Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của một loài thuộc chi stephania lour ở bà rịa vũng tàu

Loài Stephania dielsiana Y.C.Wu thu hái ở Ba Vì có đặc điểm nổi bật là có dịch màu đỏ và đã phân lập ra được chất oxostephanin – một hoạt chất được nghiên cứu gần đây là có tác dụng gây

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

QUÁCH THỊ THÚY NGA

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT

ỘC CHI STEPHANIA LOUR

BÀ RỊA – VŨNG TÀU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

QUÁCH THỊ THÚY NGA

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT LOÀI

THUỘC CHI STEPHANIA LOUR Ở BÀ RỊA

– VŨNG TÀU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Quốc Huy

2 ThS.NCS Hoàng Văn Thủy

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Thực vật

HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận này em đã nhận được sự giúp đỡ, tạo điều kiện của Ban Giám Hiệu, phòng Đào Tạo, Trường Đại Học Dược Hà Nội, sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô ở Bộ Môn Thực vật, gia đình và bạn bè

Em xin được gửi tới lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS.Nguyễn Quốc Huy,

ThS.NCSHoàng Văn Thủy, các thầy đã trực tiếp hướng dẫn em tận tình trong quá

trình làm khóa luận tốt nghiệp tại bộ môn

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô Bộ môn Thực Vật, Trường ĐH Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới DS Nguyễn Thị Thùy Linh, bạn Phạm

Thị Việt Hồng lớp M2K65, Lương Thị Lan lớp M1K65, Tống Xuân Quang lớp

A3K65, em Nguyễn Thị Mai Hạnh lớp M3K66, em Lê Thiên Kim lớp P1K66, những

người đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện, và em xin gửi tới gia đình, bạn

bè, những người đã động viên, khích lệ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Quách Thị Thúy Nga

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2 1.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI STEPHANIA LOUR 2

1.1.1.Vị trí phân loại chi Stephania Lour 2

1.1.2.Đặc điểm của chi Stephania Lour 2

1.1.3.Đặc điểm một số loài có dịch màu đỏ trong chi Stephania Lour 3

1.2.PHÂN BỐ CỦA CHI STEPHANIA LOUR 5

1.2.1.Trên thế giới 5

1.2.2.Ở Việt Nam 5

1.3.THÀNH PHẦN HÓA HỌC 8

1.3.1.Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania Lour trên thế giới 8

1.3.2.Những nghiên cứu về oxostephanin trong chi Stephania Lour 9

1.4.TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO 9

1.4.1.Sắc ký lớp mỏng 9

1.4.2.Đặc điểm chung về HPTLC 10

1.4.3.Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu 11

1.5.CÔNG DỤNG, TÁC DỤNG CỦA OXOSTEPHANIN 12

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1.NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 13

2.1.1.Nguyên liệu 13

2.1.2.Hóa chất và dụng cụ 13

2.2.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

2.2.1.Nghiên cứu về thực vật 14

2.2.2.Nghiên cứu về hóa học 14

2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.3.1.Phương pháp nghiên cứu về thực vật 14

2.3.2.Phương pháp nghiên cứu về hóa học 14

CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1.THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20

3.1.1.Kết quả về thực vật 20

3.1.2.Kết quả về thành phần hóa học 24

3.2.BÀN LUẬN 35

3.2.1.Về thực vật 35

3.2.2.Về hóa học 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

PHỤ LỤC 4

PHỤ LỤC 5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatigraphy (Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1.Phân bố của các loài thuộc chi Stephania Lour.ở Việt Nam 6

Bảng 1.2.Các nhóm chất chính trong chi Stephania Lour 8 Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 29 Bảng 3.2 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần 32

Bảng 3.3 Bảng nồng độ và diện tích pic của các mẫu chuẩn 33 Bảng 3.4 Giá trị Rf và diện tích pic của các mẫu chuẩn 33

Bảng 3.5 Kết quả định lượng oxostephanin 35 Bảng 3.6 Đặc điểm làm cơ sở giám định tên khoa học 37 Bảng 3.7 So sánh tiêu bản loài nghiên cứu với tiêu bản các phòng tiêu bản nước

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của oxostephanin 9 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của loài nghiên cứu 21 Hình 3.2 Đặc điểm bột dược liệu 22 Hình 3.3.Vi phẫu thân 22 Hình 3.4.Vi phẫu cuống lá 23 Hình 3.5.Vi phẫu lá 23 Hình 3.6 SKLM dịch chiết tổng 31 Hình 3.7 SKLM của 3 hệ dung môi khác nhau 31 Hình 3.8 Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic 33 Hình 3.9 Sác ký đồ của các mẫu chuẩn và thử 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Bình vôi Stephania Lour.là một chi lớn trong họ Tiết dê (Menispermaceae) Ở Việt Nam, Ngô Thị Tâm đã nghiên cứu loài Stephania pierrei Diels.mọc ở Nghĩa Bình [22] Nguyễn Tiến Vững đã nghiên cứu loài Stephania

glabra (Roxb.)Miers.mọc ở Ninh Bình và loài Stephania kuinanensis H.S.Lo et

M.Yang mọc ở Lạng Sơn[27] Nguyễn Quốc Huy đã nghiên cứu 3 loài: Stephania

brachyandra Diels, Stephania dielsiana Y.C.Wu, Stephania sinica Diels [17]…

Tuy nhiên vẫn có nhiều loài chưa được nghiên cứu kỹ về thực vật và hóa học, nhất

là các loài bình vôi thu hái ở các tỉnh phía Nam

Loài Stephania dielsiana Y.C.Wu thu hái ở Ba Vì có đặc điểm nổi bật là có

dịch màu đỏ và đã phân lập ra được chất oxostephanin – một hoạt chất được nghiên cứu gần đây là có tác dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư [17]

Gần đây, một loài Bình vôi thu hái ở Bà Rịa-Vũng Tàu có dịch màu đỏ giống

với loài Stephania dielsiana Y.C.Wu chưa thấy có tài liệu nào ở Việt Nam nghiên

cứu Để có định hướng phát triển, sử dụng và bảo tồn loài bình vôi này, đề tài

“Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của một loài thuộc chi

Stephania Lour.ở Bà Rịa-Vũng Tàu” được thực hiện với 3 mục tiêu sau:

 Mô tả đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học của loài nghiên cứu; mô tả đặc điểm vi phẫu và bột dược liệu

 Định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học, định tính alcaloid trong dược liệu bằng SKLM

 Định lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu; bán định lượng oxostephanin bằng phương pháp HPTLC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI STEPHANIA LOUR

1.1.1 Vị trí phân loại chi Stephania Lour

Theo tài liệu [6], [24], [32], chi Stephania Lour.thuộc:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)

Liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae)

Bộ Hoàng liên (Ranunculales) Phân bộ Tiết dê (Menispermineae)

Họ Tiết dê (Menispermaceae)

1.1.2 Đặc điểm của chi Stephania Lour

Theo tài liệu [2], [19], [24], [32], chi Stephania Lour.được mô tả như sau:

Dây leo, sống lâu năm, hầu hết mảnh khảnh Thân cỏ Thân non thường nhẵn, xanh nhạt, xanh bóng hay xanh thẫm Thân già thường có rãnh dọc, mụn cóc sần sùi màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất Rễ dạng sợi hoặc phình to thành rễ củ.Rễ củ thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hay có hình dạng bất định Tùy thuộc vào loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống mà vỏ củ có nhiều thay đổi (nhẵn, xù xì, màu nâu xám nhạt, xám tro hay đen,…)

Lá mọc so le.Cuống lá thường gấp khúc ở gốc, hai đầu phình lên, đính vào phiến lá khoảng 1/5-1/3 chiều dài phiến lá Phiến lá mỏng hoặc dày, nhẵn bóng hoặc rải rác có lông, hình lọng, thường hình trứng hay gần tròn, có cạnh hoặc tam giác tròn, mép lá nguyên hoặc chia thùy, gân lá hình chân vịt, gồm 8-13 gân xuất phát từ đỉnh cuống lá

Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay trên thân cây già không lá, thường có dạng tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù, có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm ít nhất ở các nhánh của tán cấp 1, các nhánh cuối cùng đôi khi không đều, hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa Hoa đơn tính khác gốc Hoa đực có 6 - 8 đài rời nhau, xếp thành 2 vòng, bằng nhau hay không bằng nhau, hoặc

chỉ 2 - 3 ở loài S capitata, đài ít nhiều hình trái xoan ngược Cánh hoa rời nhau, 3

hay 4, hình trứng ngược, mép bên nhiều khi gập vào trong, màu vàng hay trắng xanh.Nhị 2 - 6, chỉ nhị dính nhau thành ống hình trụ, bao phấn dính nhau thành hình đĩa với 4 - 8 ô nứt ngang Hoa cái đối xứng hay bất đối xứng, 1 - 8 lá đài, 2 - 4 cánh hoa; bầu hình trứng, 2 lá noãn (nhưng chỉ có 1 lá noãn phát triển thành hạt, 1 lá noãn bị thoái hóa), vòi rất ngắn hoặc không có; núm nhụy có 4 - 6 (-7), thùy ngắn hoặc rách, hình dùi, choãi ra

Quả hạch, hai bên dẹt, hình trứng ngược với vết sẹo ở núm gần gốc nhẵn Quả chín màu vàng đậm hay đỏ tươi nhẵn bóng Hạt hình móng ngựa, hai mặt bên lõm, hình trứng hoặc gần tròn, mang 2 - 4 hàng vân dạng gai.Giá noãn có lỗ thủng hoặc không.Cây mềm có lá mầm, ít nhiều bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ

Mùa hoa: tháng 4 - 6 Mùa quả: tháng 8 - 10

1.1.3 Đặc điểm một số loài có dịch màu đỏ trong chi Stephania Lour

1.1.3.1 Stephania dentifolia H S Lo & M Yang [32]

Dây leo, thân thảo, nhẵn Rễ lớn phình thành củ.Thân cây đường khía và có dịch màu đỏ Cuống lá dài 2 - 4 cm, phiến lá hình khiên, dẹt, 2 - 4(- 8) x 2,5 - 4,4(- 9)cm, gốc lá cụt hoặc hơi tròn, mép lá có khía hình răng cưa, ngọn lá tù hoặc hơi nhọn, gồm 8 – 10 gân lá mảnh mọc từ gốc lá Cụm hoa đực mọc dạng xim tán, mọc

từ nách lá, đơn độc hoặc kết hợp, cuống cụm hoa mảnh, dài 0,8 – 2,5cm; tán gồm 4 – 6 nhánh nhỏ, cuống mỗi nhánh dài 0,3 – 1cm, lá bắc của hoa và của cụm hoa đều nhọn, dài 2 – 2,5cm, nhẵn hoặc có ít lông Hoa đực có đài 6 chia 2 vòng, vòng ngoài hình bầu dục, 1,7×0,9 – 1 mm, trên đài có các đường gân ngắn Hoa đực có tràng 3, nạc, 0,8 – 1,4mm với nốt sần ở trong Cụm hoa cái mọc dạng gần đầu, cuống của cả cụm mảnh dài 1 - 1,5 cm, lá bắc của cụm dài 1 – 3mm Hoa cái có đài 1, tràng 2, nạc Quả chưa rõ

1.1.3.2 Stephania yunnanensis H S Lo [32]

Dây leo, thân thảo, dài 4 – 5m, nhẵn Thân và lá đều có dịch màu đỏ Cuống

lá gần bằng hoặc dài hơn thân lá, lá có hình dạng tam giác rộng đến tam giác nhọn,

5 – 11cm, chiều dài lá gần bằng hoặc dài hơn một ít chiều rộng lá, lá mỏng như

màng, cả 2mặt đều nhẵn, gốc lá cụt hoặc hơi nhọn, đỉnh lá tròn hoặc hơi tù, mép nguyên hoặc hơi lượn sóng; gồm 9 – 10 gân lá mọc từ gốc, tất cả đều màu nâu khi khô Cụm hoa mọc dạng xim tán Hoa đực có cuống cụm hoa dài 2 – 6cm, hoặc dài hơn, tán gồm 4 – 8 nhánh, có cuống mỗi nhánh dài hơn 2,5cm, lá bắc hình mũi mác dài 1,5 – 2,5mm Hoa đực đài 6 chia 2 vòng, mỗi vòng 3 đài, vòng ngoài nhỏ hơn, hình trứng hơi hẹp ở gốc, dài 1,2 – 1,6 mm, tràng 3, kích thước 1×1,8 mm Hoa cái dạng tán, dài 1 – 2,5cm Cuống quả không dày, dài 5mm Quả hạch màu đỏ khi chín, hình hơi tròn, 6-7mm

