Một số đặc tính sinh hoá, miễn dịch và sinh học phân tử của các chủng Bacillus du và NT trong sản xuất các sinh phẩm

Một số đặc tính sinh hoá, miễn dịch và sinh học phân tử của các chủng Bacillus du và NT trong sản xuất các sinh phẩm

Bé GI¸O DôC Vμ §μO T¹O Bé Y TÕ

VIÖN VÖ SINH DÞCH TÔ TRUNG ¦¥NG Hμ NéI

TãM T¾T LUËN ¸N TIÕN SÜ sinh HäC

Hμ NéI - 2006

vµo håi … giê… ngµy… th¸ng… n¨m 200

Cã thÓ t×m hiÓu luËn ¸n t¹i th− viÖn Quèc gia vµ th− viÖn ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng Hµ Néi

DANH MụC CÔNG TRìNH Có LIÊN QUAN ĐếN LUậN áN

1 Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Đặng Văn Phú( 2001),” Bước đầu tìm hiểu tác động của các loại Oligo-alginat đến qúa trình sinh trưởng

phát triển của Bacillus subtilis”, tạp chí Y học dự phòng tập XI, số

4(50), trang 70-72

2 Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Đặng Thị Thanh Hà, Vũ Kim

Quyên(2003) ”Nhận xét về sự hình thành bào tử của Bacillus

subtilis”, tạp chí Y học dự phòng tập XIII, số 6(63), trang 97-99

3 Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Nguyễn Thị Kim Chi (2004)”Nghiên cứu

một số đặc tính sinh hóa của các chủng Bacillus subtilis dùng trong

sản xuất sinh phẩm”, tạp chí Y học thực hành, số 478, trg 357-361

4 Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Dương Hồng Quân, Nguyễn Tiến Minh,

Đinh Duy Kháng (2004) “Cloning and sequencing of 16S ribosomal RNA genes from two Bacillus sp Strains used as an oral probiotic product” (Kết qủa giải hai trình tự gen 16S ribosome của hai chủng

Du và NT đăng ký vào Ngân hàng gen quốc tế ( EMBL/ GENEBANK) đã được công bố, EMBL Nucleotide Sequence Database, Số AJ842963 Bacillus sp Du p…[ gi: 52851158], AJ842964 Bacillus sp NTp…[ gi: 52851159], tháng 9 năm 2004)

5 Lê Thị Loan, Lê Văn Hiệp, Dương Hồng Quân, Nguyễn Tiến Minh,

Đinh Duy Kháng( 2005)”Định loại các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus dùng trong sản xuất Biosubtyl bằng trình tự gen 16S rRNA

và đánh gía thành phần kháng nguyên giữa các chủng bằng Western Blot, tạp chí Công nghệ Sinh học, tập 3, số 2, 2005, trang 201-206

Mở ĐầU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong một thời gian dài trước đây, người ta quen dùng kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và cũng đã mang lại hiệu quả to lớn Tuy nhiên, chúng cũng gây ra nhiều tác dụng phụ cho người sử dụng Một trong những tác dụng phụ gây hậu qủa nghiêm trọng là gây rối loạn hệ vi sinh vật sẵn có trong đường ruột dẫn đến rối loạn tiêu hóa Theo thống kê của báo sức khỏe thì tiêu chảy là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tử vong cho trẻ em ở các nước đang phát triển và ước tính hàng năm có tới 1.3 ngàn triệu lượt trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy và 4 triệu trẻ em chết vì bệnh này Xuất phát từ các vấn đề nêu trên, xu hướng ngày nay của thế giới là tập trung nghiên cứu những chế phẩm sinh học có gía trị trị liệu cao, không gây độc, hạn chế tác dụng phụ và không ảnh hưởng đến cân bằng hệ vi sinh vật có ích trong đường ruột Phương pháp dùng vi sinh vật sống đường uống để điều trị các bệnh đường ruột là một thành công lớn của nền y học

thế giới Đã có nhiều sản phẩm probiotic ra đời được làm từ Bacillus- là

một loại vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất trong các chế phấm sinh học dùng trong y học, nông nghiệp và thủy sản Trên thị trường Việt Nam cũng

