cuối kỳ quang học kỹ thuật

SẮC KÝPhương pháp tách trong đó cấu tử ( thành phần hóa học ) được phân bố giữa 2 phaPha tĩnh : giữ cấu tử ( rắn, lỏng )Pha động : kéo cấu tử ra khỏi cột ( lỏng, khí )Sắc ký phẳng Tấm phẳng ( thường là thủy tinh ) tráng lớp pha tĩnhPha động ( thường là nước ) đựng trong khayNhúng tấm phẳng vào khay ( nơi xảy ra tác dụng của lực mao dẫn, nước dính vào tấm phẳng, trọng lực kéo pha tĩnh đi xuống). Cấu tử có tương tác với mao dẫn sẽ thắng trọng lực và đi lên, tương tác càng mạnh càng đi lên cao Sắc ký cột ( pha tĩnh được giữ trong cột và pha động được cho chuyển động qua cột bởi áp suất hay trọng lực, detector có nhiệm vụ phát hiện cấu tử và được thể hiện trên sắc ký đồ, sắc ký đồ thể hiện các peak, peak tỷ lệ thuận với số lượng cấu tử ) Rửa giải : (bơm 1 lần hết )pha động được chế vào với lưu lượng nhất định. A,B,C là các cấu tử cần tách ,E là dung môi . Trên detector 3 peaks xuất hiện riêng biệt ( độ tinh khiết cao)Tiền lưu : nhỏ theo thời gian ( pha động được bơm liên tục ) => chỉ có A đầu tiên là tinh khiết, về sau không còn tinh khiết do các giọt bị trộn lẫn. Nhưng, tiền lưu có ưu điểm : nếu chỉ lấy độ tinh khiết của A thì sẽ nhanh hơn do đổ liên tục pha động định lượng và định tính đều dựa vào detector một số trường hợp không cần detector để định lượng, có thể dùng tR ( thời gian lưu : biểu thị time từ lúc mẫu đưa vào cột cho đến khi có sự nhận biết được chiều cao của peak lớn nhất trên sắc ký đồ ) tR thường không chính xác trong việc định tính do nhiều chất có tR gần giống nhau, thông thường để định tính, kết hợp với Mass spectrometer hay Infrared spectrometer Cơ chế tách •Hấp thụ•Rây ( phân tử ) : phân tử lớn ở lại, phân tử nhỏ rớt xuống •Trao đổi ion Trạng thái pha động : Sắc ký lỏng, sắc ký khíCác hình thành sắc đồ•Tiền lưu•Rửa giải•ĐẩyThiết bị hình thành sắc đồ : sắc ký cột, sắc ký phẳng tách chất màu trong lá có các pp sau : sắc ký cột , sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy Sắc ký lỏng ( Liquid Chromatography – LC ) : Có khả năng phân tích những hỗn hợp mẫu cực kỳ phức tạp trong hóa học và trong khoa họcSắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC – high performance liquid chromatography) có thể dò tìm được lượng mẫu nhỏ đến 200 pg các loại sắc ký ( tùy thuộc cơ chế lưu) Sắc ký lỏng – rắn ( sắc ký hấp thụ ) : pha tĩnh là chất rắn trơ đối với các chất cần phân tích. Hệ số hóa lý là hệ số hấp thụSắc ký trao đổi ion : pha động là những dung dịch đệm, còn pha tĩnh là rắn có cấu tạo bề mặt gắn những nhóm trao đổi ionSắc ký rây phân tử ( size exclusion chromatography ) : pha tĩnh là vật liệu có lỗ xốp. Các phân tử có kích thước phù hợp với kích thước lỗ sẽ được lưu giữ trong cột lâu hơn. (kích thước lỗ là yếu tố đặc trưng cho quá trình tách)Sắc ký lỏng – lỏng (hiệu suất không cao) : pha tĩnh lỏng được phủ lên vật liệu trơ hay xốp. Quá trình tách chất dựa trên sự phân bố chất tan giữa hai pha tĩnh và động ( 2 pha đều lỏng). Hệ số đặc trưng của quá trình là hệ số phân bốSơ đồ cấu tạo máy HPLCBình chứa dung môi => máy bơm => cột tách và van tiêm mẫu ( chứa trong lò nhiệt)=> detector => computor cột tách (nhồi) đặt trong lò