Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cây dóng xanh

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất chính của bột dược liệu bằng phương pháp hóa học Bảng 3.4 Kết quả định lượng polyphenol trong dược liệu Dóng xanh tính

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LƯU THỊ QUỲNH TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA

CÂY DÓNG XANH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LƯU THỊ QUỲNH TRANG

LỜI CÁM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp

đỡ cũng như động viên quý báu từ các thầy giáo, cô giáo, gia đình và bạn bè

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn

Mạnh Tuyển - người đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng truyền đạt những kiến thức quý báu

giúp em hoàn thành khóa luận

Em xin phép gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc tới HVCH Lê Thị Thu Hà cùng

các thầy cô, các chị kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại bộ môn Dược học cổ truyền Mọi người đã luôn tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cám ơn tới các thầy cô giáo, giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội

đã tận tình chỉ bảo, giảng dạy, dìu dắt và truyền nhiệt huyết cho em trong suốt 5 năm học vừa qua

Cuối cùng, em xin gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận cũng như học tập

Do thời gian làm thực nghiệm và kiến thức của bản thân còn có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 6 năm 2018

Sinh viên

Lưu Thị Quỳnh Trang

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 CHI JUSTICIA 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Justicia 2

1.1.3 Thành phần hóa học 4

1.1.4 Tác dụng sinh học 7

1.1.5 Công dụng 8

1.2 CÂY DÓNG XANH 9

1.2.1 Đặc điểm thực vật 9

1.2.2 Phân bố 10

1.2.3 Công dụng 10

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLAVOVOID, POLYPHENOL, POLYSACCHARIDE 10

1.3.1 Định lượng flavonoid 10

1.3.2 Định lượng polyphenol 11

1.3.3 Định lượng polysaccharide 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 12

2.1.1 Nguyên liệu 12

2.1.2 Thiết bị, hóa chất 12

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 13

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học: 13

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật 13

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hóa học: 13

2.3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học: 13

2.3.2.3 Định lượng một số nhóm chất bằng quang phổ UV-Vis 19

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 25

3.1.1 Đặc điểm thực vật 25

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 27

3.1.2.1 Đặc điểm vi phẫu thân 27

3.1.2.2 Đặc điểm vi phẫu lá 27

3.1.2.3 Đặc điểm bột thân 29

3.1.2.4 Đặc điểm bột lá 30

3.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 31

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ 31

3.2.1.1 Định tính bằng phản ứng hóa học 31

3.2.1.2 Định tính một số nhóm chất bằng phương pháp SKLM 34

3.2.2 Định lượng flavonoid, polyphenol, polysaccharide trong dược liệu 37

3.2.2.1 Định lượng flavonoid 38

3.2.2.2 Định lượng polyphenol: 39

3.2.2.1 Định lượng polysaccharide 40

3.3 BÀN LUẬN 41

3.3.1 Đặc điểm thực vật 41

3.3.2 Thành phần hóa học 41

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất chính của bột dược

liệu bằng phương pháp hóa học

Bảng 3.4 Kết quả định lượng polyphenol trong dược liệu Dóng xanh

tính theo acid gallic

39

Bảng 3.5 Kết quả định lượng polysaccharid trong dược liệu Dóng xanh

tính theo glucose

40

Bảng 3.6 Kết quả định lượng một số nhóm chất trong dược liệu Dóng

xanh (Justicia ventricosa Wall.) thu hái tại Thường Tín, Hà

Nội

41

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 3.11 Đường chuẩn định lượng flavonoid trong dược liệu theo

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước ta là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có nhiều điều kiện thiên nhiên thuận lợi cho hệ động, thực vật phát triển phong phú và đa dạng, đặc biệt là nguồn tài nguyên cây thuốc Từ xa xưa, cha ông ta đã biết sử dụng cây cỏ để chữa bệnh, tuy nhiên việc sử dụng những dược liệu này chủ yếu theo kinh nghiệm của nhân dân từng địa phương Còn rất nhiều những cây thuốc chưa được nghiên cứu hoặc nghiên cứu chưa

có hệ thống Vì vậy, ngày nay, cùng với sự phát triển của tổng hợp hóa dược, việc nghiên cứu và phát triển thuốc từ nguồn gốc thảo dược cũng đang được quan tâm để góp phần nâng cao tính an toàn và hiệu quả điều trị

