Lao kháng thuốc và sinh học phân tử

Một chuyên đề hay về lao kháng thuốc giải thích cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao dưới góc độ sinh học phân tử. Chuyên đề gồm cách phần: 1. Định nghĩa lao kháng thuốc 1 2. Dịch tễ học 2 3. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao và sinh học phân tử trong lao kháng thuốc 3 3.1. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao 3 3.2. Cơ chế kháng isoniazid (H) 5 3.3. Cơ chế kháng rifampicin 8 3.4. Cơ chế kháng Pyrazinamid 10 3.5. Cơ chế kháng Ethambutol 11 3.6. Cơ chế kháng Steptomycin 12 3.7. Cơ chế kháng các thuốc kháng lao hàng hai 12 4. Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán lao kháng thuốc 15 4.1. Kỹ thuật PCRRFLP 16 4.2. Giải trình tự ADN 17 4.3. Kỹ thuật lai đầu dò 21 4.4. Xét nghiệm Realtime PCR (RTPCR) 24 5. Điều trị lao kháng thuốc 28 5.1. Phác đồ điều trị lao đơn kháng thuốc và lao kháng nhiều thuốc 28 5.2. Phác đồ điều trị lao đa kháng thuốc 29 5.3. Điều trị lao siêu kháng thuốc 30 5.4. Phác đồ điều trị lao kháng thuốc theo Dự án phòng chống lao tại Việt Nam 30

Danh mục chữ viết tắt

1 Định nghĩa lao kháng thuốc 1

2 Dịch tễ học 2

3 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao và sinh học phân tử trong lao kháng thuốc 3

3.1 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao 3

3.2 Cơ chế kháng isoniazid (H) 5

3.3 Cơ chế kháng rifampicin 8

3.4 Cơ chế kháng Pyrazinamid 10

3.5 Cơ chế kháng Ethambutol 11

3.6 Cơ chế kháng Steptomycin 12

3.7 Cơ chế kháng các thuốc kháng lao hàng hai 12

4 Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán lao kháng thuốc 15

4.1 Kỹ thuật PCR-RFLP 16

4.2 Giải trình tự ADN 17

4.3 Kỹ thuật lai đầu dò 21

4.4 Xét nghiệm Real-time PCR (RT-PCR) 24

5 Điều trị lao kháng thuốc 28

5.1 Phác đồ điều trị lao đơn kháng thuốc và lao kháng nhiều thuốc 28

5.2 Phác đồ điều trị lao đa kháng thuốc 29

5.3 Điều trị lao siêu kháng thuốc 30

5.4 Phác đồ điều trị lao kháng thuốc theo Dự án phòng chống lao tại Việt Nam 30

Tài liệu tham khảo

LSKT : Lao siêu kháng thuốc

Tiếng Anh

KM : Kanamycin

1 Định nghĩa lao kháng thuốc

Bệnh lao kháng thuốc, đặc biệt là lao đa kháng thuốc (LĐKT) và lao siêu kháng thuốc(LSKT), ngày càng diễn biến phức tạp và đang có chiều hướng gia tăng, nhất là khi có phốihợp với nhiễm HIV/AIDS, gây nhiều khó khăn cho công tác quản lý và kiểm soát bệnh lao,đặc biệt ở những vùng có tỉ lệ nhiễm lao cao và hoạt động chương trình chống lao không

hiệu quả Do đó, những tiến bộ trong việc hiểu biết cơ chế hoạt động và kháng thuốc lao của

vi khuẩn lao, đặc biệt là về khía cạnh di truyền học, góp phần giúp hiểu biết sâu sắc hơn vềsinh bệnh học của những chủng vi khuẩn lao kháng thuốc và cũng là cơ sở khoa học giúpgiải quyết các vấn đề quan trọng như chẩn đoán bệnh lao, phát minh những thuốc kháng laomới và chiến lược điều trị lao thích hợp

Về phương diện sinh học, một dòng vi khuẩn gọi là kháng thuốc lao khi số lượng vikhuẩn kháng thuốc lao đạt tỷ lệ > 1% Lao kháng thuốc được định nghĩa khi vi khuẩn lao

Mycobacterium tuberculosis kháng với ít nhất một loại thuốc kháng lao hàng thứ nhất

(thực hiện trong ống nghiệm) Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) [9] có 4 loại lao khángthuốc:

1 Lao đơn kháng thuốc: khi vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng với mộtloại thuốc kháng lao hàng thứ nhất

2 Lao kháng nhiều thuốc: khi vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng với ítnhất hai loại thuốc kháng lao hàng thứ nhất nhưng không bao gồm cả hai loại thuốcRifampicin và Isoniazid

3 Lao đa kháng thuốc (LĐKT): khi vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis khángvới cả hai loại thuốc Rifampicin và Isoniazid