1.1.3.3 Stephania longipes H S Lo [32]

Dây leo, thân thảo, nhẵn Thân và lá đều có dịch màu đỏ, màu nâu khi khô, dọc thân có khía.Cuống lá rất dài, ít nhất là hơn gấp 2 lần chiều dài của lá Lá hình tam giác tròn, kích thước 9 -15 × 8 – 14cm, màu xanh đen khi khô, gốc lá cụt, mép

lá có răng cưa, ngọn lá nhọn đôi khi hơi tù, gồm 10 – 11 gân lá Cụm hoa mọc dạng xim tán Cuống cụm hoa đực 3 – 4cm, tán gồm 5 – 7 nhánh, cuống tán dài 1,5cm, cuống mỗi hoa dài 3 – 5mm rõ khi khô Hoa đực đài 6 – 8, mép nguyên, màu nâu khi khô, kích thước 1,2 – 1,5mm, mỏng như màng Tràng 3 hoặc 4, phẳng, kích thước 0,8 – 1 mm, gốc hơi rộng Hoa cái có cuống cụm hoa dài 4 – 11cm, tán có 10 -12 nhánh có cuống dài 8 – 15mm, cuống hoa dài 3mm Hoa cái có đài 1, tràng 2, hơi rộng

1.1.3.4 Stephania dielsiana Y.C.Wu [17], [32]

Tên thường dùng: Củ dòm Tên khác: Bình vôi nhựa tím, cà tòm (Tày, Tuyên Quang), củ gà ấp Phân bố: Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Sơn La, Hòa Bình, Phú Thọ, Hà Tây, Bắc Giang, Bắc Ninh, Quảng Ninh Dây leo nhỏ, sống nhiều năm Rễ củ to Thân leo cuốn dài khoảng 3m Thân non màu tím hồng nhạt Ngọn non, cuống lá và cuống cụm hoa có màu tím hồng Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực 3-5 xim nhỏ hợp thành xim tán kép.Hoa nhỏ, có cuống ngắn; đài 6, màu tím, xếp 2 vòng, cánh hoa 3, hình quạt tròn, màu vàng cam Cột nhị ngắn, bao phấn 6, dính thành đĩa 6 ô Cụm hoa cái gồm 7-8 đầu nhỏ, cuống rất ngắn, xếp thành dạng đầu Hoa nhỏ; đài 1, màu tím hồng; cánh hoa 2, hình quạt tròn, màu

vàng cam và có các vân tím; bầu hínhtrứng, đầu nhụy có 4-5 thùy dạng dùi.Quả hình trứng đảo, hơi dẹt.Hạt hình trứng ngược cụt đầu, có lỗ thủng ở giữa, trên lưng hạt có 4 hàng gai nhọn, cong

1.1.3.5 Stephania venosa (Bl.) Spreng [16], [17], [30]

Tên đồng nghĩa: Clypea verosa Bl Tên thường dùng: Bình vôi đỏ Tên khác:

Lõi tiền đỏ Phân bố: Các tỉnh phía Nam Dây leo có củ, mủ đỏ Rễ củ to trồi lên mặt đất, đường kính có thể lên tới 40 cm Thân màu rơm đo đỏ, không lông, nhẵn, lúc khô màu lục Lá mọc cách, phiến lá hình trứng rộng tam giác.Gân đỏ, cuống 6 -

8 cm Phát hoa ở nách lá, mang vài tán dày Hoa đực: đài 6, cánh hoa 3 Hoa cái có cuống; đài 1, màu cam; cánh hoa 2.Quả hạch hình gần trứng, dẹp nhỏ.Hạt hình trứng bầu, dẹt, dọc chiều lưng bụng có 4 hàng gai, mỗi hàng có 12 - 20 gai nhỏ

1.2 PHÂN BỐ CỦA CHI STEPHANIA LOUR

1.2.1 Trên thế giới

Chi Stephania Lour phân bố ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới, có ở các nước:

Indonesia, Myanmar, Malaysia, Thái lan, Campuchia, Việt Nam, Philippin, Ấn Độ, Banglades, Sri Lanka, Quần đảo Solomon, Trung Quốc, Đài Loan, Papua New Guinea, Nhật Bản (Châu Á); Australia (Châu Úc); Nigeria, Ethiopia (Châu Phi) [27]

1.2.2 Ở Việt Nam

Các loài Bình vôi thường mọc hoang ở một số vùng núi đá vôi, núi đất, núi đất lẫn đá, ở đồng bằng, ven biển, có loài mọc ngay trên bãi cát hoặc gò cát hoang vùng ven biển

Ở nước ta, các loài Bình vôi phân bố rộng khắp cả 3 miền [16], [19], [25]:

 Miền Bắc: Cao Bằng, Lạng Sơn, Sơn La, Yên Bái, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Phú Thọ, Lào Cai, Hà Giang, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hòa Bình, Nam Định, Ninh Bình

 Miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Bình, Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên, Lâm Đồng, Đắc Lắc

 Miền Nam: An Giang, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu

Bảng 1.1.Phân bố của các loài thuộc chi Stephania Lour.ở Việt Nam

1 S brachyandra Diels Bình vôi núi

cao, Bình vôi nhị ngắn

Lai Châu, Lào Cai 7, 9, 17

2 S cambodia Gagnep Bình vôi

Campuchia

Đắc Lắc, Lâm Đồng

7, 9, 17

3 S cepharantha Hayata Hán phòng

kỷ, Bình vôi hoa đầu

Quảng Ninh (Cẩm Phả, Hòn Gai), Hòa Bình (Kỳ Sơn)

7, 8, 9, 17,

25

5 S excentrica H.S.Lo Vùng núi 9, 17, 25

6 S glabra (Roxb.) Miers Ngải tượng,

Dây mối tròn

Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Tuyên Qang, Hà Nội, Hòa Bình, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình, Thanh Hóa, Côn Đảo

