Sử dụng kỹ thuật hoá sinh và sinh học phân tử góp phần phân loại các giống bưởi trồng tại nghệ an và hà tĩnh

Có rất nhiều phơng pháp phân loại học phân tử dùng trong phân tích tính đa hình hệ gen nh phơng pháp RFLP, AFLP, SSR… Tuy nhiên các ph Tuy nhiên các phơngpháp này đều phức tạp, yêu cầu t

Bộ giáo dục và đào tạo

Trờng đại học vinh

Nguyễn Thị Thu Loan

sử dụng kỹ thuật hóa sinh và sinh học phân tử góp phần phân loại các giống bởi

trồng tại nghệ an và hà tĩnh

Chuyên ngành: Thực vật họcMã số: 60 42 20

Luận văn thạc sĩ sinh học

Ngời hớng dẫn khoa học:

PGS.TS Nguyễn Văn Mùi

Vinh - 2006 Những từ viết tắt

ADN Axit Deoxyribonucleic

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

= Đa hình độ dài các mảnh đợc khuyếch đại

ARN Axit ribonucleic

bp Cặp bazơ nitơ

dNTPs Deoxyribonucleozit 5’ Triphotphat

ISSR Inter - Simple Sequence Repeat

IRAP Inter - Restrotransposon Amplified Polymorphism

Kb Kilo bazơ

M Marker = thang ADN chuẩn

PCR Polymerase Chain Reaction

=Phản ứng chuỗi trùng hợp

RAPD Random Amplified polymorphism DNA

=Đa hình các đoạn ADN đợc nhân bản ngẫu nhiên

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

= Đa hình các mảnh cắt giới hạn

RNaza Ribonucleaza

TE Tris - Ethylenediaminetetraaxetate

Tm Melting Temperatures

= Nhiệt độ nóng chảy

UPGMA Unweighted pairgroup method analysis

SSR Simple Sequence Repeat

Mục lục

Trang

Mở đầu 1

Chơng 1 Tổng quan tài liệu 3

1.1 Giới thiệu chung về chi Citrus và cây bởi 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3

1.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bởi 4

1.1.3.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ trên thế giới 4

1.1.3.2 Tình hình sản xuất và tiêu thu trong nớc 5

1.1.4 Đặc điểm chung và giá trị của cây bởi 6

1.1.4.1 Đặc điểm thực vật của bởi 6

1.1.4.2 Giá trị cây bởi 7

1.1.5 Lợc sử nghiên cứu chi Citrus 8

1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu chi Citrus trên thế giới 8

1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu chi Citrus ở Việt Nam 12

1.2 Kỹ thuật PCR- RAPD 15

1.2.1 Kỹ thuật PCR 15

1.2.1.1 Lịch sử của phơng pháp 15

1.2.1.2 Nguyên tắc của phơng pháp 15

1.2.1.3 Thành phần phản ứng PCR 16

1.2.1.4 ứng dụng của phản ứng PCR 18

1.2.2 Kỹ thuật RAPD 19

1.2.2.1 Nguyên lý của kỹ thuật RAPD 19

1.2.2.2 Các ứng dụng kỹ thuật RAPD 20

Chơng 2 Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu 23

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 23

2.1.1 Nguyên liệu thực vật 23

2.1.2 Thiết bị và hoá chất sử dụng 23

2.2 Phơng pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phơng pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật 24

2.2.2 Phơng pháp phân tích các chỉ tiêu sinh hoá 24

2.2.3 Phơng pháp phân tích sinh học phân tử 25

2.2.3.1 Phơng pháp tách chiết và làm sạch ADN từ lá bởi 25

2.2.3.2 Phơng pháp xác định hàm lợng và độ tinh sạch ADN 26

2.2.3.3 Phơng pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR- RAPD 26

2.2.2.4 Phơng pháp điện di trên gel agaroza và gel polyacrylamit .27

2.2.3.5 Phơng pháp phân tích số liệu 27

Chơng 3 Kết quả và thảo luận 29

3.1 Đặc điểm hình thái các giống bởi nghiên cứu 29

3.1.1 Đặc điểm hình thái của giống bởi Phúc Trạch 29

3.1.2 Đặc điểm hình thái của giống bởi Đờng 30

3.1.3 Đặc điểm hình thái của giống bởi Đào 30

3.1.4 Đặc điểm hình thái của giống bởi Chua 31

3.1.5 Đặc điểm hình thái của giống bởi Chộng 31

3.1.6 Đặc điểm hình thái của giống bởi Trắng 32

3.1.7 Đặc điểm hình thái của giống bởi Oi 32

3.1.8 Đặc điểm hình thái của giống bởi Sơn 33

3.2 Đặc điểm sinh hóa của các giống bởi nghiên cứu 35

3.2.1 Hàm lợng chất hữu cơ trong quả 35

3.2.2 Phân tích hợp chất flavonoit bằng sắc ký lớp mỏng 37

3.3 Kết quả phân tích các chỉ tiêu phân tử 40

3.3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá 8 giống bởi 40

3.3.2 Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD 41

3.3.2.1 Số phân đoạn ADN xuất hiện 41

3.3.2.2 Phân tích sự đa hình ADN của sản phẩm RAPD trên điện di đồ 44

3.3.2.3 Mối quan hệ di truyền giữa các giống bởi nghiên cứu 64

Kết luận và kiến nghị 69

Tài liệu tham khảo 71

Phụ Lục 79

Lời cảm ơn

Luận văn đợc hoàn thành tại phòng Sinh lý - Sinh hoá, Khoa Sinh học, trờng Đại học Vinh và phòng Công nghệ Enzym - Protein, Trung tâm sinh học phân tử và công nghệ tế bào, khoa Sinh học, trờng Đại học Khoa học Tự nhiên

- ĐHQGHN

Để hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Mùi, ngời đã tận hớng dẫn và tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Sinh học, trờng Đại học Vinh, các thầy cô giáo khoa Sinh học, trờng Đại học Khoa học Tự nhiên

-ĐHQGHN đã chỉ bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập

Qua đây, em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đối với các thầy cô giáo khoa

Đào tạo Sau đại học, các cô chú là cán bộ phòng Thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ trong thời gian qua

Cuối cùng, xin dành cho gia đình và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Vinh, ngày 20 tháng 12 năm 2006

Học viên

Nguyễn Thị Thu Loan

Mở đầu

Nghệ An và Hà Tĩnh là khu vực có điều kiện khí hậu, đất đai thuận lợicho các loài của chi Citrus phát triển, đây đợc xem là nơi có nhiều giống camquýt nổi tiếng mà sản phẩm của chúng đợc bán rộng rãi trên thị trờng trong n-

ớc và thị trờng thế giới

Điều tra các giống bởi thuộc chi Citrus, chúng tôi nhận thấy rằng ở Nghệ

An và Hà Tĩnh có sự đa dạng cao về thành phần các giống bởi địa phơng Một

số giống đợc biết đến từ lâu nh bởi Phúc Trạch, bởi Đờng Hơng Sơn vì có chấtlợng quả tốt, bên cạnh đó còn nhiều giống khác đợc ngời dân gọi bằng các tênkhác nhau, cha có sự thống nhất về mặt phân loại Dù là giống nổi tiếng haycha đợc biết đến thì các giống bởi trồng ở hai tỉnh này đều cho năng suất cao,chất lợng tốt, đáp ứng đợc nhu cầu của ngời tiêu dùng Vì vậy từ đời này qua

đời khác, các cây bởi ngon đều đợc chiết cành để gây giống mới

Là một trong ba đối tợng cây ăn quả chính (chuối, dứa, và cây có múi)nhng ở Việt Nam việc nghiên cứu về bởi, đặc biệt là nghiên cứu về mặt phânloại hiện nay vẫn cha đợc tiến hành rộng khắp Bởi lại có sự đa dạng về giống

và ít có sự khác biệt giữa các giống trong loài nên việc phân loại chúng gặp rấtnhiều khó khăn, kết quả phân loại hầu nh mới chỉ đạt đợc ở mức độ hình thái

và giải phẫu, cha phản ánh hết đợc mối quan hệ xa gần của chúng về mặt họhàng Vì vậy sử dụng các kỹ thuật sinh học hiện đại, đặc biệt là kỹ thuật hóasinh và sinh học phân tử hỗ trợ cho phân loại đạt hiệu quả cao và chính xáchơn, bổ sung cho phơng pháp phân loại bằng hình thái, là một việc làm quantrọng và cần thiết

Có rất nhiều phơng pháp phân loại học phân tử dùng trong phân tích tính

đa hình hệ gen nh phơng pháp RFLP, AFLP, SSR… Tuy nhiên các ph Tuy nhiên các phơngpháp này đều phức tạp, yêu cầu thông tin về trình tự nghiên cứu và đòi hỏi mộtlợng lớn ADN của hệ gen nên chỉ có kỹ thuật RAPD (Random AmplyfiedPolymorphism DNA) là đợc sử dụng phổ biến, đây là kỹ thuật đơn giản, dễ

làm, ít tốn kém, nó dựa trên nguyên tắc phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) vớicác mồi ADN không đặc thù để nhân bản các đoạn ADN một cách ngẫunhiên Bằng kỹ thuật này, Viện công nghệ sinh học Việt Nam đã đánh giá tính

đa hình của nhiều giống bởi, phân loại chúng, xây dựng đợc cây phát sinhchủng loại và tìm đợc các dạng tổ tiên [32] Trong nghiên cứu này chúng tôi

đã lựa chọn kỹ thuật RAPD

Xuất phát từ một thực tế là nhiều giống bởi trồng ở Nghệ An và Hà Tĩnh

về mặt hình thái khó phân biệt nhau nhng đợc ngời dân địa phơng gọi bằngcác tên gọi khác nhau, song liệu chúng có phải là các giống khác nhau haykhông thì cho đến nay vẫn cha đợc làm sáng tỏ Vì vậy tiến hành nghiên cứu

để tìm một lời giải đáp cho vấn đề này là một việc làm có ý nghĩa khoa học và

thực tiễn Với những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Sử dụng kỹ“Sử dụng kỹ

thuật hóa sinh và sinh học phân tử góp phần phân loại các giống bởi trồng tại Nghệ An và Hà Tĩnh” Đề tài thực hiện với mục tiêu là: nghiên cứu đặc

điểm sinh hóa và di truyền của các giống bởi nhằm đánh giá mối quan hệ họhàng giữa chúng, thông qua đó cung cấp thêm các dẫn liệu làm cơ sở cho việcphân loại, đồng thời góp phần đánh giá đa dạng sinh học, định hớng khoa họccho việc bảo tồn và khai thác hợp lí nguồn tài nguyên thực vật ở nớc ta

Chơng 1 Tổng quan tài liệu

1.1 Giới thiệu chung về chi Citrus và cây bởi

1.1.1 Phân loại

Cây bởi có tên khoa học là Citrus maxima (J Burmal) Merrill thuộc chi

Citrus, họ phụ Aurantioideae, họ Cam Rutaceae, bộ Cam Rutales Họ Cam là

họ lớn nhất, có khoảng 150 chi với khoảng 1600 loài, phân bố chủ yếu ở vùng

nhiệt đới và cận nhiệt, chỉ có một số ít ở vùng ôn đới, đặc biệt có nhiều ở NamPhi và Australia [24]

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Trong các loại cây ăn quả nhiệt đới và á nhiệt đới, chi Citrus có địa bànphân bố rộng, chúng có mặt ở hầu hết các lục địa, thích nghi rộng với nhiều

điều kiện đất đai, ngay cả ở đất rất nghèo dinh dỡng hay đất ủng

Bởi là loài phân bố rộng nhất trong các loài Citrus, bởi đợc trồng nhiều ởNam á và trên khắp lãnh thổ Malaixia, đặc biệt mọc hoang trên bờ sông Fiji

và Tonga Cây bởi cũng có mặt ở Trung Quốc gần 100 năm trớc công nguyên,vùng trồng bởi nhiều nhất là Nam Trung Quốc thuộc các tỉnh Jiangsu, Jiangxi

và Fujian Đặc biệt ở Thái Lan ngời ta thấy trên bờ sông Thachin có nhiều loàithuộc chi Citrus, trong đó có bởi Bởi cũng đợc trồng nhiều ở Đài Loan, phíaNam Nhật Bản, Bănglades, Việt Nam, Indonesia, New Guinea, Tahiti,California và Israel [56]

