm rất nhỏ và trôi nổi lơ lửng trong môi trường nuôi (hội chứng này do một tổ hợp mầm bệnh gồm 1 loài vi khuẩn Vibrioharveae và 3 loại virus gây nên) Hội chứng Taura gây các triệu chứng: thân tôm có màu đỏ nhạt, tôm yếu, tôm chậm lớn Loại bệnh này có thể bị lây nhiễm sang tôm sú

2.3 Đặc điểm sinh học của WSSV

2.3.1 Hình thái cấu trúc

WSSV thuộc họ Nimaviridae, có cấu trúc virion có dạng hình trụ đến elip hoặc

hình trứng, rộng khoảng 121 ± 9 nm, dài khoảng 276 ± 26 nm, có vỏ bọc, không có thể vùi Bộ gen của virus này là DNA sợi đôi với kích thước khoảng 305 kb

Đây là loại virus gây chết tôm nhiều nhất, nhanh nhất và có khả năng lây nhiễm cao Khi thâm nhập vào cơ thể vật chủ, virus này cư trú ở nhiều bộ phận như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng (hay tinh hoàn), hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi, … Khi nhiễm bệnh, tôm có màu đỏ hồng, đốm trắng ở vỏ giáp đầu ngực, với tỷ lệ tôm chết khi nhiễm bệnh lên đến 80 - 100%

Virus WSSV có kích thước khá lớn, dưới kính hiển vi điện tử có thể quan sát thấy các virion của WSSV gần như đối xứng, đường kính 120 – 150 nm, chiều dài 270 – 290 nm Một số virion hình trứng có phần phụ nhọn ở một đầu, có vẻ như được kéo dài từ vỏ virion

Nucleocapsid: quan sát thấy ở nhiều trạng thái khác nhau như dạng không có vỏ, dạng có vỏ và dạng hình que, kích thước 65 – 70 x 300 – 350 nm Dạng nucleocapsid có lõi được bao vỏ phân đoạn (dày khoảng 23 nm, phân cắt với nhau bởi dãi đệm đậm đặc điện tử rộng khoảng 6 nm) Ngoài ra còn có một dạng khác lớn hơn , có phần xoắn chồi ra như một cái đuôi

Hình 2.5 Virus WSSV dưới kính hiển vi điện tử: a) virion của WSSV b) nucleocapsid: A-Bản gel điện di của WSSV (1 – marker; 2 – protein của tôm sống không nhiễm bệnh; 3 – virus WSSV; 4 – Nucleocapsid của WSSV); B – mô hình cấu tạo Whispovirus (theo Just M và ctv, 2002)

Hình 2.6 Virus nhuộm gram âm ở trong huyết tương của tôm sú nhiễm bệnh

WSSV, một số thể virus có đuôi, ảnh kính hiển vi điện tử (vạch kẻ a = 240,

b = 150, c = 100 nm) (theo Graindorge & Flegel, 1999)

2.3.2 DNA bộ gen

Virus WSSV có DNA bộ gen vòng lớn, mạch đôi Kích thước của bộ gen khoảng

300 - 320 kb Dựa trên những phân tích các trình tự đặc biệt của WSSV, người ta nhận thấy rằng có sự sai khác về gen của virus WSSV có nguồn gốc khác nhau Điều này cũng

lý giải các kết luận khác nhau được đưa ra khi phân tích cấu trúc protein của virus WSSV

ở các vùng khác nhau

Những nghiên cứu sâu hơn về bộ gen của virus WSSV (có nguồn gốc từ Thái Lan) cho thấy: ở dạng mạch vòng, kích thước của gen là 292967 bp, chứa 184 khung đọc mở ORF, tỷ lệ của 2 loại acid nucleic A và T là 58,9% Tại Việt Nam, chưa có tài liệu nghiên cứu nào về vấn đề này được công bố

Hình 2.7 DNA genome của WSSV

2.3.3 Protein cấu trúc

Virion WSSV có 5 loại protein cấu trúc chính, được gọi tên dựa theo trọng lượng phân tử khi điện di trên gel SDS-PAGE, là VP15 (15 kDa), VP24 (24 kDa), VP26 (26 kDa), VP19 (19 kDa), VP28 (28 kDa) Trong đó, VP28 và VP19 hiện diện tại vỏ của virus, VP15, VP24, VP26 hiện diện tại nucleocapsid

2.4 Protein VP19

Protein VP19 được tìm thấy tại vỏ của virus WSSV Gene mã hóa cho protein VP19 gồm 365 Nu Protein này gồm 121 acid amin, có trọng lượng phân tử trên lý thuyết là 13,2 kDa nhưng khi điện di trên gel SDS-PAGE lại thấy có trọng lương phân tử là 19 kDa, được mã hóa bởi ORF182 trên gen, tại vị trí 290363 – 289998 (mã số trên Genebank

Hiện nay, trong ngân hàng gen chưa có trình tự acid amin nào tương đồng với trình

tự acid amin của VP19

2.5 Protein VP26

Gene mã hóa cho VP26 gồm 615 Nu Mã số trên Genebank là EU931452.1

Protein VP26, sản phẩm dịch mã của gen WSV311, là một trong những protein cấu trúc lớn của virus WSSV