Cây Dóng xanh thường được sử dụng trong các bài thuốc dân gian trị đau xương, thấp khớp, Theo các tài liệu tìm được, ở Việt Nam và trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về loài cây này Để góp phần làm sáng tỏ về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Dóng xanh, từ đó góp phần định hướng nghiên cứu sâu hơn về loài cây này, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cây Dóng xanh” với các mục tiêu chính sau:

1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật:

- Lấy mẫu, mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học

- Mô tả đặc điểm vi học: vi phẫu, bột

2 Nghiên cứu về thành phần hóa học:

- Định tính sơ bộ thành phần hóa học trong cây bằng phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng

- Định lượng một số thành phần hóa học trong cây

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 CHI JUSTICIA

Các loài thuộc chi Justicia thường là cây bụi, sống hàng năm, vỏ thân sần sùi Lá

có cuống hoặc không, phiến lá thường nguyên, hiếm khi xuất hiện răng cưa

Hoa dạng cụm xim ngù (hiếm khi mọc đơn lẻ) thường mọc ở các kẽ lá, mọc thành chùm hoặc phân nhánh thành các cụm chùy hoa nhỏ hơn Lá bắc có hình thù đa dạng, hai

lá bắc thường giống nhau hoặc một lá nhỏ một lá to hơn Đài dài, tiền khai hoa 4 hoặc 5, đều hoặc không Tràng hình ống hình phễu, hoặc hình hoa môi, cánh hoa mọc hướng lên trên và xếp hình xoắn ốc Nhị 2, bao phấn 2, các bao phấn đều hoặc không đều, song song hoặc vuông góc với nhau Bầu nhụy 2 ô, mỗi ô có 1 noãn

Quả nang, 2 - 4 hạt, hạt hình dẹt, có cánh [20], [15]

Bảng 1.1 Một số loài Justicia phân bố ở Việt Nam [6]:

1 Xuân tiết, cang

mai

Nam, Đà Nẵng

5 Xuân tiết Nam bộ Justicia cochinchinensis R Ben Núi Dinh, núi Dày (Châu

Quảng Trị, Tây Ninh

11 Thuốc trặc, thanh

táo, tần cửu

13 Xuân tiết mập Justicia grossa C.B Clarke Lạng Sơn

16 Xuân tiết đuôi

chuột

18 Xuân tiết hao ẩm Justicia oreophila C.B Clarke Bình Phước

19 Xuân tiết hình

đờn

Giang

22 Xuân tiết bò, tước

sàng

23 Xuân tiết chẻ bốn Justicia quadrifaria T Anders Phú Khánh, Đồng Nai

0,025% [30] Phần chiết ethanol của lá Justicia extensa chứa justicidin A (2) và khoảng

1% justicidin P (3) [34] Một số arylnaphtalid lignan ở dạng dẫn xuất glycoside cũng

được chiết xuất, phân lập như: elenoside (4) từ phân đoạn ethyl acetat ở loài Justica

hyssopiflora, patentiflorin A (5) từ phân đoạn ethyl acetat loài Justica patentiflora [37],

tuberculatin được phân lập từ dịch chiết methanol của loài Justica ciliate, Justicia

bentonica… Ngoài ra, các lignan hỗn hợp khác cũng được tìm thấy trong các loài Justicia

như justiciresinol (6) từ phân đoạn ethyl acetat của loài Justicia glauca [32]; podophyllotoxin (7) và helioxanthin (8) từ loài Justicia flava [27]

(7) (8)

Ngoài lignan, các nghiên cứu về hóa học cho thấy sự có mặt của nhiều nhóm chất

có hoạt tính sinh học khác trong chi Justicia như coumarin, flavonoid, glycoside,

tecpenoid [15] Umbeliferon (9) và scopoletin (10) là hai coumarin được phân lập từ dịch

chiết ethanol của các loài Justicia pectoralis, Justicia procumbens [24]

Một số flavonoid được phân lập như apigenin (11), vitexin (12) từ dịch chiết

methanol của loài Justicia gendarussa [10]; 3’,4’- dihydroflavonol (13) từ dịch chiết

ethanol toàn cây của loài Justicia cataractae, kaempferitrin (14) từ dịch chiết chloroform

lá của loài Justicia spicigera [18]

Các glycoside được phân lập như: vasicine (14) với hàm lượng 0,85%, vasicinone

(15) 0,027% từ dịch chiết cồn phần lá của loài Justicia adhatoda [23], 10H-Quindoline từ

phân đoạn ethyl acetat phần lá, jusbetonin từ dịch chiết methanol Justicia betonica [31]