nhiệt => tạo nhiệt độ ổn định, nhiệt độ không ổn định thì tR và vận tốc đi xuống bị ảnh hưởng1. Bình chứa dung môiBình thủy tinh (trơn) có lỗ trên nắp gắn ống nhựa dẫn dung môi (pha động) từ bình đến bơmCần lọc tạp chất trong dung môi qua giấy lọc 0.45 µm trước khi dùng và nên có đầu lọc gắn vào đầu ống nhựa trong bình chứaCần loại bỏ hoặc đuổi các không khí hòa tan hoặc bọt khí trong dung môi để trách nhiễu đường nền. Loại bỏ bằng siêu âm hoặc sục khí trơ như heli2. Bơm cao áp : vận chuyển pha động (dung môi) đi qua cột tách với tốc độ nhất định. Các loại bơm thông dụng : •Bơm tốc độ dòng hằng định (constant flow pump) : bơm kiểu syringe đẩy dung môi liên tục, khi hết dung trong ống, bơm dừng lại•Bơm kiểu piston thì đẩy hút luân phiên3. Hệ thống tiêm mẫuTiêm mẫu bằng tay ( tiêm bằng ống tiêm syringe)Tiêm mẫu tự động Tiêm với liều lượng xác định, nếu mẫu là rắn thì kèm thêm dung môi4. Cột tách ( được nhồi pha tĩnh )Được làm bằng vật liệu thép không rỉ ( thép CrNiMo) với mặt trong cột được làm nhẵnKích thước phổ biến : đường kính ngoài 6.35 mm, đường kính trong 4.6mm và chiều dài nhiều cỡ đến 25cmCột được nhồi các hạt có đường kính cỡ 3, 4, 5, 10 mirco mét. Chất nhồi trong cột thường là silicagen, nhôm oxit, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion5. DetectorDetector UV – VIS (thiên về định lượng) : cho pha động từ cột được chảy qua một ống đo nhỏ có chùm bức xạ đơn sắc UVVIS chiếu qua. Đo phổ hấp thụ UVVISDetector huỳnh quang (tốt cho định tính) : dùng cho các hợp chất có vòng liên hợp như các hợp chất vòng thơm có nhiều nhân. Nhiều hợp chất không có phổ có thể chuyển sang các dẫn xuất có phổ nhờ xử lý thuốc thử hợp lý chất nhuộm phát quang, đo nồng độ chất nhuộm => nồng độ chất không phát quang (do tỉ lệ thuận với nhau)Detector đo chỉ số khúc xạ (Refractive index detector) (đo chiết suất không chính xác do chiết suất dễ bị ảnh hưởng bởi tạp chất) : detector thông dụng nhất do bất kỳ chất hòa tan nào đều dò tìm được miễn chỉ số khúc xạ khác với dòng chảy của pha động nguyên chấtDetector đo độ dẫn điện (Conductivity detector) : xác định ion vô cơ, hữu cơDetector khối phổ ( mass spectrometry) : xác định phần lớn các chất hữu cơ ( hóa hơi trước thích hợp sắc ký khí )6. Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu do phổ hiện thị hẹp nên dùng phân bố Gaussian để xem do nhiễu hay đó là phổ thật sựSắc ký khí ( Gas chromatography – GC)1. Sắc ký khí lỏng ( GLC) Pha tĩnh là lỏng được phủ lên bề mặt rắn của một chất mang bằng sự hấp thụ bề mặt hay liên kết với bề mặt bên trong chất mang của cột. Mẫu phải được hóa hơi và được khí mang đưa đi qua cột, làm tăng khả năng tách các hợp chất từ trong mẫu ban đầu.2. Sắc ký khí – rắn (GSC) ( ưu tiên do dễ xử lý ) Pha tĩnh ở dạng rắn xốp như than hoạt tính, silicagel, bột nhôm. Pha động là khí. Sắc ký loại này ảnh hưởng tới những cấu tử trong hỗn hợp có nhiệt độ sôi thấpCấu tạo hệ thống sắc ký khí ( cột nhồi và detector được đặt trong lò )1. Khí mang( pha động ) trơ về mặt hóa học như N2, H2, He, Ar, CO¬2,… Khí He và Ar thích hợp cho sắc ký nhiệt độ cao Khí N2 rẻ và dễ dàng làm tinh khiết nên được dùng nhiều việc chọn khí dựa vào loại detector được sử dụngHệ thống cung cấp khí mang bao gồm các bộ điều chỉnh áp suất (pressure regulators), các thiết bị đo áp suất (gauges), thiết bị đo tốc độ dòng, hệ thống lọc phân tử để tách nước và các chất nhiễm bẩn khác2. Bộ phận tiêm mẫu ( vào cột nhồi ) Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo thể tích bơm có thể thay đổi từ một vài đến 20 µl. Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công (microsyringe) và tiêm mẫu tự động (autosamper)3. Cột phân tích (pha tĩnh)Cột thường được làm bằng thép không rỉ, niken, thủy tinh. Cột nhồi chứa các hạt chất mang rắn được phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặc bản thân hạt rắn là pha tĩnh (Al2O3, SiO2, cacbon, polymer, zeolite…). đường kính cột nhỏ, uốn cong được Có 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản.Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường kính 24 mm và chiều dài 23 m. Giá thành thấp, nạp mẫu đơn giản, hiệu quả thấp. Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong (bề dày 0,20,5 µm), cột có đường kính trong 0,10,5 mm và chiều dài 30100 m. Hiệu quả cao, nhanh, thích hợp cho hỗn hợp phức tạp.4. Detector Detector dẫn nhiệt ( thermal conductivity detector – TCD) Sự khác nhau về tính dẫn nhiệt của các khí là do tính linh động, nghĩa là tốc độ khí khuếch tán tới và đi khỏi sợi đốt. Tốc độ của phân tử lại là hàm của trọng lượng phân tử, do đó phân tử càng nhỏ tốc độ chuyển động càng cao, dẫn nhiệt càng tốt Heli là khí mang thông dụng được sử dụng cho detector đo độ dẫn nhiệt TCD. Bất kỳ chất phân tích nào trộn với dòng khí He cũng làm giảm độ dẫn nhiệt của nó, sợi dây tóc trở nên nóng hơn nên điện trở của nó tăng lên và thế áp vào sợi dây này thay đổi. R3 : chứa khí Heli + khí của chất phân tíchR4 : điện trở mẫu dùng để so sánh độ chính xác không cao về mặt định lượngb) Detector ion hóa ngọn lửa (Flame Ioniation Detetor FID): Dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa được tạo bởi hỗn hợp khí H2 và O2 trong không khí (nguồn ion hóa) và được đặt trong buồng điện cực. Khi khí mang đem theo các phân tử mẫu, các phân tử này bị bắn phá bởi các chùm hạt electron tạo thành các hạt tích điện tạo thành dòng điện giữa hai điện cực. Các tín hiệu được ghi lại dưới dạng các pic. Độ nhạy của detector FID cao hơn độ nhạy của detector TCD khoảng 100 1000 lần. Thích hợp nhất với hợp chất hữu cơ chứa cacbon. Một số hợp chất không thể phát hiện bằng detector này như: CO, CO2, axit formic, formaldehit, H2S, H2O … Columm : đầu ra cột nhồi Detector cộng kết điện tử (ECDElectron Capture Detector) Detector quang hóa ngọn lửa (FPDFlame Photometric Detector) Detector NPD (Nitrogen Phospho Detector) Detector khối phổ (MSMass Spectrometry): được sử dụng rộng rãi nhất nhưng đắt tiền.Nếu chỉ cần biết những thông tin định tính để nhận diện các chất rửa giải, các detector khối phổ và hồng ngoại là những chọn lựa tốt. Detector hồng ngoại giống detector đo độ dẫn nhiệt thường không đủ nhạy cho những cột mao quản mở.5. Bộ ghi nhận tín hiệu : ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện và hiển thị lên màn hình các thông số liên quan, sắc ký đồ, các peak, …

