Nghiên cứu sản xuất mứt từ vỏ bưởi

Nghiên cứu sản xuất mứt từ vỏ bưởi

MỤC LỤC Trang

1.3 Y học dân gian của cây mướp đắng

2.1 Các công trình nghiên cứu trong nước 7

2.1.1 Thành phần hóa học 7

2.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới 8

2.2.1 Thành phần hóa học 8

2.2.2 Một số triterpene trong cây mướp đắng 10

2.2.2.1 Các triterpene glycoside được cô lập từ hạt mướp đắng 10

2.2.2.2 Các triterpene glycoside được cô lập từ trái mướp đắng 12

2.2.2.3 Các triterpene glycoside được cô lập từ lá và dây mướp đắng 16

2.2.3 Tác dụng dược lý 19

THỰC NGHIỆM 1 NGUYÊNLIỆU 23 2 ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TRÁI MƯỚP ĐẮNG 23 2.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid 24 2.1.1 Thuốc thử alkaloid 24

2.1.2 Định tính alkaloid 24

2 2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid 25

2.2.1 Thuốc thử flavonoid 25 2.2.2 Định tính flavonoid 25 2.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất anthraglycoside 25 2.3.1 Thuốc thử anthraglycoside 25 2.3.2 Định tính anthraglycoside 25

2.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất sterol 26 2.4.1 Thuốc thử sterol 26 2.4.2 Định tính sterol 26

2.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin 26

2.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất đường khử 28

2.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin 28

3.3 Phân lập và tinh chế các hợp chất 32

KẾT QUẢ & THẢO LUẬN

1 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TRÁI

MƯỚP ĐẮNG 36

2 NHẬN DANH CẤU TRÚC CÁC CHẤT TINH KHIẾT 37

2.1.1 Kết quả phân tích độ tinh khiết của MC1 bằng HPLC 37

2.1.2 Nhận danh cấu trúc hóa học của MC1A và MC1B 37

1 CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẠT ĐƯỢC 52

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMSO : Dimethyl sulfoxid

PE : Petroleum ether

EtOAc : Ethyl acetate

EtOH : Ethanol

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

ppm : Parts per million

Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR; DEPT và HMBC của MC1A 39

Bảng 3.3 : Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của MC1B 42

Bảng 3.4: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR, DEPT và HMBC của MC1B 45

Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của MC6 49

Bảng 3.6: Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR, DEPT và HMBC của MC6 49

Bảng 3.7: So sánh dữ liệu phổ MC6 với tài liệu 50

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Quy trình chiết xuất các nhóm hợp chất của trái mướp đắng 32

Sơ đồ 2.2: Quy trình phân lập và tinh chế các hợp chất từ trái mướp đắng 33

Hình 2.1: Quá trình sấy nguyên liệu 23

Hình 2.3: Sắc ký lớp mỏng 30

Hình 3.3: TLC của MC1A ở các hệ giải ly khác nhau 38

Hình 3.4: Công thức cấu tạo của MC1A 39

Hình 3.5: TLC của MC1B ở các hệ giải ly khác nhau 42

Khoa Công nghệ Hóa- Thực phẩm cùng Thầy, Cô và các bạn sinh

viên trường Đại học Lạc Hồng đã quan tâm động viên, tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu

ThS Phan Nhật Minh, các anh chị trong phòng Hóa hợp chất thiên

nhiên, cùng các anh chị nghiên cứu viên trường Đại học Cần Thơ, các bạn sinh viên đến làm đề tài nghiên cứu đã tận tình hướng dẫn, góp ý, cung cấp tài liệu, tạo điều kiện giúp em làm tốt công việc của mình

Con kính gửi đến Gia đình lòng biết ơn sâu sắc

Xin chân thành cảm ơn!

LẠC HỒNG, tháng 11 năm 2009

Lê Thị Minh Nguyệt

LỜI MỞ ĐẦU

Mướp đắng hay còn gọi là khổ qua (Momordica charantia L.), thuộc họ Bầu bí -

Cucurbitaceae) được trồng ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là những vùng có khí hậu nhiệt đới Ở Việt Nam, cây được trồng ở hầu hết các tỉnh từ đồng bằng đến trung du và miền núi

Mướp đắng có vị đắng, tính hàn nên trong dân gian thường dùng để trị các bệnh mụn nhọt, giải nhiệt, trừ phiền, thanh tâm, sáng mắt, giảm đau… Khoa học ngày nay đã chứng minh dịch chiết trái mướp đắng có khả năng ức chế khối u, có tác dụng hỗ trợ men gan và điều trị bệnh đái tháo đường…

Hiện nay bệnh đái tháo đường là một trong các bệnh mãn tính, gây tử vong cao, đứng hàng thứ ba trên thế giới sau bệnh tim mạch và ung thư Ở Việt Nam, tỉ lệ mắc bệnh ngày một gia tăng, đòi hỏi cấp thiết phải tìm ra các loại thuốc hiệu quả, đặc trị