(14) (15)

Ngoài ra, các hợp chất steroid như stigmasterol, sitosterol, sitosterol-D-glucoside

cũng đã được phân lập từ lá và rễ của các loài Justicia gendarussa, Justicia flava [11]

1.1.4 Tác dụng sinh học

Các tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Justicia có liên quan đến một số hoạt

chất đã phân lập được Một số tác dụng sinh học nổi bật đó là:

- Kháng virus, kháng khuẩn:

Patentiflorin A - một lignan được phân lập từ loài Justicia gendarussa có khả năng chống sự sao chép ngược của virus HIV type 1, đem đến triển vọng mới trong lĩnh vực

nghiên cứu các thuốc điều trị HIV- AIDS [37] Helioxanthin - hợp chất được phân lập từ

loài Justicia flava - có hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của virus viêm gan B ở người [33]

Loài Justicia pectoralis có hoạt tính kháng khuẩn cao khi kháng được các vi khuẩn

thể hiện hoạt tính kháng sốt rét khi cho các test dương tính khi theo dõi sự tăng trưởng và

phát triển ấu trùng của muỗi Aedes aegypti giai đoạn IV Trong số các dịch chiết được thử nghiệm thì dịch chiết của Justicia pectoralis được nhận thấy là độc nhất đối với ấu trùng muỗi [13] Dịch chiết nước của cây Justicia adhatoda cũng được phát hiện có hiệu quả trong việc ức chế Mycobacterium tuberculosis, có thể giúp phát triển các loại thuốc mới

để kiểm soát bệnh lao [22]

- Tác dụng chống viêm:

Từ lá của Justicia gendarussa đã phân lập được vitexin - có tác dụng như một loại

thuốc chống viêm có hiệu lực cao, có hoạt tính kháng enzym 5 - lipoxygenase và cyclooxynase - 2 (COX - 2), giúp làm sáng tỏ những bài thuốc dân gian sử dụng loài này để điều trị các chứng viêm khớp, thấp khớp [28] Umbeliferon - hợp chất thuộc nhóm

coumarin - được phân lập từ phần chiết alcol của lá Justicia pectoralis có các hoạt tính

kháng viêm, giãn phế quản, do đó thường được dùng phổ biến trong điều trị viêm bệnh phế quản và các bệnh về đường hô hấp [24]

- Khả năng chống ung thư:

Một số loài thuộc chi Justicia có hoạt tính chống ung thư đối với các dòng tế bào ung thư khác nhau Dịch chiết ethanol của phần trên mặt đất của Justicia neesii có hoạt tính

chống ung thư kháng lympho bào bạch cầu P-388 ở chuột Dịch chiết methanol của

Justicia procumbens ức chế đáng kể sự tăng trưởng của lympho bào bạch cầu P-388

in vivo và có hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với dòng ung thư biểu mô người [14]

Diphyllin, justicidin A và tubeculatin là các lignan được phân lập từ Justicia ciliata, có

tác dụng chống ung thư đối với một số dòng tế bào ung thư người như ung thư biểu mô, ung thư cổ tử cung, ung thư đại trực tràng và ung thư vú… [17]

Ngoài ra, một số flavonoid được phân lập từ các loài Justicia có khả năng làm giãn mạch, ứng dụng trong điều trị các bệnh cao huyết áp, đái tháo đường, như

3’,4’- dihydroflavonol được phân lập từ loài Justicia cataractae Trong rễ của loài

Justicia adhatoda có chứa vasicol làm tim đập chậm lại song mạnh hơn, trị ho tốt, trị đau

cuống phổi [6]

1.1.5 Công dụng

Nhiều loài thuộc chi Justicia đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền của

một số nước để chữa các loại bệnh khác nhau Toàn bộ cây hoặc phần trên mặt đất thường được sử dụng để làm thuốc, hay dùng nhất là dịch chiết nước của lá cây, của bột

rễ cây, hoặc sử dụng kết hợp với các loài cây khác [15] Ở Việt Nam, đa phần các cây

thuộc chi Justicia được sử dụng để chữa các bệnh về xương khớp, các bệnh đường hô hấp hoặc bệnh ngoài da như: cây thanh táo (Justicia gendarussa) dùng lá hoặc cành cây giã