SẮC KÝ

Phương pháp tách trong đó cấu tử ( thành phần hóa học ) được phân bố giữa 2 pha

Pha tĩnh : giữ cấu tử ( rắn, lỏng )

Pha động : kéo cấu tử ra khỏi cột ( lỏng, khí )

Sắc ký phẳng

Tấm phẳng ( thường là thủy tinh ) tráng lớp pha tĩnh

Pha động ( thường là nước ) đựng trong khay

Nhúng tấm phẳng vào khay ( nơi xảy ra tác dụng của lực mao dẫn, nước dính vào tấm phẳng, trọng lực kéo pha tĩnh đi xuống) Cấu tử có tương tác với mao dẫn sẽ thắng trọng lực và đi lên, tương tác càng mạnh càng đi lên cao

Rửa giải : (bơm 1 lần hết )pha động được chế vào với lưu lượng nhất định A,B,C là các cấu

tử cần tách ,E là dung môi Trên detector 3 peaks xuất hiện riêng biệt ( độ tinh khiết cao)

Tiền lưu : nhỏ theo thời gian ( pha động được bơm liên tục ) => chỉ có A đầu tiên là tinh khiết, về sau không còn tinh khiết do các giọt bị trộn lẫn Nhưng, tiền lưu có ưu điểm : nếu

chỉ lấy độ tinh khiết của A thì sẽ nhanh hơn do đổ liên tục pha động

* định lượng và định tính đều dựa vào detector

* một số trường hợp không cần detector để định lượng, có thể dùng tR ( thời gian lưu : biểu thị time từ lúc mẫu đưa vào cột cho đến khi có sự nhận biết được chiều cao của peak lớn nhất trên sắc ký đồ )

* tR thường không chính xác trong việc định tính do nhiều chất có tR gần giống nhau, thông thường để định tính, kết hợp với Mass spectrometer hay Infrared spectrometer

Cơ chế tách

 Hấp thụ

 Rây ( phân tử ) : phân tử lớn ở lại, phân tử nhỏ rớt xuống

 Trao đổi ion

Trạng thái pha động : Sắc ký lỏng, sắc ký khí

Các hình thành sắc đồ

 Tiền lưu

 Rửa giải

 Đẩy

Thiết bị hình thành sắc đồ : sắc ký cột, sắc ký phẳng

* tách chất màu trong lá có các pp sau : sắc ký cột , sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy

Sắc ký lỏng ( Liquid Chromatography – LC ) :

Có khả năng phân tích những hỗn hợp mẫu cực kỳ phức tạp trong hóa học và trong khoa học Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC – high performance liquid chromatography) có thể dò tìm được lượng mẫu nhỏ đến 200 pg

* các loại sắc ký ( tùy thuộc cơ chế lưu)

Sắc ký lỏng – rắn ( sắc ký hấp thụ ) : pha tĩnh là chất rắn trơ đối với các chất cần phân tích.

Hệ số hóa lý là hệ số hấp thụ

Sắc ký trao đổi ion : pha động là những dung dịch đệm, còn pha tĩnh là rắn có cấu tạo bề

mặt gắn những nhóm trao đổi ion

Sắc ký rây phân tử ( size exclusion chromatography ) : pha tĩnh là vật liệu có lỗ xốp Các

phân tử có kích thước phù hợp với kích thước lỗ sẽ được lưu giữ trong cột lâu hơn (kích thước lỗ là yếu tố đặc trưng cho quá trình tách)

Sắc ký lỏng – lỏng (hiệu suất không cao) : pha tĩnh lỏng được phủ lên vật liệu trơ hay xốp

Quá trình tách chất dựa trên sự phân bố chất tan giữa hai pha tĩnh và động ( 2 pha đều lỏng)

Hệ số đặc trưng của quá trình là hệ số phân bố

Sơ đồ cấu tạo máy HPLC

Bình chứa dung môi => máy bơm => cột tách và van tiêm mẫu ( chứa trong lò nhiệt)=> detector => computor