4 Lao siêu kháng thuốc (LSKT): là LĐKT kết hợp với kháng bất kỳ một thứ thuốcfluoroquinolones và kháng tối thiểu với một trong ba thuốc kháng lao loại chích hàngthứ hai (Capreomycin, Amikacin, Kanamycin…) [8, 21]

Ngày nay, để thuận lợi cho việc quản lý bệnh lao kháng thuốc theo chương trìnhchống lao, lao kháng thuốc không còn được gọi là lao kháng thuốc tiên phát và lao khángthuốc mắc phải mà được chia thành 2 nhóm [11]:

 Lao kháng thuốc mới: là khi một bệnh nhân chưa bao giờ điều trị lao trước đó hoặc đãđiều trị lao dưới một tháng có tiếp xúc với chủng vi khuẩn lao kháng thuốc

 Lao kháng thuốc xảy ra ở những bệnh nhân đã có điều trị lao trước đó như lao tái phát,lao bỏ trị, lao thất hại với phác đồ I và II (thường do điều trị lao không đúng nguyên tắcnhư bệnh nhân tự ý bỏ trị, hoặc dùng thuốc lao không đủ liều, không đủ thời gian, hoặc

cơ địa bệnh nhân đang mắc bệnh nặng trầm trọng gây suy giảm miễn dịch nhất là tìnhtrạng nhiễm HIV/AIDS, đái tháo đường, sử dụng corticoid kéo dài, bệnh lý ác tính…)

2 Dịch tễ học

 Năm 1947, Pyle mô tả sự xuất hiện của kháng thuốc khi dùng Streptomycin để điều trịlao

 Vào thập kỷ 50, đã chứng minh được sự hiện diện của vi khuẩn kháng thuốc trong dòng

hoang dại M tuberculosis ngay cả khi chưa dùng thuốc kháng lao

 Năm 1970, David chứng minh rằng kháng thuốc trong lao xuất phát từ sự xuất hiện độtbiến tự nhiên và ngẫu nhiên trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn David tính được tỷ lệ độtbiến kháng với từng loại thuốc kháng lao như Streptomycin (S), Isoniazid (H),Rifampicin (R), Ethambutol (E) Tỷ lệ dòng đột biến kháng các loại thuốc đối với 106 vikhuẩn như sau: 40 vi khuẩn kháng với S; 5 vi khuẩn kháng với H: 0,1 vi khuẩn kháng với

R, 10 vi khuẩn kháng với E Và khả năng đột biến ngẫu nhiên kháng cùng lúc với 2 thuốc

R và H là 0,1/106 x 5/106

 Năm 1997, trong một khảo sát của WHO về tình trạng lao kháng thuốc trên toàn tầu đãcho thấy tỷ lệ LĐKT mắc phải ở Nepal, Ấn Độ, NewYork, Bolivia, Hàn Quốc lần lượt là48%, 34%, 30%; 15%, và 15% [21]

 Một cuộc khảo sát khác của WHO trong giai đoạn 1999-2002 trên 55.779 trường hợp chothấy tỷ lệ đề kháng với một loại thuốc lao như sau: 6,3% kháng S, 5,9% kháng H; 1,4%kháng R, và 0,8% kháng E Tỷ lệ đa kháng thuốc lao trung bình là 1,1% (0- 14,2%)

 Năm 2004, một báo cáo của WHO cho thấy tỷ lệ LĐKT của một số nước trên toàn cầunhư sau: cao nhất là Parkistan (9,6%); kế tiếp là Afghanistan (7,3%); Nga (6,0%); Trungquốc (5,3%); Cambodia (4,2%); Ấn Độ (3,4%); Philippines (3,25%); Việt nam (2,3%);Tanzania (2,1%); Zimbabwe (1,9%); Nam Phi 11,5%); Myanmar (1,5%); Indonesia(0,7%); Thái lan (0,5%); và Kenya (0%) [19]

 Thống kê của WHO năm 2005 ước tính tối thiểu có 104 nước có ít nhất một trường hợpLĐKT trong đó đa số nước có từ 50 trường hợp LĐKT trở lên

 Năm 2006 trong khi các chương trình chống lao trên thế giới chưa giai quyết được tìnhirạng LĐKT thì nhân loại phải đối mặt với một tình trạng kháng thuốc lao mới, đó làLSKT.