Mướp đắng có tác dụng đăc biệt như vậy nhưng hiện nay vẫn còn rất ít công trình nghiên cứu về hợp chất trị bệnh đái tháo đường Vì thế, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề

tài : “Góp phần khảo sát thành phần hóa học của trái mướp đắng”

Tên Việt Nam: Mướp đắng, khổ qua, lương qua, cẩm lệ chi…[3]

Ngoài ra nó còn có nhiều tên khác như: Mướp mủ, chua hao, dưa mát, hồng cô nương, hồng dương, bồ đạt, lại qua. [16]

Mô tả cây mướp đắng: [3,21]

Cây mướp đắng thuộc loại dây leo, có đời sống khoảng một năm Đường kính dây khoảng 5-10mm, dây bò dài 5 – 7m, thân màu xanh nhạt có góc cạnh, leo được nhờ có nhiều tua cuốn, ở ngọn có lông tơ

Lá đơn, nhám, mọc so le, dài 5-10cm, rộng 4-8cm, phiến lá mỏng chia làm 5 – 7 thùy hình trứng, mép có răng cưa đều, mặt dưới lá màu xanh nhạt hơn mặt trên lá, gân lá nổi rõ ở mặt dưới, phiến lá có lông ngắn

Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái cùng gốc, có cuống dài Hoa đực có đài và ống rất ngắn, tràng gồm năm cánh mỏng hình bầu dục, nhụy 5 rời nhau Hoa cái có đài và tràng hoa giống hoa đực Tràng hoa màu vàng nhạt, đường kính khoảng 2cm Trái hình thoi, dài 8 – 15cm, gốc và đầu thuôn nhọn Mặt vỏ có nhiều u lồi to nhỏ không đều Trái khi chưa chín có màu xanh hoặc xanh vàng nhạt, khi chín có màu vàng hồng Vì thế ở Trung Quốc, mướp đắng còn có tên là hồng dương, hồng cô nương.Khi chín, trái nứt dần ra từ đầu, tách ra làm ba phần để lộ chùm áo hạt màu đỏ bên trong

Hạt dẹt, dài 13 – 15mm, rộng 7 – 8mm, hình răng ngựa, thắt đột ngột ở hai đầu Vỏ hạt cứng, quanh hạt có màng màu đỏ như màng hạt gấc

Hình 1.1: Cây mướp đắng Hình 1.2: Dây và lá mướp đắng

Hình 1.3:Trái mướp đắng Hình 1.4: Hạt mướp đắng

Hình 1.5: Giàn mướp đắng (Phú Yên)

1.2 Phân bố và sinh thái

Mướp đắng được phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp các châu lục Từ thời xa xưa, mướp đắng được trồng lần đầu tiên ở Đông Ấn và Nam Trung Quốc, được sử dụng như là loại rau ăn quả giàu chất sắt và vitamin C Sau đó cây được du nhập sang châu Phi và châu Mỹ Latinh Quần thể mướp đắngtrồng đã trở nên rất phong phú với các giống cây đa dạng được tạo ra trong quá trình chọn giống và lai tạo.[29]

Ở Việt Nam, mướp đắng được trồng ở hầu hết các tỉnh từ Bắc Trung Nam, từ đồng bằng đến trung du và miền núi Ở một số vùng núi cao và lạnh như Sa Pa (Lào Cai), Phó Bảng (Hà Giang)…không thấy cómướp đắng.[15]

Trên thế giới, mướp đắng cũng có mặt ở hầu hết các nước nhiệt đới như Ấn Độ, Nam Á, Đông Nam Á, Trung Quốc, châu Phi và vùng Caribbean.[29]

Cây mướp đắng có biên độ sinh thái tương đối rộng, nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng từ 20 đến 35oC, lượng mưa hàng năm từ 1500mm đến 2500mm, độ cao đến 1000m Cây chịu đựng được nhiều điều kiện đất khác nhau nhưng phát triển tốt nhất trên đất thoát thủy tốt, giàu chất hữu cơ

Mướp đắng có thể trồng quanh năm Cây sinh trưởng nhanh trong mùa mưa ẩm, ra hoa quả sau 7 – 8 tuần gieo trồng Hoa thụ phấn chủ yếu nhờ côn trùng Sau khi trái già, cây sẽ tàn lụi và kết thúc vòng đời sau 4 – 5 tháng tồn tại

Hiện nay, cây vẫn còn tồn tại ở hai quần thể: Mọc hoang và được trồng trọt Loại trồng trọt rất phong phú về giống nhưng đều được xếp chung vào chi mướp đắng

(Momordica charantia L.) Tuy nhiên, căn cứ vào kích thước, hình dạng, màu sắc của quả

mà chia mướp đắngthành hai chủng loại:

