BÁO CÁO KHOA HỌC: "XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HOÁ SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS VAR. AIZAWAI H1 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM" pptx

Tiến hành tạo dòng và đọc trình tự đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry 1C đồng thời so sánh với trình tự cùng đoạn gen này đã được công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế.. aizawai H1 p

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HOÁ SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG BACILLUS

THURINGIENSIS VAR AIZAWAI H1 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Bùi Thị Hương, Nguyễn Thuỳ Châu

Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu Hoạch

Đinh Duy Kháng

Phòng Vi Sinh phân tử, Viện Công Nghệ Sinh Học

Bacillus thuringiensis (gọi tắt là Bt) là vi khuẩn gram

dương được phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, chúng chứa

các gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố

có khả năng diệt nhiều loại côn trùng, vì thế chế phẩm

thuốc trừ sâu vi sinh Bt đã được sử dụng để phòng trừ các côn trùng dịch hại thuộc các bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh cứng và các động vật không xương sống khác Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã tập trung nghiên

cứu, sưu tập, phân tích và sàng lọc các chủng B

thuringiensis thu nhận được ở các mẫu phân lập từ môi

trường, với mục đích tìm ra những chủng mới có hoạt tính diệt sâu cao, phổ diệt sâu rộng đối với nhiều loài côn trùng Việc xác định sự tồn tại các nguồn gen quý từ những chủng này là công việc rất cần thiết, làm cơ sở tiền đề cho các

nghiên cứu đi sâu tiếp theo đối với những gen cry này như: việc gây đột biến vị trí có định hướng đối với gen cry nhằm tạo chủng B thuringiensis mới chống khả năng kháng

thuốc của các loại côn trùng; việc tạo ra các chủng B

thuringiensis tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng, hoạt lực

diệt sâu cao hơn đối với nhiều loài côn trùng quan trọng;

việc biến nạp các gen độc tố cry thích hợp vào từng loại

cây trồng để bảo vệ chúng trước sự tấn công của côn

trùng Trong khuôn khổ bài báo này chúng tôi đã tiến

hành thử hoạt tính diệt sâu, thăm dò sự tồn tại gen cry1C và cry1Ab của chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân

lập ở Việt Nam Tiến hành tạo dòng và đọc trình tự đoạn

ADN đặc hiệu thuộc gen cry 1C đồng thời so sánh với trình

tự cùng đoạn gen này đã được công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế

I.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I.1.Thử sinh học hoạt tính diệt sâu:

Tiến hành theo phương pháp của S.H.Park: Đối tượng sâu

được thử là sâu tơ (Plutella xylostella), sâu keo

(Spodoptera exiqua) và sâu khoang (Spodoptera litura): lá

bắp cải tươi được cắt thành các khoanh tròn có đường kính

3cm vào hỗn dịch bào tử tinh thể B thuringiensis có nồng

độ 5x107 bào tử/ml, sau đó đặt vào đĩa petri và cho vào mỗi đĩa 10 con sâu; mỗi mẫu thử với 30 con sâu Đối với

sâu bông ( Helicoverpa armigera) cũng được tiến hành

tương tự trên lá bông Hoạt tính diệt sâu ngài gạo (Corrcyra cephalonia) được đánh giá như sau: bỏ 30 con sâu ngài gạo

vào bình thuỷ tinh 400g gạo đã được nhiễm bào tử và tinh thể của B thuringiensis với liều 5x107 bào tử/gam gạo, nuôi ở 300C với độ ẩm 70-80%

I.2 Điện di protein (SDS-PAGE) bào tử và tinh thể của chủng B thuringiensis var aizawai H1

Chủng B thuringiensis phát triển trên môi trường thạch T3

đã được tạo hỗn dịch trong 5 ml dịch 0,02% Triton X-100

Ly tâm trong 1 phút Cắn được hoà tan với 30 l đệm SDS (1x SDS gel- loading buffer) Các mẫu được đun sôi trong

5 phút, ly tâm ở 8000vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổi

và chạy điện di trên gel polyacryamide 10% ở 30mA theo phương pháp của Sambrook và Maniatis [5]

I.3 Xác định sự tồn tại gen cry1Ab, cry1C bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựng trong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khử ion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzim Tag-polymeraza 0,4l, MgCl2: 2l, ADN 2l ( nồng độ 50ng/l)

Sử dụng cặp mồi

TY6(5’-GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) và TY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’); TYIC (5’-CAACCTCTATTTGGTGC AGGTTC-3’) và TYIUNI