 Năm 2007, trên toàn thế giới ước tính có khoảng 0,5 triệu trường hợp LĐKT, trong đó có

27 nước có tần suất mắc LĐKT cao nhất, đứng hàng đầu là Ấn Độ (131.000 trường hợp),

kế đến là Trung Quốc (112.000), Liên Bang Nga (43.000), Nam Phi (16.000) vàBangladesh (15.000) Đồng thời, có 35 nước có tối thiểu 1 trường hợp LSKT, trong đó cóViệt Nam [20]

 Đến tháng 11/2009, trên toàn thế giới có 57 nước và vùng lãnh thổ có ít nhất 1 trườnghợp LSKT [22]

 Tại Việt nam, tỷ lệ LĐKT mới gia tăng từ 2,3% (vào năm 1997) đến 2,7% (vào năm2007) và tỷ lệ LĐKT ở những bệnh nhân đã điều trị lao trước đó cũng gia tăng từ 14%(vào năm 2004) đến 19% (vào năm 2007) [7]

3 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao và sinh học phân tử trong lao kháng thuốc

3.1 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn lao

Hầu hết các loại vi khuẩn thường dùng một số cơ chế để đề kháng với các loại thuốckháng sinh Những cơ chế này có thể chia thành ba nhóm:

1 Cơ chế làm vững thành tế bào (giảm tính thấm đối với thuốc và bơm đẩy)

2 Tiết ra men làm giảm hay bất hoạt tác dụng của thuốc, chẳng hạn men β-lactamases

3 Làm thay đổi mục tiêu tác dụng của thuốc như đột biến điểm trên vùng gen khóa

Hình 1 Cơ chế tác dụng của thuốc kháng sinh và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn

Vi khuẩn lao về cơ bản không khác biệt so với các vi khuẩn khác trong việc sử dụngcác cơ chế kháng thuốc kháng lao [10] Cơ chế 1 và 2 thường được phát hiện trong sự đềkháng tự nhiên của vi khuẩn lao đối với các loại thuốc kháng lao được sử dụng thườngxuyên Tuy nhiên cơ chế 3, cơ chế đột biến gen, mới là cơ chế chính dẫn đến LĐKT vàLSKT

Về mặt lâm sàng lao kháng thuốc chủ yếu xảy ra trong quá trình điều trị bằng thuốckháng lao (gọi là kháng thuốc mắc phải) Việc điều trị bằng thuốc khang lao dẫn đến áp lực

lựa chọn các dòng M tuberculosis đột biến gen có thể chống chịu với các thuốc kháng lao.

Một số yếu tố khác góp phần dẫn đến áp lực lựa chọn chính là việc sử dụng đơn trị liệuthuốc kháng lao, bác sĩ kê toa không phù hợp và quan trọng nhất là bệnh nhân không tuânthủ phác đồ điều trị [8]

Mặc dù tỷ lệ xảy ra đột biến ở vi khuẩn lao tương đối thấp (10-6-10-8 lần nhân lên của

vi khuẩn), nhưng nếu đột biến xảy ra tại một điểm (đột biến điểm) sẽ tạo ra dòng vi khuẩnlao đơn kháng thuốc và nếu đột biến xảy ra nhiều điểm trên nhiều gen khác nhau sẽ tạo radòng vi khuẩn LĐKT [15] Các dòng kháng thuốc kháng lao này theo thời gian sẽ dần chiếm

Một số ít trực khuẩn lao

có sức đề kháng tự nhiên với thuốc kháng laoChọn lọc

Đề kháng mắc phải

Sinh sản dòng kháng thuốc trên cùng vật chủ

Đề kháng nguyên phát

Lây truyền dòng kháng thuốc sang vật chủ khác

ưu thế so với các dòng khác và sẽ được phát tán vào cộng đồng Những người nhiễm dònglao kháng thuốc sẽ có thể mắc phải thể lao kháng thuốc trước khi được điều trị (kháng thuốcnguyên phát)

Hình 2 Cơ chế sinh học phân tử của lao kháng thuốc

3.2 Cơ chế kháng isoniazid (H)

H có thể nói là thuốc kháng lao hàng thứ nhất hiệu quả nhất trong phác đồ điều trị lao.Trực khuẩn lao nhạy cảm cao với H (nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của H chỉ từ 0,02-0,2μg/ml) vì vậy H có hiệu quả cao trong việc tiêu diệt các trực khuẩn lao đang phân chia H cókhả năng chống lại các dòng vi khuẩn lao kháng với các loại thuốc kháng lao khác, tuy nhiênlại là thuốc dễ bị kháng lại nhất trong phác đồ ngắn ngày 6 tháng

3.2.1 Cơ chế kháng vi khuẩn lao của isoniazid

H sẽ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn lao dưới dạng tiền thuốc và được kích hoạt bằngmen catalase-peroxidase (men katG) Hoạt động peroxidase (oxi hóa) của men katG sẽ kíchhoạt H trở thành một dạng chất gây độc (isonicotinc acid ) đối với màng tế bào vi khuẩn lao.Dạng chất gây độc của H tác động đến hai chất chính là men inhA và men kasA đóng vai tròquan trọng trong quá trình tổng hợp mycolic acid, là thành phần cấu tạo nên màng tế bào.Nếu vi khuẩn thiếu mycolic acid sẽ không thể duy trì tính bền vững của tế bào và sẽ bị chết[4]