Theo Cassin (1984), khu phân bố các loài trong chi Citrus nói chung, bởinói riêng nằm trong phạm vi từ 40 vĩ độ Nam đến 40 vĩ độ Bắc, nhng tập trungnhiều nhất là ở Châu á, vùng xung quanh Địa Trung Hải, Trung Mĩ, phía NamChâu Phi và Châu Mĩ, Châu úc (theo Nguyễn Nghĩa Thìn,[30]) ở Châu Âu,các nớc trồng cam, bởi có tiếng nh Pháp, ý, Tây Ban Nha với diện tích hàngchục vạn hecta Còn ở Châu Mĩ, nơi có số lợng cam đứng đầu thế giới thì có cácvùng trồng cam, bởi lớn nh California, Florida, Colombia, Arizon Riêng ởChâu á, bởi đợc trồng ở Xiri, ấn Độ, Trung Quốc, Malaixia, Nhật Bản và cảViệt Nam Đặc biệt ở Trung Quốc và ấn Độ đợc xem là trung tâm phát sinh củanhiều giống bởi nổi tiếng Bởi thích nghi với đất phù sa cổ ven sông nên ở ViệtNam vùng trồng bởi lớn nhất là vùng ven sông nh sông Hồng, sông Thái Bình,sông Ngàn Sâu, sông Ngàn Phố

Còn theo Tanaka và Engler thì trung tâm phát sinh chính của các loài trongchi Citrus là ở ấn Độ và Mianma Tác giả đã vạch ra đờng ranh giới vùng xuất

xứ của các giống thuộc chi Citrus từ phía Đông ấn Độ (chân núi Himalaya) quaAustralia, miền Nam Trung Quốc và Nhật Bản (theo Hoàng Ngọc Thuận, [34]).Mặc dù có nhiều giả thuyết khác nhau về nguồn gốc dã sinh của bởi nhnghầu hết đều thống nhất rằng cây bởi bắt nguồn từ các vùng nhiệt đới và cậnnhiệt đới Đông Nam Châu á, kể cả lục địa, bán đảo và quần đảo Ngoài tìm ra

đợc nơi xuất xứ của bởi, các nhà nghiên cứu còn tìm đợc nguồn gốc của quýt ởNam á, trên quần đảo Malaixia và một số nơi ở Nhật Bản; còn cam thì bắt

nguồn từ biên giới Việt Nam - Trung Quốc, từ ấn Độ, Mianma Ngày nayngoài những nơi nằm trong giả thuyết về nguồn gốc phát sinh, các loài Citrus đ-

ợc phân bố rộng rãi khắp những nơi có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt, quá trìnhtrồng trọt và lai tạo đã làm cho những loài ban đầu biến đổi, dẫn đến sự đa dạng

và phong phú về thành phần loài trong chi Citrus nh hiện nay

1.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bởi

1.1.3.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ trên thế giới

So với các loài cây ăn quả khác, cam quýt đợc trồng phổ biến ở nhiềunơi trên thế giới, chúng chiếm tỉ trọng cao cả về số lợng và nhu cầu tiêudùng Theo dự báo của tổ chức lơng thực thế giới (FAO), vào năm 1994 tổngsản lợng cam quýt trên thế giới đạt 80 triệu tấn (chiếm 20% sản lợng các loạiquả) trong đó cam chanh 58,373 triệu tấn, quýt 7,636 triệu tấn và ít nhất làchanh và bởi Đến năm 2000, sản lợng quả có múi lên tới 85 triệu tấn, nhucầu tiêu thụ trên thị trờng vào khoảng 80 triệu tấn, tăng trởng hàng năm là2,65%

Cũng theo thông báo của tổ chức này, diện tích trồng cây có múi ngàycàng đợc mở rộng Vào năm 1990 trên thế giới có 2 triệu ha đất trồng camquýt, đến năm 2000 diện tích này tăng lên gần 3,5 triệu ha Khu vực đứng đầu

về diện tích và sản lợng cam quýt là Châu Mỹ và Châu á, từ đây cam quýt đợcxuất khẩu sang nhiều nớc khác [34]

1.1.3.2 Tình hình sản xuất và tiêu thu trong nớc

Nhân dân ta có tập quán trồng cam quýt lâu đời Với 53 tỉnh thành trong cảnớc nơi đâu cũng có mặt của các loài cây ăn quả có múi này, song tuỳ thuộc vào

điều kiện khí hậu đất đai mà cam quýt đợc trồng tập trung hay phân tán nhiềuhoặc ít Ba vùng trồng cây ăn quả có múi trên diện tích lớn ở nớc ta là: vùng đồngbằng sông Cửu Long, vùng khu bốn cũ và vùng trung du miền núi phía Bắc.Riêng ở đồng bằng sông Cửu Long, theo tài liệu của tổng cục thống kê (1995) thìnăm 1993 diện tích cam quýt lên tới 15.944 ha, chiếm 57,86% diện tích camquýt cả nớc và sản lợng đạt 124,548 tấn, chiếm 76,04% sản lợng cam quýt cả n-

ớc Các tỉnh trồng nhiều cam quýt nhất của vùng này là Tiền Giang, Bến Tre,Vĩnh Long, Cần Thơ, Đồng Tháp, năng suất bình quân của cam đạt 105 tạ/ha,chanh đạt 88 tạ/ha, quýt 87 tạ/ha, bởi 74 tạ/ha ở vùng khu bốn cũ, nơi tập trungcam quýt lớn nhất là Phủ Quỳ - Nghệ An với diện tích cam quýt là 1.600 ha,ngoài ra còn một số vùng rải rác sản xuất cam, bởi nh Hơng Sơn, Hơng Khê (HàTĩnh), cam quýt ở đây cho mẫu mã đẹp và chất lợng tốt nên hấp dẫn đợc ngời

tiêu dùng Vùng núi phía Bắc gồm các tỉnh Tuyên Quang, Hà Giang, Yên Bái,Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Thái là nơi sản xuất nhiều cam quýt, riêngdiện tích trồng cam quýt ở Bắc Giang đã lên 1.000 ha [36].

Bởi có mặt trong tập đoàn cây ăn quả nổi tiếng này, các vùng sản xuấtbởi chính ở nớc ta là Bến Tre, Đồng Nai, Bình Dơng, Huế, Phú Thọ, Hà Tĩnh

và Hà Nội với các giống bởi quý nh bởi Phúc Trạch, bởi Thanh Trà, bởi

Đoan Hùng, bởi Diễn Diện tích trồng bởi ở Việt Nam vào khoảng 8.170 ha,trong đó 5.000 ha sản xuất với sản lợng hàng năm là 50.000 tấn Riêng bởiPhúc Trạch trồng ở Hơng Khê-Hà Tĩnh thì năm 1994 diện tích trồng bởi là290,6 ha, chiếm 65% tổng diện tích cây ăn quả có múi của huyện, đây làgiống bởi ngon nổi tiếng, đợc tiêu thụ rộng rãi trên khắp các thị trờng trongnớc và thế giới [5]

1.1.4 Đặc điểm chung và giá trị của cây bởi

1.1.4.1 Đặc điểm thực vật của bởi

Bởi là cây ăn quả thuộc chi Citrus, họ cam Rutaceae, phân bố rộng rãikhắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt Bởi có dạng cây to, cao đến 13 m, vỏ đôikhi để toát ra một chất gôm, cành có gai nhỏ mọc đứng ở kẽ lá, có lông, sựphân cành nhiều hay ít phụ thuộc vào từng giống Lá bởi hình trứng ngợc,nguyên, dai, có khoảng 8 đến 10 đôi gân bên, gân nhỏ chỉ rõ và lồi ở mặt dới,nhất là trên sống giữa Lá có nổi rõ túi tinh dầu, kích thớc và mật độ túi tinhdầu khác nhau ở từng giống

Đặc điểm nổi bật của loài là có lông mịn màu trắng bao phủ ở các bộphận còn non nh thân, cành, lá, hoa, quả Hoa bởi mọc thành chùm 6 đến 10hoa, cuống hoa có lông, lá bắc hình vạch Hoa trắng, to, rất thơm Đài 4-5,tròn, có lông Tràng 5, màu trắng Số lợng nhị lớn, khoảng 28-42 cái trên mộthoa, nhị ngắn bằng nửa cánh hoa Đĩa mật dày, nằm ở gốc bầu Bầu hình cầu,

có lông, vòi dài Bầu nhuỵ hình đầu, to Quả ít, hình cầu, đôi khi to bằng đầungời, cùi rất dày, màu cùi thay đổi tuỳ theo từng loại bởi Vỏ quả ngoài cónhiều túi tiết, vỏ quả trong dai, phía ngoài có nhiều lông đơn bào mọng nớcchua hay ngọt mà ta thờng gọi là “Sử dụng kỹtép” Quả thờng có 12-13 múi Hạt có phôilớn, cây mầm không có màu

Bởi ra hoa vào khoảng tháng 1-2, có quả từ khoảng tháng 7-12 Cây trồngkhắp nớc ta Quả bởi dùng để ăn và chế biến thành các sản phẩm khác có giátrị [3]

1.1.4.2 Giá trị cây bởi

Từ xa, trong cuốn “Sử dụng kỹNam dợc thần liệu” Tuệ Tĩnh đã viết về bởi, vỏ quả

b-ởi gọi là cam phao, vị đắng cay, tính không độc, thông lợi, trừ đờm ráo thấp,hoà huyết, giảm đau, trị tràng phong, tiêu phù thũng, khi dùng phần vỏ bởi thì

bỏ phần cùi, lấy vỏ vàng sao lên, tán nhỏ để dùng [4]

Bởi là cây ăn quả đặc sản của cả nớc, có giá trị dinh dỡng cao Hàm lợngnớc trong quả bởi đạt 80-87% khối lợng, độ khô 10-15%, axit hữu cơ 0,2-1%,dinh dỡng khoáng 0,5-0,6% với đầy đủ các nguyên tố khoáng nh Ca, Na, Mg,

P, K Nớc ép từ ruột bởi có độ Brix 9-12% (chỉ đứng sau độ Brix của vải) Đặcbiệt ở bởi rất giàu VitaminC, hàm lợng VitaminC có thể lên tới 90-100mg%[39] Ngoài ra vị ngọt mát, thanh chua ở bởi còn kích thích quá trình tiêu hóa

và hấp thụ thức ăn của ruột

Quả bởi ngoài ăn tơi còn đợc chế biến thành các sản phẩm có giá trị: mứtbởi, chè bởi, nớc bởi, nem bởi Vỏ quả bởi, hoa bởi, lá bởi giàu tinh dầu có thểlàm nguyên liệu sản xuất thuốc bóp và phục vụ một số nghành công nghiệpkhác Hạt bởi chứa nhiều dầu, có thể ép lấy dầu thắp sáng Pectin trong cùi bởi

là một thứ dợc liệu quan trọng điều trị nhiễm xạ, nhiễm kim loại nặng và cầmmáu Mùi thơm tinh dầu bởi còn kích thích tiêu hoá, chữa bệnh đờng ruột vàchảy máu dới da [21]

Cây bởi đã góp phần cải tạo đời sống kinh tế của nhiều hộ gia đình ởhuyện Hơng Khê - Hà Tĩnh trong phơng hớng xoá đói giảm nghèo thì bởiPhúc Trạch gắn liền với nghề kinh tế làm vờn Năm 1993-1994 toàn huyện H-