đắp vào các vết sưng hoặc sắc nước, nước còn nóng đắp vào chỗ sưng đau, đau thấp, đau

xương, hoặc có khi ngâm rượu uống chữa tê thấp [4] Cây cang mai (Justicia adhatoda)

được sử dụng để chữa gãy xương, trẹo chân, phong thấp, đau lưng [9]

Cây xuân tiết bò (Justicia procumbens) dùng ngoài chữa mụn nhọt và viêm mủ da Cây bạch hạc, có nơi gọi là kiên cò (Justicia nasuta) được nhân dân nhiều nơi dùng rễ

chữa bệnh hắc lào và một số bệnh ngoài da như bệnh chốc lở, bệnh mụn rộp loang vòng,

eczema mãn tính, bằng cách dùng rễ tươi hoặc khô giã nhỏ, ngâm rượu hoặc ngâm dấm trong 7 đến 10 ngày, rửa sạch các vết hắc lào rồi bôi thuốc này lên [4]

Cây cang mai (Justicia adhatoda) được được dùng để trị ho, viêm phế quản mạn

tính, hen suyễn, lao phổi bằng cách sử dụng lá và rễ sắc uống Lá còn được sử dụng trị thấp khớp và sát trùng Ở Trung Quốc, người ta dùng toàn cây để làm thuốc trừ đờm và trị

chứng rong kinh ở phụ nữ [9] Cây xuân tiết bò (Justicia procumbens) được dùng trị cảm

mạo phát sốt, sưng họng, trẻ em cam tích suy dinh dưỡng, lỵ, viêm ruột, viêm gan hoàng đản, sốt rét, bệnh đường tiết niệu, đái ra mật [6], [9]

ở đầu, quay mặt ra phía ngoài, kích thước 6 - 17 × 2 - 6 cm, lá có 6 - 8 gân

Cụm hoa bông, dài 5 - 10 cm, dày đặc các lá bắc xếp thành 4 dãy trên một bông, thường có 1 - 3 bông hoa trên một cụm Lá bắc có màu từ xanh lá đến nâu đỏ, hình bầu dục, có lông, kích thước 1 – 1,5 × 0,8 - 1 cm Đài 5 thùy, thùy hình mác, kích thước 3mm Tràng hoa màu trắng nhạt với sọc màu hồng tía ở mặt trên, kích thước 1,5 - 1,8 cm, mặt dưới lõm, cánh hoa nhọn ở phân cuống và tròn dần ở phần đầu Nhị hoa có chỉ nhị dài

6mm, nhẵn, có túi phấn hình oval Bầu nhụy có nhiều lông, kích thước 1,6 cm Quả nang,

1.2.2 Phân bố

Cây mọc nhiều ở Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam, Vân Nam) và các nước Đông Nam Á (Campuchia, Lào, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam) [20]

Tại Việt Nam cây mọc rải rác ở chỗ ẩm, gần suối trong rừng Phân bố chủ yếu ở

Cao Bằng, Ninh Bình, Quảng Trị, Bình Dương, Bình Phước [9]

1.2.3 Công dụng

Ở Trung Quốc, toàn cây dùng trị: đòn ngã, gãy xương, phong thấp đau nhức xương, đau ngang thắt lưng, viêm mủ da, áp xe vú Liều dùng 15 – 30 g dạng thuốc sắc, dùng ngoài giã đắp [9]

Tại Việt Nam, cây thường được trồng làm cây cảnh Lá được dùng giã lấy nước uống và bã đắp trị rắn cắn, còn dùng nấu nước trị đau răng

* Một số bài thuốc trong dân gian:

- Trị rắn cắn: dùng lá Dóng xanh 50 g giã nát thêm nước gạn uống Lá trầu không 10 g, nấu nước, rửa sạch vết cắn Vỏ cây Nóng 30 g, giã nhỏ đắp xung quanh vết cắn

- Gãy xương: Dóng xanh, Thanh táo, Chua me đất, Xuyên tiền tất cả đều dùng tươi, mỗi

vị 30 g, nghiền nát thêm ít rượu vang đắp xung quanh vết thương sau khi đã chỉnh lại tư thế của xương và có nẹp xương Hàng ngày thay thuốc

- Apxe vú: dùng lá tươi và thân cây giã ra với mật đường đỏ và bã rượu để đắp ngoài [9]