3.2.2 Cơ chế kháng isoniazid của vi khuẩn lao

Cho đến nay cơ chế kháng H của trực khuẩn lao vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn.Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp lao kháng H đều phát hiện các đột biến một số gentrong hệ gen của trực khuẩn lao Các gen thường bị đột biến nhất là các gen katG, inhA,ahpC, kasA, và ndh Ngoài ra có ít nhất 16 gen khác cũng đột biến gây kháng H [4]

Đột biến tại gen katG

Gen katG chính là gen mã hóa tổng hợp nên men katG Các nghiên cứu thử nghiệm

trong ống nghiệm cho thấy nếu gen katG của vi khuẩn bị mất đi thì vi khuẩn sẽ có tính

kháng H, ngược lại nếu gen katG được phục hồi vi khuẩn sẽ lại nhạy cảm với H Tuy nhiêntrên lâm sàng, các mẫu phân lập được vi khuẩn lao kháng H đều cho thấy gen katG hầu hếtđều bị đột biến chứ không mất đi Đột biến gen katG dẫn đến giảm hoạt tính của men katG,

từ đó gây kháng H

Có đến 40-95% các trường hợp kháng H là do các biến đổi của gen katG Các nghiêncứu cho thấy đột biến của gen katG thường xảy ra trong đoạn gen từ codon 138-328 trong đóđột biến tại codon 315 là phổ biến nhất (75-90%) Có đến 53-96% các trường hợp đột biếntại codon 315 là dạng đột biến thay thế một nucleotide (gọi là đột biến S315T) Việc tại saođột biến lại thường xảy ra trong đoạn codon 138-328 được các nhà khoa học lý giải là do độtbiến tại đoạn này vừa có thể làm suy giảm hiệu quả dược lực của H vừa không làm mất đihoạt tính của men katG

Mặc dù đột biến S315T là đột biến phổ biến nhất nhưng các dạng đột biến tại cáccodon khác như V33Stop, D65E, D94A, G99E, H108E, N138S/H, S140A/N, D142A,L150A, S160L, A172T, T180C, V200Stop, F252L, T262R, P275T, Q294Stop, W299G,W328G, I335T, A350S của gen katG cũng ảnh hưởng đến việc tổng hợp và chức năng củamen katG và vì vậy cũng đóng vai trò không nhỏ trong việc kháng H của vi khuẩn lao

Đột biến tại gen ahpC

Các nghiên cứu cho thấy khi có đột biến tại gen katG làm giảm hoạt tính của menkatG thì đồng thời xảy ra quá trình tăng tổng hợp men alkyl hydroperoxide reductase (menahpC) có tác dụng khử độc các gốc peroxide bị tổn hại do tác dụng oxi hóa của H Lý giải

hiện tượng này các nhà khoa học chứng minh rằng dưới tác dụng oxi hóa của H, men katGbuộc phải tăng tổng hợp tạo điều kiện cho việc chuyển hóa H thành chất gây độc đối với tếbào vi khuẩn lao, do đó men ahpC phải được tăng tổng hợp để ngăn chặn các tác động oxihóa của H.

Việc tăng tổng hợp men ahpC xảy ra là do các đột biến tại gen ahpC Có 5 loại biếnđổi nucleotide trong vùng khởi động của gen ahpC đã được phát hiện có thể dẫn đến việctăng tổng hợp men ahpC bao gồm −48(G→A), −51(G→A), −54(C→T), −74(G→A) và

−81(C→T) [17] Ngoài ra các đột biến tại vùng chuyển tiếp gen oxyR-ahpC cũng dẫn đếnviệc tăng tổng hợp men ahpC, tuy nhiên mối quan hệ này cần phải được nghiên cứu thêm

Đột biến gen inhA

Trong tế bào vi khuẩn, men inhA (được mã hóa bởi gen inhA) trong điều kiện bìnhthường sẽ kết hợp với NADH tạo thành phức hợp tham gia vào quá trình tổng hợp mycolicacid Tuy nhiên khi có sự hiện diện của H dạng hoạt tính, phân tử H hoạt tính sẽ gắn vớiphức hợp inhA-NADH gây ức chế quá trình tổng hợp mycolic acid

Các nghiên cứu cho thấy đột biến tại gen inhA mã hóa cho men inhA là một trong cácnguyên nhân gây lao kháng H Men inhA được mã hóa trên một operon tạo thành từ geninhA và mabA Hiện nay đã phát hiện được 6 loại đột biến điểm gây kháng H liên quan đếncấu trúc của gen inhA (I16T, I21T, I21V, I47T, V78A, và I95P), tuy nhiên tỷ lệ các trườnghợp lao kháng H do đột biến tại gen inhA rất thấp chỉ vào khoảng 0-5% Có đến 8-20% cáctrường hợp đột biến tại gen inhA xảy ra tại vùng khởi động của operon, phổ biến là các vị trí