ơng Khê đã dấy lên phong trào trồng bởi, thay thế các cây trồng khác nh chè,

cọ, mít Còn ở Thanh Chơng - Nghệ An không có vùng trồng bởi đặc trng

nh-ng cây bởi có mặt ở hầu hết các hộ gia đình, nh-ngoài trồnh-ng bởi với mục đíchkinh tế ngời ta còn trồng bởi nội tiêu Thu nhập từ cây bởi đã góp phần xoá

đói cho một số ngời dân huyện nhà

Ngày nay, việc mở rộng diện tích trồng bởi đi liền với nâng cao chất lợnggiống, tạo những giống mới kết hợp đợc nhiều đặc tính tốt, cải tiến công nghệsau thu hoạch và tăng cờng xuất khẩu Để làm đợc điều này thì cần phải quantâm nhiều đến việc tìm kiếm các nguồn gen quý trong quỹ gen của các loàiCitrus có giá trị cao trong sản xuất nông nghiệp Vì vậy, nghiên cứu quỹ gencây bởi, đặc biệt là những cây bởi đặc sản sẽ không chỉ có ý nghĩa khoa học

cơ bản mà còn góp phần thiết thực vào việc cải thiện, bảo tồn và phát triển sự

đa dạng sinh học các giống cây trồng ở nớc ta

1.1.5 Lợc sử nghiên cứu chi Citrus

1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu chi Citrus trên thế giới

Chi Citrus bao gồm các loài cây ăn quả có giá trị dinh dỡng cao nên rấtthu hút đợc sự quan tâm của các nhà nghiên cứu Đã có nhiều tài liệu đề cập

đến chi này trên nhiều lĩnh vực nh phân loại học, nghiên cứu các đặc điểmsinh lý, sinh hoá, di truyền và lai tạo các giống mới

ở Trung Quốc, nghề trồng cam đã có cơ sở từ cách đây trên 3 đến 4nghìn năm Vào đời Tống, Hán Nhan Trực đã ghi chép một số đặc điểm phânloại, cách trồng, sử dụng và chế biến cây ăn quả này [8]

Đã có rất nhiều tác giả quan tâm đến mặt phân loại của các giống camquýt, tuy nhiên do tính đa dạng và dễ lai tạo giữa các giống, các loài để tạogiống mới nên việc nghiên cứu cho đến nay vẫn cha đa ra đợc một ý kiếnthống nhất về số lợng và thành phần loài Theo Linnaeus (1753), cam quýt

có 3-4 loài J.D Hooker (1875) trong bộ thực vật chí ấn Độ thuộc Anh đãchỉ ra họ Rutaceae có 13 chi trong đó chi Citrus có 4 loài, còn theo Tanaka

và Swingle (1954) thì có 16 loài thuộc hai phân chi trong đó phân chi Citrus

có 10 loài Đến năm 1967, R Singh đã bằng phơng pháp tổng hợp các quan

điểm của các nhà phân loại trớc đó đã dung hoà hệ thống Tanaka và Swingle,

từ đó ông đa ra hệ thống 42 loài và thứ Còn một số tác giả khác khi phân loạivừa kết hợp các đặc điểm hình thái với sinh lý, sinh hóa đã khẳng định chi

Citrus chỉ có 3 loài cơ bản là Citrus Maxima Merr., C medica và C reticulata

Blanco (theo Nguyễn Nghĩa Thìn, [30], [31])

Song song với việc nghiên cứu các đặc điểm hình thái để phân loại camquýt, việc tìm hiểu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa cũng đợc nhiều tác giả quantâm Năm 1958, Brin J M đã nghiên cứu sự thay đổi hình thái, giải phẫu, sinh

lý và cờng độ tổng hợp các chất của cam Valenxia trong quá trình phát triển thìthấy rằng vào giai đoạn giữa và cuối có sự biến đổi mạnh mẽ [44] Còn Yamada

Y và cs khi nghiên cứu các giống cam quýt Nhật Bản về các đặc điểm hình thái

và chất lợng quả theo từng mùa vụ đã đi đến kết luận qua các mùa vụ khác nhauchất lợng quả cũng nh kích thớc quả có sự thay đổi đáng kể, ông cho rằng đó là

do sự tác động tổng hợp của nhiều nhân tố trong đó quan trọng nhất là các yếu

tố ảnh hởng đến tỉ lệ phần ăn đợc của quả [77]

Kết quả nghiên cứu về một số chỉ tiêu sinh hoá của Hilgeman và Smith(1940) cho thấy rằng sự tích luỹ đờng trong quá trình sinh trởng và phát triểnquả cam quýt ở mỗi giai đoạn khác nhau cũng khác nhau, tăng dần cho đến khiquả chín [55] Cũng theo hớng này, Daito H và Sato Y (1985) còn cho rằngtuy lợng đờng khử tăng ít hơn và đạt tỉ lệ % ít hơn đờng không khử nhng chúnglại tạo vị ngọt mát dễ ăn của phần ruột quả Hàm lợng đờng khử đợc xem là chỉtiêu để đánh giá độ chín và chất lợng của quả [49].

Theo công bố của tác giả Widodo S E (1995) khi nghiên cứu hàm lợngcác thành phần axit hữu cơ trong quả thì thấy rằng hàm lợng axit tổng số đạt 3-9% trong đó axit malic và citric chiếm 90% Cũng theo tác giả trên, hàm lợng

đờng và tỉ lệ đờng khử/đờng không khử là một chỉ tiêu nhằm xác định độ chíncủa quả, giúp cho việc xác định thời điểm chín để thu hoạch; còn tỉ lệ đờng/axitlại xác định độ chua của quả, nếu tỉ lệ này cao thì quả ngọt ít chua, còn tỉ lệ nàythấp thì ngợc lại, do đó tỉ lệ này kết hợp với tiêu chuẩn Brix (chất rắn hoà tan)

đợc sử dụng kết hợp để đánh giá chất lợng quả [74], [75]

Bởi có giá trị không chỉ ở thành phần và hàm lợng các chất dinh dỡng màcác chế phẩm chiết xuất từ bởi nh pectin, tinh dầu, flavonoit, carotenoit đã đónggóp một phần không nhỏ cho các ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và d-

ợc phẩm Đã có nhiều công trình nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp này

Một số nghiên cứu còn cho rằng, thành phần flavonoit chủ yếu của cácloài trong chi Citrus là flavon và flavonon, nó có vị hơi đắng tạo nên mùi đặctrng và ảnh hởng trực tiếp đến hơng vị của quả ở bởi, flavonon -7- 0-neohesperidozit là thành phần chủ yếu gây vị đắng trong quả; còn ở cam, quýtthì hợp chất trên đợc thay bằng flavonon -7- 0- rutinozit không có vị đắng; đây

đợc xem là tiêu chí để phân biệt bởi với các loài Citrus khác [57]

Hợp chất flavonoit đầu tiên đợc phát hiện là hỗn hợp của flavanon baogồm hesperidin và eryodietol glucozit [1] Tiếp theo công trình này, Geissman

đã chiết xuất từ quả Citrus aunantium các flavonoit naringin và rhofolin, từ quả Citrus nobilis là nobiletin [52]

Thành phần hóa học hợp chất flavonoit đợc nhiều tác giả sử dụng nhmột chỉ tiêu để phân loại Năm 1997, Kevin Robard và cs đã tiến hành phântích hợp chất flavanol glucozit gồm naringin, hesperidin, neohesperidin,neoeriocetrin, poncitris và neoponcitris trong các loài của chi Citrus, kết quảcho thấy naringin là thành phần chính của bởi còn hesperidin là thành phầnchính của cam [61] Ngoài ra ngời ta còn phát hiện các loài trong chi Citrus

có hợp chất limonoit, đây cũng là chất gây vị đắng, mùi hắc làm cho sâu bọngán ăn Hợp chất này có nhiều trong hạt, đã đợc các tác giả Behow M A.

(1994) phát hiện đầu tiên trong quả C grandis và chứng minh đợc nó là

nhóm dẫn chất của tritecpen Flavonoit có mặt trong các loài Citrus tập hợpthành hai nhóm tơng ứng là anglycon flavonoit và glycozit flavonoit [43]

Kế tiếp nghiên cứu của các tác giả trên, Satoshi Y và cs (1995) đã chiết xuất

đợc từ quả Citrus unshi chất abscisyl beta - glucopyranozit có tác dụng ức chế lên

sự nảy mầm [72]; Masuda Toshiyo và cs tách đợc chất hasakol từ quả Citrus hasaku, đây là chất hoạt tính chống co thắt của cumarin với hiệu suất 27% [63].

Tinh dầu là thành phần hoá học quan trọng của các loài Citrus Theo kếtquả nghiên cứu của Attway J A thì vỏ cam quýt chứa nhiều chất thơm, trong

đó limonen là thành phần chủ yếu [42] Còn theo kết quả định lợng của ErnestGuenther (1984) thì hàm lợng tinh dầu trong vỏ quả cam quýt giao động từ 1,7

đến 5% Tinh dầu phân bố rải rác khắp các bộ phận trong cây, trong đó tậptrung nhiều nhất là ở vỏ quả [51]

Khoa học ngày càng phát triển, việc nghiên cứu không chỉ dừng lại ở

điều tra các đặc điểm hình thái và sinh hoá mà các nhà khoa học đã đi sâu vàonghiên cứu bộ máy di truyền, tìm kiếm những gen quy định tính trạng tốt gópphần làm nên tính chất đặc sản của giống Một số nhà khoa học khi nghiêncứu về gen mã hoá enzym xúc tác tổng hợp nên các hợp chất flavonoit gây vị

đắng cho quả bởi đã đi đến kết luận enzym xúc tác là rhamnozyl transferaza

đợc mã hoá bởi gen Cm1,2 RhaT ở Citrus ta gặp hai dạng của enzym này:một là 1,2 rhamonozyl transferaza (1,2 RhaT) xúc tác tổng hợpneohesperidozit gây vị đắng, và enzym 1,6 rhamonozyl transferaza (1,6 RhaT)xúc tác tổng hợp rutinozit không gây vị đắng ở bởi, gen Cm 1,2 RhaT mã hoáenzym 1,2 RhaT nên một số giống bởi quả khi ăn có vị the đắng [58]

Cũng theo hớng phân tích hệ gen của các loài Citrus, tác giả Orfort và

cs (1995) khi sử dụng các chỉ thị tiểu vệ tinh (microsatellite) để phân tích

vật chất di truyền của cam ngọt (Citrus cinensis (L.) Osbeck) đã đi đến kết

luận chúng không chỉ khác nhau ở hình thái mà sự đa dạng còn đ ợc tìm thấytrong ADN hệ gen với những khác biệt rất nhỏ, chẳng hạn khác nhau vềchiều dài các đoạn cắt hạn chế (RFLPs), về các đoạn đ ợc nhân bản một cáchngẫu nhiên (RAPDs), về chỉ thị izozym Một số tác giả đã sử dụng kỹ thuậtRAPD, RFLP và chỉ thị izozym với quần thể BC1 bao gồm những nhóm gần

gũi nhau về mặt di truyền trong Citrus grandis để nghiên cứu bản đồ di

truyền, bản đồ cho thấy có 9 nhóm gen liên kết với khoảng cách trung bìnhgiữa các locus là 7,5 cM Bằng việc sử dụng kỹ thuật RAPD, Josepl L K.cũng đã phân tích đợc đặc điểm di truyền của hiện tợng phát sinh phôi từ

phôi tâm của cây bởi Citrus maxima và Poncilus trifoliata Các nghiên cứu

di truyền học phân tử còn đợc tiến hành trên các loài Citrus khác: ở chanh,Deng và cs (1995) đã dùng kỹ thuật RAPD để phân tích xác định đột biến,phân tích kết quả lai soma; Andracle và cs (2004) đã phân tích hiện tợngnhiều phôi; ở cam, Khan và Roose (1998) đã sử dụng chỉ thị izozym để phântích nhân và phôi trong hợp tử; ở quýt, Kijias và cs (1995) sử dụng kỹ thuậtSSR để phân tích phát sinh loài và mối quan hệ loài trong Citrus; đồng thờivới kỹ thuật trên, Corazza và cs (2002) đã phân tích các biến dị tính trạngcủa bởi Còn chỉ thị RFLP đợc Liou và cs sử dụng để phân tích quan hệ ditruyền giữa các loài trong chi Citrus và đã đa lại kết quả có độ chính xác

cao Năm 1997, phân tích ISSR đã đợc Fang và cs sử dụng đối với Poncilus

và nhận dạng Citrus, tiếp đó là sử dụng phân tích IRAPs và AFLP để nhận

dạng quýt Clementia AFLP là kỹ thuật chỉ điểm dựa trên nền tảng PCR,

một kỹ thuật sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền của cácloài thực vật, đã đợc Vos và cs (1995) sử dụng rất thành công trong nhữngnghiên cứu của mình về các chỉ thị lặp lại trong genom của các loài Citrus[59]