đã thấy xuất hiện nhiều chế phẩm sinh học có sử dụng Bacillus Từ trên 20

năm nay, Viện Vắcxin và các chế phẩm sinh học đã sản xuất và lưu hành

trên thị trường nhiều loại sản phẩm mang dấu ấn của Bacillus, một trong

những sản phẩm quan trọng được nhiều người ưa chuộng và sử dụng nhất

là Biosubtyl Thành phần chính của Biosubtyl là chủng Bacillus subtilis

Tuy đã ra đời nhiều năm song Biosubtyl chỉ mới được chú trọng về mặt ứng dụng mà chưa có một nghiên cứu nào mang tính chất hệ thống về các

tính chất sinh hóa, miễn dịch và sinh học phân tử của các chủng Bacillus

subtilis nhất là đối với những chủng phân lập được Vì vậy đề tài được thực

hiện với mong muốn khẳng định tính chất thuần chủng của các chủng

Bacillus subtilis đang sử dụng trong sản xuất để góp phần nâng cao chất

lượng sản phẩm và tiến tới tiêu chuẩn hóa Biosubtyl thành một mặt hàng có thể xuất khẩu được

2 Mục đích nghiên cứu:

2.1 Xác định một số đặc tính sinh hoá, miễn dịch và sinh học phân tử

của hai chủng Bacillus Du và NT dùng trong sản xuất

2.2 Đề xuất các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu được hiệu suất sinh khối cao nhất

3 Những đóng góp mới và giá trị thực tiễn của luận án

Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu đầy đủ về các đặc tính sinh lý, sinh hóa, di truyền và miễn dịch của các chủng vi khuẩn dùng trong sản xuất chế phẩm Probiotic tại Việt Nam

4 Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 150 trang, 4 chương, có 17 bảng, 42 hình, cấu trúc từng phần như sau: Mở đầu 2 trang, chương 1: Tổng quan tài liệu 43 trang, chương 2: Đối tượng-vật liệu và phương pháp nghiên cứu 15 trang, chương 3: Kết quả nghiên cứu 45 trang, chương 4: bàn luận 10 trang, kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang, danh mục các công trình có liên quan

đến luận án 1 trang, phần tài liệu tham khảo 12 trang gồm 113 tài liệu trong đó tiếng Việt 24, tiếng Anh 89 và cuối cùng là phần phụ lục 21 trang

Chương 1 : TổNG QUAN TμI LIệU

1.1 Đặc điểm sinh học của Bacillus:

1.4.1 Hình thể và tính chất sinh vật hoá học:

Bảng 1.2 So sánh các loài của Bacillus

Đặc điểm B subtilis B pumilus B cereus

B cereus var

thuringiensis

B cereus var mycoides

-

0.6 - 0.7 2.0 – 3.0 + + + + + + + + +

- +

- +

-

1.0 - 1.2

3 – 5 + +

-

a + +

-

-

-

- + + + +

1.0 - 1.2

3 – 5 + +

a

a + + +

-

-

- + + + +

1.0 - 1.2

3 – 5 + +

-

- + + +

-

-

- +

a + +

1.0 - 1.2

3 – 5 + +

-

- + + +

-

-

- +

b + +

% giống với các đặc điểm: + : 85- 100%; a : 50- 84%; b : 15- 49%; - : 0- 14% [36 ], [38]

1.7 Di truyền học và sinh học phân tử

1.7.1 Vectụ taùo doứng

Đây là các plasmit nằm ngoài nhiễm sắc thể có kích thước nhỏ và chứa gen chọn lọc được sử dụng để tạo dòng các đoạn ADN Chúng được phát

hiện đầu tiên ở vi khuẩn, sau đó không ngừng được cải tiến với nhiều đặc tính quý: (1) Plasmit thế hệ thứ nhất như ColE1, pSC101 nguồn gốc tự nhiên có rất ít các đặc tính cần thiết; (2) Plasmit thế hệ thứ hai như pBR322

