Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của một loài giảo cổ lam ở bắc sơn (lạng sơn)

Em cũng xin chân thành cảm ơn đến các thầy, cô giáo và các chị kĩ thuật viên trong Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khoá luận tại trườ

BẮC SƠN (LẠNG SƠN) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018

BẮC SƠN (LẠNG SƠN) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này, lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn

sâu sắc đến ThS Nghiêm Đức Trọng, người thầy đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn

em trong suốt thời gian em thực hiện khoá luận này

Em cũng xin chân thành cảm ơn đến các thầy, cô giáo và các chị kĩ thuật viên trong Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khoá luận tại trường

Trong quá trình thực hiện khóa luận, em cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ và góp ý

nhiệt tình của ThS Phạm Tuấn Anh (Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà

Nội)

Em xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện khoá luận tốt nghiệp

Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp

đã luôn ở bên cạnh giúp đỡ, cổ vũ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khoá luận này

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Đặng Duy Việt

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume 2

1.2 Đặc điểm thực vật chi Gynostemma Blume 2

1.3 Phân bố chi Gynostemma Blume 2

1.4 Khoá phân loại chi Gynostemma Blume 3

1.5 Nhầm lẫn với các loài thực vật khác 5

1.6 Thành phần hoá học một số loài trong chi Gynostemma Blume 5

1.6.1 Saponin 5

1.6.2 Flavonoid 7

1.6.3 Các thành phần khác 7

1.1.8 Tác dụng sinh học và công dụng một số loài trong chi Gynostemma Blume 8

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Đối tượng nghiên cứu 10

2.2 Phương tiện nghiên cứu 10

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất 10

2.2.2 Dụng cụ 10

2.2.3 Phương tiện và máy móc 10

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 11

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 11

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 11

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 14

3.1 Thực nghiệm và kết quả 14

3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 14

3.1.2 Nghiên cứu thành phần hoá học 19

3.2 Bàn luận 25

3.2.1 Về thực vật 25

3.2.2 Về hoá học 25

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Gynostemma

High-performance liquid chromatography – Sắc ký lỏng hiệu năng cao Methanol

n-Butanol Nhà xuất bản Sắc ký lớp mỏng

Số thứ tự Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng Thuốc thử

Y học cổ truyền

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Bảng so sánh đặc điểm của các loài/chi có hình thái giống với các loài trong

chi Gynostemma 5

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất chính của Giảo cổ lam quả dẹt 19

Bảng 3.2 Kết quả phân tích sắc ký đồ dịch chiết MeOH khai triển với hệ dung môi Cloroform - EtOAc - MeOH - Nước (25 : 40 : 22 : 5) 20

Bảng 3.3 Kết quả phân tích sắc ký đồ dịch chiết MeOH khai triển với hệ dung môi Cloroform - n-BuOH - MeOH - Nước (2 : 4 : 1 : 2) 21

Bảng 3.4 Kết quả phân tích sắc ký đồ dịch chiết BuOH 23

khai triển với hệ dung môi Cloroform - Methanol - Nước (7 : 3 : 0,4) 23

Bảng 3.5 Kết quả định lượng saponin toàn phần trong mẫu nghiên cứu 24

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc khung dammaran 6

Hình 1.2 Công thức các dammaran saponin đã được phân lập từ G compressum 7

Hình 2.1 Giảo cổ lam thu hái tại Bắc Sơn 10

Hình 3.1: Đặc điểm hình thái của cây đực 15

Hình 3.2: Đặc điểm hình thái của cây cái 15

Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu thân cây Giảo cổ lam quả dẹt 16

Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu lá Giảo cổ lam quả dẹt 17

Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu cuống lá Giảo cổ lam quả dẹt .18

Hình 3.6 Đặc điểm bột Giảo cổ lam nghiên cứu 18

Hình 3.7 Hình ảnh sắc kí đồ khai triển bằng hệ dung môi Cloroform - EtOAc - MeOH - Nước (25 : 40 : 22 : 5) 21

Hình 3.8 Hình ảnh sắc kí đồ khai triển bằng hệ dung môi 8 22

Hình 3.9 Hình ảnh sắc kí đồ khai triển bằng hệ dung môi 24

Cloroform - Methanol - Nước (7 : 3 : 0,4) 24

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, xu thế sử dụng các sản phẩm từ thảo dược để chăm sóc sức khoẻ, điều trị và phòng ngừa các loại bệnh ngày càng gia tăng ở thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Tuy nhiên các loại sản phẩm này hầu hết được sử dụng dựa trên kinh nghiệm dân gian hoặc y học cổ truyền, còn nhiều cây thuốc, bài thuốc chưa được nghiên cứu, hoặc nghiên cứu chưa đầy đủ, kĩ lưỡng Giảo cổ lam là một trong số đó