1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu chi Citrus ở Việt Nam

Cam quýt là nhóm cây ăn quả có giá trị đợc ngời dân trồng từ bao đờinay, các loài đợc trồng phổ biến nh cam Sành, chanh, bởi Phúc Trạch, bởi

Đoan Hùng… Tuy nhiên các ph Đã có rất nhiều công trình đề cập đến việc nghiên cứu hìnhthái, sinh hóa và di truyền của các đối tợng này

Từ những năm 1973, Bùi Huy Đáp và cộng sự đã tiến hành khảo sát môtả đặc điểm thực vật và hóa sinh cũng nh điều kiện sinh thái của các giốngcam quýt chính ở Việt Nam [8] Phạm Hoàng Hộ trong công trình “Sử dụng kỹCây cỏViệt Nam” đã thống kê đợc cam quýt gồm 150 chi và gần 200 loài, riêng ở n-

ớc ta có khoảng 20 chi và hơn 60 loài [14] Bên cạnh đó việc mô tả đặc điểm

để phân loại cam quýt và tìm hiểu công dụng của chúng đã đợc Võ Văn Chi

và Lê Khả Kế tiến hành đem lại kết quả tin cậy [4], [15]

ở Việt Nam, cam quýt đợc trồng tập trung tại một số vùng nhất định.Theo kết quả nghiên cứu của Trần Thế Tục và cs (1996) thì nớc ta có 3 vùngtrồng cam quýt trên diện tích lớn là đồng bằng sông Cửu Long, vùng khu 4 cũ

và trung du miền núi phía Bắc, theo tác giả thì nơi đây còn là quê hơng củanhiều giống cam quýt, là nơi thể hiện tính đa dạng cao về thành phần loài củatập đoàn giống cây ăn quả có múi này [36].

Tính đa dạng của cam quýt là một vấn đề nổi bật lên hơn bất cứ loại cây ănquả khác nào, vì vậy vấn đề này đã thu hút đợc nhiều tác giả quan tâm Năm1994-1995, Nguyễn Nghĩa Thìn và Lê Quang Hạnh đã phân loại cam quýt trồngtại Phủ Quỳ - Nghệ An dựa vào một số tiêu chí nh độ lớn của cánh lá, của quả,

độ axit của tép, màu sắc của mầm… Tuy nhiên các ph[30], [31] Trần Thị Uyên và cs (1995) đãthống kê số lợng cây ăn quả có múi tại trung tâm giống cây ăn quả Phủ Quỳ-Nghệ An từ năm 1984 đến 1994 và công bố tất cả 55 loài thuộc các giống cam,quýt, bởi trong đó có 35 giống địa phơng và 20 giống nhập nội, dựa vào khóaphân loại của Swingle tác giả đã xác định đợc chúng thuộc 8 loài [38]

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trởng phát triển của cam quýt có côngtrình của Lê Đình Định và cs (1995), tác giả đã khảo sát quá trình sinh trởng

và ra hoa của một số giống cam có mặt trong tập đoàn cây ăn quả Phủ Quỳ,kết quả chỉ ra rằng cam Sông Con có số lợng cành có hoa lớn nhất, kế đến làcam Vân Du, cam Hamlin và thấp nhất là cam Valencia [9] Nguyễn Thị Chắt

và cs (1988) khi nghiên cứu khả năng sinh trởng của một số giống cam nhậpnội ở nông trờng Xuân Mai đã cho thấy khả năng sinh trởng và ra hoa kết quảcủa các giống này không thua kém các giống cam trong nớc, tuy nhiên giốngHamlin thờng chín muộn và quả khô nên ít đợc a dùng [2]

Một số nghiên cứu về sinh trởng phát triển của cây bởi Phúc Trạch đã đợcTrần Thế Tục và cs thực hiện, kết quả chỉ ra rằng đây là giống sinh trởng pháttriển tốt, chín sớm, năng suất trung bình khoảng 50-100 quả/cây, tỉ lệ phần ăn đ-

ợc lớn và hàm lợng chất dinh dỡng lớn hơn nhiều so với giống bởi khác [37] LêQuang Hạnh (1994) đã đánh giá đợc một số chỉ tiêu sinh hóa của giống cam Xã

Đoài và tìm ra đợc dạng có chất lợng quả tốt nhất [10]

Việc điều tra và bảo tồn quỹ gen của các loài cam quýt cũng thu hút đợc

sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu Phan Thị Chữ (1996) đã tiến hành tuyểnchọn đợc 18 cây bởi Phúc Trạch u tú có năng suất cao và theo dõi qua từngnăm, đến năm thứ ba thì chỉ còn 5 dòng là đạt chỉ tiêu về năng suất, chất lợng

và chống chịu sâu bệnh [5] Cũng tác giả này đã phân loại và tuyển chọn cácgiống bởi có phẩm chất tốt ở các vùng, đặc biệt tập trung vào các giống đặcsản nh bởi Phúc Trạch, bởi Thanh Trà, bởi Năm Roi để lựa chọn các giống tốt,không thoái hóa [6]

Đi liền với việc tuyển chọn giống tốt, việc ứng dụng công nghệ sinh họctrong cải tạo giống cây ăn quả có múi là một hớng nghiên cứu mới có ý nghĩathực tiễn cao Hà Thị Thúy và cs (2003) đã đa ra một số biện phát kỹ thuật tổnghợp của công nghệ sinh học tạo ra một tập đoàn giống lớn, đa dạng và sạchbệnh [35] Kết quả nghiên cứu của Bùi Văn Lệ và cs đã cho thấy có thể dùngphơng pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào để thực hiện vi nhân giống một số cây ănquả, trong đó có cam quýt [18] Trần Thị Hạnh và cs đã dùng cosixin tạo dòng

tứ bội cam Xã Đoài từ chồi nhị bội trong điều kiện invitro [11].

Các sản phẩm tách chiết từ cam quýt rất phong phú và có nhiều ý nghĩathực tiễn Flavonoit là một chất màu tập trung chủ yếu ở vỏ quả, đợc chiết xuất

và sử dụng trong y học với vai trò là chất kháng khuẩn, ngăn ngừa ung th, nângcao tính bền của thành mạch máu, và đặc trị các bệnh “Sử dụng kỹtuổi già” Với hớngnày, Bế Thị Thuấn đã chiết xuất đợc naringin, một thành phần chủ yếu củaflavonoit, từ vỏ quả Citrus và thử nghiệm tác dụng trên chuột thì thấy rằngchuột có khả năng chống viêm, hạ huyết áp, giảm nhu động ruột và giảm tínhthấm mao mạch [33] Tinh dầu cũng là đối tợng của nhiều công trình nghiêncứu, ớc tính sản lợng tinh dầu cam quýt ở nớc ta đạt 1 tấn/năm Phan Thị PhơngThảo (1999) đã nghiên cứu về tinh dầu vỏ bởi Đoan Hùng và Phúc Trạch [27];Phùng Thị Bạch Yến và Nguyễn Xuân Sâm đã có nhiều công trình chuyên khảophân tích thành phần tinh dầu trong các loài Citrus [40]

Trong những năm gần đây, cùng với sự ra đời và phát triển của sinh họcphân tử, đối tợng nghiên cứu mà các nhà khoa học lựa chọn lại chính là ADN

hệ gen Trịnh Hồng Kiên và cs đã sử dụng chỉ thị microsatellite để đánh giá đadạng về nguồn gen của các loài Citrus [16]; còn bằng sử dụng chỉ thị RAPD,Nguyễn Xuân Thụ và cs đã xây dựng đợc cây phát sinh chủng loại của một sốgiống bởi trồng tại Việt Nam, cây phát sinh thể hiện rõ mối quan hệ di truyềngiữa các đối tợng nghiên cứu [32]

của đoạn ADN cần tổng hợp mà không phải tách dòng, nhân dòng hay sử dụng

các sinh vật sống nh E coli hoặc nấm men [19].

1.2.1.2.Nguyên tắc của phơng pháp

PCR là một phản ứng invitro cho phép nhân bản nhanh một đoạn ADN

dựa trên cơ sở đặc tính hoạt động của các ADN polymeraza Khi tế bào chuẩn

bị thực hiện quá trình phân chia, ADN sẽ thực hiện chức năng sao chép đểtổng hợp nên sợi ADN mới, quá trình sao chép này là nhờ có ADNpolymeraza bám trên một sợi đơn và xúc tác tổng hợp sợi đơn còn lại để tạothành sợi ADN kép theo nguyên tắc bổ sung A_ T, G_ X

Lần đầu tiên sử dụng phơng pháp này, Kary Mullis đã dùng loại ADNpolymeraza mà khi nâng nhiệt độ phản ứng lên 950C để biến tính và tách ADNkhuôn thì enzym này bị mất hoạt tính, vì vậy sau mỗi chu kì phản ứng lại phải

bổ sung enzym vào làm cho quá trình nhân bản vừa tốn thời gian, kém hiệu quảvừa yêu cầu một lợng ADN polymeraza lớn và phải theo dõi liên tục trong suốtquá trình thực hiện phản ứng Về sau phơng pháp này đã đợc cải tiến bằng cách

sử dụng ADN polymeraza tách từ vi khuẩn a nhiệt sống ở các suối nớc nóngtrên 1000C, đây là những enzym bền nhiệt, nó không bị mất hoạt tính khi nângnhiệt độ phản ứng để tách các sợi ADN, vì vậy cũng không cần phải bổ sungthêm ADN polymeraza sau mỗi chu kì và quá trình nhân bản một sợi ADN cầnlựa chọn có thể đợc đơn giản hoá và tự động hoá

Phản ứng PCR muốn thực hiện đợc đòi hỏi phải có một đoạn mồioligonucleotit (có độ dài 6-24 nucleotit), đoạn này gắn kết với ADN khuôn tại

điểm khởi đầu sao chép và cung cấp đầu 3’-OH tự do cho quá trình tổng hợp.Mồi sử dụng có trình tự hai đầu giống trình tự hai đầu đoạn ADN cần nhânnên sự bắt cặp sẽ xảy ra đợc dễ dàng, và tuỳ số lợng chu kì phản ứng mà sẽnhân lên đợc số lợng bản sao tơng ứng Phản ứng PCR gồm một chuỗi các chukì lặp lại, mỗi chu kì gồm ba giai đoạn:

+ Giai đoạn 1 (biến tính): ADN đợc biến tính ở 950C trong thời gian khoảng 1phút, khi đó các liên kết hidro bị đứt và sợi ADN kép tách thành hai sợi đơn + Giai đoạn 2 (gắn mồi): ở nhiệt độ 30-600C trong 30 giây đến 1 phút thìmồi sẽ bắt cặp với ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở hai đầu sợi ADNcần nhân Tuỳ thuộc vào từng loại mồi mà nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng

là khác nhau, ta có thể tính Tm bằng công thức sau:

Tm = 81,5+ 16,6 x(log10{J+} + 0,4 x(%G + C) – 600/I – 0,63x(%FA)