Ban đầu, VP26 được xem như nucleocapsid protein Sau đó người ta cho rằng VP26

đóng vai trò nối lớp vỏ ngoài và lớp vỏ trong của virus (protein tegument) VP26 có sự tương đồng cao với protein VP28, một trong các protein cấu trúc chính của WSSV

Một điều thú vị là VP26, VP28 đều có kích thước gen tương tự nhau nhưng lại cho kết quả điện di SDS-PAGE khác nhau Giả thiết ban đầu là do quá trình biến đổi sau dịch

mã Cũng như VP28, VP26 cũng được các nhà khoa học tìm hiểu về các đặc điểm cơ bản

để từ đó nghiên cứu tạo kháng thể

Các phương pháp thông dụng để phát hiện bệnh đốm trắng ở tôm bao gồm:

- Phương pháp chẩn đoán mô học

- Phương pháp lai

- Phương pháp miễn dịch

- Phương pháp PCR

2.6.1 Phương pháp chẩn đoán mô học

Phương pháp chẩn đoán mô học giúp chẩn đoán bệnh dựa trên những biến đổi bất thường của cấu trúc tế bào, mô và cơ quan Để phát hiện bệnh WSSV, người ta cũng có thể sử dụng phương pháp phân tích mô học bằng cách cố định mẫu làm tiêu bản mô học nhuộm với Hematoxylin và Eosin, sau đó quan sát thể vùi (Inclusion body) bên trong

nhân tế bào, hoặc chẩn đoán nhanh bằng cách lấy mẫu ép mỏng, cố định trong methanol

và nhuộm với Giemsa, quan sát thể vùi xuất hiện trong nhân tế bào

Đặc điểm mô học quan sát thấy là nhân phồng to do sự phát triển và tích lũy virion bên trong, đây là một dấu hiệu đặc trưng của bệnh Các thể vùi (Inclusion body-IB) ưa kiềm có mặt trong nhân tế bào biểu bì, ruột trước, mang và hệ bạch huyết Mô đích của virus là những mô có nguồn gốc ngoại bì (ectodermal, gồm biểu bì, da, thần kinh, tuyến anten…) và trung bì (mesodermal, gồm cơ, gan, tụy và hệ tiêu hóa)

2.6.2 Phương pháp lai

Để phát hiện WSSV, người ta có thể sử dụng các phương pháp lai như Dot blot, southern blot, lai tại chỗ Trong các phương pháp này, người ta sử dụng một trình tự DNA chuyên biệt của WSSV Dò tìm sự hiện diện của trình tự DNA này trên mẫu tôm nghi bệnh Kết quả của phương pháp này cho phép kết luận mẫu tôm có bệnh hay không

Tuy nhiên, phương pháp này không tỏ ra hữu hiệu do rất tốn thời gian và cho độ nhạy thấp hơn phương pháp PCR và phương pháp miễn dịch

2.6.3 Phương pháp PCR

Là phương pháp dùng để khuếch đại một đoạn DNA mà đã biết trước trình tự của

nó và là phương pháp thông dụng nhất

Phản ứng PCR phụ thuộc vào khả năng tách đôi của mạch DNA đơn và sự bắt cặp

bổ sung trong điều kiện được kiểm soát Yếu tố thứ hai ảnh hưởng đến quá trình phản ứng PCR là đoạn mồi (primer), đoạn oligonucleotide có độ dại khoảng từ 18 đến 20 base Hai đoạn mồi này sẽ bắt cặp bổ sung với đoạn DNA đích cần khuếch đại đã được biến tính Nhiệt độ ủ bắt cặp của chúng lạ từ 50 – 60oC Sau khi đoạn mồi bắt cặp với đoạn DNA mẫu thì sẽ được tiếp tục kéo dài nhờ vào các deoxynucleotide (dNTPs) và DNA

polymerase chịu nhiệt có trong hỗn hợp phản ứng, enzyme này được gọi là Taq

polymerase có khả năng giữ hoạt tính ở 95oC trong quá trình DNA duỗi thẳng và quá

trình kéo dài chuỗi ở 72oC Khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp được nâng lên 95oC để tách

đoạn DNA mạch đôi mới Sau đó nhiệt độ được hạ thấp xuống và bắt đầu một chu kỳ mới

vì các đoạn mồi vẫn còn trong hỗn hợp Các chu kỳ được lặp lại sẽ nhanh chóng khuếch đại đoạn gen mong muốn Ở mỗi chu kỳ số lượng DNA được tăng gấp đôi Vì thế trong một thời gian ngắn khoảng hơn 20 chu kỳ, đoạn DNA mong muốn tăng lên hàng triệu lần trong khi đoạn DNA gốc vẫn không được nhân lên (Sandy Primrose và ctv, 2004)

2.6.4 Phương pháp miễn dịch

Phương pháp miễn dịch dựa trên phản ứng đáp ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể Thông thường các kháng thể này được sản xuất nhờ chuột hoặc thỏ được tiêm kháng nguyên là virus WSSV hay một loại protein vỏ của virus Huyết thanh thu được từ thỏ hay chuột có chứa kháng thể đa dòng