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLAVOVOID,

POLYPHENOL, POLYSACCHARIDE

1.3.1 Định lượng flavonoid

Để xác định hàm lượng flavonoid trong thực vật có rất nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp cân, GC - MS, TLC, HPLC, UV-Vis, IR

Phương pháp cân thường chỉ ứng dụng khi nguyên liệu giàu flavonoid và dịch chiết

ít tạp chất, ví dụ như định lượng rutin trong hoa hòe [7] Các phương pháp như GC - MS, TLC, HPLC thường cho kết quả khá chính xác nhưng tốn nhiều thời gian và máy móc phức tạp [35]

Vì vậy, phổ biến nhất là 2 phương pháp đo màu sử dụng thuốc thử AlCl3 Cả 2 phương pháp đều dựa trên nguyên tắc là có 3,5,3’,4’ hydroxyl có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại (Al3+) tạo phức màu vàng (theo phức oxychromon, oxycarbonyl hoặc 3’,4’ orthodioxyphenol) Trong đó, phương pháp 1 chỉ sử dụng Al3+ để tạo phức Al-flavonoid có màu vàng, có thể thêm hoặc không các muối acetat vào trong quá trình thực hiện, chất chuẩn so sánh thường là nhóm flavonol (quercetin, kaempferol,…) và đo quang

ở bước sóng cực đại 410 – 430 nm Phương pháp 2 có sử dụng thêm NaNO2 để nitrat hóa phức Al - flavonoid và dùng môi trường kiềm NaOH để chuyển màu phức từ vàng sang

đỏ Với phương pháp 2, chất chuẩn so sánh thường là catechin, luteolin và đo quang ở bước sóng 510nm [29]

1.3.2 Định lượng polyphenol

Có rất nhiều phương pháp đánh giá hàm lượng polyphenol (là các chất có một hoặc nhiều vòng thơm liên kết trực tiếp với một hoặc nhiều nhóm hydroxyl) như đo màu (sử dụng thuốc thử Folin - Ciocalteu, Folin Denis, chuẩn độ permanganate, ) hay HPLC, GC, Do sự phức tạp về mặt công thức của các hợp chất polyphenol cũng như nền mẫu thực vật không ổn định nên dường như không có phương pháp nào hoàn hảo cả Phổ biến nhất là phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin - Ciocalteu với cơ chế trao đổi electron giữa các polyphenol và thuốc thử Folin - Ciocalteu Phương pháp này thực chất là đánh giá hàm lượng chung của các hợp chất có tính chống oxy hóa trong thực vật (polyphenol, thiol, 1 số acid amin, …) nên có thể không phản ánh đúng hàm lượng polyphenol tổng số, nhưng bù lại, nó dễ thực hiện và có độ lặp lại cao đồng thời cũng một phần đánh giá tổng quát tính oxy hóa của thực vật, là một vấn đề đang được khoa học quan tâm [16]

1.3.3 Định lượng polysaccharide

Trong các phương pháp định lượng carbobohydrat, phương pháp đo màu là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất [26] Các chất lên màu được sử dụng sau khi thủy phân mẫu với acid sulfuric đặc thường là phenol hoặc anthrone Do cách tiến hành đơn giản, nhanh chóng và độ chính xác cao nên phương pháp đo màu sử dụng acid phenol - sulfuric

là phương pháp được sử dụng rộng rãi và phổ biến hơn so với sử dụng anthrone [38] [25]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên liệu

Đối tượng nghiên cứu: bộ phận (phần) trên mặt đất của cây Dóng xanh thu hái tại Thường Tín, Hà Nội Mẫu cây Dóng xanh được Thạc sĩ Nghiêm Đức Trọng, bộ môn Thực vật - trường Đại học Dược Hà Nội giám định tên khoa học

2.1.2 Thiết bị, hóa chất

 Thuốc thử, dung môi, hóa chất:

- Dung môi: ethanol, methanol, ethyl acetat, chloroform, nước;

- Thuốc thử: Mayer, Dragendorff, Bouchardat, Legal, Baljet, Libermann- Bouchard, diazo mới pha, dung dịch FeCl3 5%, gelatin 1% mới pha, chì acetat 10%, Fehling A, Fehling B, Lugol, Ninhydrin;

- Thuốc nhuộm: xanh methylene, đỏ son phèn;

- Chất chuẩn: quercetin (độ tinh khiết 98%, viện Dược liệu), acid gallic (độ tinh khiết 97%, viện Dược liệu), glucose (độ tinh khiết 99%, viện Dược liệu)