được thiết kế nhân tạo trên cơ sở tập trung các tính trạng quý của plasmit tự

nhiên và được sử dụng để biến nạp gen quan tâm vào E coli nhằm tạo dòng và nhân lên với lượng lớn Chúng thường chứa vùng sao chép trong E

coli, chỉ thị chọn lọc vi khuẩn và vùng MCS Plasmit pBR322 và các thế hệ

vectơ biểu hiện có nguồn gốc từ pBR322 khá bền, tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ nuôi cấy ngay trong điều kiện không có kháng sinh chọn lọc Tuy nhiên, trong một vài trường hợp, plasmit có thể không bền vững khi protein tái tổ hợp có hoạt tính độc ảnh hưởng đến sinh trưởng của tế bào chủ; (3) Plasmit thế hệ thứ ba: như pUC, pSP, pBluescript có kích thư-

ớc nên sao chép rất nhanh trong tế bào vi khuẩn Để tách dòng gen mã hoá 16S ribosome và gen mã hoá α-amylase của các chủng vi khuẩn thuộc chi

Bacillus, chúng tôi sử dụng plasmit pCR 2.1 của hãng Invitrogen làm

vector tách dòng Đây là một trong các plasmit có hiệu quả tạo dòng rất cao

1.7.2 Gen 16S ARN ribosome và ứng dụng

Gen 16S ARN ribosome lần đầu tiên đã được xác định ở E coli với 1520

bp [48].Và ngay sau đó người ta đã sử dụng gen này để nghiên cứu nguồn

gốc phát sinh chủng loại ở các vi sinh vật procaryot như Euglena gracilis

[116], nghiên cứu sự khác biệt giữa các giống tảo đỏ (Rhodophyta), tảo

lam (Anacystis nidulans) và các vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus subtilis

[35]

Chương 2

Vật liệu vμ phương pháp nghiên cứu

2.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị máy móc

2.1.1.Vật liệu

2.1.1.1 Chủng giống

- Trực khuẩn B subtilis Trần Văn Du do bác sĩ Trần Văn Du phân lập

từ Pháp trao cho bác sĩ Phạm Ngọc Thạch nghiên cứu năm 1952, từ năm

1983 Viện Vacxin sử dụng sản xuất Biosubtyl đến nay, được phòng Kiểm

định Viện vacxin ĐàLạt đông khô ngày 19/1/1999

- Trực khuẩn B.subtilis NT nhập từ Banladesh dưới tên B subtilis

được phòng Kiểm định Viện vacxin ĐàLạt đông khô ngày 15/9/2000

-Trực khuẩn B.subtilis ATCC 6633 nhập từ Viện Americal Type

Culture Collection, được phòng Kiểm định Viện vacxin ĐàLạt đông khô ngày 20/3/2001

- Escherichia coli tên DH5α, mua từ hãng Invitrogen ( Mỹ)

Cặp mồi để khuếch đại gen mã hóa amylase của vi khuẩn B subtilis

được chúng tôi thiết kế dựa trên các trình tự gen này đã được công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế số đăng ký K00563 [111] Các cặp mồi được tổng hợp nhờ Hãng Invitrogen (Mỹ)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

A Phần nghiên cứu sinh hóa

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn để quan sát hình thái tế bào: 2.2.2 Tính chất sinh hóa: Tính lên men các loại đường, tính nhạy cảm với

kháng sinh

2.2.3 Hoạt tính men của vi khuẩn

2.2.3.1 Khảo sát thời gian sinh hoạt tính men amylase và protease của các chủng nghiên cứu

2.2.3.2 Khảo sát hoạt tính men amylase và protease trong sinh phẩm Biosubtyl (Biosubtyl DL loạt 16,17,18,19; Biosubtyl NT loạt

B Phần nghiên cứu sinh học phân tử

2.2.7 Nuôi cấy và lưu giữ các chủng vi khuẩn

2.2.8 Tách chiết và tinh sạch ADN plasmit, ADN genom

2.2.8.1 Tách chiết ADN plasmit của vi khuẩn E coli

2.2.8.2 Quy trình tách chiết ADN plasmit của E coli:

2.2.8.3 Tách chiết ADN Genom từ vi khuẩn thuộc chi Bacillus

2.2.9 Phản ứng tổng hợp chuỗi polymeraza

2.2.10 Phản ứng cắt ADN với enzym hạn chế

2.2.11 Điện di :Điện di ADN trên gel agaroza; điện di protein trên gel polyacrylamit