* cột tách (nhồi) đặt trong lò nhiệt => tạo nhiệt độ ổn định, nhiệt độ không ổn định thì tR và vận tốc đi xuống bị ảnh hưởng

1 Bình chứa dung môi

Bình thủy tinh (trơn) có lỗ trên nắp gắn ống nhựa dẫn dung môi (pha động) từ bình đến bơm Cần lọc tạp chất trong dung môi qua giấy lọc 0.45 µm trước khi dùng và nên có đầu lọc gắn vào đầu ống nhựa trong bình chứa

Cần loại bỏ hoặc đuổi các không khí hòa tan hoặc bọt khí trong dung môi để trách nhiễu đường nền Loại bỏ bằng siêu âm hoặc sục khí trơ như heli

2 Bơm cao áp : vận chuyển pha động (dung môi) đi qua cột tách với tốc độ nhất định Các

loại bơm thông dụng :

 Bơm tốc độ dòng hằng định (constant flow pump) : bơm kiểu syringe đẩy dung môi liên tục, khi hết dung trong ống, bơm dừng lại

 Bơm kiểu piston thì đẩy hút luân phiên

3 Hệ thống tiêm mẫu

Tiêm mẫu bằng tay ( tiêm bằng ống tiêm syringe)

Tiêm mẫu tự động

* Tiêm với liều lượng xác định, nếu mẫu là rắn thì kèm thêm dung môi

4 Cột tách ( được nhồi pha tĩnh )

Được làm bằng vật liệu thép không rỉ ( thép Cr-Ni-Mo) với mặt trong cột được làm nhẵn Kích thước phổ biến : đường kính ngoài 6.35 mm, đường kính trong 4.6mm và chiều dài nhiều cỡ đến 25cm

Cột được nhồi các hạt có đường kính cỡ 3, 4, 5, 10 mirco mét Chất nhồi trong cột thường là silicagen, nhôm oxit, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion

5 Detector

Detector UV – VIS (thiên về định lượng) : cho pha động từ cột được chảy qua một ống đo

nhỏ có chùm bức xạ đơn sắc UV/VIS chiếu qua Đo phổ hấp thụ UV-VIS

Detector huỳnh quang (tốt cho định tính) : dùng cho các hợp chất có vòng liên hợp như các

hợp chất vòng thơm có nhiều nhân Nhiều hợp chất không có phổ có thể chuyển sang các dẫn xuất có phổ nhờ xử lý thuốc thử hợp lý

* chất nhuộm phát quang, đo nồng độ chất nhuộm => nồng độ chất không phát quang (do tỉ

lệ thuận với nhau)

Detector đo chỉ số khúc xạ (Refractive index detector) (đo chiết suất không chính xác do

chiết suất dễ bị ảnh hưởng bởi tạp chất) : detector thông dụng nhất do bất kỳ chất hòa tan nào đều dò tìm được miễn chỉ số khúc xạ khác với dòng chảy của pha động nguyên chất

Detector đo độ dẫn điện (Conductivity detector) : xác định ion vô cơ, hữu cơ

Detector khối phổ ( mass spectrometry) : xác định phần lớn các chất hữu cơ ( hóa hơi

trước thích hợp sắc ký khí )

6 Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu

* do phổ hiện thị hẹp nên dùng phân bố Gaussian để xem do nhiễu hay đó là phổ thật sự

Sắc ký khí ( Gas chromatography – GC)

1 Sắc ký khí - lỏng ( GLC)

- Pha tĩnh là lỏng được phủ lên bề mặt rắn của một chất mang bằng sự hấp thụ bề mặt hay liên kết với bề mặt bên trong chất mang của cột

- Mẫu phải được hóa hơi và được khí mang đưa đi qua cột, làm tăng khả năng tách các hợp chất từ trong mẫu ban đầu

2 Sắc ký khí – rắn (GSC) ( ưu tiên do dễ xử lý )

- Pha tĩnh ở dạng rắn xốp như than hoạt tính, silicagel, bột nhôm Pha động là khí

