Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây giảo cổ lam mèo vạc

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUỲNH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM MÈO VẠC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2018... B

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ QUỲNH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM MÈO VẠC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ QUỲNH PHƯƠNG

Mã sinh viên: 1301326

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY GIẢO CỔ LAM MÈO VẠC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp dược sĩ này, em đã nhận được

sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, anh chị tại Bộ môn Thực vật –

Trường Đại học Dược Hà Nội, cũng như gia đình và bạn bè

Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Trần Văn Ơn

(Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội) – người thầy luôn quan tâm và

hướng dẫn em trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên và các

bạn sinh viên nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược

Hà Nội đã giúp đỡ em trong thời gian tham gia nghiên cứu khoa học và thực hiện

khóa luận tại bộ môn

Trong quá trình thực hiện khóa luận, em cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ và góp

ý nhiệt tình của ThS Phạm Tuấn Anh (Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học

Dược Hà Nội)

Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội đã

luôn tạo điều kiện, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận

tốt nghiệp dược sĩ

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè – những

người luôn động viên và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt quá trình học tập

và thực hiện khóa luận này

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018

Sinh viên

Lê Thị Quỳnh Phương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Gynostemma Blume 2

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố chi Gynostemma Blume 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân loại chi Gynostemma Blume 2

1.1.3 Thành phần hóa học trong chi Gynostemma Blume 9

1.2 Tổng quan về loài Gynostemma longipes C.Y.Wu 13

1.2.1 Đặc điểm hình thái 13

1.2.2 Thành phần hóa học 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Phương tiện nghiên cứu 16

2.2.1 Hóa chất 16

2.2.2 Phương tiện và máy móc 17

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 17

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Thực nghiệm và kết quả 27

3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 27

3.1.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 34

3.2 Bàn luận 37

3.2.1 Về đặc điểm thực vật 37

3.2.2 Về thành phần hóa học 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt

Gynostemma

High-performance liquid chromatography – Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Methanol n-Butanol Nhà xuất bản Sắc ký lớp mỏng

Số thứ tự Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng Thuốc thử

Ultra Violet – Tử ngoại

1 36Bảng 3.3 Kết quả phân tích sắc ký đồ dịch chiết n-BuOH khai triển với hệ

5 37Bảng 3.4 Kết quả định lượng saponin toàn phần trong mẫu nghiên cứu 37Bảng 3.5 So sánh đặc điểm cơ quan sinh dưỡng 38

DANH MỤC CÁC HÌNH

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Hình 1.1 Cấu trúc khung dammaran 9

Hình 1.2 Cấu trúc saponin thường gặp trong G pentaphyllum 10

Hình 2.1 Giảo cổ lam thu hái tại Mèo Vạc 16

Hình 3.1 Đặc điểm dạng sống của mẫu nghiên cứu 27

Hình 3.2 Đặc điểm thân của mẫu nghiên cứu 28

Hình 3.3 Đặc điểm lá của mẫu nghiên cứu 29

Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu thân của mẫu nghiên cứu 30

Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu cuống lá của mẫu nghiên cứu 31

Hình 3.6 Đặc điểm vi phẫu gân lá và phiến lá của mẫu nghiên cứu 32

Hình 3.7 Đặc điểm bột của mẫu nghiên cứu 33

Hình 3.8 Sắc ký đồ dịch chiết MeOH khai triển với hệ 1 35

Hình 3.9 Sắc ký đồ dịch chiết n-BuOH khai triển với hệ 5 36

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các loài thuộc chi Gynostemma Blume thuộc họ Bí (Cucurbitaceae) thường

được sử dụng trong dân gian để làm giảm cholesterol máu, điều hòa huyết áp, tăng cường miễn dịch, điều trị viêm phế quản, đau dạ dày mãn tính và chống viêm [35]

Bên cạnh loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino đang được nghiên cứu sâu và sử dụng rộng rãi trên thị trường, loài Giảo cổ lam bảy lá Gynostemma

longipes C.Y.Wu cũng đang là đối tượng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa

học Loài này hiện đã được nghiên cứu ở Việt Nam với tác dụng giảm cholesterol [2], chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan [18]

Qua khảo sát sơ bộ, một loài Giảo cổ lam mọc tại Mèo Vạc – Hà Giang có

nhiều đặc điểm thực vật giống với loài G longipes C.Y.Wu nhưng bên cạnh đó

cũng có một số đặc điểm khác biệt Cùng với đó, loài Giảo cổ lam Mèo Vạc được dùng với tác dụng chống lão hóa, chống mất cơ và tăng cường trí nhớ [50]

Nhận thấy sự khác biệt về đặc điểm thực vật và tác dụng sinh học, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học

của cây Giảo cổ lam Mèo Vạc” với 2 mục tiêu:

- Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu;

- Định tính các nhóm chất hữu cơ, định lượng nhóm chất chính trong mẫu nghiên cứu

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Gynostemma Blume

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố chi Gynostemma Blume

Theo các tài liệu [6], [11], [13], chi Gynostemma Blume được xếp vào họ Bí

(Cucurbitaceae) Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan [19], vị trí của

chi Gynostemma Blume được tóm tắt dưới đây:

định, phân bố từ vùng nhiệt đới châu Á tới Đông Á, từ Himalaya tới Nhật Bản,

Malaysia và New Guinea [24] Loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino là loài phổ

biến nhất, phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myanma, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [23] Ở Trung Quốc đã ghi nhận được 14 loài thuộc

Cây thảo, lâu năm, dây leo, nhẵn hoặc có lông Lá so le, kép chân vịt, 3 – 9

lá chét, hiếm khi đơn; phiến lá chét hình trứng – mác Tua cuốn chẻ đôi, ít khi đơn

3

Hoa đơn tính khác gốc, ít khi cùng gốc Cụm hoa chùm hoặc chùy, ở nách lá hoặc đầu cành; cuống của hoa có khớp; lá bắc con ở gốc Hoa đực: ống đài ngắn, 5 thùy; các mảnh hình mác hẹp; tràng màu xanh hoặc trắng, hình bánh xe, 5 thùy xẻ sâu; các thùy hình mác hoặc trứng – mác, mép cuộn vào trong khi là nụ; nhị 5, đính vào gốc của ống bao hoa; chỉ nhị ngắn, hàn liền; bao phấn đứng, hình trứng, 2 ô, nứt dọc, trung đới hẹp, nhưng không kéo dài; hạt phấn hình cầu hoặc elip, có gờ theo chiều dọc hoặc nhẵn, tự mở bằng lỗ; nhụy hoa tiêu giảm hay không có (tiêu giảm hoàn toàn) Hoa cái: đài và tràng giống hoa đực; nhị lép tồn tại; bầu hình cầu, 2 – 5 ô; vòi nhụy 3, hiếm khi 2, 4 hoặc 5, rời nhau; núm nhụy 2 hoặc 1, hình lưỡi liềm hoặc xẻ răng cưa không đều; noãn 2, treo trong mỗi ô Quả mọng hình cầu, hình dạng và kích thước giống hạt đậu, hoặc quả nang, có 3 thùy từ đỉnh, đỉnh có u hoặc

3 vòi nhụy dài tồn tại Hạt 2 hoặc 3, hình trứng rộng, dẹt, có nhú hoặc gai nhú

Đặc điểm một số loài trong chi Gynostemma Blume ở Việt Nam:

Ở Việt Nam, tính đến nay đã có 5 loài thuộc chi Gynostemma Blume được công bố là G pentaphyllum (Thunb.) Makino, G laxum (Wall.) Cogn [10], [11], [13], G longipes C.Y.Wu [33], G burmanicum King ex Chakrav và G

compressum X.X.Chen & D.R.Liang [4] Đặc điểm chính của các loài này được thể

hiện ở Bảng 1.1 [4]

4

Bảng 1.1 Đặc điểm chính của các loài trong chi Gynostemma Blume đã xác định ở Việt Nam

STT Đặc điểm G pentaphyllum G laxum G longipes G burmanicum G compressum

1 Đặc điểm

thân

Mảnh, có góc – rãnh, nhẵn hoặc có

lông tơ rải rác

Mảnh, nhiều nhánh, nhẵn hoặc có lông tơ rải rác

Có lông tơ Có góc – rãnh, có lông

mm

Cuống lá kép 1,5 – 4 cm; cuống lá chét (2 –)

Cuống lá kép 5 – 12

cm, nhẵn; cuống lá chét 3 – 5 mm

Bề mặt lá Có lông tơ hoặc

nhẵn

Nhẵn Mặt dưới có lông

xồm xoàm – lông

tơ ở gân, mặt trên

có lông tơ rải rác

Cả hai mặt có lông Mặt dưới có lông

lá chét bên hình trứng

Hình thoi – elip hoặc trứng ngược – mác

Lá chét giữa hình thoi Hình elip – trứng

Kích thước

lá

Lá chét giữa 3 – 12

× 1,5 – 4 cm; lá chét bên nhỏ hơn

Lá chét giữa 5 – 10 × 2 – 3 cm; lá chét bên 4 – 7

× 2 – 3,5 cm

Lá chét giữa 5 –

12 × 2 – 4,5 cm; lá chét bên nhỏ hơn

Lá chét giữa (6 –) 9 –

12 × 3 – 3,5 cm; lá chét bên 4 – 9 × 4 cm

Lá chét giữa 3,6 – 6,5

× 2 – 2,25 cm, lá chét bên nhỏ hơn, phía ngoài không đối xứng

Gốc lá Hẹp dần vào cuống Hình nêm rộng Hẹp dần vào Gốc lá chét giữa hình Hình nêm