2.2.12 Ghép nối các đoạn ADN

2.2.13 Chuẩn bị tế bào khả biến: Chuẩn bị tế bào khả biến E coli để

biến nạp bằng sốc nhiệt

2.2.14 Biến nạp ADN plasmit vào tế bào vi khuẩn: Biến nạp ADN

plasmit vào tế bào E coli bằng sốc nhiệt

2.2.15 Xác định trình tự nucleotit của gen

Xử lý số liệu bằng phần mềm vi tính chuyên dụng

C Phần nghiên cứu miễn dịch

2.2.16 Kỹ thuật Western blot

2.2.17 Kỹ thuật gây miễn dịch sản xuất kháng thể

Chương 3 Kết quả

3.1 Hình thái tế bào và tính chất nuôi cấy

Bảng 3.1 Một số đặc tính nuôi cấy của 3 chủng Bacillus

0.8-1 x

3.5-4.5

dạng R, lồi ở giữa, bám chặt trên mặt

thạch

tạo váng dày, môi trường

tạo váng mỏng môi trường hơi

xếp thành chuỗi trong

ATCC

6633

Trực khuẩn Gram+, hai đầu vuông,

nhiều tia

tạo váng mỏng môi trường rất

trong

3.2 Tính chất sinh hóa:

Cả ba chủng vi khuẩn Du, NT và ATCC 6633 đều có tính di động và không

3.3 Độ nhạy cảm với kháng sinh

Bảng 3.3: Độ nhạy cảm với kháng sinh

Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

3.4 Hoạt tính men: Cả ba chủng Du, , NT và ATCC 6633 đều có hoạt

tính men amylase, protease

Bảng 3.4 Hoạt tính enzym protease của các chủng qua thời gian nuôi cấy (t o = 37 o C)

Độ pha loãng enzym Thời

66 33

D u

N T

66 33

D u

24 0 0 0 - - - - - - - - -

48 10 0 0 + - - - - - - - -

72 100 10 10 + + + + - - - - -

96 1000 100 100 + + + + + + + - - - - -

120 100 0 10 + - + + - - - - -

144 10 0 0 + - - - - - - - -

(+): Lỏng hoàn toàn (-): Đông đặc

0200

Hình 3.10 Thời gian nuôi cấy và hoạt tính enzym protease của các

chủng Bacillus Bảng 3.5 Hoạt tính enzym amylase của các chủng qua thời gian nuôi cấy ( t o =37 o C)

Độ pha loãng enzym Thời

3

D u

N T

6 6 3 3

D u

N T

6 6 3 3

D u

N T

6 6 3 3

D u

N T

6 6 3

3

B¶ng 3.6 Ho¹t tÝnh enzym protease trong Biosubtyl

§é pha lo·ng enzym

D u

N T

D

u NT Du NT Du NT

24 100 10 + + + + - - - - - - - -

48 1000 100 + + + + + - - - - - - -

B¶ng 3.7 Ho¹t tÝnh enzym amylase trong Biosubtyl

§é pha lo·ng enzym

0 10 20 30 40

Hình 3.18 Sự tạo thành sinh khối nuôi cấy chủng Du theo trọng lượng

phân tử oligo-alginat

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Hình 3.19 Sự tạo thành sinh khối nuôi cấy chủng NT theo trọng lượng

phân tử oligo-alginat

3.6 ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến sự hình thành

bào tử Bacillus trên môi trường thạch dinh dưỡng pH = 7,2

Bảng 3.10 Sự tạo thành bào tử của chủng Du và chủng NT theo thời gian và nhiệt độ nuôi cấy khác nhau trên môi trường thạch dinh dưỡng

108/ ml hỗn dịch

Số lượng bào tử x

108/ ml hỗn dịch

Số lượng bào tử x

108/ ml hỗn dịch

Số lượng bào tử x

108/ ml hỗn dịch

3.7 ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến sự hình thành

bào tử Bacillus trên môi trường thạch Edwards

Bảng 3.11 Sự tạo thành bào tử của chủng Du và chủng NT theo thời

gian và nhiệt độ nuôi cấy trên môi trường thạch Edwards

108/ ml hỗn dịch

Số lượng bào tử x 108/

ml hỗn dịch

Số lượng bào tử x 108/

ml hỗn dịch

Số lượng bào tử x

108/ ml hỗn dịch

Du NT Du NT Du NT Du NT

176 185

274 266

Hình 3.20 Khuếch đại gen 16S ARN ribosome của các chủng Du,

NT và ATCC6633 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi B16Sp1, B16Sp2 Theo lý thuyết, sản phẩm PCR có độ dài 1544 cặp bazơ M: Chỉ thị phân

tử (ADNλ cắt bằng Hind III và EcoR I) 1: Sản phẩm PCR từ chủng Du; 2: Sản phẩm PCR từ chủng NT; 3: Sản phẩm PCR từ chủng ATCC6633