- Sắc ký loại này ảnh hưởng tới những cấu tử trong hỗn hợp có nhiệt độ sôi thấp

Cấu tạo hệ thống sắc ký khí ( cột nhồi và detector được đặt trong lò )

1 Khí mang( pha động )

- trơ về mặt hóa học như N2, H2, He, Ar, CO2,…

- Khí He và Ar thích hợp cho sắc ký nhiệt độ cao

- Khí N2 rẻ và dễ dàng làm tinh khiết nên được dùng nhiều

- việc chọn khí dựa vào loại detector được sử dụng

Hệ thống cung cấp khí mang bao gồm các bộ điều chỉnh áp suất (pressure regulators), các thiết bị đo áp suất (gauges), thiết bị đo tốc độ dòng, hệ thống lọc phân tử để tách nước và các chất nhiễm bẩn khác

2 Bộ phận tiêm mẫu ( vào cột nhồi )

- Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo thể tích bơm có thể thay đổi từ một vài đến 20 µl

- Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công (microsyringe) và tiêm mẫu tự động (autosamper)

3 Cột phân tích (pha tĩnh)

-Cột thường được làm bằng thép không rỉ, niken, thủy tinh

- Cột nhồi chứa các hạt chất mang rắn được phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặc bản thân hạt rắn

là pha tĩnh (Al2O3, SiO2, cacbon, polymer, zeolite…) * đường kính cột nhỏ, uốn cong được

- Có 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản

Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường kính 2-4 mm

và chiều dài 2-3 m Giá thành thấp, nạp mẫu đơn giản, hiệu quả thấp

Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong (bề dày 0,2-0,5 µm), cột có đường kính trong 0,1-0,5 mm và chiều dài 30-100 m Hiệu quả cao, nhanh, thích hợp cho

hỗn hợp phức tạp

4 Detector

Detector dẫn nhiệt ( thermal conductivity detector – TCD)

- Sự khác nhau về tính dẫn nhiệt của các khí là do tính linh động, nghĩa là tốc độ khí khuếch tán tới và đi khỏi sợi đốt

- Tốc độ của phân tử lại là hàm của trọng lượng phân tử, do đó phân tử càng nhỏ tốc độ chuyển động càng cao, dẫn nhiệt càng tốt

- Heli là khí mang thông dụng được sử dụng cho detector đo độ dẫn nhiệt TCD Bất kỳ chất phân tích nào trộn với dòng khí He cũng làm giảm độ dẫn nhiệt của nó, sợi dây tóc trở nên nóng hơn nên điện trở của nó tăng lên và thế áp vào sợi dây này thay đổi

R3 : chứa khí Heli + khí của chất phân tích

R4 : điện trở mẫu dùng để so sánh

* độ chính xác không cao về mặt định lượng

b) Detector ion hóa ngọn lửa (Flame Ioniation Detetor - FID):

- Dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa được tạo bởi hỗn hợp khí H2 và O2 trong không khí (nguồn ion hóa) và được đặt trong buồng điện cực

- Khi khí mang đem theo các phân tử mẫu, các phân tử này bị bắn phá bởi các chùm hạt electron tạo thành các hạt tích điện tạo thành dòng điện giữa hai điện cực Các tín hiệu được ghi lại dưới dạng các pic

- Độ nhạy của detector FID cao hơn độ nhạy của detector TCD khoảng 100 - 1000 lần.

- Thích hợp nhất với hợp chất hữu cơ chứa cacbon Một số hợp chất không thể phát hiện bằng detector này như: CO, CO2, axit formic, formaldehit, H2S, H2O …

Columm : đầu ra cột nhồi Detector cộng kết điện tử (ECD-Electron Capture Detector)

Detector quang hóa ngọn lửa (FPD-Flame Photometric Detector)

Detector NPD (Nitrogen Phospho Detector)

Detector khối phổ (MS-Mass Spectrometry): được sử dụng rộng rãi nhất nhưng đắt tiền