− Momordica charantia L var charantia L., trái to (đường kính > 5cm), màu xanh

nhạt, gai tù, ít đắng

− Momordica charantia L var abbreviata Ser., trái nhỏ (đường kính < 5cm), màu

xanh đậm, gai nhọn, vị rất đắng

Hình 1.6: Var charantia L Hình 1.7: Var abbreviata Ser

1.3 Y học dân gian của cây mướp đắng

Hầu hết các bộ phận của cây như rễ, thân, lá, hoa, trái, hạt đều có thể dùng làm thuốc chữa bệnh. [4]

1.3.1 Rễ

Rễ tươi, sắc nước uống, mỗi ngày một thang, từ 1000ml nước với 60g rễ mướp đắng tươi, sắc còn 400ml, chia làm 2 – 3 lần uống, có thể áp dụng cho mọi dạng bệnh Rễ mướp đắng dùng trị lỵ, nhất là amip Tại Ấn Độ, dịch rễ (cũng như lá, trái) mướp đắngđược dùng trị bệnh tiểu đường, do có tác dụng làm giảm đường huyết Rễ mướp đắngcòn

Ở Trung Quốc, trái mướp đắng còn dùng để trị đột quị tim, bệnh sốt, khô miệng, viêm họng Ở Ấn Độ, dịch trái mướp đắng được dùng trị rắn cắn Người ta còn dùng bột trái mướp đắngđể hàn các vết thương (làm kéo da non), trị vết loét ác tính Ở Thái Lan, dịch trái được dùng trị bệnh về gan, lá lách.[2]

Với tính diệt khuẩn và chống oxi hóa, trái mướp đắng làm da mịn màng, trị mụn trứng cá hay bệnh vẩy nến, và ngay cả với vết thương do côn trùng cắn, nhiễm trùng da Mặt khác, trái mướp đắngcòn cung cấp nguồn năng lượng dồi dào và tăng khả năng chịu đựng cho cơ thể.[22]

Ngoài các công dụng trên, trái mướp đắng còn được dùng để trị nhiều bệnh như: Trị

ho, sốt, kiết lỵ, dạ dày, đau tức, đái dắt, phù thủng do gan, mắt đỏ đau nhức, giải nhiệt, hồi hộp, buồn phiền, tắm cho trẻ em trị rôm sảy, làm hạ đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 (không phụ thuộc insulin) [17]

1.3.6 Hạt

Hạt có chất béo, vị đắng, hơi ngọt, tính ấm, thanh nhiệt, giải độc, giải cảm, trị ho, lợi tiểu Hạt còn chữa rắn cắn, chữa nhọt độc sưng tấy, vết thương nhiễm trùng, hạ sốt đau họng và chống thụ thai.[13] Tại nhiều nước khác, hạt mướp đắng được dùng để trị bệnh đái tháo đường.[18, 22]

Ngoài ra, theo một số nghiên cứu gần đây cho biết các hoạt chất trong hạt mướp đắng còn có tác dụng chống ung thư, làm hạ huyết áp, kháng virus HIV…[17]

2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ MƯỚP ĐẮNG

2.1 Các công trình nghiên cứu trong nước

2.1.1 Thành phần hóa học

Các tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng và Lê Minh Phượng của Viện Dược liệu đã thống kê và khảo sát sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của cây mướp đắng Tuy nhiên, các tác giả này chưa cô lập được các hoạt chất có hoạt tính dưới dạng chất tinh khiết cũng như chưa xác định cấu trúc của các hoạt chất này, mà chỉ định lượng theo chất G6, một aglycon của nhóm glycoside [14]

Các tác giả Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Phùng Văn Trung ở Viện công nghệ Hóa học đã cô lập và nhận danh được hai hợp chất từ hạt: Momordicoside A

và Momordicoside B và bốn hợp chất từ trái: Momordicoside K, Momordicoside L, [β-D-glucopyranosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene và 23-O-β-D-allopyranosyl 5β,19- epoxycucurbita-6,24-dien-3β,22,23ξ-triol 3-O-β-D-allopyranoside. [10]

2.1.2 Tác dụng dược lý

Y học cổ truyền và dân gian Việt Nam đã có nhiều kinh nghiệm chữa bệnh từ mướp đắng, nhưng chỉ ở dạng nguyên liệu thô ban đầu hoặc ở các dạng nước ép, nước sắc mà thôi Ngày nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều sản phẩm trái mướp đắng nhưng đa số

ở dạng thực phẩm chức năng như trà hòa tan, trà túi lọc Điển hình là sản phẩm trà mướp đắngcủa Viện Dược liệu hay trà túi lọc mướp đắng của Công ty Traphaco