Đỉnh lá chét giữa

có mũi nhọn ngắn, đỉnh lá chét bên tù

Có mũi nhọn ngắn Nhọn hoặc có mũi

nhọn

3 Cụm hoa Hình chùy, cuống

cụm hoa dạng chỉ,

10 – 15 (– 30) cm, rất nhiều nhánh

Hình chùy, mọc ở đầu cành hoặc nách lá, có lông tơ

Hình chùy, 10 –

20 cm, trục và nhánh có lông tơ

Hình chùy Hình chùy, mọc ở

nách lá, 2 – 5 cm, cuống cụm hoa dạng chỉ, 8 – 16 mm (đực),

Thùy đài hình thuôn, 0,75 × 0,3 mm, đỉnh tù

Thùy đài hình tam giác, 0,8 × 0,5 mm

Tràng Xanh lá cây nhạt

hoặc trắng; thùy tràng hình trứng – mác, 2,5 – 3 × 1

mm, 1 gân, đỉnh có

mũi nhọn dài

Vàng – xanh lá cây;

thùy tràng hình trứng – mác hẹp, 1,5 × 0,5 mm, nhẵn, 1 gân, nguyên, đỉnh có mũi nhọn

Trắng; thùy tràng hình trứng – mác hẹp, 2,5 × 1 mm,

có lông, 1 gân, đỉnh có mũi nhọn dài

Xanh lá cây; thùy ± hình elip, đỉnh nhọn hoặc có mũi nhọn

Xanh lục nhạt; đường kính ca 1,5 mm

sinh

5 Hoa cái Mọc thành cụm Mọc thành cụm Mọc thành cụm Chưa rõ Đơn độc hoặc từng

giác hẹp

– mác, 2 – 3 × 0,4

mm, đỉnh có đuôi – mũi nhọn

Bầu Hình cầu, 2 hoặc 3

2 ô, mỗi ô 1 noãn

Nhụy Vòi nhụy 3; núm

nhụy 2 thùy

Vòi nhụy 3, rời nhau, đỉnh chẻ 2

Vòi nhụy 2, núm nhụy 3 – 4 thùy

Vòi nhụy 2, rời; núm nhụy 2 thùy

vòi nhụy tồn tại Loại quả Không tự mở Không tự mở

Bề mặt quả Nhẵn hoặc có lông

cứng và lông tơ dày đặc

Màu sắc Đen khi trưởng

thành

Vàng – xanh lá cây Vàng – xanh lục Xanh

Kích thước 5 – 6 mm 8 – 10 mm 6 – 7 mm 5 – 10 mm 5 – 8 × 5 – 7 mm

Hình dạng Trứng – tim, dẹt;

gốc tim, đỉnh tù

Hình trứng rộng, dẹt, gốc tròn, đỉnh nhọn

Hình tim dẹt Hình tim Hình tam giác ngược

7

1.1.2.2 Phân loại chi Gynostemma Blume

Khóa phân loại chi Gynostemma Blume trong Thực vật chí Trung Quốc [24]

có 14 loài, được thể hiện như sau:

1a Quả nang hình chuông, khi chín tự mở theo đường quanh thân bầu nhụy,

có 3 thùy; 3 (– 5) vòi nhụy tồn tại, dạng mỏ dài

2a Hoa cái đơn độc hoặc mọc thành từng đôi một ở nách lá, cuống

hoa nhỏ dài 3 – 4 cm; bầu 5 ô, mẫu 5 1 G pentagynum

2b Hoa cái mọc nhiều trên cành hoặc dạng chùm ở nách lá hoặc đầu cành, cuống hoa ngắn hơn 5 mm; bầu 3 ô, mẫu 3

3a Hoa cái mọc thành chùm thưa; cuống quả dài 8 – 10 mm

6a Đường kính quả khoảng 3 mm, nhẵn, có đốm

đen Lá kép với 5 lá chét hình elip 5 G microspermum

8a Cuống lá 3 cạnh, với cánh hẹp 8 G caulopterum

8b Cuống lá hình trụ với vân dọc, không có cánh

9a Lá kép 3 – 5 lá chét

10a Lá có cả hai bề mặt đều trơn nhẵn, có thể có lông dọc theo gân chính; có lông thưa ở các mấu; thùy