Nếu chỉ cần biết những thông tin định tính để nhận diện các chất rửa giải, các detector khối phổ và hồng ngoại là những chọn lựa tốt Detector hồng ngoại giống detector đo độ dẫn

nhiệt thường không đủ nhạy cho những cột mao quản mở

5 Bộ ghi nhận tín hiệu : ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện và hiển thị lên màn hình các thông

số liên quan, sắc ký đồ, các peak, …

Ứng dụng : SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ĐỂ PHÂN TÍCH CHẤT TRONG THỰC PHẨM

1 Cấu tạo máy

Trong đó:

1: Bình chứa pha động

2: Bộ phận khử khí

3: Bơm cao áp

4: Bộ phận tiêm mẫu

5: Cộ sắc ký (pha tĩnh)

6: Đầu dò

7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống 8: In dữ liệu

2 Chuẩn bị máy

Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng, năng lượng đèn đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra

Đặc biệt, cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký

Ví dụ: Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: Rửa bằng MeOH không rửa bằng nước

Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước trước

Trước khi mở máy phải kiểm tra các bình chứa dung môi pha động, nếu mực dung dịch trong bình còn ít quá thì cần thêm dung môi Đồng thời kiểm tra bình nước thải, nếu đầy thì phải đem đổ

3 Chuẩn bị pha động

Pha động trong HPLC được đưa liên tục vào hệ thống Dung môi sử dụng cho

pha động cần phải sạch, có độ tinh khiết nhất định

Trước khi gắn vào máy HPLC, dung môi phải được khử bọt khí, bởi vì nếu còn

lẫn bọt khí vào trong luồng dung môi đi vào máy sẽ làm cho máy bơm và đầu dò hoạt động kém hiệu quả Có thể khử khí bằng cách cho một luồng khí helium xục mạnh vào bình với vận tốc 300ml/phút trong vài phút, bong bóng khí helium sẽ đuổi bọt khí ra khỏi bình Dung môi bão hòa helium không ảnh hưởng gì đến quá trình sắc kí Cũng

có thể khử khí bằng cách đặt bình đã mở nắp vào bồn siêu âm và cho máy hoạt động trong 5 – 10 phút

Dung môi và đệm cần lọc thật kỹ (dưới lỗ lọc 0,45 µm) đuổi khí pha động; hạn

chế dùng đệm, nếu có dùng thì dùng đệm acetate tốt hơn là đệm phosphate Nếu sử

dụng dung môi là nước thì cần phải cẩn thận vì trong môi trường nước vi khuẩn có thể sinh sản, cần thường xuyên thay nước (phòng tránh các hạt gây ra hỏng máy hay tắc đầu cột), có thể dùng sodium azid 0,04 làm chất diệt khuẩn trong nước

Dung môi của Merck có những ưu điểm sau: khi sử dụng không cần phải lọc,

không dùng chất ổn định trong dung môi (vì chất ổn định thường tạo tạp), không chứa clo trong dung môi (vì nếu có clo dưới tác dụng của ánh sáng sẽ xảy ra phản ứng làm hỏng cột) Nếu sử dụng dung môi có chất lượng thấp khi chạy máy sẽ xuất hiện những peak lạ và có thể làm nghẹt cột hoặc hỏng máy, vì vậy đối với pha động phải sử dụng dung môi thật sạch và có độ tinh khiết cao

4 Chuẩn bị mẫu

Xử lí mẫu là quá tình hòa tan và phân hủy, phá hủy cấu trúc mẫu ban đầu lấy từ

đối tượng cần phân tích, để giải phóng và chuyển hóa chất cần xác định về một dạng đồng thể phù hợp cho một phép đo đã chọn để xác định hàm lượng của chất mà chúng

ta mong muốn

Xử lí mẫu có hai quá trình xảy ra đồng thời là:

- Phá hủy cấu trúc ban đầu của mẫu

- Hòa tan giải phóng chất cần xác định

Lý do phải xử lý mẫu:

Để đưa các chất cần xác định về một trạng thái thích hợp cho phép đo, theo

phương pháp phân tích đã chọn

-Các kết quả phân tích phải phản ánh và đại diện đúng cho đối tượng cần

nghiên cứu, theo dõi

-Với bất kì một phương pháp xác định, mỗi chất cần phân tích chỉ có thể được

xác định chính xác khi nó tồn tại ở một trạng thái nhất định và đồng nhất phù hợp với kĩ thuật phân tích