Nhóm tác giả Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu và cộng sự đã sản xuất chế phẩm Morantin từ thành phần glycoside của trái mướp đắng dạng to, màu trắng

và chứng minh tác dụng hạ đường huyết của nhóm glycoside trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng Alloxan. [14]

Các tác giả Nguyễn Thị Như, Nguyễn Thị Bay đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của một bài thuốc nam trên thực nghiệm lâm sàng, đó là sản phẩm trà túi lọc mà thành phần mướp đắngqua chiếm 60%

Các tác giả Mai Phương Mai, Võ Phùng Nguyên cũng đã thăm dò tác dụng hạ đường huyết của một số bài thuốc dân gian ở mô hình đái tháo đường bằng streptozotocin trên chuột nhắt, mà thành phần của bài thuốc cũng có chứa trái mướp đắng

2.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới

• Momordicine II, momordicine III

• Goyaglycosides -a, -b, -c, -d, -e, -f, -g, -h

• Momordicin I, momordicin II

− Triterpene saponin: Goyasaponins I, II, III

− Các triterpene khác:

• Momordicin, momordicinin, momordicilin

• Cucurbitane triterpenoid 3, cucurbitane triterpenoid 6

• β-amyrin, cycloartenol, erythrodiol, gypsogenin, karounidiol, multiflorenol, oleanolic acid, squalene, taraxerol…

− Trypsin inhibitor mcti-I, trypsin inhibitor mcti-II, trypsin inhibitor mci-3

− Các protein khác: Alanine, β-alanine, phenylanaline, arginine, asparagine, aspartic acid…

Trong nhiều nghiên cứu, người ta đã chứng minh được rằng có ít nhất ba nhóm hợp chất có tác dụng làm giảm lượng đường huyết hoặc có hoạt tính kháng đái tháo đường

Đó là hỗn hợp của hai steroid glycoside gọi là charantin, các peptide giống insulin

(p-insulin) và alkaloid Các hợp chất này chủ yếu tập trung ở trái mướp đắng

2.2.2 Một số Triterpene Glycosede có trong cây mướp đắng

2.2.2.1 Các triterpene glycoside được cô lập từ hạt mướp đắng [25, 26, 27,28,31,33]

OH

HO HO

1 2

4 5

6 7 8

9

10

11 12

13 14

15 16 17 18

19

20 21

1' 2' 3' 4' 5' 6'

OH OH

OH

1 2 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13 14

15 16 17 18

19

20 21

O OH

OH

OH OH

OH

HO

1' 2' 3' 4' 5' 6'

O

1''' 2''' 3''' 4''' 5'''

O OOO

H

OH OH

OH

OH

OH

OH OH

OH

HO HO

1 2

4 5

6 7 8

9

10

11 12

13 14

15 16 17 18

19

20 21

1' 2' 3' 4' 5' 6'

OH

HO HO

1 2

4 5

6 7 8

9

10

11 12

13 14

15 16 17 18

19

20 21

1' 2' 3' 4' 5' 6'

− Công thức cấu tạo:

OOHO

OMe

OH

OH HO

1 2

4 5

6 7 8

9 10

11 12

13 14

15

16 17 18

19

20 21

27

32 3

1' 2' 3' 4' 5' 6'

O

™ Momordicoside F2

− Là 3-O-β-D-allopyranoside của 5,19-epoxy-5β-cucurbita-6,23-dien-3β,25-diol

− Công thức chung: C35H58O8; M = 618 đvC; kết tinh trong acetone-nước cho tinh thể hình vảy, không màu; mp = 155 – 158oC

− Công thức cấu tạo:

4 5

6 7 8

9 10

11 12

13 14

15

16 17 18

19

20 21

27

32 3

1' 2' 3' 4' 5' 6'

O

OH HO

− Công thức cấu tạo:

O OHO

OMe

OH

1 2

4 5

6 7 8

9 10

11 12

13 14

15

16 17 18

19

20 21

27

32 3

1' 2' 3' 4' 5' 6'

O

OH HO

4 5

6 7 8

9 10

11 12

13 14

15

16 17 18

19

20 21

1' 2' 3' 4' 5' 6'

O

OH HO

− Công thức cấu tạo:

HO

OMe

1 2

4 56 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16 17 18

19

20 21

22 23

27

32 3

O

1' 2' 3' 4' 5' 6'

OHC

O HO

OH

OH HO

6 7 8 9 10

11 12

13 14

15 16 17 18

19

20 21

22 23

O

1'

2' 3' 4' 5' 6'