tràng hình mũi mác hẹp dài 2 – 3 mm 9 G laxum

10b Phiến lá và thân có nhiều lông; thùy tràng

hình elip thuôn dài khoảng 2 mm 10 G burmanicum

9b Lá kép (3) 5 – 7 (– 9) lá chét

11a Vỏ quả nhiều lông; cuống lá mập………

11 G pentaphyllum

11b Vỏ quả nhẵn; cuống lá thanh mảnh

12a Cuống quả ngắn hơn 5 mm; lá có lông

thưa thớt hoặc dày đặc 11 G pentaphyllum

12b Cuống quả dài 7 – 25 mm

13a Hoa đơn tính cùng gốc; quả 3

cạnh rộng hoặc dẹt 12 G guangxiense

13b Hoa đơn tính khác gốc; quả hình cầu hoặc hình tam giác ngược

1.1.3 Thành phần hóa học trong chi Gynostemma Blume

1.1.3.1 Saponin

Hình 1.1 Cấu trúc khung dammaran

Thành phần hóa học chính và được nghiên cứu nhiều nhất ở chi Gynostemma Blume là saponin Các saponin có mặt trong chi này thuộc nhóm dammaran (Hình

1.1) Dammaran là một nhóm saponin triterpenoid tetracyclic, trong đó cấu trúc phần genin của saponin triterpenoid có 30 carbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen nối với nhau theo quy tắc đầu đuôi tạo thành 4 vòng: A, B, C (6 cạnh), D (5 cạnh)

10

và một mạch nhánh 8 carbon Đại diện cho nhóm này là các saponin của Nhân sâm

(Panax ginseng C.A Meyer, họ Nhân sâm – Araliaceae) và một số dược liệu khác như hạt Táo (Ziziphus jujuba Mill., họ Táo – Rhamnaceae), Rau đắng biển (Bacopa

monnieri (L.) Wettst., họ Hoa mõm chó – Scrophulariaceae),… [9]

Các saponin trong chi Gynostemma Blume thường được đặt tên là các gypenosid hay gynosaponin Trên 100 gypenosid đã được phân lập từ loài G

pentaphyllum (Thunb.) Makino [40], trong đó có 10 saponin có trong chi Panax là

ginsenosid-Rb2 [29], -Rg3 [39], -Rc [37], -Rb1, -Rb3, -Rd, -F2 [42], malonylginsenosid-Rb1, -Rd [32] và Rf (proto-panaxatriol) [37] Các ginsenosid này chiếm 25% saponin toàn phần trong cây và là bằng chứng đầu tiên cho các ginsenosid được tìm thấy ngoài họ Nhân sâm (Araliaceae) Hình 1.2 cho thấy cấu

trúc saponin thường gặp trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino [40]

-CH 3 -CH 2 OH -CHO

-H -OH

=O

-OH -O-đường

-CH 3 -CH 2 OH -CH 2 O-glucose -OH

a – i

Hình 1.2 Cấu trúc saponin thường gặp trong G pentaphyllum

Các gypenosid khác bao gồm gylongiposid I, gypenosid XLVIII, LXIX và

các chất

19-oxo-3β,20S,21-trihydroxy-25-hydroperoxydammar-23-en-3-O-α-L-rhamnopyranosyl (1→2)-[β-D-xylopyranosyl (1→3)]-α-L-arabinopyranosid;

11

3β,12β,23S,25-tetrahydroxy-20S,24S-epoxydammaran 3-O-[β-D-xylopyranosyl (1→2)]-β-D-glucopyranosid; 3β,20S,21-trihydroxy-25-methoxydammar-23-en-3-

O-α-L-rhamnopyranosyl (1→2)-[β-D-xylopyranosyl

3-O-β-D-dihydroxydammaran-3-yl O-β-D-glucopyranosyl (1→2)-β-D-xylopyranosid; (20S,24S)-20,24-epoxy-12,25-dihydroxydammaran-3-yl O-β-D-glucopyranosyl

Những loài khác trong chi Gynostemma Blume cũng phân lập được một số

saponin như ginsenosid-Rb2; 3-O-β-D-glucopyranosyl 20-O-[β-D-glucopyranosyl (1→6)-α-L-arabinopyranosyl]-3β,12β,20β-trihydroxydammar-24-en từ loài G

burmanicum King ex Chakrav [16]; gycomosid I

(1β,3β,12β,20(S),26-pentahydroxydammar-24(25)-en-20(S)-O-β-D-glucopyranosyl glucopyranosid) từ G compressum X.X.Chen & D.R.Liang [26]; ginsenosid-Rh1, -

(1→6)-β)-D-F1, -Rc, -Rg2, -Rd, gypenoside XLVI và amarantholidosid IV từ G yixingense

