nhóm 14 phương pháp gián tiếp

Phương pháp gián tiếp xác định tế bào liên quan đến việc phân tích hóa học của một quy trình nuôi cấy, thành phần hoặc một số các hoạt động trao đổi chất.. Việc xác định của axit nucleic

Đại học Nông lâm TP.HCM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO CHUYÊN NGÀNH TẾ BÀO HỌC ĐỘNG VẬT GV: Trần Thị Bích Liên Chủ đề: Nhận biết sự phát triển của tế bào bằng phương pháp gián tiếp Thành viên trong nhóm 1.Lê Nhật Tân 11126321

2.Lê Văn Vũ Linh 11126154

3.Nguyễn Lê Thụ Minh 11126164

4.Trần Thị Anh Thương 11126037

5.Đoàn Thị Mỹ Linh 11126016

6.Nguyễn Thị Kim Loan 11126155

Tháng 12,2012

Mục lục

Đặt vấn đề 3

Chương I Mở đầu 4

I.1 Sự sinh trưởng của tế bào 5

I.2 Con đường sinh trưởng và phát triển của tế bào 5

Chương II Nội dung 6

II.1 Định nghĩa phương pháp gián tiếp 6

II.2 Các phương pháp vật lý 6

II.3 phương pháp hóa học 18

II.4 Những nhân tố ảnh hưởng quá trình phát triển tế bào 21

Chương III Kết luận 23

Tài liệu tham khảo 24

Đặt vấn đề

Xác định chính xác sự tăng trưởng tế bào là điều rất quan trọng để theo dõi một quá trình sinh

lý của động vật Trực tiếp phương pháp để xác định các tế bào bao gồm đếm vi, điện tử đếm hạt, giám sát sinh khối, và phân tích hình ảnh Những phương pháp làm việc nhất chỉ đơn giản là khi một mẫu khối lượng cố định có thể được lấy từ một bình nuôi cấy Đếm hiển vi thì mất thời gian nhưng dành lợi thế là cho phép khả năng sống được xác định nếu một loại thuốc nhuộm phù hợp.Đếm hạt điện tử là một phương pháp nhanh chóng cho tái tạo mẫu, nhưng một số biến dạng dữ liệu có thể xảy ra nếu mẫu có tế bào lớn, các mảnh vỡ hoặc tế bào cốt lõi Việc sử dụng một đầu

dò sinh khối phát hiện các tế bào bởi các tính chất điện môi và có thể được sử dụng như một mànhình liên tục của sự tiến bộ của một nền văn hóa Phân tích dựa trên hình ảnh về việc sử dụng hình ảnh máy ảnh kỹ thuật số được thông qua một kính hiển vi đã nâng cao nhanh chóng với sự sẵn có của một số gói phần mềm thương mại có sẵn

Phương pháp gián tiếp xác định tế bào liên quan đến việc phân tích hóa học của một quy trình nuôi cấy, thành phần hoặc một số các hoạt động trao đổi chất Những phương pháp này rất hữu ích nhưng nó là khó khăn để có được mẫu tế bào nguyên vẹn Tuy nhiên, mối quan hệ giữa các thông số và số lượng tế bào có thể không được tính thông qua các giai đoạn của một quá trình nuôi cấy tế bào Việc xác định của axit nucleic (DNA) hoặc tổng số protein có thể được sử dụng như một ước tính sinh khối, trong khi sự suy giảm của glucose có thể được sử dụng như một ước tính của hoạt động tế bào Các trạng thái tồn tại của tế bào có thể được đo bằng việc phát hành một loại enzyme như lactate dehydrogenase (LDH) hoặc trực tiếp từ phí năng lượng trong tế bào adenylate từ tế bào lysates Ngoài ra, kỹ thuật phóng xạ có thể được sử dụng để cho chính xác xác định tổng hợp protein của tế bào