Giảo cổ lam là tên gọi chung của các loài trong chi Gynostemma Blume, được

sử dụng rất rộng rãi ở Việt Nam, với các tác dụng hạ glucose máu [18], chống oxy hoá [13], giảm cholesterol máu [1] Trong Y học cổ truyền (YHCT) cây được sử dụng điều trị các bệnh về gan, viêm phế quản mạn tính [50] Một số dạng bào chế từ Giảo cổ lam cũng đã được sản xuất và lưu hành trên thị trường như trà túi lọc, viên nang cứng, viên nén, viên bao film

Trong một chuyến đi thực địa tại huyện Bắc Sơn tỉnh Lạng Sơn, đoàn nghiên cứu Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội đã phát hiện thấy một loài Giảo

cổ lam có nhiều đặc điểm thực vật khác các loài được sử dụng phổ biến, đặc biệt loài này có vị ngọt dễ chịu chứ không đắng như các loài khác Nhận thấy sự khác biệt về đặc điểm thực vật và dự đoán sự khác biệt về thành phần hoá học, chúng tôi tiến hành

đề tài: "Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học của một loài Giảo cổ lam ở Bắc Sơn (Lạng Sơn)"

Đề tài có 2 mục tiêu chính:

- Mô tả đặc điểm thực vật và đặc điểm vi học mẫu nghiên cứu

- Định tính các nhóm chất hoá học, định tính bằng sắc kí lớp mỏng và định lượng saponin toàn phần trong mẫu nghiên cứu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume

Theo tài liệu hệ thống phân loại của Takhtajan [17], chi Gynostemma Blume

được xếp vào họ Bí (Cucurbitaceae), bộ Bí (Cucurbitales), liên bộ Hoa tím (Violanae), phân lớp Sổ (Dilleniidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

1.2 Đặc điểm thực vật chi Gynostemma Blume

Cây thảo, lâu năm, dây leo, nhẵn hoặc có lông Lá so le, kép chân vịt, 3 – 9 lá chét, hiếm khi đơn; phiến lá chét hình trứng – mác Tua cuốn chẻ đôi, ít khi đơn Cây đơn tính khác gốc, hiếm khi đơn tính cùng gốc Hoa đơn tính, cụm hoa chùm hoặc chùy, ở nách lá hoặc đầy cành; cuống của hoa có khớp; lá bắc con ở gốc Hoa đực: ống đài ngắn, 5 thùy; các mảnh hình mác hẹp; tràng màu xanh hoặc trắng, hình bánh xe, 5 thùy xẻ sâu; các thùy hình mác hoặc trứng – mác, mép cuộn vào trong khi là nụ; nhị 5, đính vào gốc của ống bao hoa; chỉ nhị ngắn, hàn liền; bao phấn đứng, hình trứng, 2 ô, nứt dọc, trung đới hẹp, nhưng không kéo dài; hạt phấn hình cầu hoặc elip, có gờ theo chiều dọc hoặc nhẵn, tự mở bằng lỗ; nhụy hoa tiêu giảm hay không có (tiêu giảm hoàn toàn) Hoa cái: đài và tràng giống hoa đực; nhị lép tồn tại; bầu hình cầu, 2 – 5 ô; vòi nhụy 3, hiếm khi 2, 4 hoặc 5, rời nhau; núm nhụy 2 hoặc 1, hình lưỡi liềm hoặc xẻ răng cưa không đều; noãn 2, treo trong mỗi ô Quả mọng hình cầu, hình dàn và kích thước giống hạt đậu Hà Lan, hoặc quả nang, có 3 thùy tử đinh, đinh có u hoặc 3 vòi nhụy dài tồn tại hạt 2 hoặc 3, hình trứng rộng, dẹt, có nhú hoặc gai nhú [9], [23]

1.3 Phân bố chi Gynostemma Blume

Hiện nay trên thế giới có khoảng 19 loài thuộc chi Gynostemma Blume, phân

bố từ vùng nhiệt đới châu Á tới Đông Á; từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và New

Guinea Loài G pentaphyllum (Thumb.) Makino phổ biến nhất, phân bố ở Ấn Độ,

Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myanma, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam Nơi

đa dạng Gynostemma nhất là ở Trung Quốc, hiện nay đã được ghi nhận 14 loài [23] Theo quan điểm hiện nay, chi Gynostemma được chia thành 2 phân chi (Subgenus), bao gồm: (i) Subg Trirostellum, với dạng quả nang, tự mở bằng 3 van, và (ii) Subg Gynostemma, với dạng quả mọng không tự mở Ở Subg Trirostellum lại được chia thành 2 loại (Section) là (i) Sect Pentagyne và Sect Trirostellae