3’) theo thứ tự, để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong

(5’-ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC-gen cry1Ab và cry1C Các sản phẩm PCR được phân tích

bằng điện di trên gel agaroza 1%

I.4 Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1C

Tạo vectơ tái tổ hợp: tiến hành theo phương pháp của

Sambrook và cs [5]: gắn trực tiếp sản phẩm PCR được tạo

ra ở mục I.3 vào vectơ tách dòng PCRTM 2.1 Phản ứng gắn gồm: nước khử ion: 3l; Dung dịch đệm gắn: 1l; Sản

phẩm PCR:3l; vectơ PCRTM2.1: 2l; T4- ligaza: 1l Ủ qua đêm ở nhiệt độ 140C Sau đó biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E coli chủng DH5 Các khuẩn lạc E coli chứa vectơ pCRTM 2.1 tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB chứa ampixillin, IPTG (Isopropyl- -D-

Thiogalactopyranoside) và X-gal Sau đó tách chiết ADN plasmit từ tế bào vi khuẩn bằng cách xử lý với dung dịch chứa NaOH, SDS để phá vỡ tế bào Thu dịch nổi chứa

ADN plasmit, kết tủa bằng cồn rồi hoà lại cặn trong dung

dịch đệm TE, ARN được loại bằng RNaza nồng độ

100g/ml

I.5 Phân tích trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C

Sau khi tách chiết và tinh sạch vectơ tái tổ hợp từ tế bào chủ, gen được xác định trình tự theo phương pháp enzim học của Sanger nhờ bộ kit của Hãng Amersham-Pharmacia Biotech với máy đọc trình tự ADN tự động ALF-Express của Hãng Pharmacia Phân tích kết quả được tiến hành với chương trình PC/Gene

II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

II.1 Thử sinh học hoạt tính diệt sâu của chủng B

thuringiensis var aizawai H1 phân lập

Chủng B thuringiensis phân lập đã được phân loại là chủng

B thuringiensis var aizawai theo phương pháp định typ

huyết thanh của Ohba và Aizawai [1]

Chúng tôi đã tiến hành thử sinh học hoạt tính diệt sâu của

chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập có tinh thể

hình quả trám đối với một số côn trùng phổ biến thuộc bộ cánh vảy như sâu ngài gạo, sâu tơ, sâu keo, sâu khoang và sâu bông kết quả được chỉ ra ở bảng 1:

Bảng 1: Hoạt tính diệt sâu của các chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập đối với sâu tơ (Plutella

xylostella), sâu keo (Spodoptera exiqua), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu bông (Helicoverpa armigera) và

sâu ngài gạo (Corrcyra cephalonica)

Kết quả bảng 1 cho thấy: chủng B thuringiensis var

aizawai H1 phân lập có hiệu lực diệt đặc hiệu cao là 100%

đối với sâu ngài gạo, sâu tơ và sâu keo Hiệu quả diệt giảm hơn đối với sâu khoang (90%) và giảm hơn nữa trên đối

tượng sâu bông (30%) Như vậy chủng B thuringiensis var

aizawai H1 có ý nghĩa rất quan trọng để bổ sung vào bộ

sưu tập chủng giống phục vụ cho công nghệ sản xuất thuốc

trừ sâu vi sinh B thuringiensis

Kết quả thử sinh học cho thấy sâu bông là loài rất khó diệt Chúng tôi cho rằng cần phải có những nghiên cứu sâu hơn

về mặt sinh học phân tử đối với chủng B thuringiensis var aizawai H1 có hiệu lực diệt sâu bông nói trên như: phân tích sự tồn tại các gen cry, tạo dòng và đọc trình tự các gen cry mã hoá protein tinh thể độc tố có hiệu lực diệt sâu

bông, từ đó tạo ra chủng B thuringiensis tái tổ hợp mới có

hiệu lực diệt sâu bông là rất cần thiết và có ý nghĩa thực

tiễn cho công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu B thuringiensis diệt trừ sâu bông H armigera tại Việt nam