Sự phát triển của các tế bào động vật có vú trong nuôi cấy có thể được giám sát bởi một số cácthông số liên quan đến sự gia tăng sinh khối tế bào theo thời gian Phương pháp đếm tế bào đơn giản nhất là cách đếm tế bào đều đặn trong nuôi cấy tương ứng với thời gian tăng gấp đôi theo ước tính của tế bào động vật có vú Điều này cho thấy được sự sinh trưởng và phát triển của tế bào

Hai phương pháp tế bào đếm trực tiếp được sử dụng thường xuyên dựa trên kiểm tra trực quanthông qua một kính hiển vi điện tử hoặc bằng một bộ đếm hạt Cả hai phương pháp phụ thuộc vào việc có một mẫu của một hệ thống các tế bào ổn định Vì vậy, nó vô cùng quan trọng để đảmbảo rằng việc nuôi cấy cũng được trộn lẫn bằng cách khuấy hoặc lắc trước khi lấy mẫu

Phương pháp gián tiếp ước tính tăng trưởng tế bào dựa vào việc đo lường một thành phần tế bào trong tế bào như DNA hoặc protein hoặc, cách khác, một ngoài thay đổi tế bào chẳng hạn như sự suy giảm chất dinh dưỡng hoặc một hoạt động của enzyme được phát hành bởi các tế bào Phương pháp gián tiếp của dự toán tăng trưởng phụ thuộc vào mối quan hệ giữa các thông

số đo và nồng độ tế bào Tuy nhiên, điều quan trọng là nhận ra rằng các mối quan hệ hiếm khi tuyến tính trong quá trình nuôi cấy ghi dựng đường chuẩn Nó cũng có ghi nhận rằng tổng hàm lượng protein và mức độ hoạt động của enzyme cụ thể đo trên mỗi cơ sở tế bào thay đổi đáng kể trong quá trình nuôi cấy như một kết quả của những thay đổi trong tốc độ tăng trưởng và thành phần của môi trường nuôi cấy

Trong một số trường hợp như có thể xảy ra, ví dụ, trong phản ứng sinh học tế bào cho phép đogián tiếp của tăng trưởng tế bào có thể là lựa chọn duy nhất Điều này có thể được sử dụng để theo dõi sự phát triển của quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, cần thực hiện nếu dữ liệu đó được sử

dụng trong phân tích so sánh giữa các môi trường nuôi cấy, như sự khác biệt có thể là một sự phản ánh của những thay đổi trong chuyển hóa hoặc làm nồng độ tế bào tăng đáng kể.

I) Mở đầu:

I.1.Sự tăng trưởng của tế bào

Động vật cũng như nhiều loại sinh vật đa bào khác được cấu tạo từ các loại mô khác nhau Các mô được cấu tạo từ những tế bào cùng loại Như vậy, tế bào là đơn vị cấu trúc nhỏ nhất của một cơ thể, là đơn vị chức năng cơ bản của sự sống

Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme

và các hoạt động của enzyme, đây cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những sản phẩm trao đổi chất của tế bào, cũng như khả năng phân chia tế bào Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hưởng quyết định đến kết quả:

- Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào

- Những yếu tố môi trường quyết định đặc trưng riêng biệt của tế bào

Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng của tế bào động vật rất chậm Do đặc điểm di truyền, các tế bào vi khuẩn thường phân chia với tốc độ rất nhanh, khoảng 20-50 phút Ở động vật và thực vật, một chu kỳ tế bào thường kéo dài 20-70 giờ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nếu trong một điều kiện nào đó, một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng

số lượng một cách bất thường, cơ thể sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý

Lưu ý: Khi nuôi cấy tế bào động vật cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá

đỡ để có thể sống và phân chia Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi Tuy vậy, một số dòng tế bào như tế bào ung thư hoặc dòng tế bào kiên tục từ mô bình

Hình 1.Các bào quan gồm: (1)hạch nhân, (2) nhân, (3) ribosome, 4) túi tiết,(5) mạng lưới nội chất(ER) hạt, (6) bộ máy Golgi, (7) khung

xương tế bào, (8) ER trơn, (9) ty thể, (10) không bào, (11) tế bào chất, (12) lysosome, (13) trung thể.