Ở Việt Nam, theo các tài liệu của tác giả Võ Văn Chi [8] và Phạm Hoàng Hộ

[12], chi Gynostemma Blume có 2 loài G pentaphyllum (Thumb.) Makino (Giảo cổ lam, Cổ yếm, Thư tràng năm lá) và G laxum (Wall.) Cogn (Cổ yếm lá bóng, Thư tràng thưa) Năm 2009, có thêm một loài mới thuộc chi Gynostemma Blume được công bố, bổ sung vào hệ thực vật Việt Nam là G longipes C Y W [30] Năm 2015,

có thêm 2 loài là Gynostemma burmanicum King ex Charkav (Giảo cổ lam Miến điện) và Gynostemma compressum X X Chen & D R Liang (Giảo cổ lam quả dẹt)

được công bố và bổ sung vào hệ thực vật Việt Nam [3] Tính đến nay đã có 5 loài được công bố ở Việt Nam

1.4 Khoá phân loại chi Gynostemma Blume

Khoá phân loại chi Gynostemma Blume ở Trung Quốc [23] như sau:

1a Quả nang hình chuông, khi chín tự mở theo đường quanh thân bầu nhuỵ, có 3 thuỳ;

3 (-5) vòi nhuỵ tồn tại, dạng mỏ dài

2a Hoa cái đơn độc hoặc mọc thành từng đôi một ở nách lá, cuống hoa nhỏ dài

3-4 cm, bầu 5 ô, mẫu 5 1 G pentagynum

2b Hoa cái mọc nhiều trên cành hoặc dạng chùm ở nách lá hoặc đầu cành, cuống hoa ngắn hơn 5 mm, bầu 3 ô, mẫu 3

3a Hoa cái mọc thành chùm thưa; cuống quả dài 8-10 mm

2 G laxiforum

3b Hoa cái mọc trên cành thành dạng spiciform; cuống quả ngắn hơn 5 mm

4a Núm nhuỵ hình lưỡi liềm có răng không đều, vòi nhuỵ dài 2,5-3 mm, hoặc dày và ngắn vào khoảng 0,5 mm

5a Vòi nhuỵ mỏng và dài, 2,5-3 mm, có thể dài đến 5 mm; không rụng; mép hạt không có rãnh và không có cánh

6a Đường kính quả khoảng 3 mm, nhẵn, có đốm đen Lá

kép với 5 lá chét hình elip 5 G microspermum

6b Đường kính quả 5-6 mm, có lông trắng, không có đốm đen Lá kép với 5-7 lá chét hình elip rộng

8a Cuống lá 3 cạnh, với cánh hẹp 8 G caulopterum

8b Cuống lá hình trụ, với vân dọc, không có cánh

9a Lá kép với 3-5 lá chét

10a Lá có cả hai bề mặt đều trơn nhẵn, có thể có lông dọc theo gân chính; có lông thưa ở các mấu; thuỳ tràng hình

mũi mác hẹp dài 2-3 mm 9 G laxum

10b Phiến lá và thân cây có nhiều lông; thuỳ tràng elip

thuôn dài khoảng 2 mm 10 G burmanicum

9b Lá kép với (3) 5-7 (-9) lá chét

11a Vỏ quả nhiều lông; cuống lá mập

11 G pentaphyllum

11b Vỏ quả nhẵn; cuống lá thanh mảnh

12a Cuống quả ngắn hơn 5 mm; lá có lông thưa

thớt hoặc dày đặc 11 G pentaphyllum

13a Hoa đơn tính cùng gốc; quả 3 cạnh rộng

Bảng 1.1: Bảng so sánh đặc điểm của các loài/chi có hình thái giống với các loài

trong chi Gynostemma

Lá kép,

1-3-5-7-9 lá chét, mép răng cưa

Lá kép, 7-9 lá chét,

Mọc đối diện với lá

thành cột ở trung tâm

chuỳ hay hình trụ cụt ở đỉnh,

ở đỉnh

Quả mọng, hình cầu, không tự

1.6 Thành phần hoá học một số loài trong chi Gynostemma Blume

Theo các tài liệu đã công bố trong nước và trên thế giới, thành phần hoá học

của chi Gynostemma gồm các nhóm chất chính là saponin, flavonoid, ngoài ra còn có

sterol, carotenoid, polysaccharid, alcaloid và acid hữu cơ

Các nghiên cứu về hoá học của chi Gynostemma Blume chủ yếu ở loài Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino

1.6.1 Saponin

Phần aglycol của các saponin thuộc nhóm dammaran, là một nhóm triterpenoid

có 4 vòng (triterpenoid tetracyclic) [39]

Hình 1.1 Cấu trúc khung dammaran

- Saponin trong Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino

Saponin là thành phần chính trong cây, còn được gọi là gynosaponin Hơn 100 saponins đã được phân lập và xác định trong cây bởi các nhà khoa học Nhật Bản và