Trong đó : {J+}: nồng độ của các cation hoá trị 1

FA: chất dùng để gây biến tính ADN I: chiều dài của đoạn mồi

+ Giai đoạn 3 (tổng hợp ADN): xảy ra ở nhiệt độ 720C trong thời gian từ 30giây đến nhiều phút tùy thuộc vào chiều dài đoạn ADN cần tổng hợp Quá trìnhtổng hợp diễn ra theo chiều 5’-3’ dới sự xúc tác của enzym ADN polymeraza

Số chu kì lặp lại của phản ứng PCR trung bình vào khoảng 30 đến 40 chukì, nếu kéo dài hơn thì hiệu suất sẽ giảm vì các thành phần trong hỗn hợp phảnứng đã sử dụng hết [70]

1.2.1.3 Thành phần phản ứng PCR

Các thành phần cơ bản của một phản ứng PCR gồm:

- ADN khuôn (template): là vật liệu khởi đầu cho quá trình tổng hợp ờng thì nồng độ của ADN khuôn đợc đa vào phản ứng PCR vào khoảng 10-500ng Vì phản ứng PCR với mục đích là để nhân lên những đoạn ADN mongmuốn nên ADN khuôn phải biết trớc đợc trình tự hai đầu để thiết lập cặp mồi

Th-đặc hiệu ADN khuôn có thể là sợi đôi hoặc sợi đơn

- Đoạn mồi (primer): Mồi thực chất là một đoạn oligonucleotit dài 6-10nucleotit (đối với mồi ngẫu nhiên) hoặc 12-24 nucleotit (đối với mồi đặc trng),không quá 50 nucleotit Việc tính toán độ dài mồi, nhiệt độ nóng chảy củamồi và nhiệt độ gắn mồi là bớc quan trọng để quyết định chất lợng sản phẩmcủa phản ứng PCR Thông thờng mồi đặc trng có chiều dài khoảng 20nucleotit và nhiệt độ nóng chảy khoảng 50-600C Nồng độ mồi thích hợp đểtiến hành phản ứng là 10-20pg/25l hỗn hợp phản ứng Lợng mồi đa vào phảnứng PCR phải phù hợp với lợng ADN cần tổng hợp, nồng độ mồi quá thấp hayquá cao đều ảnh hởng đến sản phẩm của phản ứng

- ADN polymeraza: đợc sử dụng phổ biến hiện nay là Taq polymeraza

tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nớc nóng Taq polymeraza có

trọng lợng phân tử 94 kDa, không mất hoạt tính ở nhiệt độ gây biến tính ADNnhng giảm hoạt tính nếu nâng thời gian của nhiệt độ gây biến tính lên quá cao.Nồng độ Taq thích hợp cho phản ứng PCR là 0,5-2,5 đơn vị, ngoài ra hoạt

động của Taq còn phụ thuộc vào nồng độ của ion Mg2+ và dNTPs Ngày nayngoài Taq polymeraza ngời ta còn sử dụng các enzym khác nh Tthpolymeraza, Pwo và Pfu polymeraza có thêm cả hoạt tính enzym phiên mã ng-

ợc và hoạt tính đọc sửa lỗi, nhờ đó làm giảm tỉ lệ sai sót trong sao chép

- Các nucleotit (dNTPs): dNTPs là một hỗn hợp của 4 loạideoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) Nồng độ phản ứng của cácdNTPs vào khoảng 200mM mỗi loại, tuy nhiên nồng độ thấp (10-100mM) thìTaq ADN polymeraza hoạt động chính xác hơn Nồng độ tối u của chúng phụthuộc vào nhiều yếu tố nh: nồng độ Mg2+, nồng độ mồi, độ dài của sản phẩmkhuyếch đại và số chu kì phản ứng.

- Dung dịch đệm PCR (buffer): thành phần của dung dịch đệm phụ thuộcvào loại enzym đợc sử dụng Trong đệm photphat quan trọng nhất là ion Mg2+,ion này làm tăng nhiệt độ nóng chảy của ADN mạch đôi, tạo ra phức chất tanvới dNTPs để hình thành cơ chất mà enzym nucleaza có thể nhận ra, điều nàyrất cần thiết cho quá trình liên kết các dNTPs Nồng độ ion Mg2+ trong hỗn hợpphản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5-5,0mM, hoặc có thể thay đổi nếu cần Nếunồng độ Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzym polymeraza,còn nếu quá cao sẽ tạo ra nhng phân đoạn không đặc hiệu [19], [70]

Kỹ thuật PCR còn đợc sử dụng trong di truyền y học để chuẩn đoán nhanh

và chính xác các bệnh di truyền, chuẩn đoán virut trớc khi chúng gây nên cáctriệu chứng hay gây ra các đáp ứng miễn dịch trông thấy [19] Trong khoa họchình sự, PCR là một phơng pháp hữu hiệu cho phép chuẩn đoán nhanh và chínhxác thủ phạm từ một vết máu, sợi tóc mà thủ phạm để lại trên hiện trờng [66].Ngày nay kỹ thuật này đợc sử dụng rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm, tr-ờng đại học và các viện nghiên cứu, nó thực sự đem lại một cuộc cách mạngtrong lĩnh vực ứng dụng thực tế của di truyền học phân tử

1.2.2 Kỹ thuật RAPD (Randomly Amplified Polymorphism DNA)

Nhiều năm trở lại đây, với sự ra đời của sinh học phân tử và công nghệgen, một ngành khoa học mới đã xuất hiện: phân loại học phân tử (moleculartaxonomy) Từ khi ngành khoa học mới này ra đời, bằng các kỹ thuật phântích ADN của hệ gen, so sánh trình tự nucleotit trên các đoạn ADN đã giúpcho việc phát hiện loài mới và giải quyết mối nghi ngờ về vị trí phân loại củaloài, đánh giá mức độ đa dạng di truyền và tìm đợc mối quan hệ chủng loạicũng nh sự tiến hoá của nhiều loài động thực vật trong sinh giới [70]

Các kỹ thuật sinh học phân tử đợc sử dụng với mục đích phân loại baogồm: kỹ thuật izozym, kỹ thuật RFLP, các kỹ thuật dựa trên cơ sở phản ứngPCR nh kỹ thuật SSR, RAPD, AFLP, chỉ điểm ADN đa locus, lai ADN vàphân tích trình tự ADN Tuy phân loại học phân tử có thể tiến hành với nhiềuphơng pháp khác nhau nhng một trong những kỹ thuật đợc sử dụng rộng rãinhất là kỹ thuật RAPD

1.2.2.1 Nguyên lý của kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD đợc tiến hành dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR,trong đó các mồi đặc trng đợc thay bằng các mồi không đặc trng có kích thớc6-12 nucleotit để nhân các đoạn ADN một cách ngẫu nhiên Các đoạn ADNngẫu nhiên có thể đa hình bởi đoạn nhân đôi khi có trong mẫu ADN của cáthể này nhng không có trong mẫu ADN của cá thể khác [79]

Để kiểm tra tính đa hình của ADN hệ gen, sản phẩm đợc điện di trên gelagaroza hoặc gel polyacrylamit Trên bản gel điện di các đoạn ADN đợc nhân

sẽ phân tách nhau và định vị ở những vị trí nhất định tuỳ thuộc vào kích th ớccủa chúng Tính đa dạng thu đợc nhờ kỹ thuật RAPD là đáng tin cậy vì khi có

đột biến hay sự sắp xếp lại một số nucleotit nào đó ở vị trí gắn mồi thì nó sẽngăn cản việc gắn kết mồi vào ADN khuôn Ngoài ra, sự mất đoạn NST, sựthêm bớt điểm gắn mồi cũng nh sự xen vào của một gen nào đó có thể làmthay đổi kích thớc của đoạn ADN đợc nhân bản Do vậy mỗi đoạn mồi có thểtạo ra một vài sự đa dạng, có thể phát hiện ra đợc dễ dàng trên biểu đồ RAPD[22] Việc phân tích mối quan hệ giữa các loài hay các nhóm loài đợc thựchiện theo quy trình gồm các bớc nh sau:

- Bớc 1: So sánh từng cặp đối tợng trong nghiên cứu bằng cách tính toánkhoảng cách di truyền giữa chúng

- Bớc 2: Lập ma trận gồm tất cả những giá trị tính đợc trớc đó

- Bớc3: Giải ma trận và biểu diễn thành một biểu đồ đặc trng Giá trị biểudiễn khoảng cách giữa các cá thể đợc thiết lập theo hệ số tơng đồng của Nei

và Li (1985): S = 2x NAB/ (NA + NB)

Trong đó : NAB là số phân đoạn có mặt ở cả hai loài A và B; NA: số phân

đoạn chỉ có ở loài A; NB: số phân đoạn chỉ có ở loài B

Ngày nay, việc tính toán thủ công đã đợc thay thế bằng phần mềm máytính để vẽ tự động biểu đồ mối quan hệ di truyền các đối tợng nghiên cứu, ch-

ơng trình có tên là NTSYS version 2.0 Kết quả thu đợc là một biểu đồ hìnhcây cho phép đánh giá một cách chính xác khoảng cách di truyền xa gần giữacác đối tợng nghiên cứu

1.2.2.2 Các ứng dụng kỹ thuật RAPD

RAPD là một kỹ thuật đợc sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyềnhọc phân tử, đặc biệt là nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và phân loại thựcvật, xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các loài hay các cá thể để phục vụcho công tác lai tạo giống mới, xác định nguồn gốc và bản đồ gen sinh vật [45].RAPD còn là một chỉ thị để xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan

đến một số tính trạng tốt nào đó ở cây trồng, chẳng hạn tính trạng chất lợng sợi

ở cây bông, tính trạng kháng virut ở cà chua, tính trạng kháng bệnh FHB ở lúa… Tuy nhiên các phNgày nay, việc sử dụng kỹ thuật RAPD thay thế phơng pháp điện diizozym đã đa lại những thành công đáng kể Cao D.và Oard J H (1997) đãdùng RAPD để xác định giống và nghiên cứu đa dạng di truyền ở lúa [46];Harvey M và cs (1996) phân tích tính đa dạng di truyền giữa các giống

Saccharum [54]; Yang X và Quiros C với 28 đoạn mồi có trình tự 10 nucleotit

chỉ ra đợc sự khác biệt của 28 giống cần tây và xếp chúng thành 3 nhóm, kếtquả này trùng khớp với kết quả thu nhận đợc khi sử dụng 6 chỉ thị protein đểphân loại [78]

Cũng theo hớng trên, Orozco C C và cs (1994) đã khảo sát mối quan hệ

di truyền và tiến hoá của các giống cà phê đợc lai tạo từ các loài bố mẹ ở cácvùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo conlai có đặc điểm quý [65] Kỹ thuật RAPD còn đợc Song B K và cs (2000) sử

dụng để phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống Bòn bon (Lansium domesticum Corr.) có đặc điểm hình thái khó phân biệt nhau và do sự đặt tên

khác nhau cho cùng một giống của ngời dân địa phơng [73]

Đối với cây ăn quả đặc sản nổi tiếng thế giới nh cây vải, trớc khi kỹ thuậtRAPD ra đời thì tính đa hình di truyền đợc nghiên cứu dựa trên dấu chuẩnizozym [41], về sau việc nghiên cứu đa hình chủ yếu dựa trên kỹ thuật RAPD.Bằng kỹ thuật này, Lee và cs (2001) đã phân tích đợc mối quan hệ di truyềncủa 13 giống vải Đài Loan vốn có nhiều biến đổi dẫn đến khó phân biệt nhau

về mặt hình thái [62]; Ding X D và cs (2001) đã lập bản đồ liên kết gen dựatrên quần thể F1 đợc tạo ra từ sự lai giữa hai giống vải khác nhau, bản đồ đãgiúp cho việc xác định kiểu gen của cây bố mẹ và định vị đợc các gen điềukhiển các tính trạng nh phẩm chất quả, kích thớc quả, sức sống của cây, tínhkháng bệnh mà không cần trồng thế hệ cây F1 để theo dõi [50]