I.2.Con đường sinh trưởng và phát triển của các tế bào.

1 Pha ức chế

Pha ức chế là pha đầu tiên, nó phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thành phần, mật độ, trạng tháiban đầu của tế bào Pha này xảy ra sớm, không tăng về số luợng tế bào (số lượng tế bào có thểgiảm) Nếu mật độ nuôi cấy và khả năng sống của tế bào nuôi cấy thấp thì pha này sẽ kéo dàihơn

2 Pha phát triển (pha lag)

Sau 3 – 4 ngày nuôi cấy, số lượng tế bào sẽ bắt đầu tăng lên nhanh chóng Trong chẩn đoán,thường sử dụng bình tế bào đã phủ 80% bề mặt bình (ở pha phát triển)

Pha lag (hoặc pha tĩnh khởi đầu hoặc tiềm tàng) là thời kỳ khởi đầu của quá trình nuôi cấy,trong suốt thời kỳ này sự thay đổi số lượng tế bào là bằng không hoặc không đáng kể Mặc dù sốlượng tế bào không tăng lên,

3 Pha ổn định

Mật độ tế bào không tăng, tốc độ chết bằng tốc độ sinh trưởng Sự sinh trưởng của tế bào bịhạn chế do: Hết dinh dưỡng Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất có thể ức chế sự pháttriển của tế bào Tế bào đã phủ kín trên chất nền, nên không còn chỗ bám và không thể sinh sảntiếp được

4 Pha tĩnh hay pha chết: Số lượng tế bào chết tăng, mật độ tế bào sống giảm

Sinh trưởng của quần thể tế bào thường bị hạn chế hoặc do sử dụng hết toàn bộ các chất dinhdưỡng có sẵn hoặc do sự tích lũycác sản phẩm độc của sự trao đổi chất Kết quả là tốc độ sinhtrưởng giảm và sự sinh trưởng cuối cùng đã dừng lại Ở thời điểm này nuôi cấy được gọi là pha tĩnh Giai đoạn chuyển tiếp giữa pha hàm mũ và pha tĩnh bao gồm một thời kỳsinh trưởngkhông cân bằng và trong suốt thời kỳ này các thành phần khác nhau của tế bào được tổng hợp ởcác tốc độ không bằng nhau Kết quả là các tế bào trong pha tĩnh có một thành phần hóa họckhác với các tế bào trong pha hàm mũ

Pha tĩnh thường được tiếp theo bởi pha chết mà trong đó các cơ thể trong quần thể bị chết Sựchết xuất hiện hoặc do sự suy yếu của việc bảo quản năng lượng của tế bào, hoặc do sự tích lũycác sản phẩm độc tố Giống như sự sinh trưởng, sự chết là một hàm mũ Trong một số trườnghợp, cơ thể không chỉ chết mà còn phân hủy, một quá trình còn được gọi là sự phân giải.

Chính vì vậy việc quan sát sự phát triển của tế bào thường gắn với giai đoạn ổn định

II) Nội dung:

II.1.Định nghĩa phương pháp gián tiếp là gì?

Là phương pháp không cần sử dụng kính hiển vi hoặc nuôi cấy tế bào động vật như phươngpháp đếm trực tiếp nhưng vẫn có thể nhận biết được sự phát triển của tế bào Phương pháp nàythường được ứng dụng cho các nhà máy bởi việc tính toán tế bào là rất tốn kém thời gian cần có

1 phương pháp ước lượng mật độ tế bào đang phát triển để đi vào sản xuất

II.2 Các phương pháp nhận biết sự phát triển của tế bào bằng phương pháp vật lý 2.1 Phương pháp đo độ đục của dinh dưỡng để xác định số lượng tế bào