−24(G-T), −16(A-G), hoặc −8(T-G/A) và −15(C-T) Đột biến tại gen inhA không chỉ gâykháng H mà còn có thể gây kháng chéo với thuốc kháng lao hàng hai là ethionamide (ETH)

vì thuốc này có cấu trúc tương tự với H

Đột biến gen kasA và ndh

Gần đây các nhà khoa học còn phát hiện thêm các đột biến gây kháng H trên các genkasA và ndh, nhưng tỷ lệ các trường hợp đột biến hai gen này rất thấp

Gen kasA mã hóa tổng hợp men β-ketoacyl-ACP synthase (men KasA) tham gia vàoquá trình tổng hợp mycolic acids của vi khuẩn Đột biến tại gen kasA có thể gây kháng Hvới MIC là 0,1 μg/ml Các phân tích di truyền trên gen kasA bị đột biến cho thấy một số

codon bị đột biến thay thế bao gồm codon 66 (GAT→AAT), codon 121 (AGG→AAG),codon 269 (GGT→AGT), codon 312 (GGC→AGC), codon 387 (GGC→GAG) và codon

413 (TTC→TTA) Mặc dù, đột biến tại gen kasA cũng được phát hiện trong các trường hợplao vẫn còn nhạy với H, nhưng đột biến tại gen kasA có thể là một cơ chế có khả năng gâykháng H của trực khuẩn lao

Gen ndh là gen mã hóa tổng hợp men NADH gắn kết với protein inhA tham gia tổng

hợp mycolic acid, gần đây được phát hiện cũng gây kháng H và E trên chủng M bovis H

dưới dạng hoạt tính sẽ gắn kết cộng hóa trị với NAD là một phân tử bị khử oxi hóa của menNADH Phức hợp H-NAD sẽ cạnh tranh với men NADH gắn kết với men inhA ức chế tổnghợp mycolic acid của tế bào vi khuẩn Khi đột biến xảy ra ở gen ndh, sẽ làm suy giảm hoạtđộng oxi hóa của men NADH làm chúng không thể oxi hóa thành NAD, vì vậy làm giảm sựkết hợp với H, hay nói cách khác làm giảm hiệu lực của H Có khoảng 9,5% các trường hợplao kháng H có đột biến điểm gen ndh tại các codon 110 và 168, và các đột biến này khôngthấy ở các trường hợp còn nhạy với H

3.3 Cơ chế kháng rifampicin

3.3.1 Cơ chế kháng lao của rifampicin

Men polymerase ARN (ARNP) đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình dịch

mã Ở vi khuẩn, ARNP chịu trách nhiệm tổng hợp nên ARNm, ARNr và ARNt Nhân củamen ARNP có trọng lượng 400 KDa bao gồm 5 tiểu đơn vị là nhị phân tử α (α2), tiểu đơn vị

β, tiểu đơn vị β’ và tiểu đơn vị ω Các tiểu đơn vị sẽ gắn với tiểu đơn vị σ tạo thành menhoàn chỉnh để kích hoạt quá trình dịch mã tại vùng vận hành Các gen mã hóa cho các tiểuđơn vị α, β, β’, ω và σ được kí hiệu là rpoA, rpoB, rpoC, rpoZ và rpoD

Rifampicin (R) là thuốc kháng lao hàng thứ nhất có hiệu quả điều trị cao vì R sẽ gắnvào tiểu đơn vị β, và chặn việc tạo thành chuỗi ARN ngay khi chỉ mới 2-3 nucleotid đượcgắn vào chuỗi ARN

Tỷ lệ kháng R tương đối thấp chỉ vào khoảng 10-7-10-8 lần phân chia của vi khuẩnlao Do đó các trường hợp đơn kháng với R rất hiếm, ngoại trừ ở bệnh nhân nhiễm HIV Trên90% các trường hợp kháng R cũng kháng với H vì vậy kháng R được xem như là yếu tố chỉđiểm các trường hợp LĐKT R không chỉ có tác dụng với các vi khuẩn lao đang phát triển

mà còn trên cả thể tiềm ẩn với MIC từ 0,05-1 μg/ml trên môi trường cấy lỏng hoặc đặcnhưng có MIC cao hơn trong môi trường trứng (MIC = 2.5 - 10 μg/ml) Các dòng có MIC <

1 μg/ml khi cấy trong môi trường agar hoặc môi trường lỏng hoặc MICs ˂ 40 μg/ml trongmôi trường Lowenstein-Jensen được xem là còn nhạy với R