 Dụng cụ, thiết bị, máy móc:

- Bản mỏng silicagel GF 254 (Merck);

- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ, pipet, bình chiết, bình nón, ống đong, ống nghiệm;

- Máy cắt vi phẫu cầm tay, dao, dao lam;

- Kính hiển vi Labomed, máy ảnh kỹ thuật số Canon;

- Cân phân tích Sartorius TE214S, cân kỹ thuật, cân sấy ẩm Ohaus MB25;

- Nồi cách thủy, bếp điện;

- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Shimadzu UV 1800;

- Các dụng cụ khác: cối chày sứ, máy xay dược liệu, thuyền tán, rây,…

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

- Lấy mẫu, mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học

- Mô tả đặc điểm vi phẫu thân, lá

- Mô tả đặc điểm bột thân, lá

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học:

- Định tính các nhóm hợp chất trong cây bằng phản ứng hóa học và sắc kí lớp mỏng

- Định lượng một số thành phần trong cây

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật

- Quan sát, mô tả hình dạng, màu sắc, kích thước dược liệu bằng mắt thường và chụp ảnh

- Mô tả đặc điểm vi phẫu thân, lá: mẫu thân, lá được cắt vi phẫu bằng máy cắt cầm tay, tẩy nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép Quan sát cấu tạo vi phẫu qua kính hiển vi, tiến hành mô tả và chụp lại, theo tài liệu [8]

- Mô tả đặc điểm bột thân, lá: thân, lá của cây được nhặt riêng, sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 60℃, tán thành bột mịn bằng thuyền tán, rây qua rây mịn Soi tìm đặc điểm qua kính hiển vi, chụp ảnh

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu hóa học:

2.3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học:

Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu Dóng xanh bằng phản ứng hóa học đặc trưng theo các tài liệu [2], [7], [3]

a Định tính flavonoid, coumarin

Cân khoảng 10g dược liệu (đã được sấy khô và chia nhỏ) cho vào bình nón, thêm 50ml ethanol 90⁰ Đun cách thủy vài phút, lọc nóng Dịch lọc thu được dùng để tiến hành các phản ứng định tính flavonoid, coumarin

 Định tính flavonoid:

- Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda): Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm

một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg) Nhỏ từng giọt HCl đặc (3 - 5 giọt) Để yên 1

- 2 phút Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ

- Phản ứng với kiềm:

+ Phản ứng với NH3: Nhỏ 1 - 2 giọt dịch chiết lên một mảnh giấy lọc Sấy khô rồi để

lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút Phản ứng dương tính nếu màu vàng của vết dịch chiết tăng lên, có thể so sánh với giọt dịch chiết đối chứng

+ Phản ứng với dung dịch NaOH: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vài

giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện tủa vàng và khi thêm

1 ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch tăng lên

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vài

giọt dd FeCl3 5% Phản ứng dương tính nếu dung dịch xuất hiện màu xanh đen

- Phản ứng diazo hóa:

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10%, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thủy vài phút) Phản ứng dương tính xuất hiện màu đỏ

 Định tính coumarin:

- Phản ứng mở, đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết:

Đun cách thuỷ cả 2 ống đến sôi, để nguội, quan sát hiện tượng Nếu có coumarin sẽ quan sát thấy, ống 1 xuất hiện tủa đục màu vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong Thêm vào cả

2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml nước cất Lắc đều rồi quan sát thấy:

Ống 1: Dung dịch trong suốt

Ống 2: Tủa đục

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ trở lại tủa đục như ống 2

- Quan sát hiện tượng huỳnh quang:

Nhỏ lên một khoanh giấy thấm 2 vết dịch chiết cồn (mỗi vết 2-3 giọt dịch chiết) Nhỏ 2 - 3 giọt dung dịch NaOH 5% lên 2 vết dịch chiết Sấy nhẹ Che một vết dịch chiết trên giấy thấm bằng một miếng kim loại, rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút Bỏ miếng kim loại ra Quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại, nếu có coumarin sẽ thấy: phần không bị che

có huỳnh quang sáng hơn phần bị che Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên Sau vài phút cả 2 phần sẽ phát quang như nhau

- Phản ứng diazo hóa: cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, kiềm hóa bằng dung dịch

NaOH 10%, đun cách thủy đến sôi rồi để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ

b, Định tính saponin:

- Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm lớn 0,1 g bột dược liệu, thêm 5 ml

nước Lắc mạnh trong 5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu cột bọt bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin

- Phản ứng Libermann-Buchard: Cho khoảng 5 g bột dược liệu vào bình định mức

250ml, thêm 50 ml ethanol 70% Đun cách thủy đến sôi trong 30 phút Lọc nóng Thêm

10 ml HCl 10%, đun cách thủy sôi vài phút Để nguội, lắc với chloroform Gộp dịch chiết chloroform, đem cô đến cắn Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1 ml anhydride acetic, lắc đều cho tan hết Nghiêng ống 45⁰ Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng, nếu có vòng màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ kết luận có saponin triterpen, nếu vòng có màu xanh dương đậm hay xanh lá cây thì sơ bộ kết luận có saponin steroid

c, Định tính glycoside tim:

Cân khoảng 10 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250 ml Thêm 100 ml ethanol 25% rồi ngâm trong 24 giờ Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mỏ có dung tích 10 ml Thêm vào dịch chiết 3 ml chì acetat 30%, khuấy đều Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100 ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào

dịch chiết, khuấy đều, lọc lại, và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn dung tích 125 ml Lắc kỹ 2 lần với cloroform, mỗi lần với 8 ml Gạn dịch chiết cloroform vào cốc có mỏ, loại nước bằng natri sulfat khan

Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và đem bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:

- Phản ứng Liebermann- Bouchardat: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml anhydrid

acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống nghiệm 45º Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml

H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Phản ứng dương tính nếu ở giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên

có màu xanh lá

- Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90% Nhỏ 1 giọt

thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm thấy xuất hiện màu đỏ cam, so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn

- Phản ứng Baljet: Hoà tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho

tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (gồm 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm thấy xuất hiện màu đỏ cam, so sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn

đều cho tan hết cắn Nhỏ vài giọt dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic, lắc đều Nghiêng ống nghiệm 45o cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Nếu có glycoside tim thì mặt tiếp xúc ở giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng màu tím đỏ Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên sẽ có màu xanh lá

d, Định tính alcaloid

Cân khoảng 3 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml Thêm 20 ml dung dịch H2SO4 1N, đun sôi, để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn 100 ml Kiềm hóa dịch lọc bằng NH3 6N đến pH 9-10 Chiết alcaloid base bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Gộp dịch chiết cloroform, loại nước bằng Na2SO4 khan, dịch chiết lắc với H2SO4 1N 2 lần, mỗi lần 5 ml Gộp các dịch chiết nước thu được cho vào 3 ống nghiệm:

- Ống 1: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Mayer

Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm xuất hiện tủa trắng

- Ống 2: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Bouchardat

Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm xuất hiện tủa nâu

- Ống 3: 1 ml dịch chiết + 2 giọt thuốc thử Dragendorff

Phản ứng dương tính nếu ống nghiệm xuất hiện tủa vàng

e, Định tính antranoid

- Phản ứng Borntraeger:

Cân khoảng 2 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 10 ml

dung dịch H2SO4 1N Đun sôi khoảng 15 phút Lọc dịch chiết nóng qua giấy lọc vào bình gạn dung tích 50 ml Để nguội Thêm 5 ml cloroform, lắc nhẹ, gạn bỏ lớp nước, giữ lớp

cloroform để làm phản ứng

Lấy 1 ml dịch chiết cloroform, cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10% Lắc nhẹ Phản ứng dương tính nếu lớp nước chuyển sang màu đỏ sim

g, Định tính tanin, acid hữu cơ, acid amin, polysaccharide, đường khử:

Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thủy 20 phút, lọc nóng Dịch lọc để nguội làm các phản ứng định tính sau:

 Định tính tannin:

Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống nghiệm 1ml dịch chiết nước, làm các phản ứng sau:

- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Ống 1 thêm 2-3 giọt dung dịch gelatin 1% mới

pha Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng

- Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: Ống 2 thêm 2-3 giọt dd FeCl3 5% Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết màu hoặc tủa màu xanh đen

- Phản ứng với dung dịch chì acetat: Ống 3 thêm 2-3 giọt dung dịch chì acetat 10%

Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông

 Định tính acid hữu cơ:

Cho vào ống nghiệm lớn 3 ml dịch lọc, thêm 1 ít bột Na2CO3 vào ống nghiệm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện bọt khí bay lên

 Định tính acid amin

Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc, thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy vài phút Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu tím