-Mẫu phân tích có nhiều chủng loại, đa dạng, có thành phần đơn giản đến loại

có thành phần phức tạp Chúng có thể tồn tại ở các dạng khác nhau như rắn từng

cục, từng mảnh, hay lỏng, khí, huyền phù Không thể cho nguyên mẫu như thế vào máy để đo và xác định được Phải xử lí để đưa các chất phân tích về trạng thái phù hợp nhất cho một phưong pháp đã được chon để xác định nó

-Các chất cần xác định tồn tại ở trạng thái liên kết hóa học khác nhau, trong các hợp chất vô cơ, hữu cơ khác nhau, có khi rất bền vững, lượng chất ở mỗi vị trí trong mẫu cũng không đồng đều, nên không thể xác định đúng hàm lượng của nó trong một tổ hợp phức tạp, bền vững và bị các nguyên tố, các chất liên kết khác cản trở, do đó cần phải xử lí mẫu để phá vỡ các hợp chất mà chất phân tích đang tồn tại, đưa chúng sang một dạng phù hợp để định lượng tốt và đúng theo phương pháp đã chọn

*1 số kĩ thuật xử lý mẫu:

Kĩ thuật vô cơ hóa khô (xử lí khô)

-Kĩ thuật vô cơ hóa ướt (xử lí ướt)

-Kĩ thuật vô cơ hóa khô – ướt kết hợp

-Các kĩ thuật chiết (lỏng-lỏng, chiết rắn – lỏng, chiết rắn – khí, )

-Các kĩ thuật sắc kí,

Quy trình xử lý:

Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường

hợp dung môi pha động được dùng để hòa tan hoạt chất mẫu

-Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động họăc không rửa giải được bằng cách chiết, lọc Phải lọc và li tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45µm

-Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột Có thể gây ra ngẽn cột

-Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần

5 Nguyên tắc hoạt động

-Hệ thống dung môi (1) đóng vai trò dung môi động được trộn với nhau theo tỉ lệ thích hợp (điều kiển bằng máy tính) và có thể thay đổi thành phần bởi hệ thống xử khí (2) -Pha động được bơm liên tục qua cột tách bằng hệ thống bơm cao áp (3)

-Mẫu phân tích được đưa vào cột tách bằng bộ phận tiêm mẫu (4), sau đó được pha động đẩy vào cột tách (5), quá trình tách xảy ra ở đây

-Các chất sau khi ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau lần lượt vào detector (6) thích hợp và được chuyển thành thế hiệu điện rồi được khuếch đại và chuyển đến bộ phận

tự ghi và xử lí kết quả ở (7)

*Cần lưu ý:

-Đưa mẫu vào: bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào rất cao

-Thời gian lưu của mẫu: Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào đến khi đỉnh (pic) hiển thị rõ nét Khoảng thời gian này bị chi phối bởi các yếu tố:

+ Áp suất đầu vào

+ Tính chất của pha tĩnh (hợp chất, kích thước hạt)

+ Thành phần dung môi

+ Nhiệt độ cột

Qúa trình dịch kết quả:

Kết quả ra thường gồm một dãy pic, mỗi pic đại diện cho một hợp chất trong hỗn hợp

đi qua cột hấp phụ và hấp thụ tia UV Ta có thể điều khiển điều kiện của cột hấp phụ và thời gian lưu để xác định sự có mặt của các hợp chất Những tham số điều khiển này đã được đo trước với các mẫu thử

Tuy nhiên, từ các peak này ta còn có thể định lượng được các hợp chất Giả sử có một hợp chất X Chúng ta đưa một dung dịch có một lượng hợp chất X đã biết trước vào máy

Từ đó, có thể xác định được thời gian lưu cũng như sự tương ứng giữa khối lượng chất X

và hình ảnh của peak Diện tích bên dưới peak ứng với số lượng chất X đi qua máy dò và diện tích này có thể tính được nhờ máy tính nối với màn hình