Trung Quốc từ 1976 đến nay Trong đó 8 saponin là ginsenoside có trong Panax ginseng [39] Các ginsenosides trong G pentaphyllum chiếm gần 25% tổng

gynosaponin trong cây Phần còn lại hầu hết là các gypenosides được phát hiện chỉ

trong G pentaphyllum [35] Hàm lượng saponin toàn phần chiếm khoảng 2,4% dược

liệu khô Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hàm lượng saponin đạt tối đa khi cây đang ra hoa [47]

Khung cấu trúc dammaran của G pentaphyllum có 4 vòng và một mạch nhánh

có 8 carbon, 4 vòng gồm 3 vòng 6 cạnh và 1 vòng 5 cạnh [20] Phần aglycol có cấu trúc gần giống với cấu trúc aglycol của ginsenoside trong nhân sâm [26]

Các saponin trong G pentaphyllum (Thumb.) Makino đa số ở dạng vô định

hình [35], chỉ một số ít ở dạng tinh thể là gypenoside A [35], gynogenin II [36] và gynosaponin TN1 [39]

- Saponin trong Gynostemma longipes C Y WU

Đã phân lập được các saponin là glycoside A, glycoside B, gylonggiposide 1,

ginsenoside Rb1, gypenosid XLIX [41] và vinagynosteside A [19] từ G longipes

- Saponin trong Gynostemma burmanicum King ex Chakrav

Bằng phương pháp sắc ký cột đã phân lập được hai dammaran saponin, ký hiệu

là GB.Bu-02 và GB.Bu-01 Đã nhận dạng được GB.Bu-01 là: glucopyranosyl-20-O-[β-D-glucopyranosyl(1→6)-α-L-arabinopyranosyl]-3β,12β,20β-

3-O-β-D-trihydroxydammar-24-en; GB.Bu-02 là: glucopyranosyl]-20-O-[β-D-glucopyranosyl(1→6)-α-L-arabinopyranosyl]-

3-O-[β-Dglucopyranosyl(1→2)-β-D-3β,12β,20β-trihydroxydammar-24-en hay còn gọi là ginsenosid Rb2 [16]

- Saponin trong Gynostemma compressum X X Chen & D R Liang

Saponin là thành phần chính trong cây Giảo cổ lam quả dẹt Bốn saponin, gycomoside I-IV, được phân lập từ phần trên mặt đất của cây Cấu trúc các chất được xác định là 1,3,12,20(S),26-pentahydroxy-dammar-24(25)-en-20(S)-O--D-glucopyranosyl-(1-6)--D-glucopyranoside (gycomoside I); 1,3,12,20(S)-tetrahydroxy-dammar-24(25)-en-3-O--D-glucopyranosyl-20(S)-O--D-

glucopyranosyl-(1-6)--D-glucopyranoside (gycomoside II); 1,3,12,20(S), pentahydroxy-dammar-24(25)-en-20(S)-O--D-glucopyranoside (gycomoside III) và

26-1,3,12,20(S),26-pentahydroxy-dammar-24(25)-en-3-O-O--D-glucopyranosyl1-6--D-glucopyranoside (gycomoside IV) [27]

Hình 1.2 Công thức các dammaran saponin đã đƣợc phân lập từ G compressum

1.6.2 Flavonoid

Đã xác định được trong G pentaphyllum có ombuin, ombuoside, rutin [28],

quercitin [14], quercetin-di-(rhamno)-hexosid, quercetin-rhamno-hexosid, rhamno-hexosid và kaempferol-3-O-rutinosid [32]

kaempferol-1.6.3 Các thành phần khác

- Polysaccharid: Đã phân lập được heteropolysaccharid với thành phần chính là glucose, galactose, arabinose, rhamnose, xylose, [46] và một polysaccharid trung tính với các thành phần: mannose, glucose, arabinose, rhamnose, galactose, acid glucuronic [34]

- Sterol: được xác định có mặt trong G pentaphyllum và chiếm một lượng nhỏ

(khoảng 0,0001%) bao gồm ergostanol, sitosterol, stigmasterol [39]

- Carotenoid: đã xác định 25 carotenoid có mặt G pentaphyllum bằng phương

pháp HPLC, trong đó nhiều nhất là trans- Lutein, kế tiếp là cis- Lutein [33]

- Acid hữu cơ: đã xác định được sự có mặt của một số loại acid hữu cơ là acid malonic [28], acid benzoic, acid vanillic [3]