3.3.2 Cơ chế kháng rifampicin của vi khuẩn lao

Các nghiên cứu phân tích các trường hợp lao kháng R cho thấy có rất nhiều loại độtbiến xảy ra trên gen rpoB của vi khuẩn lao 94% - 98% các trường hợp lao kháng R có độtbiến xảy ra tại một vùng gồm 81 cặp base trên gen rpoB tương ứng từ codon 507 đến 533gọi là vùng quyết định kháng rifampicin (RRDR) Có khoảng 69 kiểu đột biến thay thế mộtnucleotid, 3 kiểu chèn nucleotid, 16 kiểu loại bỏ nucleotid và 38 kiểu thay thế nhiềunucleotid trên vùng RRDR [9] Đột biến tại codon 531 và 526 là phổ biến nhất (81%) vàthường dẫn đến mức độ kháng kiểu hình cao (MIC > 64 µg/ml) và gây kháng chéo với cácloại thuốc khác thuộc nhóm rifamycins Đột biến tại codon 511, 516, 518 và 522 dẫn đếnmức kháng thấp đối với R và rifapentine; và đôi khi làm tăng nhạy đối với rifabutin Ngoàicác codon trong vùng RRDR bị đột biến, một số ít trường hợp lao kháng R (< 5%) có độtbiến xảy ra ngoài vùng RRDR chẳng hạn như đột biến tại codon 481, 490, 498, 505, 534,

535, 553, 561, 571, 572, 633, và 672

Hình 3 Đột biến sai nghĩa ở gen rpoB gây kháng với R

Hình 4 Đột biến sai nghĩa ngoài vùng RRDR của gen ropB gây kháng R

Tần suất và bản chất của các trường hợp lao kháng R không chỉ phụ thuộc vào các độtbiến trên gen rpoB mà còn thay đổi tùy vào khu vực địa lý cũng như chủng tộc Kapur vàcộng sự tiến hành thu thập mẫu lao kháng R tại Mỹ cho thấy dòng vi khuẩn lao có đột biếnthay thế CAC→TAC tại codon 526 trên gen rpoB chiếm đến 30% nhưng tại 9 quốc gia khácđột biến dạng này chỉ chiếm 12% [18] Một nghiên cứu của Taniguchi phát hiện các dònglao kháng R và dòng nhạy với R đều có đột biến tại codon 533 [16], nhưng các nghiên cứutại Brazil, Pháp, và tại Việt Nam lại cho thấy đột biến dạng này chỉ xảy ra ở dòng kháng R[5, 14]

3.4 Cơ chế kháng Pyrazinamid

3.4.1 Cơ chế kháng vi khuẩn lao của pyrazinamid

Pyrazinamid (Z) là thuốc kháng lao hàng thứ nhất quan trọng không kém H và Rtrong điều trị lao bởi vì Z có thể tiêu diệt vi khuẩn lao thể tiềm ẩn tồn tại tại các tổn thươnglao có nồng độ pH toan mà các thuốc khác không thể tiêu diệt được Z chỉ có hoạt lực trongmôi trường pH toan, nhưng thậm chí trong môi trường pH toan hoạt lực của Z tương đốithấp với MIC từ 6.25- 50 μg/ml

Z là một tiền thuốc cần phải được chuyển thành dạng hoạt tính (pyrazinoic acid(POA)) bằng men pyrazinamidase (PZAse)/nicotinamidase được mã hóa bởi gen pncA của

vi khuẩn lao Z sẽ tiếp cận bề mặt tế bào vi khuẩn, thâm nhập vào nội bào qua con đườngkhuyếch tán thụ động Sự tích tụ POA và POA proton hóa sẽ làm giảm nồng độ pH nội bàotạo thành môi trường kém thuận lợi cho một số quá trình sinh hóa của vi khuẩn như quátrình tổng hợp acid mỡ và các chức năng vận chuyển màng Bên cạnh đó các POA protonhóa cũng sẽ mang các proton vào tế bào vi khuẩn gây hiện tượng toan hóa tế bào chất và làmgiảm chức năng vận chuyển màng tế bào bằng cách phá hủy lực vận chuyển proton củamàng tế bào

3.4.2 Cơ chế kháng pyrazinamid của vi khuẩn lao

Cơ chế lao kháng Z cho đến nay vẫn chưa rõ Ở các dòng lao kháng Z, các nhà khoahọc phát hiện các dòng này thiếu hoạt động của men PZA và có các đột biến tại gen pncA

Có đến 72-95% các trường hợp lao kháng Z xảy ra là do đột biến tại gen pncA và các độtbiến này xảy ra tại nhiều nơi trên toàn bộ gen, mặc dù có 3 khu vực hay xảy ra đột biến cụmxung quanh các acid amino 3-71, 61-85 và 132 – 142

3.5 Cơ chế kháng Ethambutol

3.5.1 Cơ chế kháng vi khuẩn lao của ethambutol

Ethambutol (E) là một trong 4 thuốc thiết yếu dùng để ngăn ngừa các trường hợpkháng thuốc E có tác dụng tiêu diệt các trực khuẩn đang sinh trưởng nhưng lại không có tácdụng trên trực khuẩn thể tiềm ẩn