17, 18, 19

7 S hainanensis H.S.Lo Bình vôi Vùng núi 9, 17, 25

8 S.hernandifolia (Willd.) Dây mối, Dây Lào Cai, Hà Nội, 7, 9, 17

STT Tên loài Tên Việt Nam Phân bố Tài liệu

Spreng lõi tiền Ninh Bình, Quảng

Nam, Đà Nẵng, Ninh Thuận, Lâm Đồng, Đồng Nai

9 S japonica (Thunb.)

Miers

Thiên kim đằng, Dây lõi tiền

Hà Nội, Nam Định, Nghệ An, Đồng Nai

7, 9, 17

12 S kuinanensis H.S.Lo et

M.Yang

Bình vôi Lạng Sơn

Lạng Sơn 17, 28

13 S longa Lour Lõi tiền, Dây

lõi tiền rễ dài

Vùng đất thấp từ Cao Bằng, Lạng Sơn tới Thừa Thiên Huế

7, 9, 17,

19

14 S pierrei Diels Bình vôi

trắng, Dây đồng tiền, Bình vôi lá nhỏ, Ngải tượng trắng

Ninh Bình, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Bình Thuận, Ninh Thuận, Bà Rịa – Vũng Tàu

9, 16, 25

STT Tên loài Tên Việt Nam Phân bố Tài liệu

Ninh Bình tới Bà Rịa – Vũng Tàu

16 S tetrandra S Moore Phấn phòng

kỷ

Lào Cai, Yên Bái,

Hà Bắc, Hà Giang, Quảng Ninh, Hà Nội

Sơn La 10, 13, 17

1.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Cùng với việc nghiên cứu về đặc điểm thực vật của chi Stephania Lour., các

nhà khoa học đã đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi này.Alcaloid là thành phần hóa học chính và được nghiên cứu nhiều nhất

1.3.1 Những nghiên cứu về alcaloid trong chi Stephania Lour trên thế giới

Các alcaloid đã phân lập được từ các loài trong chi Stephania Lour.có thể

xếp vào 9 nhóm [17]

Bảng 1.2.Các nhóm chất chính trong chi Stephania Lour

1

Benzylisoquinolin Gồm 6 chất được phân lập từ 6 loài khác

nhau, trong đó có chất Papaverin (C20H21NO4)

2

Bis benzyl isoquinolin Gồm 47 chất được phân lập từ 14 loài,

trong đó có chất Cepharanthin (C37H38N2O6)

3 Aporphin Gồm 75 chất được phân lập từ 33 loài,

trong đó có chất Roemerin (C18H19NO3)

4 Proaporphin Gồm 8 chất được phân lập từ 9 loài, trong

đó có chất Stepharin (C18H19NO3)

5

Protoberberin Gồm 24 chất được phân lập từ 22 loài,

trong đó có L-tetrahydropalmatin (C21H25NO4) và Palmatin (C20H25N+O4)

6 Morphinan Gồm 21 chất được phân lập từ 17 loài,

1.3.2 Những nghiên cứu về oxostephanin trong chi Stephania Lour

 Oxostephanin là một alcaloid mới đã được phân lập từ loài có dịch màu đỏ

S.dielsiana Y C Wu ở Việt Nam [17]

 Trên thế giới, oxostephanin là alcaloid đã được phân lập từ 3 loài: S zippeliana,

O

O

OCH3

5 4 3

2 1

7

8 9 10 11

3a

6 6a 6b

7a 11a 11b

Hình 1.1.Cấu trúc hóa học của oxostephanin

1.4 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.4.1 Sắc kí lớp mỏng

 Tách bằng sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành trên một lớp mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá

đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi lực mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [1]

 Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

Rf = dR / dM

Trong đó:dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm).Rf có giá trị dao động từ 0 đến 1

1.4.2 Đặc điểm chung về HPTLC

Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của kĩ thuật SKLM Thuật ngữ HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc kí bán tự động như: máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc kí (ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy quét vết (TLC Scanner 3,4) và bản mỏng hiệu năng cao HPTLC [36]

Ưu điểm của phương pháp này so với SKLM thông thường là [11]:

- Khả năng phân tách tốt hơn Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng cao

có kích thước hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ của bản mỏng cũng tốt hơn

- Lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn: với thiết bị tiêm mẫu chính xác và bản mỏng có khả năng hấp phụ tốt, lượng chất cần cho phân tích là nhỏ hơn

- Thời gian triển khai ngắn hơn

- Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống máy chấm sắc kí tự động, buồng triển khai sắc kí, máy quét, chụp ảnh, phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu Các yếu tố

về môi trường, nguyên nhân ảnh hưởng lớn tới kết quả phân tích được kiểm soát và hạn chế tối đa các thay đổi

HPTLC ngày càng được ứng dụng nhiều trong định tính, định lượng

1.4.3 Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu

1.4.3.1 Định tính

- Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập được: Chấm tương đối đậm mẫu thử trên ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau Nếu cả 3 sắc ký đồ đều cho một vết gọn trong vùng Rf= 0,3 – 0,75 thì có thể sơ bộ kết luận rằng mẫu thử là một chất tinh khiết[4]

- So sánh với một chất chuẩn: Thực hiện ít nhất trên 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau Trên mỗi bản mỏng chấm ít nhất 3 vết: vết I (mẫu thử), vết II (mẫu thử + mẫu chuẩn), vết III (mẫu chuẩn) Nếu trên cả 3 sắc kí đồ mẫu thử và mẫu chuẩn đều đồng nhất (về trị số Rf, về hình dạng vết, về màu sắc vết trước và sau khi hiện màu)thì có thể sơ bộ kết luận mẫu thử và mẫu chuẩn là đồng nhất [4]

- Kiểm nghiệm dược liệu: Cùng với một qui trình chiết xuất như nhau, dịch chiết của mẫu thử dược liệu được chấm song song với dịch chiết của mẫu dược liệu chuẩn (thực hiện trên 3 bản mỏng khác nhau, không cần chấm trùng) Sau đó so sánh các vết cùng trên 1 bản mỏng về số vết, Rf của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỉ lệ tương đối giữa các vết… của mẫu dược liệu thử và dược liệu chuẩn [4]

- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu: Bằng một chiết xuất nhất định, trong các điều kiện sắc ký nhất định, sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu là không đổi về số vết, về trị số Rf của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết,

tỉ lệ tương đối giữa các vết…Sắc ký đồ được coi là tài liệu không thể thiếu trong công tác xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm các dược liệu [4]

- Theo kết quả thống kê trong tài liệu [15], SKLM là một trong các tiêu chuẩn định tính có mặt trong hầu hết các chuyên luận dược liệu trong Dược điển Dược điển thảo dược Hoa Kì có 31 chuyên luận, Dược điển Trung Quốc (2010)

có 873 chuyên luận và con số này trong Dược điển Việt NamIV là 168 Hình ảnh sắc kí đồ SKLM cho các vết đặc trưng của dược liệu Ứng dụng này giúp

xây dựng “dấu vân tay” hóa học của từng dược liệu và từ đó xác định tính đúng của dược liệu, phát hiện sự nhầm lẫn, giả mạo, đánh giá chất lượng dược liệu.

1.4.3.2 Bán định lượng

 Dựa trên diện tích hoặc dựa trên cường độ màu (khi phun thuốc thử hoặc khi soi UV) của các vết xuất hiện trên bản mỏng (đặc biệt là bản mỏng hiệu năng cao), nếu có mẫu chuẩn tương ứng, có thể bán định lượng một chất (hay một nhóm chất) có trong mẫu thử HPTLC được ứng dụng trong bán định lượng bằng phương pháp so sánh Một số dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ khác nhau được pha sẵn Dựa vào mối liên hệ giữa nồng độ chất chuẩn đã biết và diện tích pic đáp ứng của chất đó trên sắc ký đồ để từ đó xây dựng đường chuẩn định lượng Đo tín hiệu đáp ứng diện tích pic của chất cần phân tích trong mẫu thử

và nội suy nồng độ từ đường chuẩn đã xây dựng ở trên [4]

 Trên thế giới, nhiều lĩnh vực đã ứng dụng HPTLC trong bán định lượng như: nghiên cứu lâm sàng, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp, pháp y, môi trường [11] Năm 2010, nghiên cứu định lượng berberin bằng HPTLC được tiến hành ở Ấn Độ Kết quả hàm lượng berberin là khoảng 4.0% Thẩm định độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp cho RSD lần lượt là 3.0% và 2.7%

[31]

1.5 CÔNG DỤNG, TÁC DỤNG CỦA OXOSTEPHANIN

Nghiên cứu trên thế giới cho kết quả oxostephanin có tác dụng gây độc trên

2 dòng tế bào là ung thư da (Epidermoid carcinoma-KB) và ung thư vú (Breast cancer-BC) Ngoài ra, oxostephanin còn có tác dụng gây độc trên dòng tế bào ung thư gan (Hep-2), ung thư phổi (LU) và ung thư cơ vân (RD) [20]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên liệu

 Mẫu nghiên cứu được thu hái tại Bà Rịa-Vũng Tàu, được phân tích và mô tả đặc điểm thực vật,sau đó được đem về trồng tại vườn thực vật trường Đại học Dược Hà Nội và vườn nghiên cứu ở Ba Vì để theo dõi sự phát triển của cây, thu các cơ quan sinh trưởng và sinh sản trong 2 năm 2013 và 2014 để giám định tên khoa học Mẫu được lưu tại Phòng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội với

mã số tiêu bản là: HNIP/18073/14

 Mẫu nghiên cứu để xây dựng quy trình bán định lượng bằng HPTLC: Mẫu củ

và lá cây loài nghiên cứu

 Mẫu củ được rửa sạch, thái lát, sấy khô và xay thành bột dược liệu

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ

2.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

 Kính hiển vi Leica

 Kính lúp soi nổi Nikon của Nhật

 Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag bao gồm máy Linomat 5,

ADC2, TLC Visualizer, phần mềm winCATS, phần mềm VideoScan

 Bình chiết Soxhlet 250ml

 Bình triển khai sắc ký

 Bản mỏng HPTLC Silica gel 60 F254 (Merck) dành cho HPTLC và TLC

 Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ 100 và 200 ml; bình định mức 100 ml; pipet 1

ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh

 Tủ sấy WiseVen (R) WOF

 Máy đo hàm ẩm Precisa HA60

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

 Mô tả đặc điểm hình thái thực vật

 Mô tả đặc điểm bột dược liệu

 Mô tả đặc điểm vi phẫu thân, vi phẫu cuống lá, vi phẫu lá

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học

 Định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học

 Định tính alcaloid trong dược liệu bằng SKLM

 Định lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu

 Bán định lượng oxostephanin bằng phương pháp HPTLC

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu về thực vật

- Nghiên cứu đặc điểm thực vật: Quan sát bằng mắt thường, kính lúp soi nổi, chụp ảnh và mô tả theo phương pháp mô tả phân tích [3]

- Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu: Sử dụng phương pháp nhuộm kép, quan sát trên kính hiển vi, chụp ảnh và mô tả theo phương pháp mô tả phân tích [3]

- Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu: Quan sát bằng mắt thường, kính hiển vi, chụp ảnh và mô tả theo phương pháp mô tả phân tích [3]

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu về hóa học

2.3.2.1 Định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học

Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phương pháp hóa học theo tài liệu “Thực tập dược liệu” [4], [23]

2.3.2.2 Định tính alcaloid trong dược liệu bằng SKLM

- Chuẩn bị bản mỏng Silicagel GF 254 đã tráng sẵn của Merck, hoạt hóa ở

1100C/1h, để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm

- Chuẩn bị dịch chấm sắc kí:

+ Mẫu thử:lấy 10g bột dược liệu, chiết như phần định tính bằng các phản ứng hóa học rồi cô cách thủy đến khô, cắn còn lại để nguội, hòa tan trong methanol Dịch chiết dùng để chấm sắc kí

+Mẫu chuẩn: Chất chuẩn oxostephanin (độ tinh khiết 99.90%) [21]

- Dung môi khai triển [12], [20]:

+ Chấm song song mẫu thử và mẫu oxostephanin chuẩn trên cùng một bản mỏng, triển khai ở 3 hệ dung môi trên Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng

ra, để khô ở nhiệt độ phòng Soi dưới ánh sáng có bước sóng 366 nm

2.3.2.3 Định lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu

Định lượng alcaloid toàn phần theo phương pháp được ghi trong Dược điển Việt Nam III [5]:

Cân chính xác 10,00 g bột dược liệu đã sấy khô Thấm ẩm bằng ammoniac 6N trong 2 giờ.Sau đó cho vào túi lọc, đặt vào bình Sohxlet, chiết bằng chloroform cho đến hết alcaloid (kiểm tra bằng thuốc thử Dragendorff) Cất thu hồi chloroform, hòa tan cắn trong dung dịch HCl 5% (5-7 lần, mỗi lần 5 ml) Rửa dịch chiết acid bằng ether dầu hỏa (3 lần, mỗi lần 10ml); kiềm hóa bằng amoniac 6N đến pH = 10-

11 Chiết bằng chloroform 5 lần, mỗi lần 10ml để lấy hết alcaloid Tập trung dịch chiết, rửa bằng nước cất đến pH trung tính.Bốc hơi dịch chiết tới khô Hòa tan cắn với một lượng chính xác 20 ml dung dịch H2SO4 0,1 N Định lượng acid dư bằng dung dịch NaOH 0,1 N với chỉ thị đỏ methyl

1ml H2SO4 0,1 N tương đương với 71 mg alcaloid toàn phần tính theo rotundin Hàm lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu tính theo công thức:

% =(20 − V) × 0,071 × 100

mTrong đó: V: số ml NaOH 0,1N dùng để trung hòa H2SO4 0,1 N dư

m: Số gam dược liệu dùng định lượng đã trừ độ ẩm

Tiến hành định lượng 3 lần

2.3.2.4 Bán định lượng oxostephanin bằng phương pháp HPTLC

 Xây dựng phương pháp định lượng

- Xử lý mẫu thử:

+ Qui trình chiết xuất dược liệu [5]: Cân chính xác khoảng 10g bột dược liệu Thấm ẩm bằng ammoniac trong 2h Sau đó chuyển toàn bộ dược liệu vào bình Soxhlet, chiết bằng CH2Cl2 cho đến hết alcaloid

+ Lựa chọn độ pha loãng: Dịch chiết cô đến cắn Hòa tan cắn trong chính xác 25,

50, 100, 200 ml MeOH để được các dung dịch chấm mẫu Tiến hành triển khai sắc ký mẫu thử với các độ pha loãng khác nhau để lựa chọn độ pha loãng phù hợp

- Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch oxostephanin chuẩn: Triển khai SKLMcác mẫu thử và mẫu chuẩn trên cùng một bản mỏng Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên mối liên hệ giữa nồng độ oxostephanin và diện tích pic đáp ứng Từ đường chuẩn định lượng, khảo sát khoảng nồng độ oxostephanin trong các mẫu thử, từ đó lựa chọn được nồng độ của dãy dung dịch oxostephanin chuẩn

- Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC [29], [36]:

+ Bản mỏng:Bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110˚C trong 30 phút Kích thước bản mỏng 20 × 10 cm

+ Đưa mẫu lên bản mỏng: Mẫu được phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat 5 Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng là 1,5 cm, cách mép dung môi từ 0,8 – 1 cm Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 1,5 cm Độ dài băng chấm 6 mm và thể tích chấm mỗi vết là 2 µl Mỗi bản mỏng kích thước 20 × 10 cm chấm tối đa 15 vết

+ Hệ dung môi khai triển: Khai triển một số hệ dung môi sau [12], [20]

Chloroform: methanol: ammoniac (50:9:1)

Chloroform: methanol (9:1)

Toluen: aceton : cồn : ammoniac (45:45:7:3)

Lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực phù hợp, cho hiệu năng tách tốt, đồng thời vết tách lên gọn, tròn, không bị kéo, không bị lẫn vết phụ

- Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ oxostephanin của các mẫu chuẩn Xác định nồng độ oxostephnin trong các mẫu thử Từ đó tính hàm lượng oxostephanin trong dược liệu theo công thức sau :

% oxostephanin = ×

( ×( ))/ × 100

Trong đó : C là nồng độ dung dịch thử (g/ml)

V là độ pha loãng (ml)

m là khối lượng bột dược liệu (g)

a là độ ẩm của bột dược liệu (%)

 Thẩm định phương pháp

- Độ đặc hiệu:

Khái niệm: Độ đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định

chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi các chất khác

có trong mẫu thử [15]

Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu sau:

Mẫu trắng: dung dịch MeOH

Mẫu thử: dịch chiết MeOH của mẫu củ

Mẫu chuẩn oxostephanin hòa tan trong MeOH

Triển khai sắc ký với mẫu bằng hệ dung môi khai triển được lựa chọn ở trên Soi và chụp ảnh bản mỏng tại bước sóng 366 nm, quan sát số lượng vết, hình dáng các vết

và so sánh giá trị RSD của Rf [26]

Đánh giá kết quả: Đánh giá dựa trên giá trị RSD của Rf Công thức tính RSD:

Phương pháp HPTLC được coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu: (i) Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; (ii) Sắc ký đồ các

mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn

Giá trị đề nghị chấp nhận khi so sánh trị số Rf: Độ lệch chuẩn tương đối của giá trị

Rf các vết trên sắc ký đồ dung dịch thử không quá 5% Độ lệch giá trị Rf trên vết mẫu thử so với vết mẫu chuẩn không quá 5%[26]

- Tính tuyến tính:

Khái niệm: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân tích

thu được tỷ lệ với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử [15]

Cách tiến hành: Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn với nồng độ: 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2

(mg/ml) Tiến hành triển khai HPTLC với dãy dung dịch chuẩn trên Xây dựng phương trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu

Đánh giá: Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến tính

Thông thường với giá trị r > 0,90 có thể kết luận phương pháp có tương quan tuyến tính tốt [26]

- Độ thích hợp của hệ thống:

Khái niệm: Độ thích hợp của hệ thống là khái niệm chỉ sự tương thích giữa thiết bị,

dụng cụ điện tử, sự vận hành của hệ thống và mẫu phân tích Độ thích hợp của hệ thống cho biết hiệu năng của thiết bị HPTLC và hệ thống sắc ký trong ngày tiến hành thử nghiệm[15]

Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu chuẩn oxostephanin có nồng độ 0,03 mg/ml Tiêm 6

lần dung dịch chuẩn, triển khai HPTLC [26]

Đánh giá: Tính RSD của diện tích pic, chiều cao pic Giá trị RSD của diện tích

(chiều cao) pic giữa các lần tiêm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2,0%[26]

- Độ đúng [26]:

Khái niệm: Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị

thực của mẫu đã biết [15]

Cách tiến hành: Độ đúng của phương pháp HPTLC đối với định lượng hoạt chất

trong dược liệu được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn

Chuẩn bị các mẫu thử từ củ pha loãng 25ml, củ pha loãng 50 ml và lá pha loãng 200ml theo quy trình như trên

Mẫu thử 1: thêm chính xác 0,5 ml mẫu chuẩn có nồng độ 0,02 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0,5 ml mẫu thử ở trên

Mẫu thử 2: thêm chính xác 0,5 ml mẫu chuẩn có nồng độ 0,04 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0,5 ml mẫu thử ở trên

Mẫu thử 3: thêm chính xác 0,5 ml mẫu chuẩn có nồng độ 0,15 mg/ml vào các ống đã có sẵn 0,5 ml mẫu thử ở trên

Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn có nồng độ 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 (mg/ml)

Tiêm lần lượt các mẫu theo quy trình định lượng thông thường, xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất của phương pháp theo công thức:

T l thu h i (%) = t ng l ng tìm l i

t ng l ng thêm vào

Đánh giá: độ đúng của phương pháp dựa vào tỷ lệ thu hồi và các giá trị RSD của

tỷ lệ thu hồi Không có các giới hạn cụ thể mà độ đúng của một phương pháp phải đạt được, giới hạn độ đúng của phương pháp còn phụ thuộc vào tỷ lệ % hoặc khối lượng chất cần phân tích có trong mẫu thử Nói chung, đối với phương pháp định lượng hàm lượng dược chất trong dược liệu, độ đúng của phương pháp có thể được chấp nhận với khoảng sai số rộng hơn do nền mẫu lớn và quá trình chiết tách phức tạp, giới hạn RSD có thể dao động từ ± 2,0% đến ± 10,0% hoặc hơn, tuy nhiên cần có biện giải về giới hạn này [26]

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1.1 Kết quả về thực vật

3.1.1.1 Đặc điểm thực vật, giám định tên khoa học

Cây leo, thân mảnh, màu tía Cành non màu xanh nhạt, cành già màu xanh đậm.Cả cây không có lông.Rễ phình thành củ, dạng hình cầu hay bất định, hơn ½ củ hoặc gần toàn củ mọc nổi trên mặt đất, màu xám hoặc màu đất.Lá mọc cách so le.Toàn cây có nhựa màu đỏ.Cuống lá thường mảnh, dài 2,5-3 cm, phình to ở gốc, màu đỏ tím, cuống lá thường đính vào 1/4 chiều dài phiến lá, mọc vắt qua thân Lá rộng hình gần giống tam giác, phiến lá mỏng, nhẵn bóng hoặc có ít lông, mép lá nguyên hơi chia thùy, ngọn lá có chóp nhọn, gốc lá bằng hoặc hơi lõm, mặt trên có màu xanh lục, mặt dưới màu nhạt hơn.Lá có 8-10 gân nổi rõ, tỏa đều xuất phát từ đỉnh cuống lá

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa mọc ở nách lá.Hoa cái có bao hoa không đối xứng Cụm hoa cái mọc xim tán kép, cuống cụm hoa dài 3cm; tán cấp 1 có lá bắc, gồm 7-9 cụm hoa nhỏ, cuống dài 5 mm; tán cấp 2 có 3 nhánh, mỗi nhánh gồm

3 hoa đều có lá bắc, cuống hoa dài 3mm Hoa cái màu đỏ Đài 1-2, mép đài cong lên, màu vàng nhạt.Tràng 2 – 3 kích thước có thể giống hoặc khác nhau, màu đỏ đậm, hình hơi tròn hoặc thuôn dài.Bầu trên lệch về phía lá bắc

Cụm hoa đực mọc xim tán kép, cuống cụm hoa dài khoảng 6- 7cm, cấp 1 có

5 tán kép, có cuống dài từ 2,5- 4cm; tán cấp 2 có 5 nhánh dài, trên mỗi nhánh có 4 hoa có cuống hoa dài 1- 1,5mm Lá bắc màu xanh nhạt, có lá bắc ở mỗi nhánh và ở mỗi hoa Đài 6, rời, xếp thành 2 vòng, 3 lá đài vòng trong lớn hơn và xếp xen kẽ 3

lá đài vòng ngoài, màu vàng nhạt Tràng 3, màu vàng đậm hơn đài Toàn bộ mép cánh hoa uốn cong vào trong.Bộ nhị có chỉ nhị hàn liền thành hình trụ, các bao phấn hàn liền thành hình đĩa

Quả hình trứng ngược, khi chín có màu đỏ Hạt hình móng ngựa, có 4 hàng gai nhọn gờ lên ở phía lưng, mỗi hàng gồm 14-18 gai nhỏ, chiều dài hạt khoảng 6-7

mm, chiều rộng 4-5 mm Giá noãn có lỗ ở giữa Mùa hoa: tháng 5-7, mùa quả: tháng 6-8

Qua các đặc điểm của loài nghiên cứu và tham khảo các tài liệu như khóa phân loại của Thực vật chí Trung Quốc [32], của Nguyễn Chiều [8], nhất là khóa

phân loại chi Stephania Lour trong thực vật chí Thái Lan [30], so sánh tiêu bản

mẫu tại Phòng tiêu bản Singapore Botanic Garden (Singapore) số 15164, 37820, 2364; so sánh tiêu bản mẫu tại Phòng tiêu bản Queen Sirikit Botanic Garden (Chiang Mai, Thailand) số: QBG 20633, QBG 11544, QBG 6884, tham khảo các

chuyên gia, loài nghiên cứu được giám định là Stephania venosa (Bl.) Spreng., họ Tiết dê (Menispermaceae)