Hiện nay, trên thế giới đã có những báo cáo về các sản phẩm kháng thể đơn và đa dòng của virus Tuy nhiên các phương pháp huyết thanh học vẫn chỉ được giới hạn trong các phòng thí nghiệm để chẩn đoán bệnh do WSSV nhưng với giá rất cao Hướng giải quyết là kháng thể có thể phản ứng với virus ở dạng nguyên thể để phát hiện nhanh virus WSSV trên các mẫu bị nghi ngờ là nhiễm WSSV

2.7 Sự tạo dòng

Sự tạo dòng là một quá trình khuếch đại một đoạn gen mong muốn bằng phương pháp PCR nhằm tăng nhanh số lượng đoạn gen trong một thời gian ngắn

Các nguyên liệu dùng trong tạo dòng:

• Đoạn DNA cần tạo dòng

Nguồn nguyên liệu DNA dùng trong tạo dòng rất đa dạng Chúng có thể là DNA bộ gen của sinh vật đang được nghiên cứu, đoạn DNA được tổng hợp từ khuôn RNA dưới

tác động của enzyme phiên mã ngược, DNA sản phẩm của phản ứng PCR hay các DNA

được tổng hợp in vitro

• Các vector dùng trong tạo dòng

Có nhiều loại vector khác nhau được sử dụng phụ thuộc vào kích thước đoạn gen chèn và tế bào chủ: plasmid, phage, cosmid, nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YAC), nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú (MAC), virus của tế bào eukaryote…

vị trí cắt là hoàn toàn giống nhau trên hai mạch

• Các enzyme thông dụng khác

Các polymerase gồm các DNA polymerase và RNA polymerase:

DNA polymerase được quan tâm nhiều hơn do có nhiều ứng dụng trong tạo dòng Phần lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA để làm khuôn cho sự tổng hợp

( DNA polymerase I T4 DNA polymerase, taq polymerase ) Một DNA polymerase đặc

biệt là enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase) lại sử dụng khuôn RNA để tổng hợp DNA Ngoài ra còn có một DNA polymerase không tổng hợp mạch mới từ khuôn

mà chỉ thêm các nucleotide vào đầu một phân tử DNA có sẵn, đó là Terminal transferase Các DNA polymerase để hoạt động cần một mồi (primer) Mồi là một đoạn DNA hay

RNA ngắn bắt cặp bổ sung với phần đầu của khuôn, để từ đó các DNA polymerase mới nối dài tạo thành mạch bổ sung

RNA polymerase tham gia tổng hợp RNA, thông dụng nhất là SP6, T7 và T3 RNA polymerase

Các ligase là các enzyme xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA (DNA

ligase) hay RNA (RNA ligase) Trong lĩnh vực tạo dòng, lĩnh vực ứng dụng quan trọng nhất của các ligase, chúng thường được sử dụng kết hợp với hai enzyme khác là T4

polynucleotide kinase và alkaline phosphatase Có các loại ligase sau: E.coli DNA ligase,

T4 DNA ligase, T4 RNA ligase

Các nuclease là nhóm enzyme phân cắt DNA (Dnase) và RNA (Rnase) Các RE đề

cập ở trên cũng là những nuclease nhưng mang tính chuyên biệt trình tự cao hơn Các nuclease chính bao gồm: Dnase I, nuclease S I, Exonuclease III, Rnase A, Rnase H…

2.8 Kỹ thuật điện di

Kỹ thuật điện di không chỉ được dùng trong quá trình phân tích mà còn được dùng trong việc tinh sạch DNA Có 2 loại thạch dùng để điện di agarose và polyacrylamide Thạch agarose dùng để điện di phân tách DNA có độ dài từ vài trăm base đến 20.000 base Thạch polyacrylamide thường dùng để điện di đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn

Cơ chế của quá trình là dựa trên sự khác biệt về khối lượng phân tử của DNA Dưới tác dụng của điện trường thì DNA tích điện tích âm sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương bằng cách xuyên qua các lỗ nhỏ trong thạch Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn các phân tử có kích thước lớn và ngược lại kích thước lỗ trong thạch agarose phụ thuộc vào nồng độ của agarose khi sự dung để đổ gel

- Gel polyacrymide: cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA có kích thước dưới 500 bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide (Lưu ý: Gel polyacrylamide ở dạng lỏng là chất độc cho hệ thần kinh nên phải cẩn thận khi sử dụng)

Bảng 2.1 Sự phân tách các đoạn DNA trong gel

polyacrylamide có nồng độ khác nhau

- Gel agrose: Lỗ nhỏ có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thước tử 300 – 10.000 bp Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau

Bảng 2.2 Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agrose

có nồng độ khác nhau Nồng độ gel agarose (%, w/v)

Kích thước đoạn DNA dạng thẳng (kb)

bằng tia UV

Nồng độ gel polyacrylamide(%, w/v)

Kích thước đoạn DNA dạng thẳng (kb)