II.2 Phân tích protein tinh thể và bào tử của các chủng

B thuringiensis var aizawai phân lập bằng phương pháp điện di protein

Hình 1: Điện di đồ protein trên gel 10% polyacrylamit

(PAGE) của chủng

B thuringiensis var aizawai H1 phân lập và chủng chuẩn

Chú thích: Kênh 1: Maker (chỉ thị với phosphorylase có trọng lượng phân tử 97,4kDa, Bovin serum albumin – 66 kDa, Ovalbumin – 42,7 kDa, Carbonic anhydrase – 31kDa, Soybean tripsin inhibitor – 21,5 kDa, -Lactalbumin – 14,4

kDa); Kênh 2: chủng chuẩn Bt var aizawai ; Kênh 3: chủng

Bt var aizawai H1 phân lập

Kết quả điện di protein tinh thể của chủng Bt var aizawai H1 phân lập được chỉ ra ở hình 1 cho thấy: Chủng Bt var

aizawai phân lập có khuôn mẫu protein giống với chủng Bt var aizawai chuẩn gồm có các băng protein với trọng lượng

phân tử là: 130, 81, 71 kDa

II.3.Xác định sự tồn tại gen cry1Ab và cry1C của chủng

B thuringiensis var aizawai H1 phân lập:

Chúng tôi đã tiến hành sử dụng cặp mồi TYIC và TYIUNI

để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen cry1C của chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập và chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1, kết quả được thể

hiện ở hình 2

Hình 2 Điện di đồ sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry 1C của chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập và chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1

Kết quả ở hình 2 cho thấy: sản phẩm PCR thu được rất đặc

hiệu, không có sản phẩm phụ Chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập có duy nhất một sản phẩm PCR đặc

hiệu vào khoảng 285bp theo lý thuyết giống với sản phẩm

PCR của chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1 (kênh 1,3) Như vậy cả hai chủng B thuringiensis var aizawai H1phân lập và chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1 đã mang gen cry1C

Tương tự chúng tôi tiến hành sử dụng cặp mồi: TY6 và

TY14 để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab của chủng B thuringiensis var aizawai phân lập và chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1 Kết quả cho thấy

cả hai chủng này đều không có sản phẩm PCR đặc hiệu

Như vậy cả hai chủng B thuringiensis var aizawai H1

phân lập và chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1 đều không chứa gen cry1Ab

Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chủng B

thuringiensis var aizawai H1phân lập ở Việt Nam đã mang gen cry1C nhưng không mang gen cry1Ab

II.4 Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1C từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập

Tiến hành gắn sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1C từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập vào vectơ

PCRTM2.1 để tạo vectơ tái tổ hợp Sau đó biến nạp vectơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5 Nhờ quá trình nhân lên của vi khuẩn mà vectơ tái tổ hợp cũng được nhân theo Sau đó tiến hành tách chiết và tinh sạch plasmit tái tổ hợp

từ vi khuẩn E coli đã biến nạp Kiểm tra plasmit tái tổ hợp bằng cách cắt với enzim giới hạn E coR I, sản phẩm cắt

được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 1% Kết quả

được thể hiện ở hình 3

Kết quả ở hình 3 cho thấy: khi plasmit tái tổ hợp được cắt

bởi enzim EcoR I đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C được

tách ra khỏi plasmit có kích thước đúng bằng với sản phẩm PCR của đoạn ADN này ( Kênh 1 và 3, 4, 5, 6) Kênh 2 cho thấy plasmit của khuẩn lạc xanh không mang đoạn ADN ngoại lai, và chỉ có một băng duy nhất có kích thước vào khoảng 3,9kb là trọng lượng phân tử của plasmit Như vậy chúng tôi đã chọn được 4 dòng có đính sản phẩm PCR là

đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C và được vi khuẩn E coli nhân lên theo mong muốn Tuy nhiên để khẳng định

một cách chắc chắn điều này, cần xác định trình tự đoạn ADN đã được gắn vào vectơ

Hình 3: Điện di trên gel agaroza 1% để kiểm tra các plasmit

tái tổ hợp

mang sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1C cắt bằng

EcoR I

Chú thích: Kênh 1: Sản phẩm PCR của đoạn ADN đặc hiệu

gen cry1C; Kênh 2: plasmit của khuẩn lạc xanh; Kênh

3,4,5,6: Plasmit cắt bằng EcoR I ; Kênh 7: Chỉ thị phân tử

gen cry1C

Kết quả ở hình 4 cho thấy: trình tự đoạn ADN đặc hiệu của

gen cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai

H1 phân lập được xác định có chiều dài 285 cặp bazơ bao gồm số lượng các nucleotit như sau: 96A, 44C, 61G, 84T

Hình 4: Trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry 1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập,