Có nhiều giả thuyết được đặt ra để giải thích cơ chế tác dụng của E đối với vi khuẩnlao, nhưng giả thuyết được cho hợp lý nhất chính là E gây ra những biến đổi có hại trên cấutrúc màng tế bào vi khuẩn E sẽ ức chế hoạt động của men Arabinosyl transferase, là mộtmen dùng để tổng hợp arabinogalactan, chất trung gian dùng để tổng hợp arabinogalactan vàlipoarabinomannan, hai chất cấu thành nên màng tế bào vi khuẩn

3.5.2 Cơ chế kháng ethambutol của vi khuẩn lao

Men Arabinosyl transferase được mã hóa bởi gen embB Gen embB cùng với genembC và embA tạo thành một operon 10-kb được đặt tên là embCAB Các đột biến tạioperon embCAB, mà cụ thể là gen embB, tạo ra các dòng lao kháng E Có đến > 68% cáctrường hợp lao kháng E là do đột biến tại codon 306 trên gen embB, do đó vùng này còn gọi

là vùng quyết định kháng E (ERDR) Trong vùng này thường xảy ra đột biến dạng thay thế

trong đó amino acid M306 thường được thay thế bằng isoleucine, leucine hoặc valine Tuynhiên vẫn có khoảng 35% các trường hợp lao kháng E không có các đột biến tại gen embB.Điều này gợi ý rằng vẫn còn một cơ chế khác gây ra lao kháng E

3.6 Cơ chế kháng Steptomycin

3.6.1 Cơ chế kháng lao của Streptomycin

Streptomycin (S) là một aminocyclitol glycoside được WHO khuyến cáo dùng thaythế được cho các thuốc kháng lao hàng thứ nhất S có hoạt lực đối với các trực khuẩn laođang sinh trưởng với MIC từ 2- 4 μg/ml, nhưng lại bất hoạt đối với các trực khuẩn khôngsinh trưởng hoặc tồn tại nội bào S là aminoglycosides ít gây độc nhất nhưng lại có tốc độkháng rất nhanh

Cơ chế tác dụng của S được chứng minh là ở cấp độ ribosom trên nhiều loại vi khuẩnkhác nhau trong đó có trực khuẩn lao S sẽ gắn kết với tiểu đơn vị 30S của ribosom vi khuẩntương tác với ARNr 16S và protein ribosom S12 gây biến đổi ribosom từ đó gây dịch mã saiARNm và ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn

3.6.2 Cơ chế kháng Streptomycin của vi khuẩn lao

Lao kháng S xảy ra khi có các đột biến xảy ra tại các gen tổng hợp nên ARNr 16S(gen rrs) và protein ribosom S12 (gen rpsL) Có đến 65-67% các trường hợp lao kháng S là

do các đột biến xảy ra tại hai gen rrs và rpsL 50% các trường hợp lao kháng S có đột biếngen rpsL tại các vị trí codon 43 (AAG→AGG/ACG; K→R/T) và codon 88(AAG→AGG/CAG; K→R/Q) Có khoảng 20% các trường hợp lao kháng S có đột biếnđiểm thay thế C→T tại vị trí 491, 512 và 516, và A→C/T tại vị trí 513 trên vùng lặp 530 củaphân tử ARNr 16S

Các nghiên cứu cho thấy các đột biến thay thế amino acid trên gen rpsL sẽ tạo radòng vi khuẩn lao có sức kháng thuốc cao trong khi đột biến tại gen rrs sẽ tạo ra dòng khángtrung bình và các đột biến xảy ra ngoài hai gen này đều tạo ra dòng kháng yếu

3.7 Cơ chế kháng các thuốc kháng lao hàng hai

Nhóm thuốc fluoroquinolones

Levofloxacin (LVF) và ofloxacin (OFL) là hai thuốc thuộc nhóm FQ được sử dụnglàm thuốc điều trị kháng lao hàng hai Cơ chế tác dụng của hai thuốc này cũng như các thuốc

khác cùng nhóm chính là ức chế men ADN gyrase (topoisomerase II) và topoisomerase IV(là hai men thiết yếu chịu trách nhiệm duy trì hình dạng đặc trưng của nhiễm sắc thể của vikhuẩn) dẫn đến vi khuẩn lao bị chết

Men ADN gyrase là một tứ phân A2B2 trong đó tiểu đơn vị A mang vị trí hoạt hóa táikết hợp/phân rã và tiểu đơn vị B kích hoạt thủy phân adenosine triphosphate Vi khuẩn lao

có gen gyrA và gen gyrB mã hóa các tiểu đơn vị A và B Trên hai gen này đều có các vùngquyết định kháng với quinolone (QRDR) gồm 320 cặp base và 375 cặp base Hiện nay cácđột biến với thuốc FQ đều liên quan đến đột biến tại vùng QRDR của gen gyrA còn đột biếngen gyrB chỉ mới phát hiện trong thực nghiệm