Hình 3.21 Điện di gel agarose 1% để chọn lọc các plasmid có kích thước

lớn hơn plasmid gốc (có khả năng là plasmid tái tổ hợp mang gen 16S ARN ribosome của các chủng Du, NT và ATCC6633) K: Đối chứng

(plasmid gốc pCR2.1) 1-6: Plasmid tách từ các khuẩn lạc E coli biến nạp

1 2 3 4 5 6 K 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

M 1 2 3

kb

21,2 5,1 2,00 1,37

sản phẩm gắn vector pCR2.1 + sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S

ribosome của chủng Du 7-11: Plasmid tách từ các khuẩn lạc E coli biến

nạp sản phẩm gắn vector pCR2.1 + sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S

ribosome của chủng NT 12-16: Plasmid tách từ các khuẩn lạc E coli biến

nạp sản phẩm gắn vector pCR2.1 + sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S ribosome của chủng ATCC6633

Hình 3.22 Điện di gel agarose 1% để kiểm tra sản phẩm cắt các plasmid

với EcoRI để chọn các plasmid tái tổ hợp có khả năng mang gen 16S ARN

ribosome của các chủng Du, NT và ATCC6633 Sản phẩm cắt được điện di

gel agarose 1% M: Chỉ thị phân tử (ADN lamda cắt bằng EcoRI và

HindIII) 1, 8, 12: Sản phẩm PCR trước khi gắn vào vector tách dòng 2, 7,

11: Sản phẩm PCR sau khi xử lý với EcoRI 3, 4: Plasmid tái tổ hợp mang gen 16S ARN ribosome của chủng Du sau khi xử lý với EcoRI 5, 6:

Plasmid tái tổ hợp mang gen 16S ARN ribosome của chủng NT sau khi xử

lý với EcoRI 9, 10: Plasmid tái tổ hợp mang gen 16S ARN ribosome của

chủng ATCC sau khi xử lý với EcoRI

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

2,00- 1,37-

Kb

ID Du_16S ARN ribosome

SQ 1544 BP; 394 A; 349 C; 477 G; 324 T;

GAATGGATTG AGAGCTTGCT CTCAAGAAGT TAGCGGCGGA CGGGTGAGTA ACACGTGGGT

AACCTGCCCA TAAGACTGGG ATAACTCCGG GAAACCGGGG CTAATACCGG ATAACATTTT

GAACTGCATG GTTCGAAATT GAAAGGCGGC TTCGGCTGTC ACTTATGGAT GGACCCGCGT

CGCATTAGCT AGTTGGTGAG GTAACGGCTC ACCAAGGCAA CGATGCGTAG CCGACCTGAG

AGGGTGATCG GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTA

GGGAATCTTC CGCAATGGAC GAAAGTCTGA CGGAGCAACG CCGCGTGAGT GATGAAGGCT

TTCGGGTCGT AAAACTCTGT TGTTAGGGAA GAACAAGTGC TAGTTGAATA AGCTGGCACC

TTGACGGTAC CTAACCAGAA AGCCACGGCT AACTACGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACGT

AGGTGGCAAG CGTTATCCGG AATTATTGGG CGTAAAGCGC GCGCAGGTGG TTTCTTAAGT

CTGATGTGAA AGCCCACGGC TCAACCGTGG AGGGTCATTG GAAACTGGGA GACTTGAGTG

CAGAAGAGGA AAGTGGAATT CCATGTGTAG CGGTGAAATG CGTAGAGATA TGGAGGAACA

CCAGTGGCGA AGGCGACTTT CTGGTCTGTA ACTGACACTG AGGCGCGAAA GCGTGGGGAG

CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGAGTGCTA AGTGTTAGAG

GGTTTCCGCC CTTTAGTGCT GAAGTTAACG CATTAAGCAC TCCGCCTGGG GAGTACGGCC

GCAAGGCTGA AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT

AATTCGAAGC AACGCGAAGA ACCTTACCAG GTCTTGACAT CCTCTGAAAA CCCTAGAGAT

AGGGCTTCTC CTTCGGGAGC AGAGTGACAG GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG

TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTTG ATCTTAGTTG CCATCATTAA

GTTGGGCACT CTAAGGTGAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA

TCATCATGCC CCTTATGACC TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGACGGTA CAAAGAGCTG

CAAGACCGCG AGGTGGAGCT AATCTCATAA AACCGTTCTC AGTTCGGATT GTAGGCTGCA

ACTCGCCTAC ATGAAGCTGG AATCGCTAGT AATCGCGGAT CAGCATGCCG CGGTGAATAC

GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCACGAGA GTTTGTAACA CCCGAAGTCG

GTGGGGTAAC CTTTTTGGAG CCAGCCGCCT AAGGTGGGAC AGATGATTGG GGTGAAGTCG

TAACAAGGTA GCCGTATCGG AAGGTGCGGG TGGATCACCT CCTT

/ /H×nh 3.23 Tr×nh tù gen 16S ARN ribosome cña chñng Du Gen 16S ARN ribosome cña chñng Du do chóng t«i gi¶i m∙ cã chiÒu dµi 1544 cÆp baz¬ (bp) víi 394 A, 349 C, 477 G vµ 324 T.

ID NT_16S ARN ribosome

SQ 1540 BP; 382 A; 361 C; 486 G; 311 T;

GGACAGAAGG GAGCTTGCTC CCGGATGTTA GCGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA

CCTGCCTGTA AGACTGGGAT AACTCCGGGA AACCGGAGCT AATACCGGAT AGTTCCTTGA

ACCGCATGGT TCAAGGATGA AAGACGGTTT CGGCTGTCAC TTACAGATGG ACCCGCGGCG

CATTAGCTAG TTGGTGGGGT AATGGCTCAC CAAGGCGACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAG

GGTGATCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGG

GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG GAGCAACGCC GCGTGAGTGA TGAAGGTTTT

CGGATCGTAA AGCTCTGTTG TTAGGGAAGA ACAAGTGCGA GAGTAACTGC TCGCACCTTG

ACGGTACCTA ACCAGAAAGC CACGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG

TGGCAAGCGT TGTCCGGAAT TATTGGGCGT AAAGGGCTTG CAGGCGGTTT CTTAAGTCTG

ATGTGAAAGC CCCCGGCTCA ACCGGGGAGG GTCATTGGAA ACTGGGAAAC TTGAGTGCAG

AAGAGGAGAG TGGAATTCCA CGTGTAGCGG TGAAATGCGT AGAGATGTGG AGGAACACCA

GTGGCGAAGG CGACTCTCTG GTCTGTAACT GACGCTGAGG AGCGAAAGCG TGGGGAGCGA

ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCACGCC GTAAACGATG AGTGCTAAGT GTTAGGGGGT

TTCCGCCCCT TAGTGCTGCA GCTAACGCAT TAAGCACTCC GCCTGGGGAG TACGGTCGCA

AGACTGAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC GGTGGAGCAT GTGGTTTAAT

TCGAAGCAAC GCGAAGAACC TTACCAGGTC TTGACATCCT CTGACAACCC TAGAGATAGG

GCTTTCCCTT CGGGGACAGA GTGACAGGTG GTGCATGGTT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA

GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTTGATC TTAGTTGCCA GCATTCAGTT

GGGCACTCTA AGGTGACTGC CGGTGACAAA CCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAATCA

TCATGCCCCT TATGACCTGG GCTACACACG TGCTACAATG GACAGAACAA AGGGCTGCAA

GACCGCAAGG TTTAGCCAAT CCATAAATCT GTTCTCAGTT CGGATCGCAG TCTGCAACTC

GACTGCGTGA AGCTGGAATC GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC

CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ACGAGAGTTT GCAACACCCG AAGTCGGTGA

GGTAACCTTT ATGGAGCCAG CCGCCGAAGG TGGGGCAGAT GATTGGGGTG AAGTCGTAAC