Củ Lá cây Cụm hoa đực Hoa đực

Đài hoa đực Tràng hoa đực Bộ nhị Cụm hoa cái

Hoa cái Lá bắc hoa cái Đài hoa cái Tràng hoa cái

Bầu nhụy Bầu cắt ngang Bầu cắt dọc

Hạt

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của loài nghiên cứu

3.1.1.2 Đặc điểm bột dược liệu

Tinh bột Tinh thể Mảnh mô mềm Mảnh mạch điểm

Hình 3.2 Đặc điểm bột dược liệu

Soi dưới kính hiển vi thấy: Bột màu hơi xám Tinh thể calci oxalate hình kim Hạt tinh bột hình tròn hoặc hơi bầu dục, rốn hạt thường phân nhánh.Mảnh mô mềm thành mỏng.Có nhiều mảnh mạch điểm xếp thành bó hình chữ nhật

3.1.1.3 Đặc điểm vi phẫu

a) Vi phẫu thân

Hình 3.3.Vi phẫu thân

Biểu bì (1): cấu tạo bởi 1 hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn, phía ngoài

phủ cutin Mô mềm vỏ (2): gồm 6-8 hàng tế bào hình trứng, thành mỏng bằng cellulose, kích thước nhỏ hơn so với mô mềm vỏ phía trong mô cứng Cung mô

cứng (3) : gồm những tế bào hình nhiều cạnh, thành dày hoá gỗ, kích thước không

đều nhau, càng gần tâm tế bào mô cứng càng lớn; mỗi cung mô cứng ứng với mỗi

bó libe -gỗ; các cung mô cứng xếp liền nhau tạo thành vòng cung, trông như các

cánh hoa; có 7 cung mô cứng Bó libe-gỗ (4): có 7 bó; libe ở ngoài và bắt màu đỏ;

gỗ ở trong và bắt màu xanh Mô mềm ruột (5): gồm những tế bào hình đa giác,

thành mỏng bằng cellulose, kích thước không đều nhau

b) Vi phẫu cuống lá

Hình 3.4.Vi phẫu cuống lá

Biểu bì (1): cấu tạo bởi 1 hàng tế bào hình chữ nhật xếp đều đặn, phía ngoài

phủ cutin Mô mềm vỏ (2): gồm 5-7 hàng tế bào hình đa giác, thành mỏng bằng

cellulose, mô mềm vỏ phía ngoài có kích thước nhỏ hơn so với mô mềm vỏ phía

trong mô cứng Cung mô cứng (3): gồm những tế bào hình nhiều cạnh, thành dày

hoá gỗ, kích thước không đều nhau; mỗi cung mô cứng ứng với mỗi bó libe -gỗ; có

7 cung mô cứng Bó libe-gỗ (4): có 7 bó libe – gỗ; libe ở ngoài, bắt màu đỏ; gỗ ở trong, bắt màu xanh Mô mềm ruột (5): gồm những tế bào hình đa giác, thành mỏng

bằng cellulose, kích thước không đều nhau

Chú thích:

1: Biểu bì trên và dưới 2: Mô dày

3: Mô mềm 4: Bó libe – gỗ 5: Mô giậu 6: Mô xốp

Biểu bì trên và dưới (1): tế bào hình chữ nhật đều đặn, phía ngoài phủ cutin

không đều tạo những “nhú” nhô lên Mô dày (2): Mô dày phía trên: ngay hàng dưới biểu bì trên là hàng tế bào hình nhiều cạnh xếp xít nhau thành dày lên ở các góc Mô

dày phía dưới: gồm 1-2 hàng tế bào kích thước lớn hơn mô dày phía trên Mô mềm (3): những tế bào hình nhiều cạnh, thành mỏng bằng cellulose, kích thước không

đều nhau Tế bào mô mềm phía trên bó libe có kích thước nhỏ hơn tế bào mô mềm

phía dưới bó libe gỗ Bó libe - gỗ (4): libe gỗ tạo thành bó lớn ở giữa gân lá, libe ở phía dưới bắt màu đỏ, gỗ ở phía trên bắt màu xanh Mô giậu (5): gồm 2 hàng tế bào

hình chữ nhật xếp vuông góc với hàng tế bào biểu bì trên và kéo dài vào sâu trong

phần gân lá Mô xốp (6): gồm 4-5 hàng tế bào hình nhiều cạnh, kích thước không

đều, để hở khoảng gian bào hẹp

Nhỏ vào từng ống 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

- Ống 1: Thuốc thử Mayer: xuất hiện tủa trắng

- Ống 2: Thuốc thử Dragendorff: xuất hiện tủa màu da cam

- Ống 3: Thuốc thử Bouchardat : Xuất hiện tủa màu nâu

một cốc có mỏ có dung tích 100ml Thử dịch lọc bằng chì acetat cho đến khi không còn tủa với chì acetat Chuyển toàn bộ dịch lọc vào 1 bình gạn dung tích 100ml Chiết glycoside tim bằng cách lắc với chloroform 2 lần, mỗi lần 8ml Gạn lớp chloroform vào 1 cốc có mỏ Gộp các dịch chiết lại và loại nước bằng natrisulfat khan.Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô

- Phản ứng Liebermann-Burchardt (phản ứng của khung steroid): Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml anhydride acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống

450 Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng không xuất hiện vòng tím đỏ

Kết luận: phản ứng âm tính

- Phản ứng Baljet (phản ứng của vòng lacton 5 cạnh):

TT Baljet: Cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric1% và 9 phần dung dịch NaOH 10% Lắc đều Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycoside tim 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng thuốc thử Baljet mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam So với ống chứng (ống không có cắn glycoside tim) thấy màu không thay đổi

Kết luận: phản ứng âm tính

- Phản ứng Legal (phản ứng của vòng lacton 5 cạnh): Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycoside tim 0,5 ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn.Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều xuất hiện màu đỏ da cam, so sánh với ống chứng (ống không có glycoside tim) thấy màu không thay đổi

Kết luận: phản ứng âm tính

- Phản ứng Keller-Kiliani (phản ứng của phần đường 2,6 - desoxy): Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycoside tim 0,5ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid pha trong acid acetic Lắc đều, nghiêng ống 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng không thấy vòng màu tím đỏ

Kết luận: phản ứng âm tính