đoạn ADN này dài 285 cặp bazơ

II.6 So sánh trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C

Chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự đoạn ADN đặc hiệu

của gen cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var

aizawai H1 phân lập với trình tự cùng đoạn gen này đã

được công bố năm 1989 trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc

tế, kết quả được thể hiện ở hình 5

Hình 5: So sánh trình tự nucleotit giữa đoạn ADN đặc hiệu

của gen cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập ở Việt Nam (VNCRY1C) và đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C do Sanchis V và cộng sự

công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế

(QTCRY1C)

Từ kết quả ở hình 5 cho thấy đoạn ADN đặc hiệu của gen

cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai H1

phân lập của Việt nam có độ tương đồng cao so với đoạn

ADN đặc hiệu của gen cry1C do Sanchis V và cộng sự

công bố năm 1989 trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế mã

số AC X13602 Độ tương đồng đạt 99,3% Chúng chỉ khác

nhau bởi 2 nucleotit ở vị trí thứ 122 và 243

II.7 Dịch mã đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C

Chúng tôi đã tiến hành dịch mã đoạn ADN đặc hiệu của

gen cry1C sang protein nhờ chương trình phần mềm

PC/Gene Kết quả được thể hiện ở hình 6

Hình 6: Trình tự các axit amin được dịch mã từ đoạn ADN

đặc hiệu của gen cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis

var aizawai H1 phân lập ở Việt nam

Kết quả ở hình 6 cho thấy: Đoạn ADN đặc hiệu của gen

cry1C có thể dịch thông sang một đoạn protein có chiều dài

95 axit amin

III KẾT LUẬN:

Chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập ở Việt

nam có hiệu lực diệt đặc hiệu cao là 100% đối với sâu ngài gạo, sâu tơ và sâu keo Hiệu quả diệt giảm hơn đối với sâu khoang (90%) và giảm hơn nữa trên đối tượng sâu bông (30%)

Kết quả điện di protein tinh thể của chủng Bt.aizawai H1 phân lập cho thấy: Khuôn mẫu protein của chủng B

thuringiensis var aizawai H1 phân lập giống với chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1

Chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập mang gen cry1C, không mang gen cry1Ab Đã tạo dòng và đọc trình

tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C từ chủng B

thuringiensis var aizawai H1 phân lập, đoạn ADN này có

chiều dài 285bp, có thể mã hoá cho một đoạn protein có chiều dài 95 axit amin Trình tự đoạn ADN đặc hiệu của

gen cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai

H1 phân lập ở Việt nam có độ tương đồng cao đạt tới

99,3% so với đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C do

Sanchis V và cộng sự công bố năm 1989 trong Ngân hàng

dữ liệu gen Quốc tế mã số AC X13602

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bacillus thuringiensis an environment

biopesticides.(1986), Theory & Practice

2 Kalman, S., K L Kiehne, K J Libs, and T

Yamatomo (1993), “Cloning of a Novel cryIC-Type Gene from a Strain of Bacillus thuringiensis subsp–galleriae” Applied and Environmental Microbiology, p.1131-1137

3 Klier A (1985), Biopestiside opportunities and

Challegene for management insect Parteun International Symposia

4 Koo, B T., S H Park, S K Choi, B S Shin, J I Kim, J H Yu (1995), “Cloning of a novel crystal protein

gen Cry 1 K from Bacillus thuringiensis subsp Morrisoni” FEMS Microbiology Letter 134, p.159-164

5 Maniatis, T; E.F Fritisch and Sambrook (1989),

Molecular cloning: a laboratory manual Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y

6 6 Proceeding of the Second Pacific Rim Conference

on Biotechnology of Bacillus thurinsgiensis and its impact

to the environment, Chiangmai, Thailand, Nov 4-8, 1996

7 Proceeding of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis meeting September Lanberra, 1993

8 Sanchis V; D Lereclus, G Menou, J Chaufaux, S Guo, M.M Lecadet, (1989) "Nucleotide sequence and

analysis of the amino-terminal coding region of the

spodoptera active delta endotoxin gene of Bacillus

thuringiensis aizawai”, Mol Microbiol 3, p 229-238

9 Schnepf H.E and H.R Whiteley (1981), “Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein in E Coli Proc Nat” Acad Sei USA, 78: p 2893-2897

10 Manual of Technology in Insect Pathodology” A academic press, p 55-57

11 Wang Fei, Ren Gaixin and Chen Yuehua (2001),