(Z.P.Wang & Q.Z.Xie) C.Y.Wu & S.K.Chen [44]; 6 dammaran glycosid trong đó

có 5 saponin có nhóm –COOH ở vị trí C-29 từ G cardiospermum Cogn ex Oliv

[49]

12

1.1.3.2 Flavonoid

Ngoài saponin, flavonoid cũng là một trong những nhóm chất chính trong

các loài thuộc chi Gynostemma Blume nhưng ít được nghiên cứu hơn

- Nhiều nghiên cứu cho thấy sự có mặt của một số flavonoid như rutin [27], ombuosid [27], [29], isorhamnetin, quercetin [45], ombuin [45], [47], vitexin [48]

trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino

- Những flavonoid này (trừ vitexin) cũng đã được phân lập từ G laxiflorum C.Y.Wu & S.K.Chen [31]

- Từ dịch chiết cồn của cây G cardiospermum Cogn ex Oliv., người ta đã

phân lập được 3 flavonoid là rutin, kaempferol và quercetin [49]

1.1.3.3 Các chất khác

- G pentaphyllum (Thunb.) Makino được xác định là không chứa alcaloid [22] nhưng G burmanicum King ex Chakrav lại cho phản ứng dương tính với

thuốc thử chung của alcaloid [1]

- Một nghiên cứu của Huang và cộng sự đã phân lập và xác định được 15

loại clorophyll và dẫn chất từ G pentaphyllum (Thunb.) Makino, bao gồm:

pheophytin a và a′, chlorophyll a và a′, hydroxypheophytin a và a′, pyropheophytin

a, hydroxychlorophyll a, pheophytin b và b′, chlorophyll b và b′, hydroxychlorophyll b, hydroxypheophytin b và b′ [30]

- Tổng cộng có 25 carotenoid trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino đã được xác định bằng HPLC, trong đó nhiều nhất là trans-lutein, sau đó đến cis-

lutein [34]

- Sterol trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino bao gồm các loại

β-sitosterol và isofucosterol [38], stigmasterol, chodrillasterol, spinasterol, ergostanol [43]

13

- Bằng phương pháp điện di mao quản, người ta đã xác định thành phần

polysaccharid tan trong nước của G pentaphyllum (Thunb.) Makino là một

heteropolysaccharid không tinh bột điển hình có glucose là monosaccharid chính (23,2%) bên cạnh các monosaccharid khác như galactose, arabinose, rhamnose, acid galacturonic, xylose, mannose và acid glucuronic [46]

- Một số chất khác được tìm thấy trong chi Gynostemma Blume như vitamin,

muối khoáng, acid amin [25], acid hữu cơ (acid malonic [27]), acid béo [47] (acid

palmitic [45]), vomifoliol, cholesta-7,22(E)-dien-3-on, cholesta-7,22(E)-dien-3-3β-ol [45], allantion [48], linalool 3-O-β-D-glucopyranose

24-ethyl-5α-[49]

1.2 Tổng quan về loài Gynostemma longipes C.Y.Wu

Tên thường dùng: Giảo cổ lam bảy lá

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Cây dây leo Thân cành mảnh, có 5 góc hình ngũ giác; mỗi gióng dài 10 – 20

cm, đường kính 0,2 – 0,3 cm, lông dày ở mấu Lá kép chân vịt Cuống lá dài 7 – 10

cm, rộng 2,5 – 3,5 cm; gốc hình nêm; mép lá răng cưa to có gai nhỏ ở đỉnh răng; ngọn lá nhọn thuôn dài; mặt trên có lông cứng rải rác, mặt dưới nhẵn, gân bên 9 cặp hình lông chim, có lông tơ thưa Lá bên nhỏ dần Tua cuốn mảnh, rẽ đôi muộn Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực kép 3 lần chùm, mảnh, dài khoảng 5 – 15 cm Hoa đực rất nhỏ, tỏa tia màu trắng Cuống 2,3 – 2,5 mm Đài 5 rời, hình tam giác, dài 0,5 – 0,7 mm Tràng 5, hình tam giác, rời, dài 1,2 – 1,4 mm, rộng 0,8 – 1 mm, ngọn thường quăn Nhị 5, chỉ nhị dính thành một cột ở trung tâm, phần trên tách 5, hình sao; bao phấn 2 ô, hướng ngoài Cụm hoa cái kép 3 lần chùm, dài 10 – 18 cm Hoa cái cuống dài 1,8 – 2,0 mm, đài và tràng giống như hoa đực, bộ nhụy cấu tạo bởi 3 lá noãn hàn liền, 2 – 3 vòi nhụy mập, rời, núm nhụy chia 2 – 3; bầu giữa, 3 ô, mỗi ô có 1 hạt Quả mọng, khi chín màu vàng xanh, đường kính 6 – 7 mm, cuống