OHC

O HO

OH

OH HO

2.2.2.3 Các triterpene glycoside được cô lập từ lá và dây mướp đắng

™ Cucurbitan triterpenoid I

4 5

6 7 8

9

10

11 12

13 14

15

16 17 18

19

20 21

O O

HO OH OH

9 10

11 12 13 14

15

16 17 18

OHCHO

OH

™ Cucurbitan triterpenoid III

4 5

6 7 8

9

10

11 12

13 14

15

16 17 18

19

20 21

OH CHO

4 5

6 7 8

9

10

11 12

13 14

15

16 17 18

19

20 21

OH

OHC

OH

™ Momordicine II

− Là 23-O-β-glucopyranoside của 3β,7β,23ξ-trihydroxycucurbita-5,24-dien-19-al

− Công thức chung: C36H58O9; M = 634 đvC; kết tinh trong CHCl3 cho tinh thể dạng bột không màu

− Công thức cấu tạo:

HO

1 2

4 5

6 7 8

9

10

11 12

13 14

15

16 17 18

19

20 21

HO OH

4 5

6 7 8

9

10

11 12

13 14

15

16 17 18

19

20 21

HO OH O

2.2.3 Tác dụng dược lý

Theo y học hiện đại, mướp đắng có tác dụng:

− Diệt vi khuẩn và virus, chống lại các tế bào ung thư, hỗ trợ đắc lực cho bệnh nhân ung thư đang chữa bằng tia xạ

− Chống các gốc tự do – là nguyên nhân gây lão hóa và phát sinh các bệnh tim mạch, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, tổn thương thần kinh, viêm đường tiết niệu, đái tháo đường

− Tăng oxy hóa glucose, ngăn chặn sự hấp thu glucose vào tế bào Ức chế hoạt tính các men tổng hợp glucose

− Có tác dụng sinh học giống insulin, giúp cơ thể tăng tiết insulin

− Có tác dụng tốt với người mắc bệnh đái tháo đường type 2 Hỗ trợ tăng tác dụng, giảm liều và giảm tác dụng phụ của các loại sulfamid trị đái tháo đường type 2

Dịch chiết trái mướp đắng có khả năng ức chế khối u hỗ trợ men gan, chữa được nhiều bệnh như đái tháo đường, lách, gan, khớp, gout ….[14, 30]

Theo tài liệu , cao MeOH 50% từ trái mướp đắngcho tác dụng hạ đường huyết 25% (liều dùng 30mg/kg), cao butanol cho kết quả là 34% với liều dùng như trên Các tác giả này cho rằng các hợp chất phân cực, tan nhiều trong butanol có khả năng làm giảm đường huyết Cơ chế hoạt động tương tự insulin hoặc thông qua sự tiết insulin từ tuyến tụy

Nghiên cứu in vivo trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng Alloxan cho thấy,

khi dùng nước ép trái mướp đắng với liều dùng 6ml/kg B.W cho kết quả tối ưu, làm giảm lượng đường máu ở thỏ bình thường sau 2 giờ và tăng trở lại sau 3 giờ Tuy nhiên ở thỏ mắc bệnh, lượng đường máu tiếp tục giảm tới 4 giờ sau khi cho uống rồi mới bắt đầu tăng trở lại [33]

Theo báo cáo của Đại học Y khoa Calcuta (Ấn Độ), đã thử nghiệm cho 6 bệnh nhân đái tháo đường type 2 uống mỗi ngày một lần 100ml nước sắc mướp đắng tươi Sau 3 tuần lễ uống thuốc liên tục, đo lượng đường trong máu (khi đói) đã giảm được 54% so với ban đầu Sau 7 tuần dùng thuốc, cả 6 bệnh nhân đều không thấy đường trong nước tiểu, lượng đường trong máu như người bình thường

™ Tác dụng dược lý của charantin

Giới thiệu[32]

Charantin là một hỗn hợp 2 steroid glycoside được công bố là một trong những hoạt chất có hoạt tính kháng đái tháo đường type 2, được chiết tách và cô lập từ trái mướp đắng.

Năm 1962, Lotlikar và Rao lần đầu tiên cô lập được charantin với hàm lượng khoảng 0.01% Đến năm 1965, Sucrow đã xác định được đây là một hỗn hợp 2 steroid

glycosides (tỉ lệ 1:1) gồm 3-O-[D-glucopyranosyl]-stigmasta-5,25(27)-diene và sitosterol-3-O-β-glucoside , với công thức lần lượt như sau:

β-O H

HO

H HO

H

H OH H

9

10

11 12

13

16 17

20 18

19

22 21

1'

2' 3'

4'

5' 6'

O

CTPT: C35H58O6 (M = 574)

O H

HO

H HO

H

H OH H

9

10

11 12

13

16 17

20 18

19

22 21

1'

2' 3'

4'

5' 6'

O

CTPT: C35H60O6 (M = 576) Năm 1966, Lotlikar và Rao đã đưa ra qui trình chiết xuất charantin với hàm lượng cao hơn, đồng thời công bố về hoạt tính kháng đái tháo đường của hoạt chất này, được phân lập từ dịch chiết EtOH của trái mướp đắng khô