1.1.8 Tác dụng sinh học và công dụng một số loài trong chi Gynostemma

Blume

1.1.8.1 Tác dụng sinh học

- Tác dụng hạ đường huyết: Nhiều nghiên cứu in vivo được tiến hành để đánh

giá tác dụng này của Giảo cổ lam Các saponin được cho là gây nên tác dụng hạ đường huyết của Giảo cổ lam qua mô hình điều trị cho chuột đã được kích thích tăng đường huyết bởi streptozocin [39], các gypenosid cũng làm giảm glucose ngoại sinh trên chuột tiểu đường béo phì bằng cách cải thiện sự nhạy cảm của các receptor insulin

[37] Phanoside, một dammaran saponin phân lập từ G pentaphyllum được chứng

minh kích thích giải phóng insulin từ các tế bào đảo tuỵ và tăng dung nạp glucose [Norberg 2004]

- Tác dụng hạ lipid máu: Các nghiên cứu cho thấy sử dụng dịch chiết thô và các gypenosid ở các liều khác nhau đều có khả năng làm giảm mức triglycerid và cholesterol trên động vật thí nghiệm và người Những thành phần mang lại hoạt tính này được báo cáo là gynosaponin E, G, K, progypenosid A2, I, J, M, N và O [39]

- Tác dụng trên hệ tim mạch: G pentaphyllum có khả năng làm giảm áp lực

máu, giảm nhịp tim, tăng độ bền mạch ngoại vi, động mạch não và động mạch vành [38], chống huyết khối do kìm hãm sự tích tụ tiểu cầu và làm đẩy nhanh quá trình làm

tan cục máu đông [42] G compressum có tác dụng bảo vệ trên tổn thương gốc oxy

hoá tự do tại động mạch nền [45]

- Tác động lên tế bào ung thư: Một số saponin trong G pentaphyllum có hiệu quả trong việc điều trị các khối u [44], [48] Nhiều thử nghiệm in vitro và in vivo được

tiến hành chứng minh tác dụng này Các gypenosides ức chế hoạt động của acetyltransferase (NAT), sự hình thành AF-DNA và biểu hiện của gen NAT trong một

N-dòng tế bào ung thư cổ tử cung [25] Dịch chiết G pentaphyllum đảo ngược loạn sản

biểu mô trong ung thư túi má ở chuột hamster vàng [49] Gypenoside ức chế khả năng tăng sinh của các dòng tế bào gan người (Hep3B và HA22T) phụ thuộc vào liều bằng apoptosis [22]

1.1.8.2 Công dụng theo y học cổ truyền

Theo Võ Văn Chi, Giảo cổ lam có vị đắng, tính hàn, có tác dụng tiêu viêm, giải độc, chữa ho và long đờm [8]

Theo YHCT Trung Quốc, Giảo cổ lam có vị đắng, tính ôn trung, bổ âm, trợ dương và làm thuốc tăng cường sức đề kháng với vi khuẩn và các tác nhân gây viêm [21] Giảo cổ lam đã được sử dụng lâu đời ở Trung Quốc như một loại rau, một loại thức ăn từ khoảng 500 năm trước [24] Giảo cổ lam quả dẹt được người dân Quảng Tây (Trung Quốc) dùng chữa bệnh viêm gan và viêm phế quản mạn tính [50]

Ở Nhật Bản, Giảo cổ lam được dùng làm thuốc lợi tiểu, chữa tiểu ra máu, làm thuốc chống viêm và thuốc bổ [43]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Giảo cổ lam thu hái tại xã Nhất Hoà huyện Bắc Sơn tỉnh Lạng Sơn vào ngày 8 tháng 3 và ngày 18 tháng 4 năm

2018 Dược liệu sau khi thu hái được hong khô, sau đó cắt thành từng đoạn có kích thước dưới 5 cm và sấy ở nhiệt độ 60o

C trong tủ sấy có quạt thông gió Sau khi sấy khô, dược liệu được bảo quản trong túi kín, để nơi khô ráo, thoáng mát

Hình 2.1 Giảo cổ lam thu hái tại Bắc Sơn

a, Ảnh thực địa b, Tiêu bản cây cái c, Tiêu bản cây đực

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất

Các thuốc thử, dung môi, hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt Nam V

2.2.2 Dụng cụ

Nghiên cứu sử dụng các bộ dụng cụ tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội

2.2.3 Phương tiện và máy móc

- Chụp ảnh mẫu nghiên cứu bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon 60D

- Sấy dược liệu bằng tủ sấy WiseVen và tủ sấy Shellab

- Kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ 745T kết nối camera Nikon DS-Fi2 và máy tính

- Kính hiển vi Nikon Eclipse Ci-L kết nối camera Nikon DS-Fi2 và máy tính

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Cân phân tích hiện số Shimadzu AY 220

- Bể siêu âm Daihan Scientific

- Thu hồi dung môi bằng máy cất quay Buchi Rotavapor R-210

- Xác định độ ẩm dược liệu bằng máy xác định độ ẩm Ohaus (Mỹ)

- Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng tráng sẵn TLC Silica gel 60 F254

- Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa trong tủ sấy Viettronics ở nhiệt độ 110oC trong 15 phút

- Hệ thống sắc ký bản mỏng hiệu năng cao HPTLC: thiết bị phun mẫu Linomat

5 CAMAG, buồng chụp ảnh TLC Visualizer CAMAG

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Đặc điểm hình thái: Lấy mẫu có hoa quả, quan sát bằng mắt thường, qua kính hiển vi soi nổi và mô tả theo phương pháp mô tả phân tích [5] Mẫu tiêu bản được lưu tại Phòng Tiêu bản Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội với mã số tiêu bản HNIP/18522/18

- Xác định tên khoa học bằng phương pháp so sánh hình thái các mẫu dựa theo các mẫu tiêu bản trong các phòng tiêu bản (Phụ lục 3), các tài liệu về thực vật [23]

- Đặc điểm vi học:

+ Đặc điểm vi phẫu: Tiêu bản vi phẫu được thực hiện bằng phương pháp nhuộm kép Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu của thân, cuống lá và lá được mô tả phân tích theo nguyên tắc nghiên cứu tiêu bản vi phẫu [5] Tiêu bản được soi và chụp ảnh qua kính hiển vi kết nối camera ở các vật kính 4x, 10x và 40x

+ Đặc điểm bột: Dược liệu sau khi sấy khô đem xay nhỏ thành bột mịn, làm tiêu bản bằng phương pháp giọt ép, quan sát và chụp ảnh các đặc điểm của bột qua kính hiển vi ở các vật kính 10x và 40x [5]

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.2.1 Định tính bằng phản ứng hoá học đặc trưng

Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có mặt trong dược liệu theo phương pháp thường quy ghi trong tài liệu “Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc” [11]

Chuẩn bị mẫu: Dược liệu tươi thu hái về được hong khô, cắt nhỏ thành đoạn 5

cm, sấy trong tủ sấy có quạt gió ở nhiệt độ 60oC Sau khi sấy khô, dược liệu được xay thành bột thô, bảo quản trong túi kéo mép, để chỗ thoáng mát, khô ráo

2.3.2.2 Định tính bằng sắc kí lớp mỏng

- Nguyên liệu: Thân và lá Giảo cổ lam tươi thu hái về được hong khô, cắt nhỏ

thành đoạn 5 cm, sấy trong tủ sấy có quạt gió ở nhiệt độ 60o

C Sau khi sấy khô, dược liệu được xay thành bột thô, bảo quản trong túi kéo mép, để chỗ thoáng mát, khô ráo

- Chiết xuất:

+ Dịch chiết MeOH chiết theo phương pháp chiết xuất bằng siêu âm:

Cân khoảng 3,0 g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ, thêm 10 ml MeOH, chiết siêu âm 2 lần mỗi lần 20 phút, giữa 2 lần rút dịch chiết và thêm 10 ml MeOH mới Gộp dịch chiết 2 lần, để nguội, lọc lấy dịch, đem cô cách thủy còn 1 ml, dịch này được đem chấm sắc ký

+ Dịch chiết n-BuOH chiết theo phương pháp chiết xuất bằng n-BuOH bão hòa nước [2], [15]

Cân khoảng 2 g bột dược liệu, chiết hồi lưu cách thủy bằng 15 ml EtOH 70% trong 10 phút Lọc lấy dịch chiết EtOH 70%, bốc hơi cách thủy còn 5 ml, cho vào bình gạn lắc với 5 ml n-BuOH bão hòa nước Dịch chiết n-BuOH được bốc hơi cách thủy còn 1 ml đem chấm sắc ký

- Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký:

+ Pha tĩnh: Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 hoạt hóa ở nhiệt độ 110oC trong 1 giờ

+ Pha động: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để các chất được tách tốt nhất Bình sắc kí rửa sạch, sấy khô, lót một lớp giấy lọc cao gần miệng và kín 3 mặt thành trong của bình Rót hệ dung môi đã pha từ từ theo thành bình, đậy nắp, để yên cho dung môi bão hoà trong 15 phút

+ Chấm sắc kí: Đưa mẫu lên bản mỏng: mẫu được đưa lên bản mỏng bằng thiết

bị phun mẫu Linomat 5 Vị trí tiêm mẫu cách mép dưới bản mỏng 10 mm Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 7 mm Khoảng cách giữa 2 vết chấm cạnh nhau là 5 mm Độ rộng băng chấm là 7 mm Thể tích tiêm mẫu: 3µl

+ Triển khai sắc ký: Đưa bản mỏng đã chấm mẫu và làm khô vào bình sắc ký

đã bão hòa dung môi Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra và để khô tự nhiên trong tủ

hốt hoặc sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi

+ Phát hiện vết: Hiện vết bằng cách phun thuốc thử hiện màu Vanilin/H2SO4rồi sấy ở 110oC trong vài phút cho đến khi hiện màu Soi đèn tử ngoại ở bước sóng