14

quả dài 8 – 15 mm Hạt hình tim, rộng 3 – 4 mm, dài 3 – 4 mm, màu xám nhạt, cạnh hạt lõm vào phía trong, viền hạt có răng cưa, 2 mặt có hoa văn dạng cục

Đặc điểm sinh thái: ra hoa vào tháng 8 – 10, quả tháng 11 – 12

Ở Việt Nam, Giảo cổ lam bảy lá phân bố ở một số tỉnh như Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng [33]

1.2.2 Thành phần hóa học

Các nhóm chất xuất hiện trong G longipes C.Y.Wu bao gồm saponin,

flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, sterol và polysaccharid, trong đó saponin là thành phần chính [20]

Năm 1993, Sun và cộng sự đã phân lập được 2 saponin từ G longipes

C.Y.Wu là gylongosid A và B có cấu trúc lần lượt là:

(18-norfurostan-19-al,23-hydroxy-4,4,8,14,24-pentamethyl-3-[(2-O-β-D-xylopyranosyl β-D-xylopyranosyl) oxy]-(3β,16ξ,21β)-(9CI)) và (18-norfurostan-19-al,3-[(O-6-deoxy-β-L- mannopyranosyl (1→2)-O-β-D-xylopyranosyl (1→2)-β-D-xylopyranosyl)oxy)-23- hydroxy-4,4,8,14, 24-pentamethyl-(3β,16ξ,21β)-(9CI)) [41]

Sau đó 4 năm, Guo và cộng sự phân lập được 3 saponin nhân dammaran từ

G longipes C.Y.Wu, trong đó có một chất mới là gylongiposid I có cấu trúc là

19-oxo-3β,20(S),21-trihydroxydammar-24-en-3-O-{[α-L-rhamnopyranosyl (1→2)]

[β-D-xylopyranosyl (1→3)]} α-L-arabinopyranosid và hai chất đã được biết đến trước

đó là gypenosid XLIX và ginsenosid Rb1 [28]

Ở Việt Nam, có một vài nghiên cứu phân lập và tinh chế được saponin nhưng chưa xác định được cấu trúc mà mới chỉ nhận diện trong công thức có 2 – 3 đường [15], [17]

Những nghiên cứu đã phân lập và xác định được cấu trúc saponin có thể kể

đến như: nghiên cứu phân lập vinagynosteside A có cấu trúc

(20S,24R)-3β,12β,25-trihydroxy-20,24-epoxydammaran 3-O-{[α-L-rhamnopyranosyl

(1→2)][α-L-15

rhamnopyranosyl (1→3)][β-D-xylopyranosyl (1→6)]}-β-D-glucopyranosid [20],

nghiên cứu phân lập 2 saponin nhân dammaran mới gylongiposide II-III và 1 hợp

chất đã được biết đến là

23S)-3β,20ξ,21ξ-trihydroxy-19-oxo-21,23-epoxydammar-24-en 3-O-α-L-rhamnopyranosyl (1→2)-[D-xylopyranosyl

(1→3)]-α-L-arabinopyranosid [21] của nhóm tác giả trường Đại học Dược Hà Nội

Bên cạnh những nghiên cứu phân lập, một nghiên cứu của Huang và cộng sự

nhằm định lượng saponin trong 3 loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino, G

pubescens (Gagnep.) C.Y.Wu và G longipes C.Y.Wu đã được tiến hành Kết quả

cho thấy hàm lượng saponin cao nhất vào tháng 7, thấp nhất vào thời kì tạo hạt Khi

so sánh 3 loài thì hàm lượng saponin trong G longipes C.Y.Wu là thấp nhất, G

pentaphyllum (Thunb.) Makino là cao nhất [51]

16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Phần trên mặt đất của cây Giảo cổ lam thu hái tại thị trấn Mèo Vạc, huyện Mèo Vạc, tỉnh Hà Giang vào ngày 24 tháng 01 và ngày 06 tháng 04 năm 2018

Mẫu tiêu bản được làm bằng phương pháp khô [7], lưu trữ tại Phòng tiêu bản

Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP) Mã hiệu tiêu bản HNIP/18524/18

Dược liệu sau khi thu hái được hong khô, sau đó cắt thành từng đoạn có kích thước dưới 10 cm và sấy ở nhiệt độ 60oC trong tủ sấy tĩnh Sau khi sấy khô, dược liệu được bảo quản trong túi kín, để nơi khô ráo, thoáng mát

Hình 2.1 Giảo cổ lam thu hái tại Mèo Vạc

Chú thích: 1 Mẫu ngoài thực địa; 2 Mẫu tiêu bản

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

- Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

- Dung môi chiết xuất: cloroform, ether dầu hỏa, EtOH 96%, MeOH, BuOH, nước cất

n-17

- Dung môi dùng cho SKLM: acid acetic, cloroform, dicloromethan, EtOAc, MeOH, n- BuOH, nước cất