Sau đó đến năm 1979, Pugazhenthi và Suryanarayana Murthy đã khẳng định một lần nữa charantin là hỗn hợp 2 chất và hoạt tính sinh học của nó vẫn có thể mất đi trong quá trình chiết xuất kéo dài [32]

Hoạt tính kháng đái tháo đường của charantin

Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng đái tháo đường của charantin trên thỏ gây đái tháo đường thực nghiệm bằng Alloxan:

− Chọn thỏ ở cả con đực và con cái với trọng lượng cơ thể vào khoảng 1.5 – 3kg, được gây đái tháo đường bằng cách tiêm Alloxan qua tĩnh mạch với liều lượng 200mg/kg Chỉ có 4 trong 20 con còn sống sau 5 ngày được tiếp tục đem đi khảo sát

− Charantin hòa tan trong Tween 80 với nồng độ 0.3% Xử lý bằng cách cho uống hoặc tiêm qua tĩnh mạch 5ml dung dịch này Mức đường huyết giảm dần từ giờ thứ nhất đến giờ thứ tư sau khi xử lý, nhưng sau đó sẽ từ từ lấy lại mức ban đầu

− Hoạt tính của charantin có hiệu lực hơn 5 giờ, cao nhất ở giờ thứ tư, được ghi nhận là có tác động như nhau ngay cả khi xử lý bằng cách cho uống hoặc tiêm qua tĩnh mạch Với liều 50mg/kg cho uống làm giảm 42% lượng đường huyết ở giờ thứ tư và giảm còn 28% ở giờ thứ năm sau xử lý Tuy nhiên khi sử dụng với liều lượng 25mg/kg cho uống sẽ cho kết quả giảm đường huyết tương tự chỉ với liều dùng 15mg/kg tiêm qua tĩnh mạch. [32]

Charantin cho hoạt tính giảm đường huyết cao hơn Tolbutamide, một loại thuốc thông thường để chữa đái tháo đường, với cùng liều dùng Mặc dù cách thức thay đổi glucose huyết khi xử lý ở cả 2 trường hợp đều giống nhau

Tuy nhiên việc charantin có phải là chất duy nhất trong trái có hoạt tính giảm đường huyết hay không vẫn còn là vấn đề đang được đặt ra Vì giả sử để có được 50mg charantin cần tới hơn 1.5kg trái tươi Trong khi theo các nghiên cứu, chỉ với liều dùng 50 – 60ml nướp ép trái hàng ngày đã cho kết quả lâm sàng tốt, chứng tỏ không phụ thuộc hoàn toàn vào rất ít khối lượng của charantin có trong đó

MAP, một protein kháng siêu vi khuẩn, có ức chế nhiễm virus HIV-1 ở tế bào lympho T và bạch cầu đơn nhân to, nó không độc với tế bào bình thường không bị nhiễm Hạt và vỏ trái chứa một chất nhựa, một saponin glycoside, và những alkaloid gây nôn và tiêu chảy Nhiều protein có hoạt tính dược lý được phân lập từ hạt , như các protein α–momorcharin và β–momorcharin có tác dụng độc hại gan trên tế bào gan chuột

cô lập

Ở Trung Quốc, người ta đã phân tách được hai hoạt chất hạn chế sinh sản là α–protein và β–protein từ hạt Các thí nghiệm nuôi cấy, ghép phôi in vitro cho thấy 2 hoạt

chất này có tác dụng ức chế quá trình làm dày đặc nguyên bào phôi trước khi làm tổ và hình thành phôi ở thai kỳ đầu, từ đó phôi ngừng phát triển, thoái hóa phân hủy dẫn đến sẩy thai [13]

Những nghiên cứu gần đây cho thấy α–protein và β–protein cũng có ảnh hưởng đến

sự sinh sản của phôi chuột nhắt trắng và ảnh hưởng đến việc tổng hợp phân tử lớn tế bào nội mô tử cung; chúng cũng có khả năng ức chế tổng hợp ADN, ARN và protein, làm cho

sự phát triển của nội mạc tử cung bị ức chế [13]

THỰC NGHIỆM

1 NGUYÊN LIỆU

Mướp đắng do Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Dược liệu miền Trung cung cấp, là loại mướp đắng còn non, hạt chưa phát triển Trái được cắt thành lát mỏng, sấy ở nhiệt độ dưới 60oC trên hệ thống sấy nguyên liệu đến khối lượng không đổi

Tiếp đó, nguyên liệu được xay nhuyễn để quá trình tách chiết được triệt để hơn

Hình 2.1: Quá trình sấy nguyên liệu

2 NHẬN DANH CÁC NHÓM HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG TRÁI MƯỚP ĐẮNG

Để giúp cho việc nghiên cứu thành phần hóa học và chiết xuất hoạt chất từ cây thuốc, trước hết cần phải tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học để chúng ta có khái niệm sơ bộ về mặt định tính, từ đó có thể định hướng cho việc chiết xuất cũng như việc xác định cấu trúc hóa học các hợp chất trong cây thuốc