Tỷ lệ các dòng lao kháng với FQ được phát hiện trong nhiều nghiên cứu cũng rấtkhác nhau dao động từ 2-100% Điều này là do có sự khác biệt về độ phủ của hệ gen vikhuẩn lao, định nghĩa ngưỡng MIC và có lẽ là do có cơ chế khác gây kháng FQ chưa đượcphát hiện Gần đây một nghiên cứu phát hiện một cơ chế gây kháng FQ mới trong đó phân

tử MfpA (một loại phân tử lặp pentapeptid) có khả năng gắn vào ADN gyrase và ức chế hoạtđộng của men này [13] Tuy nhiên cơ chế này gây mức độ kháng thấp do đó ít được quantâm

Nhóm aminoglycoside

Kanamycin (KM) và chiết xuất là amikacin (AMK), là các thuốc thuộc nhómaminoglycoside có tác dụng ức chế tổng hợp protein thông qua cơ chế làm thay đổi cấu trúcribosome tại ARNr 16S Các thuốc này sẽ gắn kết với ribosome của vi khuẩn và gây rối loạnquá trình nối amino acid vào chuỗi peptid của vi khuẩn Vì cơ chế của KM và AMK tương

tự như S nên có thể gây khả năng kháng chéo, mặc dù không phải 100% các trường hợp laokháng S đều kháng với KM và AMK Các đột biến tại vị trí 1400, 1401 và 1483 của gen rrs(tổng hợp ARNr 16S) sẽ gây ra kháng với KM và AMK

Nhóm polypeptid

Viomycin (VM) và capreomycin (CPM) là các kháng sinh thuộc nhóm polypeptide có

cơ chế tác dụng cho đến nay vẫn chưa được hiểu rõ, tuy nhiên nhóm này được biết là có khảnăng ức chế tổng hợp protein prokaryotic và được dùng làm thuốc kháng lao hàng thứ hai

Bởi vì nhóm thuốc này có hoạt lực chống lại các dạng lao mạn tính do đó các nhàkhoa học cho rằng cơ chế tác dụng của nhóm này có thể có tác dụng ngoài ribosom MenARNr methyl transferase được mã hóa bởi gen tlyA được chứng minh là có mối liên quanvới kháng CPM và VM Men này giúp bổ sung nucleotide C1409 tại vòng xoắn 44 củaARNr 16S và nucleotide C1920 tại vòng xoắn 69 của ARNr 23S Ngoài ra đột biến tại genrrs mã hóa ra ARNr 16S cũng đóng vai trò trong việc kháng với VM và CPM, đặc biệt là cácđột biến thay thế nucleotide G→T tại codon 1484 Kháng chéo giữa KM, AMK, CPM và

VM cũng đã được phát hiện

Nhóm D-cycloserin và Ethionamide

Ethionamide (ETH) là một thuốc quan trọng trong điều trị LĐKT và có cơ chế tácdụng cũng như cấu trúc tương tự như H Giống như H, ETH được cho là một tiền thuốc Tuynhiên ETH được kích hoạt bằng một cơ chế phụ thuộc vào katG dẫn đến việc hình thành mộtchất chuyển hóa S-oxide có hoạt lực đáng kể so với thuốc gốc Các nghiên cứu cho thấy genethA (hay còn gọi là etaA) mã hóa cho men flavin mono-oxy-genase chịu trách nhiệm kíchhoạt ETH

Cơ chế tác dụng của dạng hoạt hóa của ETH chính là ức chế gen inhA sản xuất meninhA Thuốc được hoạt hóa sẽ phá hủy việc sinh tổng hợp màng tế bào bằng cách ức chếtổng hợp mycolic acid Đột biến tại vùng vận hành của gen inhA và ethA có liên quan đếnkháng ETH Chỉ có các đột biến tại gen inhA mới có thể dẫn đến dạng lao kháng chéo giữa

H và ETH

D-cycloserine (DCS) là một đồng phân vòng của amino acid D-alanine, là một trongnhiều phân tử đóng vai trò quan trọng trong các bước liên kết chéo trong quá trình tổng hợppeptideoglycan DCS sẽ ức chế alanine racemase (Alr) và D-alanine Men D-alanine ligase(Ddl) tổng hợp nên nhân pentapeptide bằng cách sử dụng D-alanine; cả hai men này đềuthiết yếu trong tổng hợp peptidoglycan và tổng hợp màng tế bào và duy trì màng tế bào Cácđột biến xảy ra tại gen alr mã hóa cho alanine racemase, đặc biệt là đột biến ngược G→T tạivùng vận hành sẽ gây ra kháng DCS