254 nm và 366 nm trước khi phun thuốc thử Soi dưới ánh sáng trắng sau khi phun

thuốc thử

2.3.2.3 Định lượng saponin toàn phần

Định lượng saponin toàn phần trong dược liệu bằng phương pháp cân được ghi trong Dược điển Việt Nam V [7]

Cách tiến hành:

Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu (qua rây số 355) đã xác định độ ẩm cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet, chiết bằng cloroform đến khi dịch chiết không còn màu xanh Loại bỏ dịch chiết cloroform Sau đó chiết bằng methanol trong

2 giờ Lọc, lấy dịch lọc cô đến còn khoảng 20 ml, rót từ từ vào 100 ml aceton, khuấy đều, sẽ xuất hiện tủa Lọc lấy tủa, hòa tan tủa vào 50 ml nước nóng, đun cách thủy cho tan hết Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn, chiết saponin bằng n-BuOH 8 lần, mỗi lần 25

ml cho đến khi kiệt saponin Gộp dịch chiêt, cất thu hồi dung môi, cô trên cách thủy đến khô Sấy cắn ở 60°C đến khối lượng không đổi

Cân và tính hàm lượng saponin trong dược liệu theo công thức sau:

X (% ) =

× 100 × 100

Trong đó: a là khối lượng cắn khô saponin (g);

m là khối lượng dược liệu đem định lượng (g); d là độ ẩm dược liệu (%)

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Thực nghiệm và kết quả

3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu

Dây leo Tua cuốn mọc ở nách lá, hình chỉ mảnh, dài khoảng 7,5 cm, thường chia 2 nhánh ở đầu, đoạn chia nhánh khoảng 2 cm, có trường hợp không xẻ hoặc xẻ

ba Thân nhẵn, mảnh, có rãnh, mọc bò lan trên mặt đất, rễ thường mọc từ đốt ra Thân

5 cạnh, ít lông, lông thường tập trung ở đốt Lá so le, mỏng, kép lông chim 7 lá chét; cuống lá dài 4-8 cm; lá chét hình thoi hoặc trứng ngược; lá chét giữa kích thước 3-4,7

cm x 1,3-2,2 cm, lá chét bên nhỏ hơn lá chét giữa, cuống lá chét 2-5 mm, mép lá khía tai bèo nhỏ, số tai bèo 6-8, đỉnh có mũi nhọn ngắn; mặt dưới có lông ở gân, mặt trên lông rải rác ở phiến lá, lông đa bào Cây đơn tính khác gốc Hoa đực trong cụm hoa dạng chuỳ, mọc ở nách lá, cuống cụm hoa dạng chỉ 9-13 mm, cuống hoa 1,5-4 mm, lá bắc khoảng 1,5 mm; hoa thường mẫu 5, đường kính khoảng 1,5 mm, đài hoa và tràng hoa màu trắng hơi xanh, hình tam giác; 5 nhị hàn liền thành 1 cột, chiều dài cột khoảng 0,3 mm, bao phấn hình trứng Hoa cái thành cụm từ 1-6 hoa, thường mẫu 5, có trường hợp mẫu 4, 6; vòi nhuỵ từ 2-3, trên đỉnh chia 3; bầu 2 ô mỗi ô 1 noãn Quả dẹp; hình tam giác ngược 5-7 x 4-6 mm, vỏ rất mỏng; đỉnh có bao hoa và vòi nhuỵ, cuống quả dạng chỉ 1,1 - 1,8 cm Hạt nâu nhạt, hình tam giác ngược, đường kính đỉnh khoảng 3,5 mm, cả 2 mặt đều có nốt, mép kía tai bèo hoặc khía rãnh Hoa tháng 3-4, quả tháng 3-5 Có khi gặp đến tháng 9-10 (Hình 3.1, Hình 3.2)

1 Một đoạn thân mang lá, hoa, quả; 2 Cách mọc hoa; 3 Lá; 4, 5 Lông mặt dưới

và trên lá chét; 6 Tua cuốn; 7 Nụ; 8 Cụm hoa đực; 9, 10, 11 Hoa đực

Hình 3.1: Đặc điểm hình thái của cây đực

1 Một đoạn mang lá, hoa, quả; 2 Cách mọc lá, hoa; 3,4,5 Hoa cái;

6 Cụm quả; 7 Quả; 8,9 Mặt cắt ngang, dọc quả; 10 Hạt

Hình 3.2: Đặc điểm hình thái của cây cái

3.1.1.2 Tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Căn cứ vào đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu, đối chiếu với khoá phân loại và

đặc điểm các loài trong chi Gynostemma Blume [23], mô tả trong các tài liệu tham

khảo [3] [50], các tiêu bản của các phòng tiêu bản trên thế giới (Phụ lục 3) cùng với sự giúp đỡ của ThS Nghiêm Đức Trọng, giảng viên Bộ môn Thực vật - Trường Đại học

Dược Hà Nội, tên khoa học của mẫu nghiên cứu được xác định là Gynostemma compressum X X Chen & D R Liang, họ Bí (Cucurbitaceae) Loài này được gọi là

Giảo cổ lam quả dẹt

3.1.1.3 Đặc điểm vi học của Giảo cổ lam quả dẹt

 Vi phẫu thân

Mặt cắt ngang thân có hình 5 cạnh Từ ngoài vào trong gồm các phần: Ngoài cùng là biểu bì (1), gồm một lớp tế bào hình chữ nhật, phía ngoài phủ cutin bắt màu xanh Dưới sát lớp biểu bì là mô dày góc (2), gồm các tế bào hình đa giác nhỏ, dày lên

ở góc tế bào, tập trung ở 5 góc của thân Kế đến là mô mềm vỏ (3) gồm các tế bào thành mỏng hình trứng hoặc đa giác xếp đều đặn từ 3-4 hàng Tiếp theo là vòng mô cứng (4) gồm nhiều cung mô cứng xếp liên tiếp sát nhau, kích thước các cung lớn nhỏ khác nhau, mỗi cung gồm 4-5 hàng tế bào hình đa giác, thành dày hoá gỗ, kích thước không đều nhau, bắt màu xanh Bên trong là mô mềm (5) gồm 2-3 hàng tế bào thành mỏng, kích thước nhỏ hơn mô mềm ruột Tiếp đến là các bó libe-gỗ cấp 2 kích thước khác nhau xếp liên tiếp nhau vòng xung quanh thân cây, bó libe-gỗ dạng chồng kép với libe phía ngoài và trong (6) (8) bắt màu đỏ, các mạch gỗ (7) giữa 2 lớp libe bắt màu xanh Trong cùng là mô mềm ruột (9) gồm các tế bào hình đa giác, có thành mỏng (Hình 3.3)

1 Biểu bì; 2 Mô dày góc; 3 Mô mềm vỏ; 4 Mô cứng;

5 Mô mềm; 6,8 Libe; 7; Gỗ; 9 Mô mềm ruột

Hình 3.3 Đặc điểm vi phẫu thân cây Giảo cổ lam quả dẹt

 Vi phẫu lá

Phần phiến lá

Gân lá: Biểu bì trên (1) và dưới (8) cấu tạo bởi các tế bào tròn nhỏ, đều đặn xếp sít nhau, phía ngoài phủ cutin bắt màu xanh Trên lớp biểu bì dưới (phần gân mặt dưới lá) là lông che chở đa bào (9) Sát dưới biểu bì trên và dưới là các tế bào hình tròn kích thước không đều nhau, có thành dày, bắt màu đỏ, xếp lộn xộn tạo thành mô dày góc tập trung nhiều ở các vị trí lồi ra của gân lá tạo thành mô dày trên (2) và mô dày dưới (7) Mô mềm (6) là các tế bào thành mỏng hình tròn hoặc đa giác, kích thước không đều nhau, bắt màu đỏ Bó libe-gỗ tạo thành vòng cung lớn ở giữa gân lá Libe (4) gồm

2 lớp trên và dưới bắt màu đỏ, bao quanh gỗ Gỗ (5) ở giữa 2 lớp libe, gồm các mạch

gỗ nối tiếp nhau thành từng dãy (Hình 3.4)

Phiến lá: Biểu bì trên và biểu bì dưới giống như biểu bì trên và biểu bì dưới phần gân lá Sát biểu bì trên là một lớp mô giậu (3) gồm các tế bào hình chữ nhật xếp vuông góc với bề mặt lá (Hình 3.4)

1 Biểu bì trên; 2 Mô dày trên; 3 Mô giậu; 4 Gỗ; 5 Libe;

6 Mô mềm; 7 Mô dày dưới; 8 Biểu bì dưới; 9 Lông che chở

Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu lá Giảo cổ lam quả dẹt Phần cuống lá

Mặt cắt ngang cuống hơi lõm phía trên Từ ngoài vào trong lần lượt là: Ngoài cùng là một hàng tế bào biểu bì (1) gồm những tế bào hình chữ nhật xếp sít nhau, phía ngoài phủ cutin Dưới lớp biểu bì là các tế bào mô dày góc (2) hình đa giác kích thước không đều nhau, dày lên ở góc tế bào, bắt màu đỏ tập trung tại những chỗ lồi trên cuống Các bó libe-gỗ nằm rải rác trong mô mềm ruột thành hình vòng cung, libe (3)