Từ mẫu cây, sử dụng kỹ thuật chiết tách khác nhau để có được cao chiết ethanol toàn phần hoặc các loại cao có tính phân cực khác nhau Áp dụng các phương pháp phân tích sơ bộ về hóa- thực vật để biết trong cao chiết có thể chứa các loại hợp chất tự nhiên nào Trong báo cáo này, em xin trình bày về phương pháp sử dụng thuốc thử hiện màu hoặc xuất hiện kết tủa mà em đã thực hiện

2.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid [7, 11]

2.1.1 Thuốc thử alkaloid

Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng màu hoặc kết tủa với alkaloid

* Phản ứng tạo kết tủa có màu:

− Thuốc thử Mayer:

• Công thức: 1.35g HgCl2 hòa tan trong 100ml dung dịch KI 5%

• Dấu hiệu: Tạo kết tủa vô định hình màu trắng vàng

− Thuốc thử Dragendoff:

• Công thức:

+ Dung dịch A: 850mg Bismut nitrat trong 40ml H2O và 10ml acetic băng

+ Dung dịch B: Hòa tan 8g KI trong 20ml H2O

Trộn hai thể tích bằng nhau của hai dung dịch A và B để làm thuốc thử

• Dấu hiệu: Tạo kết tủa có màu từ vàng cam đến đỏ

− Thuốc thử Wagner:

• Công thức: Hòa tan 5g Iod trong 100ml dung dịch KI 10%

• Dấu hiệu: Cho kết tủa màu nâu sáng đến nâu đen

− Thuốc thử Bouchardat:

• Công thức: 2.5g Iod và 5.0g KI hòa tan trong 10ml nước cất

• Dấu hiệu cho kết tủa màu nâu hoặc màu vàng đậm

2.1.2 Định tính alkaloid

Thí nghiệm: Tẩm 10g bột trái mướp đắng bằng 5ml dung dịch NH4OH 25% Đậy kín bằng giấy lọc rồi để qua đêm Sau đó đem chiết với 25ml CHCl3 Dịch CHCl3 được lắc với 10ml dung dịch H2SO4 2% Lấy dịch acid làm mẫu thử

-Với thuốc thử Wagner: Cho kết tủa màu nâu

-Với thuốc thử Mayer: Dung dịch có màu trắng đục

2.2.2 Định tính flavonoid

Thí nghiệm: Đun hoàn lưu 5g bột trái mướp đắng trong 50ml EtOH 95o trong 30 phút Lọc, lấy 1ml dịch EtOH vào ống nghiệm, thêm vài giọt HCl đậm đặc, sau đó cho một ít bột Mg vào lắc thì thấy dung dịch có màu tím

2.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất anthraglycoside

2.3.1 Thuốc thử anthraglycoside

Anthraquinon (phản ứngBotrager): Pha hữu cơ của dịch chiết anthraquinon sẽ có

màu đỏ khi có sự hiện diện của chất kiềm Do vậy dạng kết hợp phải được thủy phân và chuyển sang dạng oxy hóa trước khi thực hiện phản ứng

Anthron và anthranol:

− Phản ứng Schouteten: Cho huỳnh quang xanh với natri borat

− Phản ứng tạo màu xám với natri nitrodimethyl alanin

2.3.2 Định tính anthraglycoside [7 ]

Thí nghiệm: Đun hoàn lưu 5g bột trái mướp đắng trong 30ml ether ethyl Lọc và lặp lại nhiều lần cho đến khi dịch ether không còn màu Tập trung dịch lọc và lắc với 50ml dung dịch KOH 10% Lớp kiềm được trung hòa với dung dịch HCl 25% đến pH=7 Lọc, lấy phần kết tủa trên giấy lọc, đem hòa tan bằng EtOH 95o Nhỏ vài giọt dung dịch KOH 10% vào dịch EtOH thấy có màu vàng cam

Bã sau khi đã loại các chất tan trong ether được chiết tiếp với EtOH 95o Nhỏ vào dịch EtOH vài giọt KOH 10% thấy có màu đỏ cam

• Với thuốc thử Liebermann- Burchard: Có màu hồng đỏ

• Với thuốc thử Salkowski: Thêm 0.5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc Dung dịch tách làm hai lớp, lớp H2SO4 (lớp trên) có màu xanh và lớp CHCl3 (lớp dưới) có màu đỏ với thuốc thử Salkowski

2.5.1 Thuốc thử saponin

Căn cứ vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin

Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: Chỉ số tạo bọt của saponin là

độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện qui định

Cách tiến hành: Cân 1g bột dược liệu cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước

sôi Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa Lọc để nguội, thêm nước cất cho đến 100ml (thu được nước sắc) Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, …10ml nước sắc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10ml Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong

15 giây Mỗi giây lắc 2 lần Để yên trong 15 phút Sau đó đo chiều cao các cột bọt Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1cm thì chỉ số bọt là dưới 100, nghĩa là không có saponin

+ Nếu có huỳnh quang màu xanh thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene

+ Nếu huỳnh quang màu vàng thì sơ bộ nhận định có saponin steroid

2.5.2 Định tính saponin

Thí nghiệm: Cân 1g bột trái mướp đắng cho vào erlen 500ml chứa sẵn 100ml nước sôi Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa Lọc, để nguội Cho khoảng

1ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ và lắc mạnh trong 15 giây thì thấy rất nhiều bọt (cột bọt cao 6cm)

Thí nghiệm: Acid hóa 2g bột trái mướp đắng bằng 20ml dung dịch H2SO4 1% Lọc,

cô cạn còn 5ml Nhỏ vào mẫu thử 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 – 5 giọt thuốc thử Fehling B Đun nhẹ thấy xuất hiện tủa màu đỏ nâu

2.7.1 Thuốc thử tannin

• Stiasny: Formol (36%): 20ml

Dung dịch HCl đậm đặc : 10ml

• Dung dịch gelatin mặn: Gelatin: 2g

Dung dịch NaCl bão hòa: 10ml

• Dung dịch acetate chì bão hòa cho kết tủa màu vàng nhạt

• Dung dịch FeCl3 1% trong nước tạo phức màu đen

Lấy 2ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch gelatin mặn, xuất hiện kết tủa trắng

Lấy 2ml dịch lọc, thêm 2ml dung dịch FeCl3 1%, dung dịch chuyển thành màu nâu đen

2.8.1 Thuốc thử glycoside

Thuốc thử tác dụng lên phần aglycon

− Thuốc thử Tollen (xác định theo đường khử trong glycoside):

• Công thức: Pha 0.5ml dung dịch AgNO3 10% với 0.5ml dung dịch NaOH 10% Sau đó nhỏ từ từ dung dịch NH4OH đến khi tan kết tủa

• Dấu hiệu: Có Ag kết tủa

− Thuốc thử Molish:

• Công thức: Nhỏ 1 – 2 giọt dung dịch thymol 2% vào 1ml H2SO4 đậm đặc

• Dấu hiệu: Xuất hiện màu đỏ thẳm

95o và lấy dung dịch này làm mẫu thử

- Với thuốc thử Tollen: Xuất hiện kết tủa trắng

- Với thuốc thử Molish: Có màu đỏ carmine

3.TÁCH CHIẾT, CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT

3.1 Thiết bị và hóa chất

3.1.1 Thiết bị

- Điểm chảy (mp oC) được đo trên máy Electrothermal IA 9000 Series

- Sắc ký cột thường dùng silicagel 60, MERCK, đường kính hạt: 0.04 –

0.63mm

- Sắc ký bản mỏng TLC được thực hiện trên bản silicagel 60 F254, MERCK tráng sẵn

- Máy cô quay chân không

- Máy soi UV

Hình 2.2: Sắc ký cột thường Hình 2.3: Sắc ký bản mỏng (TLC)

3.1.2 Hóa chất

- Petroleum ether, Trung Quốc

- Diethyl ether, Trung Quốc

- Chloroform, Trung Quốc

- Ethyl acetate, Trung Quốc

- Acetone, Trung Quốc

- Methanol, Trung Quốc

- Nước cất

- Ethanol 95o

3.2 Chiết xuất các nhóm hợp chất

Trái mướp đắng sấy khô, xay nhỏ (4.5 kg), được chiết với ethanol 95o Sau đó, cô

loại dung môi thu được cao dạng sệt gọi là cao tổng (cao EtOH 95 o) (537 g)

Cao tổng hòa tan trong một lượng nước vừa đủ sệt dung dịch này được lắc với

petroleum ether (PE), thu lấy dịch PE và cô loại dung môi thu được cao PE

Pha nước còn lại sau khi lắc với EP được lắc tiếp tục với ethyl acetate (EtOAc), dịch

EtOAc cô loại dung môi thu được cao EtOAc (219 g)

Pha nước còn lại sau khi lắc với EtOAc được lắc tiếp tục với methanol (MeOH),

dịch MeOH cô đuổi dung môi thu được cao MeOH (254 g)

Sơ đồ 2.1: Quy trình chiết xuất các nhóm hợp chất của trái mướp đắng

Bột trái mướp đắng

Cao EtOH 95 o

Dịch nước

Dịch nước Cao EtOAc

Dịch nước Cao MeOH

Cao PE

Chiết với ethanol 95o

Cô đuổi dung môi

Chiết với petroleumether

Cô đuổi dung môi

Chiết với ethyl acetate

Cô đuổi dung môi

Chiết với methanol

Cô đuổi dung môi