ở Việt Nam, việc sử dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu đa dạng ditruyền và tìm ra nguồn gốc tiến hoá của loài cũng đợc ứng dụng rộng rãi.Nguyễn Văn Thiết và cs đã nghiên cứu thành công mối quan hệ di truyền giữacác giống nhãn trồng tại Việt Nam và tìm ra 19 marker ADN đặc hiệu chotừng giống nhằm phục vụ nhu cầu chọn giống, xác định và đánh giá chất lợnggiống [28], tác giả này còn đánh giá đợc tính đa dạng của quần thể vải thiều ởhuyện Kim Bôi - Hòa Bình để xác định mức độ lẫn tạp, trên cơ sở đó đề xuấtviệc bảo tồn nguồn gen vải quý này [29] Nguyễn Xuân Thụ và cs đã xây dựng

đợc cây phát sinh chủng loại của một số giống bởi trồng tại Việt Nam, kết quảcho thấy cây bởi Phúc Trạch chiếm nhánh tiến hoá đầu tiên của cây phát sinh cácgiống bởi, còn các giống khác thì tập trung về một nhánh [32]

Kỹ thuật RAPD đợc sử dụng rộng rãi bởi nó có u điểm là rất nhạy, dễthực hiện, đỡ tốn kém và cho phép tiến hành cùng một lúc với số lợng mẫulớn Kỹ thuật này chỉ yêu cầu với một lợng ADN nhỏ, không cần dùng đếnmẫu dò ADN, không cần biết đến thông tin về trình tự đoạn ADN nghiên cứu,chỉ cần một bộ mồi không đặc hiệu ta có thể đánh giá đợc mức độ sai khác vậtchất di truyền của các đối tợng quan tâm Tính đa dạng thu đợc từ chỉ thịRAPD đợc đánh giá là cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật khác bởi nó cho phépphát hiện đợc tính đa dạng ngay cả trong các đoạn chứa các trật tự nucleotitlặp lại [47], [53]

Tuy nhiên kỹ thuật này cũng có những hạn chế nhất định, đó là vì trong

kỹ thuật này chúng ta sử dụng mồi có kích thớc ngắn nên khả năng bắt cặpcủa chúng với ADN khuôn là rất ngẫu nhiên, vì vậy kết quả có thể kém chínhxác, hơn nữa chỉ thị RAPD có tính chất trội do đó những gen điều khiển tínhtrạng nào đó có tính chất lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trên gel điện di [50],

[64], [76] Tuy nhiên chỉ một hạn chế nhỏ này cũng không làm ảnh hởng lớn

đến giá trị thực tiễn của kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu di truyền

Chơng 2: Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

-2.1.2 Thiết bị và hoá chất sử dụng

tử và công nghệ tế bào, khoa Sinh học, trờng Đại học KHTN- ĐHQGHN

Bảng 1 Kí hiệu và trình tự của 25 mồi RAPD

b Thiết bị

Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu là của các hãng sản xuất chuyên dụngcung cấp nh: máy PCR System 9700 (Pharmacia), máy điện di (Biorad), máychụp ảnh Gen-Doc (Pharmacia), máy ổn nhiệt, lò vi sóng… Tuy nhiên các ph

2.2 Phơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Phơng pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật

Phơng pháp thu mẫu: Để thu đúng mẫu các giống bởi cần nghiên cứu,chúng tôi sử dụng phơng pháp phỏng vấn các hộ gia đình đã có kinh nghiệmtrồng cây lâu năm kết hợp với các tài liệu mô tả đặc điểm thực vật và khoáphân loại xác định giống của Bùi Huy Đáp [8]

Khảo sát các chỉ tiêu hình thái thực vật dựa theo tài liệu Ph“Sử dụng kỹ ơng pháp nghiên cứu thực vật” của Klein [23]

2.2.2 Phơng pháp phân tích các chỉ tiêu sinh hoá

- Xác định hàm lợng đờng bằng phơng pháp Bertrand dựa theo tài liệu

Thực hành hóa sinh

- Xác định hàm lợng VitaminC bằng phơng pháp sử dụng iot dựa theo tài

liệu Thực hành hóa sinh“Sử dụng kỹ ” của Nguyễn Văn Mùi [20]

- Xác định hàm lợng axit hữu cơ bằng phơng pháp Potrinop [80].

- Xác định hàm lợng pectin tổng số bằng phơng pháp canxi pectat [80]

- Chiết xuất flavonoit bằng cồn 900, phân tích thành phần hợp chấtflavonoit bằng sắc kí lớp mỏng với bản mỏng silicagel tráng sẵn, hệ dung môiToluen - Etylaxetat - Axeton - axit Formic (5:2:2:1), hiện màu bằng đèn tử

ngoại dựa theo tài liệu Sắc kí lớp mỏng“Sử dụng kỹ ” của Kurt Randerth [17]

2.2.3 Phơng pháp phân tích sinh học phân tử

2.2.3.1 Phơng pháp tách chiết và làm sạch ADN từ lá bởi

Việc tách chiết ADN của 8 mẫu bởi đợc thực hiện theo tài liệu

Extraction of total cellular

Bendich A J có một số cải tiến cho phù hợp với đối tợng nghiên cứu [68].Quy trình đợc cải tiến nh sau:

B1: ủ sẵn đệm chiết ở 650C trong bể ổn nhiệt 50 phút

B2: Lấy một lợng ít mô lá đã nghiền nhỏ cho vào cối sứ, nghiền với 700l

đệm chiết ở trên, cho hỗn hợp vào ống eppendorf 1,5ml, ủ ở 650C trong 1h.B3: Để nguội ở nhiệt độ phòng 2 phút Bổ sung thêm 750l hỗn hợpChloroform: Isoamylalcol (C:I, 24:1), đảo đều

B4: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi

B5: Tiếp tục thêm C:I với tỷ lệ 1:1 so với mẫu thu đợc, ly tâm 12.000vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi

B6: Tủa ADN bằng isopropanol (tỷ lệ 1:1), giữ ở -200C trong 3h

B7: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở -40C, thu tủa

B8: Rửa tủa bằng etanol 700 ba lần

B9: Làm khô ADN ở nhiệt độ phòng

B10: Hoà tan ADN trong 400l TE 10X

B11:Bổ sung thêm 3l RNaza (10g/ml), ủ ở 370C trong 30 phút

B12: Thêm 10l natri axetat 3M đảo nhẹ

B13: Bổ sung 2,5V etanol tuyệt đối, đảo nhẹ, để ở -200C trong 1h

B14: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ phần dịch nổi.B15: Rửa tủa ADN 2 lần bằng etanol 700C

B16: Hoà tan ADN trong 400l TE 1X, giữ ở –200C đến khi sử dụng

2.2.3.2 Phơng pháp xác định hàm lợng và độ tinh sạch ADN

Hàm lợng và độ sạch của ADN đợc tính toán dựa trên giá trị quang phổ hấpthụ tia tử ngoại của ADN ở bớc sóng 260nm và 280 nm Phơng pháp đợc thực

hiện dựa theo tài liệu Sinh học phân tử“Sử dụng kỹ ” của Hồ Huỳnh Thùy Dơng [7]

2.2.3.3 Phơng pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR-RAPD

Phản ứng RAPD đợc thực hiện trên máy PCR System 9700 trong ốngeppendorf dung tích 500l, thể tích các thành phần phản ứng PCR lấy dựa theo

tài liệu Standard PCR protocol“Sử dụng kỹ ” của Coyne V E et al và PCR principles and“Sử dụng kỹ

reaction component” của Innis M A et al có một số thay đổi cho phù hợp với

đối tợng nghiên cứu và điều kiện thí nghiệm nh sau [48], [60]:

dH2O : 15,2l

Đệm PCR 10X: 2,5lMgCl2 (25mM): 2,5ldNTPs (10mM): 2,0lPrimer (10M): 1,5lTaq polymeraza (5U/l): 0,3lADN khuôn (10ng/l): 1,0lTổng thể tích: 25lPhản ứng PCR-RAPD đợc thực hiện với 40 chu kì, chu trình nhiệt chophản ứng PCR là:

2.2.2.4 Phơng pháp điện di trên gel agaroza và gel polyacrylamit

- Sản phẩm ADN tổng số đợc kiểm tra trên gel agaroza 0,8% ở điệnthế 100V, 90mA trong 40phút Sau điện di bản gel đợc nhuộm bằngethidi bromit (EtBr) trong 5-10phút, quan sát dới đèn tử ngoại và chụp

ảnh gel bằng máy Gen - Doc

- Sản phẩm RAPD - PCR đợc kiểm tra trên gel polyacrylamit 10%

ở điện thế 100V, 18-25mA trong 1 giờ Sau điện di bản gel đợc nhuộmbạc và quan sát dới ánh sáng thờng Quy trình nhuộm bạc nh sau:

Phơng pháp đợc thực hiện dựa theo tài liệu Electrophoresis in practice“Sử dụng kỹ

- aguide to method and applications of DNA and protein separations” của

Reiner W [67]

2.2.3.5 Phơng pháp phân tích số liệu

Dựa trên ảnh điện di sản phẩm RAPD của ADN các mẫu bởi, ta có đợcmột dữ liệu về sự xuất hiện các băng ADN đợc nhân lên sau phản ứng Số liệuthu đợc đợc xử lí bằng chơng trình NTSYS version 2.0 dựa theo tài liệu

NTSYS numerical taxonomy and multivariate analysis system

J (2000) để lập biểu đồ hình cây biểu thị mối tơng quan di truyền giữa cácgiống nghiên cứu [69]

Tiêu chuẩn hoá sản phẩm RAPD theo quy ớc: số 1: xuất hiện phân đoạnADN; số 0: không xuất hiện phân đoạn ADN Dựa theo quy ớc này ta sẽ lập

đợc một ma trận tơng đồng, và việc tính toán ma trận tơng đồng dựa theo côngthức: Jij ni nij nj

Sau khi tính đợc hệ số tơng đồng, tiếp tục xử lí mẫu trong chơng trìnhNTSYS - UPGMA để xác định hệ số tơng đồng di truyền và dùng chơng trìnhNTSYS - Tree biểu thị mối tơng quan di truyền dới dạng biểu đồ hình cây.

Chơng 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận

3.1 Đặc điểm hình tháI các giống bởi nghiên cứu

Tiến hành điều tra, thu thập các giống bởi trồng tại Nghệ An và Hà Tĩnh,chúng tôi thu đợc 8 giống bởi trong đó 3 giống bởi Phúc Trạch, bởi bởi Đờng,bởi Chua đợc thu tại Hà Tĩnh, 5 giống còn lại thu tại Thanh Chơng - Nghệ An.Cả 8 giống bởi này đều rất khó phân biệt nhau về mặt hình thái, tuy nhiên nếuxem xét một cách chi tiết các đặc điểm nh dáng tán, chiều cao cây, hình dạnglá, màu sắc vỏ quả, kích thớc quả, hình dạng hạt và thời gian chín của quảchúng tôi đã thu đợc một số kết quả ban đầu làm cơ sở cho việc phân loại cácgiống bởi địa phơng này

3.1.1 Đặc điểm hình thái của giống bởi Phúc Trạch

Cũng nh tất cả các giống bởi khác, bởi Phúc Trạch thuộc loại thân gỗ, láthờng xanh, cành khi non có gai nhỏ và ngắn, gai rụng đi khi cây đã lớn già.Cây bởi nhân giống bằng chiết cành trên 10 năm tuổi có chiều cao trung bình 7-8m, tán cây hình bán nguyệt với đờng kính tán 8-8,5m Cây có góc độ phâncành lớn và đều tạo nên một hình dáng cân đối Lá bởi Phúc Trạch có hìnhtrứng ngợc, trên mép lá có răng ca nhỏ và nông, lá màu xanh đậm, kích thớckhoảng 10x6cm, kích thớc eo lá 3x2,2cm Hoa bởi gồm 3 loại: loại hoa nhỏ bầunhuỵ thấp hơn nhị, loại hoa lớn bầu nhuỵ cao hơn nhị, loại hoa dị hình có búphoa to hơn thờng lệ, có màu xanh nhạt và thờng không nở đợc, thờng rụng100% Hoa nở rộ vào nửa cuối tháng hai Quả bởi Phúc Trạch có hình cầu,trọng lợng 600-1000g, kích thớc 10x11cm đến 13x14cm, vỏ quả nhẵn, khi chín

có màu vàng rơm, túi tinh dầu to và nổi trên bề mặt Độ dày vỏ quả từ 0,6-2cm,

số múi/quả từ 14-16 múi Tép và cùi bởi thờng có 3 dạng: hồng đậm, hồng nhạt

và hơi trắng Quả thờng chín vào tháng 8, 9 Hạt bởi Phúc Trạch hình nêm to bèhai bên, vỏ hạt nhiều gân thờng màu nâu trắng, kích thớc trung bình hạt1,3x1,8cm, một quả có 20-120 hạt