 Định tính polysaccharide

Lấy 3 ống nghiệm lớn, cho vào mỗi ống:

Ống 1: 3 ml dịch lọc và 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 2: 3 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 3: 3 ml dịch lọc

Phản ứng dương tính nếu ống 1 có màu xanh đậm hơn ống 2 và ống 3

 Định tính đường khử:

Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch lọc thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml

Fehling B, đun cách thuỷ 10 phút Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa đỏ gạch

h, Định tính chất béo, sterol, caroten:

Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml Đổ ngập ether dầu hỏa, chiết hồi lưu trong 1 giờ, lọc thu lấy dịch lọc để làm các phản ứng định tính chất béo, sterol và carotene

 Định tính chất béo

Nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi

Phản ứng dương tính nếu có vết mờ trên giấy lọc

 Định tính sterol

Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách thuỷ bốc hơi dung môi đến khô Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 45º, nhỏ từ từ 3 giọt acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính nếu tại mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng tròn màu tím đỏ

 Định tính carotene

Cho vào chén sứ nhỏ 2 ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách thuỷ bốc hơi dung môi đến cắn Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện màu xanh lá

2.3.2.2 Định tính các nhóm chất chính bằng phương pháp SKLM:

Định tính SKLM mỗi nhóm chất cần tham khảo quy trình chiết dịch chấm sắc ký, các thuốc thử hiện màu đặc trưng và các hệ dung môi khai triển thường dùng cho nhóm chất đó để lựa chọn hệ dung môi phù hợp

Cách tiến hành chung:

 Chiết dịch chấm sắc kí theo từng yêu cầu định tính

 Hoạt hóa bản mỏng silicagel GF254 (Merck) ở 110℃ trong 1 giờ

 Bão hòa hệ dung môi khai triển trong 20- 30 phút

 Chấm riêng biệt lên bản mỏng dung dịch phân tích

 Sau khi triển khai, để khô bản mỏng trong không khí hoặc sấy nhẹ

 Phun các thuốc thử hiện màu đặc trưng cho các nhóm chất và sấy ở nhiệt độ phù hợp

Quan sát kết hợp chụp ảnh dưới ánh sáng UV 254 nm, 366 nm, ánh sáng trắng trước và sau khi phun thuốc thử

2.3.2.3 Định lượng một số nhóm chất bằng quang phổ UV-Vis

a, Định lượng flavonoid

Định lượng flavonoid tổng số trong dược liệu bằng phương pháp đo độ hấp thụ, kỹ thuật đường chuẩn

Flavonoid tạo phức được với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa Các flavonoid có 3,5,3’,4’ hydroxyl có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon, oxycarbonyl hoặc 3’,4’ orthodioxyphenol Dựa vào phản ứng flavonoid tạo phức màu với AlCl3, đo độ hấp thụ của các dung dịch thử và chuẩn sau phản ứng tạo phức ở cực đại hấp thụ vùng Vis [29]

 Tiến hành: Phương pháp tiến hành được tham khảo trong tài liệu [12], [21]

 Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử bột dược liệu khô: cân chính xác khoảng 1,5 g dược liệu khô (đã được xay nhỏ và xác định hàm ẩm) cho vào bình tam giác nút mài miệng rộng 50 ml Thêm khoảng 25 ml dung môi methanol, đậy nắp, siêu âm 20 phút, để nguội, lọc vào bình định mức 50 ml Tiếp tục thực hiện lần 2, 3 bằng 20, 10 ml dung môi Rửa dược liệu và giấy lọc bằng 1 ít dung môi, bổ sung thể tích vừa đủ 50 ml, lắc đều (Pha loãng k lần nếu thấy dung dịch sau phản ứng có màu quá đậm so với các dung dịch chuẩn)

 Thành lập đường chuẩn:

- Chuẩn bị dãy dung dịch quercetin chuẩn: cân chính xác 1,0 mg quercetin chuẩn cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan và định mức vừa đủ bằng methanol thu được dung dịch quercetin chuẩn gốc 1 mg/ml= 1000 ppm

- Dùng micro pipet chuyển các thể tích dung dịch chuẩn gốc quercetin trên vào bình định mức 1 vạch 10ml Pha loãng đến vạch bằng methanol và lắc đều

Bảng 2.1 Dãy dung dịch chuẩn quercetin

Dung dịch chuẩn

quercetin

Thể tích dung dịch quercetin chuẩn gốc (l)

Nồng độ của chất chuẩn pha