- Thuốc thử Vanilin/H2SO4 pha trong EtOH 96%

2.2.2 Phương tiện và máy móc

- Chụp ảnh mẫu nghiên cứu bằng máy ảnh kỹ thuật số Sony ILCE-6000

- Sấy dược liệu bằng tủ sấy WiseVen và tủ sấy Shellab

- Kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ 745T kết nối camera Nikon DS-Fi2 và máy tính

- Kính hiển vi Nikon Eclipse Ci-L kết nối camera Nikon DS-Fi2 và máy tính

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Cân phân tích hiện số Shimadzu AY 220

- Bể siêu âm Daihan Scientific

- Thu hồi dung môi bằng máy cất quay Buchi Rotavapor R-210

- Xác định độ ẩm dược liệu bằng máy xác định độ ẩm Ohaus (Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh Eppendorf Centrifuge 5415 R

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

- Đặc điểm hình thái: Quan sát bằng mắt thường, qua kính hiển vi soi nổi và

mô tả theo phương pháp mô tả phân tích [7]

- Đặc điểm vi học:

18

+ Đặc điểm vi phẫu: Tiêu bản vi phẫu được thực hiện bằng phương pháp nhuộm kép Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu của thân và lá được mô tả phân tích theo nguyên tắc nghiên cứu tiêu bản vi phẫu [7] Tiêu bản được soi và chụp ảnh qua kính hiển vi kết nối camera ở các vật kính 4x, 10x và 40x

+ Đặc điểm bột: Dược liệu sau khi sấy khô đem xay nhỏ, làm tiêu bản, quan sát và chụp ảnh các đặc điểm của bột qua kính hiển vi ở các vật kính 10x và 40x

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học

Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có mặt trong dược liệu theo phương pháp thường quy theo các tài liệu “Thực tập Dược liệu” và “Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc” [5], [12]

a Định tính đường khử tự do, acid amin, acid hữu cơ

Cho 5 g bột dược liệu vào cốc có mỏ, thêm 30 ml nước cất, đun sôi trong 7 phút Để nguội, lọc lấy dịch lọc đem làm phản ứng định tính

- Định tính acid amin:

Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ Nhỏ vài giọt TT Ninhydrin 3% vào, sau đó đun cách thủy vài phút Xuất hiện màu xanh tím thì kết luận phản ứng dương tính

- Định tính acid hữu cơ:

Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm ít tinh thể Na2CO3 Quan sát nếu thấy có bọt khí nổi lên thì kết luận phản ứng dương tính

- Định tính đường khử tự do:

Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ Thêm 0,5 ml TT Fehling A và 0,5 ml

TT Fehling B Đun sôi cách thủy vài phút Xuất hiện tủa màu đỏ gạch thì kết luận phản ứng dương tính

b Định tính alcaloid

19

Cân khoảng 3 g bột dược liệu cho vào bình cầu 500ml Thêm 15 ml dung dịch acid sulfuric 1N Chiết hồi lưu trong 1 giờ, để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 60 ml Kiềm hóa dịch lọc bằng amoniac đến pH 9 – 10 Chiết alcaloid base bằng cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natri sulfat khan Lấy dịch chiết cloroform bên trên lắc với dung dịch acid sulfuric 1N 3 lần, mỗi lần 5 ml Gộp các dịch chiết nước có màu vàng, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 ml Tiến hành làm cùng lúc các ống chứng (không chứa dịch chiết) với các ống thử

- Ống 1: Thêm 2 – 3 giọt TT Bouchardat

- Ống 2: Thêm 2 – 3 giọt TT Dragendorff

- Ống 3: Thêm 2 – 3 giọt TT Mayer

Quan sát thấy ống thử có tủa và có màu đậm hơn ống chứng thì kết luận

phản ứng dương tính

c Định tính anthranoid

- Phản ứng Borntrager: Định tính anthranoid toàn phần

Lấy 1 g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ Thêm 5 ml dung dịch H2SO4 1N, đun trực tiếp cho đến sôi Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc vào bình gạn 60 ml

Để nguội dịch lọc Thêm 5 ml cloroform, lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước, giữ lớp cloroform để làm phản ứng

+ Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1 ml dung dịch NH3 Lắc nhẹ Nếu lớp nước có màu đỏ sim thì kết luận phản ứng dương tính Nếu lớp cloroform màu vàng, thêm vài giọt NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp cloroform

mất màu, lớp nước đậm màu

+ Lấy 1 ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ khác Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10% Lắc nhẹ Nếu lớp nước có màu đỏ sim thì kết luận phản ứng dương tính