3.1.2 Đặc điểm hình thái của giống bởi Đờng

Các cây bởi Đờng điều tra có tuổi trên 10 năm đạt chiều cao 6-7m, tán lánhọn dốc hình tháp với đờng kính tán trung bình 4-5m Cây có độ phân cành íthơn bởi Phúc Trạch, các cành ở tán dới cùng có xu hớng trễ xuống mặt đất Lábởi Đờng hình bầu dục, đầu mũi lá xẻ thuỳ nông tạo thành hai cạnh tròn đều,mép lá xẻ thuỳ nông và tha, phiến lá màu xanh lục, kích thớc 12x6cm, kích th-

ớc eo lá 2,7x2cm Hoa bởi có đặc điểm giống bởi Phúc Trạch, tuy nhiên nở rộnhất là vào tháng hai Quả bởi Đờng có dạng hình quả lê, trọng lợng 600-800g, kích thớc 13x12cm Vỏ quả xù xì, khi chín có màu vàng chanh, các túitinh dầu nhỏ và dày tập trung trên mặt vỏ có thể nhận thấy rõ, vỏ quả dày 0,8-1,8cm Quả thờng có 13-14 múi Tép và cùi bởi chỉ có một dạng duy nhất làmàu trắng đục, các tép khô và rời nhau Quả đợc thu hoạch và từ cuối tháng 8

đến giữa tháng 10 Hạt bởi Đờng cũng có hình nêm nhng kích thớc bé hơn sovới hạt bởi Phúc Trạch, đạt 0,7x1,6cm, quả có nhiều hạt, từ 70-130 hạt/quả, íthạt lép

3.1.3 Đặc điểm hình thái của giống bởi Đào

Khi điều tra các cây bởi Đào tại huyện Thanh Chơng - Nghệ An, chúng tôinhận thấy rằng những cây trên 10 năm tuổi đều có chiều cao vợt mức so vớinhững giống bởi khác, giao động từ 10-13m, sự phân tán lại rất ít, tán khôngphân chia theo tầng mà rũ về một bên tạo nên dạng hình chổi xễ, đờng kính tánkhoảng 4-5m Lá bởi Đào có đầu nhọn, mép lá xẻ thuỳ răng ca ăn sâu rõ rệt,phiến lá màu xanh đậm, kích thớc lá lớn 25x12cm, kích thớc eo lá 4x3cm, đây

có thể xem là đặc điểm nổi bật để nhận dạng giống bởi này

Hoa bởi Đào có dạng nh bởi Phúc Trạch, nở rộ vào cuối tháng 1, đầutháng 2, hoa kích thớc lớn, mọc thành chùm, tỉ lệ đậu quả lớn Quả bởi Đào códạng hình cầu hơi dẹt, trọng lợng trung bình quả 700-900g, kích thớc11x13cm Vỏ quả khi chín có màu vàng rơm, vỏ trơn có nổi rõ các túi tinh dầunhỏ xếp tha Vỏ quả dày 1-2cm, số múi đạt 14-16 múi/quả Tép bởi mọng nớc

và mềm, cả tép và cùi bởi đều có màu hồng đậm rất đẹp mắt Quả thờng thuhoạch đợc vào khoảng tháng 9-10, khi quả chuyển dần về chín thì tép bởi càngchuyển dần từ hồng nhạt đến hồng đậm Hạt bởi Đào có kích thớc lớn, dài vànặng, trung bình 0,8x1,8cm, số lợng hạt trong quả đạt vào loại lớn nhất trong

số các giống bởi nghiên cứu, một quả có từ 70-150 hạt

3.1.4 Đặc điểm hình thái của giống bởi Chua

Theo kết quả điều tra, những cây bởi Chua nhân giống trồng bằng chiếtcành có chiều cao 8-9m, cây thân nhỏ, phân nhánh ít, tán hình tháp với đờngkính trung bình 6-6,5m Giống bởi này cành non có nhiều gai nhỏ mọc đứng ởnách lá Lá bởi Chua hình trứng ngợc, đôi khi hình hơi tròn, mép lá có răng canhỏ, nông và phân bố tha nhau, lá màu xanh đậm, kích thớc 20x10cm, eo lá3x2cm, gân lá nổi rõ ở cả hai mặt, rõ hơn ở mặt dới Hoa bởi không đó điểmnào phân biệt với các giống khác, tuy nhiên thời gian nở rộ sớm, vào nửa đầu

tháng một khi mà hoa bởi Đào và bởi Phúc Trạch còn ở dạng nụ Quả bởi códạng hình cầu không cân đối, trọng lợng quả đạt 400-600g, kích thớc tối đa12x10cm, vỏ quả khi chín có màu vàng chanh, trên bề mặt nổi rõ các túi tinhdầu bé xếp sít nhau Số múi/quả đạt 12-13 múi, vỏ quả dày 1-1,8cm Tép và cùibởi có màu trắng đục, nớc ép từ bởi có vị chua đặc trng Quả thờng chín vàotháng 9-10 Hạt bởi Chua thuôn dài, kích thớc 0,7 x 2,1cm, một quả có 50-150hạt.

3.1.5 Đặc điểm hình thái của giống bởi Chộng

Bởi Chộng là giống bởi địa phơng ít đợc nhiều ngời biết đến Thân giốngbởi này có chiều cao rất hạn chế, tối đa 3-5m Tán cây hình quạt, rộng 4-5m,những cành ở dới tán trễ xuống đất, cây phân cành ít Lá bởi Chộng hình trứngngợc, không có eo lá, kích thớc 16x7cm, lá màu xanh lục, mép lá có răng canhỏ và nông Hoa bởi Chộng có mùi thơm hấp dẫn, số hoa trên một cây thấpnhng tỉ lệ đậu quả lại cao, hoa nở muộn, có khi vào tháng 3 mới nở hết Quảbởi Chộng có hình bầu dục, trọng lợng đạt 2000-5000g, kích thớc 35x20cm,

vỏ quả chín có màu vàng đậm, trơn, túi tinh dầu nổi rõ Độ dày vỏ quả 2,5cm, số múi/quả đạt 13-14 múi, tép và cùi màu trắng đục Quả chín muộn,vào dịp tết cổ truyền mới là mùa thu hoạch giống bởi này Hạt bởi hình nêm,kích thớc 1,5x2,3cm, quả thờng có 30-80 hạt Đây là giống bởi có nhiều đặc

1,5-điểm hình thái phân biệt với các giống khác

3.1.6 Đặc điểm hình thái của giống bởi Trắng

Bởi Trắng là giống có một số đặc điểm giống với bởi Chua Thân bởiTrắng cao 8-9m, ít phân tán, tán hẹp hình trụ, đờng kính tán 3,5-4m Lá bởiTrắng hình trứng ngợc, mép lá xẻ thuỳ tha và nông, kích thớc 11x6cm, kíchthớc eo lá 3x2cm Hoa bởi nở rộ vào đầu tháng hai, tỉ lệ đậu quả lớn Quả bởiTrắng có hình cầu, trọng lợng 600-660g, kích thớc 10x9cm Vỏ quả nhẵn, khichín có màu vàng xanh, trên vỏ nổi rõ các túi tinh dầu to xếp sát nhau Độ dày

vỏ quả từ 1-2cm Bởi Trắng có nhiều đặc điểm khác biệt với các giống còn lại:tép bởi mềm nhũn, mọng nớc, có màu trắng đục nh nớc vo gạo, vỏ bọc cácmúi dính sát khó tách nhau ra Một quả thờng có 13-15 múi Quả thờng chínvào tháng 8-9 Hạt bởi có vỏ bọc màu nâu trắng, kích thớc 0,8x1,7cm, mộtquả có từ 50-100 hạt

3.1.7 Đặc điểm hình thái của giống bởi Oi

Tên gọi của giống bởi này xuất phát từ việc hình dạng quả của nó giốngcái oi bắt cá của ngời dân địa phơng Chiều cao trung bình của cây bởi Oi đạt

5-6m, tán hình quạt xòe rộng, đờng kính đạt 6-7m, cây phân cành nhiều vàrậm rạp Lá bởi Oi hình trứng ngợc, đầu lá xẻ thuỳ nông, phiến lá màu xanhlục sáng, kích thớc 11x6cm, kích thớc eo lá 3x2,5cm Hoa bởi Oi tập trungnhiều hoa trong một cụm, nở rộ vào đầu tháng hai, tỉ lệ đậu quả lớn Quả bởi

Oi tròn đầu và kéo dài hình bầu dục phía cuống, trọng lợng quả 800-1000g,kích thớc 16x12cm Khi quả chín vỏ có màu vàng rơm, túi tinh dầu to xếp tha,

vỏ quả dày 1,2-1,8cm, số múi trong một quả là 12-14 múi, quả thu hoạch vàotháng 8-9 Hạt bởi hình thuôn dài, kích thớc 0,6x0,8cm, quả nhiều hạt, từ 120-

170 hạt/quả

3.1.8 Đặc điểm hình thái của giống bởi Sơn

Bởi Sơn còn đợc ngời dân địa phơng gọi là bởi Son vì vỏ quả khi chín cómàu đỏ son, quả chín vào dịp tết nguyên đán nên thờng có mặt trong các mâmngũ quả của mỗi gia đình Cây bởi Sơn có tuổi trên 10 năm đạt chiều caokhoảng 6-8m, ít phân tán, tán cây hình tháp với đờng kính 2,5-3m Lá bởi Sơnhình trứng ngợc, mỏng, màu xanh lục, kích thớc 13x8cm, kích thớc eo lá3,5x2,5cm Hoa bởi màu trắng, thơm, nở rộ vào giữa tháng 3 và kéo dài đếncuối tháng 3 thì tàn hết Quả bởi Sơn hình cầu cân đối, trọng lợng 400-500g,kích thớc quả 8x9cm, vỏ quả hơi xù xì, trên vỏ có nhiều túi tinh dầu to xếp th-

a Vỏ quả khi chín có màu đỏ cam rất đẹp, độ dày vỏ quả 0,8-1,2cm, sốmúi/quả từ 12-14 múi Tép và cùi bởi có màu hồng đậm Hạt bởi Sơn bé, kíchthớc 0,5x1,2cm, một quả có 40-100 hạt

Bảng 2 Tóm tắt đặc điểm hình thái các giống bởi nghiên cứu

Giống

Đặc điểm

B Phúc Trạch B Đờng B Đào B Chua B Chộng B Trắng B Oi B Sơn

Tán Hình dạng Bán nguyệt Tháp Chổi xễ Tháp Quạt Trụ Quạt Tháp

Thời gian ra hoa tháng 2 tháng 2 cuối tháng 1- đầutháng 2 tháng 1 tháng 3 tháng 2 tháng 2 tháng 3

Thời gian thu hoạch Tháng 8-9 Tháng 8-9 Tháng 9-10 Tháng 9-10 Tháng 12-1 Tháng 8-9 Tháng 8-9 Tháng 12-1

3.2 Đặc điểm sinh hóa của các giống bởi nghiên cứu

3.2.1 Hàm lợng chất hữu cơ trong quả

Chúng tôi đã tiến hành phân tích các chỉ tiêu hoá sinh gồm hàm lợng ờng khử và đờng tổng số, hàm lợng vitaminC, hàm lợng axit hữu cơ tự do vàaxit hữu cơ tổng số, hàm lợng pectin trong vỏ quả, kết quả phân tích đợc chỉ ratrong bảng 3

đ-Bảng 3 Hàm lợng chất hữu cơ trong quả 8 giống bởi

b5 B Chộng 2,10 7,60 0,35 0,47 120,20 52,60 11,90 b6 B Trắng 2,60 7,60 0,35 0,45 84,48 45,10 9,27

b7 B Oi 2,41 6,70 0,32 0,47 97,30 52,60 11,40 b8 B Sơn 2,14 5,90 0,29 0,45 111,00 62,50 10,25 Giá trị trung bình 2,33 7,11 0,33 0,55 105,17 55,28 11,24

Bảng 3 cho thấy, hàm lợng các chất hữu cơ trong dịch ép quả bởi có sựgiao động lớn Hàm lợng đờng khử đạt giá trị trung bình 2,33%, giao động từ1,28% đối với bởi Đờng đến 3,28% đối với bởi Phúc Trạch Hàm lợng đờngtổng số đạt giá trị trung bình 7,11%, giao động từ 5,60% đến 9,20% cũng đốivới 2 giống bởi trên Hàm lợng axit hữu cơ tự do và axit hữu cơ tổng số đạt giátrị trung bình lần lợt là 0,33% và 0,55%, cao nhất gặp ở bởi Chua (0,41% axithữu cơ tự do và 0,95% axit hữu cơ tổng số) và thấp nhất gặp ở bởi Đờng(0,24% axit hữu cơ tự do, 0,32% axit hữu cơ tổng số) Hàm lợng vitaminCtrong ruột quả đạt giá trị trung bình 55,27mg%, giao động từ 45,10mg% đốivới bởi Trắng đến 67,00mg% đối với bởi Đào; còn trong vỏ quả thì bởi Đào cóhàm lợng vitaminC cao nhất (122,00mg%), bởi Chua có hàm lợng vitaminCthấp nhất (83,60mg%) Hàm lợng pectin trong cùi bởi thấp nhất gặp ở bởi Oivới chỉ số 9,27%, cao nhất gặp ở bởi Chua với chỉ số 12,80%, giá trị trungbình thu đợc là 11,24%

Kết quả phân tích trên cho thấy rằng hàm lợng đờng, axit hữu cơ,vitaminC và pectin trong tám giống bởi nghiên cứu khác nhau nhiều Bởi PhúcTrạch có hàm lợng đờng vợt trội, bởi Chua có hàm lợng axit và pectin vợt trội,

và hàm lợng vitaminC cao nhất đạt đợc ở bởi Đào, sự khác nhau về hàm lợngcác chất dinh dỡng trong quả phần nào cũng có thể phân biệt đợc bằng cảmquan (bảng4)

Bảng 4. Kết qủa đánh giá bằng cảm quan Stt Tên giống Vị ngọt Vị chua Vị the Vị đắng

Từ những kết quả phân tích trên, chúng tôi nhận thấy rằng các giống bởinghiên cứu không chỉ khác nhau ở một số đặc điểm hình thái mà còn khácnhau ở các chỉ tiêu sinh hóa, đây cũng có thể xem là một dấu hiệu để phânbiệt giống này với giống kia Tuy nhiên hàm lợng các chất dinh dỡng đợc đềcập ở trên không những phụ thuộc vào tính chất của giống mà còn phụ thuộcvào chế độ chăm sóc, vào điều kiện khí hậu, đất đai của từng vùng, nó có thểbiến thiên theo vị trí địa lý và theo từng mùa vụ, vì vậy nếu chỉ dừng lại ở việc

đánh giá hàm lợng chất dinh dỡng trong quả thì sẽ không phản ánh đợc đầy đủ

và chính xác sự khác biệt giữa các giống nghiên cứu Dựa trên những hiểu biết

về thành phần hóa học các hợp chất thứ cấp, chúng tôi nhận thấy rằng hàm ợng của một hợp chất thứ cấp có thể thay đổi tuỳ thuộc vào giai đoạn phát triểncũng nh vào điều kiện sống của cây nhng thành phần hóa học của một hợp chất

l-nào đấy thì hầu nh không biến đổi, đặc trng cho từng loài và có thể xem là mộttiêu chí phân loại có tính thuyết phục cao Trong đề tài này chúng tôi đã chọnhợp chất flavonoit làm đối tợng nghiên cứu.

3.2.2 Phân tích hợp chất flavonoit bằng sắc ký lớp mỏng

Chúng tôi sử dụng phơng pháp sắc ký lớp mỏng với bản mỏng silicageltráng sẵn kích thớc 5x20cm, hệ dung môi Toluen - Etylaxetat - Axeton - axitFormic (5:2:2:1) để xác định thành phần flavonoit có trong 8 giống bởi nghiêncứu Sắc ký đồ đợc tiến hành quan sát sự hiện vết và chụp ảnh dới ánh sáng

đèn tử ngoại, xác định số lợng vết và đo Rf của từng vết làm cơ sở để so sánhthành phần hóa học flavonoit giữa các giống với nhau Kết quả phân tích đợcthể hiện ở bảng 5, sắc ký đồ đợc trình bày ở hình 1

Bảng 5 Đặc điểm các vết flavonoit của 8 giống bởi tách ra trên bản

HTĐ: huỳnh quang tím đậm

HTN: huỳnh quang tím nhạt

HXĐ: huỳnh quang xanh đậm

HXN: huỳnh quang xanh nhạt

N: nâu

nh khác biệt nhau, ta chỉ thấy vết 1 là vết duy nhất có màu sắc và giá trị Rf t

-ơng đ-ơng nhau xuất hiện ở cả 8 giống, còn từ vết 2 trở đi sự khác biệt thể hiện

rõ rệt: vết 2 có ở cả 8 giống nhng ở bởi Đờng vết có màu xanh nõn chuối, ở

b-ởi Trắng vết có màu vàng nhạt, ở 6 giống còn lại có màu huỳnh quang xanhtím; vết 3 có màu huỳnh quang xanh nhạt xuất hiện ở 6 giống trừ bởi PhúcTrạch và bởi Trắng; vết 4 không xuất hiện ở bởi Phúc Trạch và bởi Trắng, cómàu xanh da trời ở bởi Đào và bởi Chua, màu huỳnh quang xanh nhạt ở cácgiống còn lại; vết 5 chỉ xuất hiện ở bởi Phúc Trạch với màu huỳnh quang xanhnhạt; vết 6 có màu nâu, xuất hiện ở bốn giống bởi Đào, bởi Chộng, bởi Oi, bởiSơn; vết 7 xuất hiện ở hai giống bởi Đào, bởi Chua với màu huỳnh quang xanhnhạt, ở bởi Oi với màu huỳnh quang xanh đậm; vết 8 chỉ xuất hiện ở hai giốngbởi Đờng và bởi Chộng với màu huỳnh quang xanh nhạt; vết 9 có màu huỳnhquang tím xuất hiện ở ba giống bởi Đờng, bởi Oi và bởi Sơn; vết 10 màuhuỳnh quang tím đậm chỉ có ở bởi Phúc Trạch; vết 11 có ở cả bởi Đào, bởiChua và bởi Oi với màu huỳnh quang tím nhạt; vết 12 xuất hiện ở bởi Đào, bởiChua có màu huỳnh quang tím đậm, ở bởi Chộng có màu xanh nõn chuối; vết

13 màu huỳnh quang tím đậm chỉ có ở bởi Phúc Trạch và bởi Đờng

Kết quả ở bảng 5 còn cho thấy số lợng, màu sắc và giá trị Rf các vết thu

đợc ở hai giống bởi Đào và bởi Chua là hoàn toàn giống nhau, rất có thể giữahai giống này có chung thành phần hóa học flavonoit và ở một khía cạnh nào

đó có thể chúng là hai giống gần gũi nhau Bên cạnh đó, giống bởi Trắng lại là

Hình 1 Sắc ký đồ hiện vết

flavonoit của 8 giống bởi khi

quan sát dới đèn tử ngoại

giống có sự khác biệt lớn nhất về thành phần hóa học hợp chất flavonoit, sốvết thu đợc là 2 vết trong đó chỉ 1 vết có giá trị Rf và màu sắc tơng đơng vớicác giống còn lại Tiếp tục so sánh các vết thu đợc từ sắc ký đồ phân tíchflavonoit của các đối tợng nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy rằng có 11/13 vếtkhông tơng đơng, hoặc chỉ xuất hiện ở giống này mà không xuất hiện ở cácgiống khác, hoặc xuất hiện ở cùng một số giống nhng màu sắc hiện vết khácnhau, điều này nói lên sự khác biệt về thành phần hóa học flavonoit giữa các

đối tợng nghiên cứu

Từ kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái và hóa sinh, chúng tôi nhậnthấy có sự khác nhau về nhiều chỉ số phân tích giữa các đối tợng nghiên cứu,

đây có thể xem là kết quả bớc đầu để phân biệt giống bởi này với giống bởikia, chỉ ra rằng chúng hoàn toàn khác nhau chứ không phải thuộc về một vàigiống Để kết quả phân loại chính xác hơn, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiêncứu hệ gen làm cơ sở xác định mức độ sai khác và mối tơng quan di truyềngiữa các đối tợng nghiên cứu, bổ sung cho phơng pháp phân loại bằng hìnhthái và sinh hóa Kỹ thuật đợc sử dụng trong phân tích hệ gen là kỹ thuậtPCR-RAPD

3.3 Kết quả phân tích các chỉ tiêu phân tử

3.3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá 8 giống bởi

ADN tổng số của 8 mẫu bởi nghiên cứu sau khi tách chiết đợc kiểm trabằng gel agaroza 0,8% Kết quả cho thấy các mẫu ADN chỉ cho một băng duynhất, ở gần giếng, không đứt gãy Tuy nhiên, ngoài băng ADN tổng số thu đợcthì ở phía cuối giếng còn xuất hiện một vệt sáng dài, đấy chính là ARN cònlẫn trong mẫu (hình 2)

Hình 2. ảnh ADN tổng số 8 giống bởi nghiên cứu

1-8: thứ tự các giếng theo thứ tự các giống bởi đợc quy ớc ở bảng 3

Để làm sạch sản phẩm ADN này, chúng tôi đã bổ sung thêm RNaza vàomẫu cho đến nồng độ cuối cùng là 10g/ml rồi ủ ở 370C trong 30 phút đểenzym hoạt động phân hủy ARN Sản phẩm sau khi phân hủy ARN đợc kiểmtra độ sạch và xác định hàm lợng bằng quang phổ kế (bảng 6)

Bảng 6 Độ sạch và hàm lợng ADN của 8 giống bởi

Stt Tên giống Hàm lợng (ngADN/ l) Độ sạch (OD 260 /OD 280 )

Hàm lợng ADN thu đợc đạt giá trị trung bình 248,8ng/l, tỉ lệ

OD260/OD280 biến thiên trong giới hạn từ 1,8-2,0 cho thấy ADN tách chiết đợc

từ các mẫu bởi đều sạch và đủ hàm lợng để thực hiện phản ứng RAPD

3.3.2 Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD

3.3.2.1 Số phân đoạn ADN xuất hiện

Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau đợc điện di trên gelpolyacrylamit 10% để phân tích đa hình ADN của các mẫu bởi nghiên cứu

Tổng số mồi tham gia là 25 mồi, tuy nhiên chỉ có 19 mồi xảy ra phản ứng, 6mồi còn lại bao gồm OBA6, OBA8, OBB2, OBB8, OBB10, OBC8 không nhânlên đợc phân đoạn ADN nào, vì vậy kết quả chỉ đợc ghi nhận từ 19 mồi có xảy

Bảng 7 Tổng số phân đoạn ADN xuất hiện khi điện di sản phẩm

RAPD với 19 mồi ngẫu nhiên