Phương pháp nhanh hơn, mẫn cảm hơn là dùng phương pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánh sáng Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào Lúc nồng độ tế bào đạt đến 107 tế bào/ml thì dịch nuôi cấy sẽ vẩn đục, nồng độ càng tăng thì độ đục cũng tăng theo và làm cản trở ánh sáng đi qua dịch nuôi Có thể đo độ tán xạ ánh sáng bằng quang phổ kế (spectrophotometer) Ở một mức độ hấp thụ ánh sáng thấp, giữa nồng độ tế bào và giá trị hấp thụ ánh sáng có quan hệ tuyến tính (hình 9) Chẳng hạn, thu tế bào trong một thể tích nhất định của dịch nuôi cấy, rửa sạch đi rồi đo tổng lượng protein hay tổng lượng nitrogen, có thể thấy sự tăng lượng tế bào là phù hợp với sự tăng tổng lượng protein (hay N) Cũng tương tự như vậy, việc xác định tổng lượng chlorophyll có thể dùng để đo sinh khối tảo; đo hàm lượng ATP có thể biết được sinh khốicủa các vi sinh vật sống

Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định được sinh khối Khi số lượng tế bàotăng lên sẽ dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng nhiều hơn và quang phổ kế sẽ đođược mức độ tăng lên của trị số hấp thụ ánh sáng Trên quang phổ kế có hai thang chia độ: phíadưới là trị số hấp thụ ánh sáng, phía trên là mức độ thấu quang Khi trị số hấp thụ ánh sáng tănglên thì mức độ thấu quang hạ xuống

2.2 Định lượng DNA để xác định lượng tế bào bằng phương pháp quang phổ:

Một giao thức thường được sử dụng liên quan đến việc điều trị của các tế bào có khả năng hòatan với thuốc thử huỳnh quang liên kết với DNA Phát hiện huỳnh quang cung cấp cao nhạy cảmvới thuốc thử như Hoechst 33.258 (8) hoặc 4e,6-diamidino-2-phenyl-indol (DAPI, 9) từ SigmaChemical Co

1.Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base

purine và pyrimidine Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260 nm – OpticalDensity260 nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ ADN trong mẫu dựa vào tươngquan sau :

Một đơn vị OD260 nm tương ứng với một nồng độ là :

- 50 μg/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi.g/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi

- 40 μg/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi.g/ml cho một dung dịch ADN hay ARN sợi đơn

Hàm lượng DNA được xác định bằng công thức:

[DNA] = OD260 x 50 x X (μg/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi.g)

Trong đó X là số lần pha loãng từ dung dịch DNA gốc ban đầu

Phương pháp này đơn giản, nhanh, nhưng có hạn chế là giá trị đọc được về độ hấp thụ có thể

bị ảnh hưởng khi trong mẫu chứa RNA và protein Trong thực tế phương pháp này thường đượcdùng để định lượng các mẫu DNA tinh khiết

Độ sạch DNA được xác định bằng tỉ số OD260/ OD280 Nếu tỉ số này > 1,8 thì dung dịchDNA đem đo được coi là sạch Khái niệm sạch ở đây là lượng protein còn lại trong dung dịchDNA tách được

OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 260 nm

OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bước sóng 280 nm

n: Độ pha loãng (thường n = 100)

- Thực hiện: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đường chuẩn Pha loãng dung dịch DNA đếnnồng độ thích hợp để đo (thường pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: hút 5 µl dung dịchDNA hòa tan với 495 µl TE 1X Cho vào cuvet để tiến hành đo OD

2.Vật liệu, hóa chất, dụng cụ

- Dung dịch DNA

- Dung dịch pha loãng DNA (TE)

- Nước cất

- Pha loãng dung dịch ADN ra 50, 100 lần từ dung dịch gốc 50 μg/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi.l ADN.

- Cho 2 ml dung dịch ADN pha loãng vào cuvet và tiến hành đo ra giá trị OD ở bước sóng

260 nm và 280 nm ghi kết quả thu được

- Lấy 2 ml dung dịch ADN vào ống effpendof đun cách thủy ở nhiệt độ 90 – 1000C (đunnước sắp sôi thì cho ống vào, đun khoảng 2 -5 phút) để làm biến tính ADN

II.2.2Phương pháp đếm gián tiếp bằng cách đo điện trở

Phương pháp gián tiếp để xác định sinh khối tế bào dựa trên phép tính hệ số tỷ lượng toànphần (overall stoichiometry) cho sự sinh trưởng và tạo thành sản phẩm, có thể được trình bàytrong một dạng chung như sau:

nguồn carbon+ nguồn nitrogen + phosphate + O2 → sinh khối tế bào + CO2+ H2O + sảnphẩm

Sự thay đổi sinh khối tế bào có thể được kiểm soát gián tiếp bằng cách xác định sự tiêu thụchất dinh dưỡng, tạo thành sản phẩm,các thành phần tế bào, giải phóng nhiệt hoặc các tính chấtvật lý khác của dịch nuôi cấy tế bào.

Biểu đồ 2.2 thể hiện mối quan hệ với điện trở và nhiệt độ đối với sự phát triển của tế bào

Máy đếm Coulter

Máy đếm Coulter là một thiết bị chuyên dùng cho việc đếm và đo kích thước các hạt trongmôi trường điện giải Nó được sử dụng cho các loại tế bào, vi khuẩn, tế bào prokaryotic và virus.Một máy đếm Coulter điển hình có một hay nhiều vi kênh (microchannels) phân cách hai buồngchứa dung dịch điện giải Khi dung dịch chứa các hạt hoặc chứa các tế bào đi qua mỗi vi kênhnhỏ này, mỗi hạt này gây nên sự thay đổi ngắn về điện trở của dung dịch trong kênh Máy đếm

sẽ phát hiện sự thay đổi về điện trở này

- Nguyên lý Coulter

Nguyên lý Coulter chỉ ra rằng các hạt đi qua một lỗ, cùng với dòng điện, tạo ra một điện trởkháng tỉ lệ với kích thước hạt khi đi qua lỗ Sự thay đổi trở kháng này xuất phát từ việc các hạtchen vào dung dịch điện giải Nguyên lý Coulter được đặt theo tên của người sáng tạo, Wallace

H Coulter Nguyên lý này có nhiều thành công trong công nghiệp y dược, đặc biệt là trong lĩnhvực huyết học, lĩnh vực mà nó được áp dụng để đếm và đo kích thước của nhiều loại tế bào làmnên máu

Tế bào, một hạt dẫn điện kém, làm thay đổi tính dẫn điện của vi kênh Nếu các hạt này dẫnđiện kém hơn so với dung dịch xung quanh, điện trở của kênh sẽ tăng, làm cho dòng điện đi quakênh giảm Bằng cách quan sát sự thay đổi trong dòng điện, số lượng các hạt trong một lượngchất lỏng nhất định có thể được đếm Mức độ thay đổi dòng điện liên quan tới kích thước của cáchạt, cho phép việc đo sự phân bổ kích thước các hạt, điều này tương quan đến việc tính chuyểnđộng, điện tích bề mặt, và nồng độ các hạt.Máy đếm Coulter là một bộ phận quan trọng trong cácphòng thí nghiệm của bệnh viện hiện nay Nhiệm vụ chính của nó là phân tích nhanh và chínhxác việc đếm toàn bộ máu (thường được gọi là CBC) CBC được sử dụng để xác định số lượngbạch cầu và hồng cầu trong cơ thể Trước đây, tiến trình này thường liên quan đến việc chuẩn bịnhuộm tế bào máu và đếm thủ công từng loại tế bào dưới kính hiển vi, một quá trình thường mấtnửa giờ.

Máy đếm Coulter có nhiều ứng dụng bao gồm sơn, ceramic, thủy tinh, luyện kim và sản xuấtthức ăn Chúng cũng thường được sử dụng trong việc quản lý chất lượng.Máy đếm Coulter đóngvai trò quan trọng trong sự phát triển của máy phân loại tế bào đầu tiên, và có liên quan đếnnhững ngày đầu của việc phát triển máy đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry) Thậm chí đếnngày hôm nay, một số máy đếm tế bào dòng chảy vẫn sử dụng nguyên lý Coulter để cung cấpthông tin chính xác hơn về kích thước và số tế bào

II.2.3 máy đếm tế bào theo nguyên lý dòng chảy

2.3.1 Hệ thống tạo dòng chất lỏng (fluidics system)

Hệ thống tạo dòng chất lỏng là bộ phận căn bản nhất của một máy đếm tế bào dòng chảy Hệthống tạo dòng chất lỏng gồm có 2 vùng chất lỏng có áp lực khác nhau Dòng dịch lỏng bênngoài (sheath fluid) còn được gọi là dung dịch tạo dòng bao: có tác dụng “nắn chỉnh” dòng dịchlỏng chứa mẫu bên trong (core fluid) còn gọi là dòng lõi thành một dòng hẹp tới mức các tếbào/hạt vật chất trong mẫu chỉ có thể đi qua khe hẹp đó từng cái một từ đó giúp tập trung tế bào/vật thể nhỏ có trong mẫu thành dòng tế bào đơn và vận chuyển dòng tế bào đơn này đi qua hệthống quang học với tốc độ rất cao, khoảng 1000 tế bào/giây

Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áp lực giữa dòng bao và dòng lõi có thể mở rộng hoặc thu hẹptiết diện dòng lõi, phù hợp với yêu cầu phân tích (ví dụ phân tích tế bào máu thì cần dòng lõilớn, phân tích ADN thì cần dòng lõi hẹp) Nhờ cơ chế này hệ thống mới có thể phân tích đồngthời nhiều đặc tính trên từng tế bào một cách chính xác, giảm được yếu tố nhiễu Dịch dùng tạodòng sheath thường phải đáp ứng 2 yêu cầu: (1) không gây ảnh hưởng tới tế bào (không làm tan

tế bào); và (2) không làm ảnh hưởng đến độ chiết quang và độ huỳnh quang của hệ thống Ởmột số dòng máy người ta sử dụng ống vi mao thay thế cho dòng bao

Hình 2.3.1 Hệ thống dòng chất lỏng trong buồng mẫu (flow cell)

2.3.2 Hệ thống quang học

Bao gồm nguồn phát tia sáng (thường là các đèn laser hoặc đèn hồ quang), hệ thống kính lọc

và các kênh thu tín hiệu quang học và tính hiệu huỳnh quang (FSC – Forward Scatter Chanel,dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc thẳng; SSC – Side Scatter Chanel, dùng thu nhậntín hiệu ánh sáng tán xạ góc bên, các FL (Fluoressen Light), dùng thu nhận tín hiệu ánh sánghuỳnh quang từ kênh màu huỳnh quang và số kênh màu huỳnh quang có thể dao động t ừ 2 đến

18 FL tùy dòng máy; PMT – Photo Multiplier Tube, các ống nhân quang tương ứng với cáckênh màu huỳnh quang có vai trò khuếch đại tín hiệu ánh sáng huỳnh quang)

Khi một tế bào hay một vật thể đi qua nguồn sáng, ánh sáng của nguồn sáng sẽ tương tác vớivật thể sẽ tạo ra các ánh sáng tán xạ (tán xạ góc thẳng và tán xạ góc bên) và nếu tế bào/vật thể đóđược nhuộm màu huỳnh quang, dưới kích thích của nguồn sáng, chất màu huỳnh quang đó sẽphát ra ánh sáng huỳnh quang Sau đó các tia sáng này sẽ đi qua hệ thống kính lọc (đó là các