- Phản ứng vi thăng hoa:

20

Trải bột dược liệu thành một lớp mỏng trong chén nung, đốt nhẹ trên đèn cồn

để loại nước Đậy chén bằng một miếng lam kính, đặt miếng bông tẩm nước ở trên

để làm lạnh, đun nóng trong khoảng 5 – 10 phút Lấy lam kính ra để nguội Soi kính hiển vi nếu có anthranoid sẽ thấy tinh thể màu vàng, nhỏ dung dịch NaOH lên

lam kính, dung dịch sẽ có màu đỏ

d Định tính chất béo, caroten, sterol

Cho 3 g dược liệu vào bình nón 100 ml Sau đó đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm 24 giờ, lọc qua giấy lọc Dịch lọc được đưa làm các phản ứng

- Định tính caroten:

Cho 2 ml dịch lọc vào một ống nghiệm nhỏ, bốc hơi cách thủy đến cắn Thêm 4 giọt acid sulfuric đặc Nếu dung dịch có màu vàng nâu, không có màu xanh thì kết luận phản ứng dương tính

- Định tính chất béo:

Nhỏ một giọt dịch lọc lên tờ giấy lọc, để bay hơi hết dung môi Quan sát vết dịch chiết Nếu trên giấy thấm để lại vết loang thì kết luận phản ứng dương tính

- Định tính sterol: Phản ứng Liebermann:

Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, bốc hơi cách thủy đến cắn Thêm 1

ml anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn Đặt nghiêng ống nghiệm 45o Thêm từ

từ 0,5 ml acid sulfuric đặc theo thành ống Nếu có vòng tím đỏ ở mặt tiếp xúc giữa

2 lớp chất thì kết luận phản ứng dương tính và kiểm tra độ bền của màu

e Định tính coumarin

Cân 5 g bột dược liệu cho vào bình cầu 500 ml Thêm 30 ml EtOH 90% Chiết hồi lưu trong 30 phút Để nguội, lọc lấy dịch lọc Dịch lọc thu được đem thực hiện các phản ứng định tính

- Phản ứng mở đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml dịch chiết

+ Ống 1: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

21

+ Ống 2: Để nguyên

Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi Sau đó để nguội rồi quan sát

+ Ống 1 có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng

+ Ống 2 trong

Thêm cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất Lắc đều

+ Ống 1 trong suốt

+ Ống 2 có tủa đục

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 sẽ lại tủa đục như ống 2

- Phản ứng huỳnh quang chuyển dạng đồng phân cis sang trans dưới ánh sáng tử ngoại:

Nhỏ vài giọt dịch chiết coumarin lên giấy thấm Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5% Sấy nhẹ Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (đồng xu) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút Bỏ miếng kim loại ra, quan sát dưới đèn tử ngoại sẽ thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sáng dần lên, sau vài phút cả 2 phần đều phát quang như nhau

- Phản ứng vi thăng hoa:

Thực hiện phản ứng vi thăng hoa trên lam kính tương tự như định tính anthranoid rồi cho tác dụng với TT Lugol Quan sát thấy sẽ thấy những tinh thể iodo coumarin màu nâu sẫm hoặc tím

f Định tính flavonoid

Lấy 10 g bột dược liệu cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet, chiết bằng cloroform cho đến khi hết màu xanh Loại bỏ dịch chiết cloroform, dược liệu được lấy ra làm khô rồi cho vào cốc có mỏ và thêm 30 ml EtOH 70% Đun cách thủy trong 10 phút, lọc nóng thu dịch chiết cồn đem làm các phản ứng định tính

- Phản ứng Cyanidin:

22

Cho 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ Thêm một ít bột Mg kim loại Sau

đó cho thêm vài giọt HCl đậm đặc Để yên vài phút Nếu có sự chuyển từ màu vàng sang màu đỏ thì kết luận phản ứng dương tính

- Phản ứng với kiềm với hơi amoniac:

Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc Hơ khô rồi để trên miệng lọ có chứa amoniac đặc Quan sát sự thay đổi màu của vết chấm Nếu màu vàng đậm hơn thì dược liệu có chứa flavon, flavonol, flavanon Nếu màu không thay đổi (không màu) thì dược liệu có chứa isoflavonoid Nếu màu hồng, đỏ cam thì dược liệu có chứa auron, chalcon Nếu có màu xanh thì dược liệu có chứa anthocyan

- Phản ứng tạo phức với muối kim loại FeCl3:

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vài giọt FeCl3 5% Quan sát nếu thấy tủa xanh, nâu xuất hiện thì kết luận phản ứng dương tính

- Xác định khung steroid: Phản ứng Liebermann – Burchardt: