Nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi

Ngày nay, nấm Linh chi được trồng khá phổ biển ở một số quốc gia như Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam… cho nên việc sử dụng nấm Linh chi như một loại thực phẩm chức năng giúp hỗ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện: TRẦN MINH HOÀNG

MSSV: 1211100082 Lớp: 12DSH01

TP Hồ Chí Minh, 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là hoàn toàn trung thực, chưa từng được ai sử dụng để công bố trong bất kì công trình nào khác Các thông tin, tài liệu trích dẫn trong luận án đều đã được ghi rõ nguồn gốc

TP Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Trần Minh Hoàng

Trước hết xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã tạo

cơ hội cho tôi được học tập tại trường Cám ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức và tâm huyết trong quá trình giảng dạy suốt những năm qua Xin gửi lời cám ơn đến TS Nguyễn Thị Hai đã

cung cấp chủng nấm Trichoderma harzianum T2; cô Đỗ Thị Tuyến đã cung cấp cơ

chất β-glucan và enzyme cellulase C20032; Ths Nguyễn Thị Ngọc Yến đã cung cấp bào tử nấm Linh chi Cám ơn quý thầy cô phụ trách quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã tạo điều kiện làm việc cho tôi và nhóm thực hiện đồ án Đặc biệt xin chân thành cám ơn TS Nguyễn Hoài Hương, người đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, nếu không có sự giúp đỡ của cô chắc chắn đồ án tốt nghiệp của tôi gặp rất nhiều thiếu sót

Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã có những sự giúp đỡ, động viên trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cám ơn!

Sinh viên thực hiện

Trần Minh Hoàng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT x

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

3 Mục đích của đề tài 2

4 Mục tiêu của đề tài 3

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Kết quả đạt được ban đầu 3

7 Hạn chế của đề tài 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi 4

1.1.1 Phân loại 4

1.1.1.1 Phân loại theo khoa học 4

1.1.1.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc 5

1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi 9

1.1.2.1 Cuống nấm 9

1.1.2.2 Mũ nấm 9

1.1.2.3 Thụ tầng 10

1.1.2.4 Bào tử nấm Linh chi 10

1.1.3 Chu kì sống của nấm Linh chi 14

1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi 15

1.1.4.1 Dinh dưỡng 15

1.1.4.2 Nhiệt độ 15

1.1.4.3 Độ ẩm 15

1.1.4.5 Không khí 15

1.1.4.6 Ánh sáng 16

1.1.4.7 Trị số pH 16

1.1.5 Thành phần dược tính của nấm Linh chi 16

1.1.5.1 Thành phần dược tính tổng quát 16

1.1.5.2 Triterpenoid 17

1.1.5.3 Hợp chất saponin 21

1.1.5.4 Những thành phần khác 22

1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi 22

1.1.6.1 Phòng ngừa ung thư 22

1.1.6.2 Tăng cường khả năng miễn dịch 23

1.1.6.3 Khả năng chống oxy hóa 24

1.1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường 24

1.1.7 Nghiên cứu về bào tử nấm Linh chi 24

1.2 Giới thiệu về nấm Trichoderma 27

1.2.1 Phân loại 27

1.2.2 Lịch sử phát triển 27

1.2.3.1 Đặc điểm hình thái 28

1.2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng 29

1.2.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất của Trichoderma 31

1.2.4 Các hệ enzyme nấm Trichoderma sinh tổng hợp 31

1.2.4.1 Hệ enzyme chitinase 31

1.2.4.2 Hệ enzyme β – glucanase 33

1.2.4.3 Hệ enzyme cellulase 34

1.2.4.4 Hệ enzyme protease 35

1.3 Giới thiệu về enzyme phá vách tế bào 36

1.3.1 Enzyme phá vách tế bào thực vật 37

1.3.2 Enzyme Cellulase C20032 41

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

2.1 Vật liệu – Thiết bị - Hóa chất 44

2.1.1 Vật liệu 44

2.1.2 Nơi tiến hành 44

2.1.3 Thời gian thực hiện 44

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ 44

2.1.4.1 Thiết bị 44

2.1.4.2 Dụng cụ 45

2.1.5 Hóa chất – Môi trường sử dụng 45

2.1.5.1 Hóa chất 45

2.1.5.2 Môi trường sử dụng 47

2.2 Phương pháp nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 49

2.3 Phương pháp nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu enzyme dịch

nuôi cấy 53

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum trên môi trường thạch PDA 54

2.3.2 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường lỏng 54

2.3.3 Thu dịch enzyme nuôi cấy bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn 54

2.4 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối ưu của enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 và enzyme chế phẩm C20032 56

2.4.1 Dựng đường chuẩn glucosamine 56

2.4.2 Xác định hoạt độ enzyme chitinase ở pH và nhiệt độ khác nhau 56

2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme celullase trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm enzyme C20032 57

2.5.1 Dựng đường chuẩn glucose 57

2.5.2 Phản ứng xác định hoạt tính cellulase 58

2.6 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease dịch nuôi cấy và chế phầm C20032 bằng phương pháp Anson cải tiến 59

2.6.1 Dựng đường chuẩn tyrosine 59

2.9 Khảo sát phá vách bào tử nấm Linh chi bằng dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và enzyme chế phẩm C20032 64 2.9.1 Phương pháp xác định tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032 64 2.9.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu 65 2.9.3 Phương pháp xác định độ ẩm bào tử nấm Linh chi 67 2.9.4 Phương pháp thay đổi nồng độ của chế phẩm C20032 kết hợp với dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum 68

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 70 3.1 Kết quả định tính enzyme chitinase, β-glucanase, protease trong chế phẩm C20032 10% và dịch nuôi cấy 70

3.1.1 Kết quả định tính các enzyme trong chế phẩm C20032 10% 70 3.1.2 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường nuôi cấy lỏng 71 3.1.3 Kết quả định tính enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường nuôi cấy rắn 72 3.2 Kết quả định lượng hoạt tính các enzyme trong dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum nuôi cấy môi trường lỏng và nuôi cấy môi trường rắn và chế phẩm

C20032 10% 73 3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm

Trichoderma harzianum và chế phẩm C20032 75 3.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch nuôi cấy nấm

Trichoderma harzianum ở điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau 75

3.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong chế phẩm C20032 10% 76

3.4 Kết quả khảo sát tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi khi thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa dịch nuôi cấy và chế phẩm C20032 10% 77

3.5 Kết quả tỉ lệ bào tử nấm linh chi bị phá vỡ khi thay đổi nồng độ chế phẩm C20032 kết hợp dịch nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum 81

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 85

4.1 Kết luận 85

4.2 Kiến nghị 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO 87

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PDA: Potato Dextrose Agar

EC: Enzyme cellulase C20032

DNC: Dịch nuôi cấy

G lucidum: Ganoderma lucidum

T.harzianum: Trichoderma harzianum

T hamatum: Trichoderma hamatum

T polysporum: Trichoderma polysporum

T viride: Trichoderma viride

T reesei: Trichoderma reeisei

B.cinerea: Botrytis cinerea

T hamatum: Trichoderma hamatum

T virens: Trichoderma virens

BSA: Bovine serum albumin

DD: Dung dịch

TCA: Trichloacetic acid

FC: Folin – Ciocalteu

CMC: Sodium carboxymethyl cellulose

DNS: acid – 2 – hydroxyl – 3,5 – dinitrobenzoic

MT: Môi trường

ĐC: Đối chứng

TB: Trung bình

NT: nghiệm thức

DANH MỤC BẢNG

1 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở

các mẫu vật khác nhau

11

2 1.2 So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở

các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2,5mg/ml)

25

3 1.3 Một số loại enzyme thủy phân của T harzianum 36

4 1.4 Một số enzyme thương mại và thành phần enzyme trong

8 2.3 Các bước xác định hoạt tính enzyme cellulase (CMCase) 58

9 2.4 Bảng bổ sung hóa chất dựng đường chuẩn tyrosine 59

10 2.5 Các bước xác định hoạt tính enzyme protease 60

11 2.6 Lập đường chuẩn β-glucan để xác định hoạt tính enzyme

β-glucanase

61

12 2.7 Các bước xác định hoạt tính enzyme β-glucanase 61

13 2.8 Dựng đường chuẩn albumin (protein theo Bradford) 62

14 2.9 Bảng bố trí sự thay đổi tỉ lệ enzyme DNC và chế phẩm

C20032 10%

65

15 2.10 Bảng bố trí sự thay đổi nồng độ enzyme C20032 68

16 3.1 Vòng phân giải các enzyme có trong chế phẩm C20032

18 3.3 Vòng phân giải các enzyme có trong DNC T harzianum

20 3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase ở điều kiện

nhiệt độ và pH thay đổi

75

21 3.6 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme chitinase có mặt trong

chế phẩm C20032 10% điều kiện pH5

77

22 3.7 Bảng kết quả % bào tử linh chi bị phá vỡ khi thay đổi tỉ

lệ enzyme phối hợp giữa DNC và chế phẩm C20032 10%

25 3.10 Bảng hoạt tính enzyme/cơ chất (U/g) của các enzyme có

mặt trong hỗn hợp dịch thí nghiệm có sự thay đổi nồng

độ enzyme chế phẩm C20032

82

DANH MỤC HÌNH

8 1.8 Hình thái giải phẫu thể quả nấm linh chi Ganoderma

11 1.11 Cấu trúc không gian của 29 loại Triterpenoids trong bào

tử nấm Linh chi

19

12 1.12 29 Triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi 20

13 1.13 Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi

trường thạch dịch chiết khoai tây PDA

28

14 1.14 Sợi nấm và cuống bào tử của T harzianum 29

16 1.16 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase 32

18 1.18 Enzyme cellulolytic xâm nhập vách tế bào qua lỗ của

20 1.20 pH hoạt động tốt nhất của enzyme C20032 Novozyme 42

22 3.1 Biểu đồ so sánh hoạt tính enzyme trong dịch nuôi cấy

T.harzianum MT nuôi cấy lỏng và MT nuôi cấy rắn

74

23 3.2 Biểu đồ khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trong dịch

nuôi cấy nấm T harzianum ở nhiệt độ và pH khác nhau

26 3.4b Bào tử nấm linh chi bị phá vỡ soi dưới kính hiển vi khi

thay đổi tỉ lệ enzyme phối hợp ở ngày thứ 4

78

27 3.5 Biểu đồ tỉ lệ % phá vỡ của bào tử nấm linh chi khi thay

đổi tỉ lệ enzyme phối hợp giữa DNC và chế phẩm C20032 10%

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

2 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ tối ưu, pH tối

ưu của enzyme chitinase từ DNC nấm T harzianum T2

51

3 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm

linh chi bằng enzyme DNC nấm T harzianum T2 kết hợp

chế phẩm EC 20032

52

4 2.4 Sơ đồ nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 thu

enzyme dịch nuôi cấy

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong y học cổ truyền phương Đông, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) là một loại

dược phẩm quý, nó được sử dụng như một loại thượng dược trong các bài thuốc để điều trị một số căn bệnh cũng như bồi bổ sức khỏe Tuy nhiên khi sử dụng nấm Linh chi trong việc điều trị người ta chỉ chú trọng đến việc phối hợp các vị trong bài thuốc

và nấu chúng trong nhiều giờ để tách các hoạt chất mà không chú ý đến thành phần, các biện pháp tách chiết các hoạt chất sao cho tối ưu Bên cạnh đó, Tây y hiện đại cho rằng thảo dược không được xem là một loại thuốc để chữa bệnh mà chỉ có thể được xem như một loại thực phẩm chức năng và nấm Linh chi cũng được xếp vào loại thảo dược thực phẩm chức năng Ngày nay, nấm Linh chi được trồng khá phổ biển ở một số quốc gia như Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam… cho nên việc sử dụng nấm Linh chi như một loại thực phẩm chức năng giúp hỗ trợ sức khỏe, tăng tuổi thọ, phòng ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh ung bướu, tim mạch, huyết áp, tiểu đường…

Trong hai thập kỉ qua, các phương pháp phân tích khoa học hiện đại đã cho phép xác định được một số lượng lớn các hợp chất hóa học có trong quả thể, tơ và bào tử nấm Linh chi như: triterpenoid, steroid, polysaccharide, saponin, chất khoáng, vitamin, amino acid, phenol… Trong đó Triterpenoid, polysaccharide được xem là thành phần chính có nhiều hoạt tính sinh học của nấm Mặc dù có một lượng lớn các hoạt chất sinh học được tìm ra trong nấm Linh chi nhưng việc phân tích, chiết xuất các hoạt chất sinh học này đa số đuợc thực hiện trên quả thể và tơ nấm, có rất ít nghiên cứu thực hiện việc trích ly các hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi bởi bào tử được cấu tạo bởi lớp vách đôi rất bền vững nên làm giảm khả năng chiết xuất các chất Do đó, việc nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi là giai đoạn quan trọng cho quá trình phân tích thành phần các chất có trong bào tử

Để góp phần nghiên cứu việc chiết xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi, tôi đã tiến hành nghiên cứu phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng

phương pháp sử dụng enzyme dịch nuôi cấy từ nấm Trichoderma harzianum T2 kết

hợp với enzyme thương mại Cellulase C20032 được trình bày trong đồ án tốt nghiệp

“NGHIÊN CỨU PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI”

2 Tình hình nghiên cứu

Các công trình nghiên cứu thành phần các hợp chất có trong nấm Linh chi được thực hiện chủ yếu trên quả thể và tơ nấm Hội nghị nấm học thế giới 7/1994 tại Vancouver (Canada) đã dành riêng một hội thảo về Linh chi, kết quả đã đi đến quyết định thành lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế đầu tiên về nấm Linh chi, đặt trụ sở tại New York (Hoa Kỳ) Do vậy, vào tháng 10/1994 Hội nghị Quốc tế đầu tiên về nấm Linh chi đã được tổ chức tại Bắc Kinh, Trung Quốc Tại đây quan điểm về sự tồn tại độc

lập của họ Linh chi Ganodermataceae Donk với tầm quan trọng là các nấm làm thuốc

quý Vào tháng 7/1996, Hội nghị Quốc tế về nấm học Châu á, lại dành một trong năm Hội thảo cho các báo cáo về Linh chi tại đại học Chiba, Nhật Bản Tại mỗi Hội nghị

số báo cáo rất lớn, thể hiện tầm quan trọng kinh tế và sự phong phú của nấm Linh chi

Vào thập niên 70 – 80, bắt đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh chi Chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và Việt Nam Gần đây một số phòng thí nghiệm ở Hoa Kỳ và vùng Đông Nam á cũng bắt đầu tham gia vào tiến trình này Năm 1988, Nhật Bản đã điều trị thành công bệnh nhược cơ bằng Linh chi theo nguyên tắc điều hoà miễn dịch Bệnh viện Sơn Đông, Trung Quốc dùng

“súp” Linh chi để giải độc và bổ gan có kết quả tốt, trong 70.000 ca trên 90% khỏi bệnh (Lui Xing Jia, 1994) Tác giả cho rằng nấm Linh chi có tác dụng tốt đối với đường tiết niệu, điều hoà rối loạn tuần hoàn não, tránh các cơn kịch phát nghẽn mạch

4 Mục tiêu của đề tài

Xây dựng quy trình phá vỡ vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp kết hợp

enzyme chế phẩm thương mại và enzyme dịch nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm linh chi

5 Phương pháp nghiên cứu

Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm

Đề tài được xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và Statisticals Analysis Systems (SAS)

6 Kết quả đạt được ban đầu

Tìm ra được phương pháp phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp kết hợp

chế phẩm thương mại và enzyme dịch nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum

Xác định được tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm linh chi trên một lượng nhất định

7 Hạn chế của đề tài

Tỷ lệ bào tử phá vỡ còn thấp làm hạn chế việc định lượng hoạt chất trong dịch trích

ly sau phá vỡ cũng như hiệu suất trích ly hoạt chất

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi

Nấm Linh chi hay còn gọi là Linh chi thảo, nấm trường thọ, nấm lim, thuốc thần tiên, hạnh nhĩ Cách đây khoảng 2000 năm, nấm Linh chi đã được ghi trong sách “Thần nông bản thảo kinh”, tác phẩm chuyên tập hợp những kinh nghiệm về dược thực vật

từ đời Hán trở về trước Xưa kia linh chi chỉ được khai thác trong thiên nhiên nên nó

là loại thuốc quý, hiếm và rất đắt tiền Từ đầu thế kỷ 17, nấm Linh chi đã được nuôi trồng ở Trung Quốc, chính bởi chính giá trị dược liệu cao của chúng Ngay từ thời Hoàng đế, trong các thư tịch cổ đã ghi chép về giá trị của Linh chi Trong “Bản thảo cương mục”, các ghi chép đã chuẩn mực hơn, và nấm Linh Chi ngày càng được coi trọng Cho nên, dễ hiểu là các nhà Đông y Việt Nam kế tục Lý Thời Trân, đã phát hiện ra Linh Chi ở nước ta và như Lê Quý Đôn đã chỉ rõ đó là “nguồn sản vật quý của đất rừng Đại Nam”

1.1.1 Phân loại

1.1.1.1 Phân loại theo khoa học

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim

(Ganodermataceae) Tên tiếng Anh là Varnished conk hay lingzhi

Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010)

- Loài: Ganoderma lucidum

- Giới: Nấm – Mycota hay Fungi

Theo trình định danh, có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này Kể từ lần đặt tên đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học Phần Lan xác

định tên chính thức Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst đã mất đến 100 năm

(1881)

1.1.1.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc

Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh y Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màu sắc

và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi

Xích chi: Còn được gọi với những cái tên khác như Linh chi đỏ hay đơn chi, hồng

chi có vị đắng Tên khoa học là Ganoderma lucidum Xích chi giúp ích tâm khí, chủ

vị, tăng trí tuệ Sử dụng linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránh các bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực

Hình 1.1 Xích chi – Ganoderma lucidum

Thanh chi: Linh chi xanh hay long chi có màu xanh, vị chua Tên khoa học là

Ganoderma genus Thanh chi giúp cho sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân

thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng và thoải mái

Hình 1.2 Thanh chi Ganoderma genus Bạch chi: Linh chi trắng hay ngọc chi có màu trắng Tên khoa học là Fomitopsis officinalis Bạch chi có vị cay tính bình không độc, ích phế khí, chữa ho nghịch hơi

Hình 1.3 Bạch chi Fomitopsis officinalis

Hoàng chi: Linh chi vàng hay kim chi, có vị ngọt, màu vàng Tên khoa học là

Laetiporus sulphureus Linh chi vàng có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần

Hình 1.4 Hoàng chi Laetiporus sulphureus

Hắc chi: Linh chi đen hay huyền chi có màu đen và vị mặn Tên khoa học là

Polyporus melanopus Hắc chi có tác dụng ích thận khí, khiến cho đầu óc sản khoái

và tinh tường

Hình 1.5 Hắc chi Polyporus melanopus

Tử chi: Linh chi tím hay Mộc chi, màu tím có vị ngọt Tên khoa học là Ganoderma sinense Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi đẹp

Hình 1.6 Tử chi – Ganoderma sinense

Gần đây khi đã tìm ra được phương pháp gây giống, những nhà khoa học Nhật Bản chứng minh được rằng những cây nấm có màu sắc khác nhau không phải vì khác loại

mà chỉ vì môi trường và điều kiện sống khác nhau Nếu thay đổi điều kiện người ta

có thể có được sáu loại từ cùng một giống

Hình 1.7 Phân loại linh chi theo màu sắc

Ngoài cách phân loại Linh chi theo màu sắc, người ta còn có thể phân loại linh chi theo các đặc điểm như:

- Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 20oC – 23oC

- Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 24oC – 26oC

- Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 27oC – 30oC

Do đó, có thể thấy rằng Linh chi không những đa dạng về chủng loại mà còn đa dạng

về sinh thái, đây là loại nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N 189) Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại, từ khi xác lập một chi riêng là Ganoderma

Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ biến nhất là Ganoderma lucidum

có tới 45 loại

Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành công

trong phòng thí nghiệm năm 1978 Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi đỏ đặc sắc của các rừng cây Lim miền Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào nuôi trồng chủ động

1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi

Về hình thái ngoài, chúng cũng có ít nhiều sai khác

1.1.2.1 Cuống nấm

Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3cm, cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi uốn khúc Lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen, bóng, không có lông phủ trên mặt tán nấm

1.1.2.2 Mũ nấm

Mũ nấm: khi non hình trứng, lớn dần hình quạt Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi

khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia

rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâu đen, được bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang xếp sít nhau kiểu hàng rào và có đầu sợi dầy thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 - 10μm Chính những tế bào

vỏ này tạo nên lớp vỏ bền vững và bóng như vecni cho nấm Lớp vỏ láng phủ suốt theo cuống Kích thước tán biến động từ 2 – 30cm, dày 0,8 – 2,5cm, cuống dài từ 2,5 – 3,5cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính từ 0,5 – 2,2cm) phần đính cuống hoặc gồ lên hoặc lõm như lõm rốn Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8cm màu vàng kem – nâu nhạt – trắng Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ Hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan mạnh trong cồn Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu được mưa, nắng Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử

1.1.2.3 Thụ tầng

Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 – 1,7 cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5 ống/mm Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy, không màu, dài

16 - 22μm Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpose) phồng căng hay lõm thụt vào mà thành

1.1.2.4 Bào tử nấm Linh chi

Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào tử, tức

là hạt giống hữu ích cho đời sau Bào tử đảm thường được mô tả có dạng trứng cụt Đôi khi có tác giả mô tả là dạng hình trứng có đầu chóp tròn – nhọn Thực ra đó là

do chụp phủ lớp nảy mầm hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành Mỗi bào tử được bao phủ với hai lớp tường rất khó khăn gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999), màu vàng mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu, kích thước bào tử rất nhỏ dao động ít nhiều khoảng từ 5-6 x 8,5 – 12 μm Vỏ bào

tử khá dày, cỡ 0,7 – 1,2 μm, có cấu trúc phức tạp Bào tử nấm Linh chi có hai lớp vỏ rất cứng, khó nảy mầm Bào tử Linh chi có chứa các thành phần giống nấm Linh chi: Polysacharide, triterpenoid, acid béo, acid amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng, với

hàm lượng đậm đặc hơn Linh chi từ 7 – 20 lần (Nguyễn Thị Sáu, 2014) Cho đến nay, hơn 150 triterpenoids đã được phát hiện Do những tiến bộ gần đây trong quang phổ hiện đại và kỹ thuật quang phổ, một loạt các triterpenoids được phân lập từ bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược sĩ Từ năm 1988 các nhà khoa học đã phân lập được 29 triterpenoids bao gồm cả cấu trúc

và hoạt tính sinh học của chúng

Bảng 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác

nhau (Lê Xuân Thám, 1996)

9 – 13 x 6 – 8

7 – 12 x 6 – 8

7 – 12 x 6 – 8 7,5 – 10 x 5 – 6,5

9 – 13 x 5 – 7 8,2 – 11,5 – 13,5 x 6,3 – 7,5 – 8,1

9 – 12 x 5,5 – 8

10 – 11,8 x 6,8 – 7,8

7 – 8 x 6 – 7,8

9 – 11 x 6 – 7 8,5 – 11,5 x 5 – 7

9 – 12 x 5 – 7

8 – 10,5 x 5 – 7 7,5 – 11,5 x 5,5 – 7

Đông Dương Nhật Bản Trung Quốc Indonesia, Úc châu Anh quốc

Bắc Âu, Phi châu Đông Phi châu Bắc Việt Nam Argentine

Bồ Đào Nha Bắc Mỹ Bắc Mỹ Bắc Âu Trung Quốc Đài Loan

Hà Bắc, Việt Nam Lạng Sơn Việt Nam

Đà Lạt Việt Nam Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào tử bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất

mịn Tuy vậy số lượng bào tử linh chi rất ít Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ chỉ thu được 1 kg bào tử

Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấu tạo tinh vi của bào tử đảm thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, Trung Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt Rõ ràng kiến tạo lỗ thủng trên bề mặt lớp vỏ ngoài là phổ biến Lỗ nảy mầm hình tròn, khá lớn, là đặc điểm quan trọng phổ biến ở các loài Ganoderma (đường kính 3,2 – 4,2μm) Thuật ngữ “germpore” là tương đương định nghĩa “aperture” do Erdtman đưa ra (1952) – là chỉ vùng mà tại đó

vỏ bào tử mỏng đi rất nhiều, nơi mầm sợi nấm nguyên thủy (hay mầm ống phấn trong trường hợp của tiểu bào tử ở thực vật) nhú ra khi nảy mầm (germination) Trên lớp

vỏ ngoài thấy rõ các trụ chống – chính là khái niệm “gai chống” theo nhiều tác giả khác Đỉnh các trụ nổi gồ thành các mụn cóc – gò hạt Các trụ chống chính là tầng cột theo phân loại của G.Erdtman (1952) (columellae), các trụ đuợc nối với nhau bởi các vách mỏng chống từ tầng nền tới tầng phủ, chúng tạo thành các xoang rỗng của lớp ngoài, nhờ đó tạo khả năng bảo vệ cao cho vỏ bào tử

Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường cản quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học Cấu trúc của lớp vỏ trong cho đến nay còn chưa được biết rõ Cần lưu ý rằng: khái niệm “gai chống nhọn”

từ màng trong đâm sát màng ngoài của hầu hết các mô tả trước đây không chính xác Thực chất các gai hay chính các cột chống hầu như không nhọn, mà phình đầu thành các u lồi – và chính các u lồi này đội lớp màng phủ trong suốt ngoài cùng (episporium, exosporium hay chính là tầng phủ tectum), tạo thành các kiến trúc gò hạt – mụn cóc – u nhú trên bề mặt vỏ bào tử Điều này Heim (1962), Hansen (1958), Perreau (1973), Mims et al (1989) đã từng phân tích và thảo luận nhiều

Hình 1.8 Hình thái giải phẫu thể quả nấm linh chi Ganoderma lucidum

Hình 1.9 Các kiểu bào tử đảm đặc thù của họ Linh chi Ganodermataceae 1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử) 2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử xẻ múi

ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma)

Bào tử nấm Linh chi chứa các vật liệu di truyền và các chất sinh học, nó có giá trị về dược phẩm lớn hơn quả thể, tuy nhiên hoạt chất trong bào tử nấm khó thu nhận, cho nên hầu hết các kết quả nghiên cứu về Linh chi được tiến hành bằng cách sử dụng quả thể

1.1.3 Chu kì sống của nấm Linh chi

Hình 1.10 Chu kì sống của nấm Linh chi Bào tử đảm đơn bội, trong điều kiện thuận lợi, nảy mầm tạo nên hệ sợi sơ cấp (primary hyphae) - trong thực nghiệm tỷ lệ nảy mầm khá thấp ở nhiệt độ 28oC – 30oC chỉ đạt

3 – 15% Hệ sợi sơ cấp đơn nhân, đơn bội mau chóng phát triển phối hợp với nhau tạo thành hệ sợi thứ cấp (tức hệ sợi song hạch), phát triển và phân nhánh rất mạnh tràn ngập khắp giá thể

Lúc này thường có hiện tượng hình thành bào tử vô tính màng dày - rất dày (gasterospores – Chlamydospores), chúng dễ dàng rụng ra và khi gặp điều kiện phù hợp sẽ nảy mầm cho ra hệ sợi song hạch tái sinh Hệ sợi thứ cấp sẽ phát triển mạnh đạt đến giai đoạn cộng bào tức là các vách ngăn được hòa tan Tiếp đó là giai đoạn sợi bện kết để chuẩn bị cho sự hình thành mầm móng thể quả (primordial) Đây chính

là giai đoạn phân hóa hệ sợi Từ hệ sợi nguyên thủy hình thành các sợi cứng màng dày, ít phân nhánh, bện kết lại thành các cấu trúc bó được cố kết bởi các sợi bện phân nhánh rất mạnh Từ đó hình thành các mầm nấm màu trắng mịn vươn dài thành các trụ tròn mập Phần đỉnh trụ bắt đầu xòe thành tán, trong lúc lớp vỏ láng đỏ cam xuất hiện Tán lớn dần hình thành bào tầng và bắt đầu phát tán bào tử đảm liên tục cho đến khi nấm già sẫm màu, khô tóp và lụi dần trong 3 – 4 tháng

Nấm Linh Chi có thể mọc trên cây gỗ (thường là thuộc bộ đậu Fabales) sống hay đã chết Quả thể gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng 5 – tháng 11), có thể trên thân cây (cuống thường ngắn), quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây (khi ấy cuống thường dài và có thể

phân nhánh) Nấm thường mọc tốt dưới bóng rợp, ánh sáng khuếch tán nhẹ Do có lớp vỏ láng đỏ Linh Chi có thể chịu nắng rọi – khi đó thường xuất hiện lớp phấn ánh xanh tím, có thể chịu mưa liên tục Ở những vùng thấp rõ ràng là ưu thế của các chủng chịu nhiệt độ cao (28oC – 35oC) như ở vùng châu thổ sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long (quanh TP Hồ Chí Minh) Ở vùng núi đồi vĩ độ cao (>1000m) thường có các chủng ôn hòa, thích hợp nhiệt độ thấp hơn (21oC – 26oC) – như vùng Đà lạt, Sapa, Tam Đảo, Tây Nguyên…ở nước ta Nếu theo các tư liệu cổ thì Linh Chi của vùng rừng sâu, núi cao được coi là linh thiêng quí giá

1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi

1.1.4.1 Dinh dưỡng

Nguồn carbon: nguồn carbon chủ yếu là đường glucose, saccharose, maltose, tinh bột, pectin, lignin, cellulose, hemicelluloses, từ đó chúng tổng hợp năng lượng và tạo thành các chất cần thiết

Nguồn nitơ hữu cơ: protein, pepton, acid amin, ngoài ra có thể hấp thu urê, muối amon, sulphate amon Nitơ không được quá nhiều làm cho sợi nấm mọc nhiều khó hình thành quả thể Trong giai đoạn sinh trưởng sợi nấm, tỉ lệ C/N là 25/1 Giai đoạn hình thành thể quả, tỉ lệ là 30/1 hoặc 40/1

Nguyên tố vi lượng: Ca, P, Mg, K nguồn vi lượng đó chỉ thêm trong quá trình nuôi cấy giống mẹ, còn khi trồng thì chúng có trong nước và nông sản phẩm

1.1.4.2 Nhiệt độ

Thích hợp nhất là 22 – 28oC Khi nuôi cấy tầng sâu nhiệt độ thích hợp là 28oC không thấp hơn 27oC Thông thường nhiệt độ thích hợp cho Linh chi phát triển là 24 – 28oC Nhiệt độ không nên thay đổi lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó phát triển thành tán

mà ở dạng sừng hươu, dạng đuôi gà

1.1.4.3 Độ ẩm

Hàm lượng nước môi trường thường là 65% là vừa, quá nhiều hoặc quá ít sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển sợi nấm Độ ẩm không khí nên giữ ở 85 – 95%, nuôi cấy trong phòng cần giải quyết vấn đề về độ ẩm và thông thoáng gió

1.1.4.5 Không khí

Nấm Linh chi là loài hiếu khí vì vậy cần thông gió, giữ độ ẩm và nhiệt độ thích hợp Khi nuôi cấy nấm trong tầng lỏng cần lắc 100 – 150 vòng/phút Lắc mạnh dễ làm sợi nấm đứt đoạn

al (1999)) Trong một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau et al (2001)

đã xác định được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm linh chi gồm: tro (1,8%),

carbonhydrate (26 - 28%), chất béo thô (3 - 5%), chất xơ (59%) và protein (7 - 8%) Hàm lượng của protein trong nấm linh chi khoảng 7- 8%, thấp hơn so với nhiều loại nấm khác (Chang et al (1996); Borchers et al (1999)) Ngoài ra trong nấm còn chứa các glycoprotein và các polysaccharide

Bên cạnh đó, nấm linh chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh học như các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của chúng Hoạt tính sinh học của nấm linh chi có được chủ yếu là do các polysaccharide, peptidoglycan và các triterpen mang lại (Boh et al (2007)

1.1.5.2 Triterpenoid

Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có cấu trúc hóa học dựa trên cơ sở các phân tử isopren liên kết lại với nhau, công thức tổng quát (C5H8)n với n ≥ 2, tuy isopren là dẫn xuất của terpenoid nhưng pharnesyl pyrophosphate mới là chất liệu cơ bản để sinh tổng hợp terpenoid (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2010) Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lượng chất béo Triterpene là một phân lớp của terpenoid được phân bố rộng rãi trong giới động vật, thực vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycosid Cấu trúc hóa học của triterpen có thể

là mạch hở 3, 4, hoặc 5 vòng với 33 khung sườn cacbon chính (Jose D Connolly et

al (1991)) Khối lượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc hóa học phức tạp và có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato et al (1997)); Zhou et al (2007))

Trong nấm linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng lanostane, đây là chất tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình thành nên các squalene mạch vòng (Haralampidis et al (2002)) Trong quá trình chiết xuất triterpene, người ta thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetone, chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng Dịch chiết sau đó sẽ được phân tách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông thường hoặc HPLC pha nghịch đảo (Chen et al (1999); Su et al (2001)) Những triterpene đầu tiên được Kubota phân tách từ nấm linh chi là ganoderic acid A và B (Kubota et al (1982)) Kể từ khi đó, hơn 100 loại triterpene cùng với cấu hình của chúng đã được

tìm ra Trong số đó, có hơn 50 loại là đặc trưng chỉ được tìm thấy trong nấm linh chi

Đa số các triterpene là các ganoderic và lucidenic acid, nhưng cũng có một số loại khác như là ganoderal, ganoderiol và ganodermic acid (Jiang et al (2008))

Nấm linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phần tạo nên vị đắng của nấm linh chi Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể Tuy nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm linh chi lại không ổn định Chúng phụ thuộc rất nhiều vào giống, loài, nơi trồng, điều kiện canh tác cũng như phương pháp chế biến, điều này đã được thể hiện trong một nghiên cứu của Chen và Su được tiến hành vào năm 1999 và 2001 (Chen et al (1999); Su et al (2001)) Cho đến nay, hơn 150 triterpenoids đã được tìm thấy từ quả thể của nấm Linh chi đại diện cho năm lớp cấu trúc chính So với quả thể của nấm Linh chi, các nghiên cứu về bào tử của nấm Linh chi mới bắt đầu từ năm 1988 (Hou CY et al (1988)), cho đến nay đã có 29 loại triterpenoids đã được tìm thấy trong bào tử này Với những tiến bộ gần đây trong quang phổ và trắc phổ kỹ thuật hiện đại, một loạt các triterpenoids được phân lập từ các bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược

sĩ Tất cả các triterpenoids trong các bào tử của nấm Linh chi có quá trình tổng hợp tương tự nhau, cụ thể là con đường acid mevalonic (MVA) (Bingji Ma et al (2011)) Các Triterpenoids này được bắt đầu từ trans - squalene và sau đó đã được thay đổi bởi quá trình oxy hóa, giảm, khử acid, tạo vòng, sắp xếp lại, tạo ra nhiều loại cấu hình triterpenoids trong bào tử của nấm Linh chi

Triterpenoids được cô lập từ bào tử Linh chi cho thấy khả năng kháng HIV-1 protease, chống khối u, và các hoạt động chống bổ sung Triterpenoids này là thành phần hoạt chất chính của bào tử Linh chi và biểu thị cho các hoạt tính sinh học khác nhau được

sử dụng trong dược liệu

Hình 1.11 Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi

(Bingji Ma et al (2011))

Hình 1.12 – 29 Triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma et al (2011))

 Triterpenoids được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi

Năm triterpenoids đã được cô lập từ phần trong ether - tan của bào tử của nấm Linh chi và trên cơ sở tính chất hóa học và dữ liệu quang phổ, acid ganopsoreric A (1), acid ganoderic B (2), acid ganoderic C1 (3), acid ganoderic E (4) và

ganodermanontriol (5) được xác định tương ứng (Bingji Ma et al (2011)) Thí nghiệm dược lý cho thấy acid ganopsoreric A có có hoạt tính GTP thấp đối với gan chuột bị tổn thương bởi CCl4 và GaNI (Chen RY et al (1993)) Hai triterpenoids pentacyclic mới, có tên ganosporelactone A (6) và B (7) được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi,

có thể được bắt nguồn từ khung lanostane thông qua việc hình thành liên kết C18 và C23 (Chen RY et al (1991)) Hai triterpenes lanostane kiểu mới, lucidumol A (8) và

β - acid ganoderic (9), cùng với một lucidumol B (10) và bảy triterpenoids đã biết, ganodermanondiol (11), ganoderiol F (12), acid ganoderic A (13), acid ganolucidic

A (14), và 2, 3, 5 Trong số các hợp chất cô lập, các hợp chất 5, 10, 11 và 14 cho thấy khả năng kháng virus gây suy giảm miễn dịch (kháng HIV) - 1 protease hoạt động đáng kể với giá trị IC50 với giá trị 20 - 90 mM (Min BS et al (1998))

Sáu triterpenes lanostane loại oxy hóa cao mới, được gọi là ganoderic acid γ (15), acid ganoderic δ (16), acid ganoderic ε (17), acid ganoderic ξ (18), acid ganoderic η (19), acid ganoderic θ (20), cùng với ganolucidic axit D (21) và axit ganoderic C2 (22) được phân lập từ các bào tử nấm Các khả năng gây độc của các hợp chất 15-21

đã được thực hiện trong ống nghiệm chống Meth - A và LLC dòng tế bào ung thư (Min BS et al (1998)) Một terpenoid C27 oxy hóa cao mới, lucidenic axit SP1 (23), được phân lập từ một phần CHCl3-tan của bào tử nấm Linh chi cùng với mười một triterpenoids, acid ganoderic C6 (24), acid ganoderic G (25), và 2, 3, 5, 8, 9, 11, 12,

13, 14

1.1.5.3 Hợp chất saponin

Saponin là một nhóm chất trao đổi thứ cấp quan trọng trong thế giới thực vật Tên gọi của saponin bắt nguồn từ từ sapo trong tiếng latin, có nghĩa là xà phòng Saponin có tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao, từ 200oC trở lên và có thể trên

300oC Saponin bị tủa bởi chì acetate, hydroxide barium, sulphate amonium nên lợi dụng chất này để cô lập saponin Về phương diện hóa học, saponin được xác định gồm các cấu trúc khác nhau: triterpenoids, glucosylated steroids steroidal alkaloids

Khả năng dược tính: trị long đờm, chữa ho, chất phụ gia cho một số vaccine, thông tiểu, kháng viêm, chống khối u

1.1.5.4 Những thành phần khác

Tiến hành phân tích thân nấm linh chi, người ta còn tìm thấy thành phần chất khoáng như phospho, silicon, sulfur, kali, calcium và magnesium chiếm một tỉ lệ khá cao Bên cạnh đó còn có sắt, nhôm, kẽm, đồng, mangan và strontium với hàm lượng thấp hơn Ngoài ra còn có một số kim loại nặng như chì, cadmium và thủy ngân (Chen et

al (1998)) Trong một nghiên cứu của Chiu được tiến hành vào năm 2000, khi phân

tích nấm linh chi hoang thuộc loài Ganoderma spp, ông đã xác định được trong hàm

lượng chất khoáng của loại nấm này có chứa 10,2% là kali, calcium và magnesium Cũng trong một nghiên cứu khác thì Falandysz đã không tìm thấy cadmium và thủy ngân trong những mẫu nấm linh chi, nhưng hàm lượng selenium được xác định là 72 µg/g

Trong thành phần của nấm linh chi (Ganoderma spp) có một chất cũng nhận được rất

nhiều sự quan tâm, đó là germanium Đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5 trong các chất khoáng (489 µg/g) có trong nấm linh chi Chất này tồn tại rất ít ở các loại thực vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm, lô hội và tỏi Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu, nhưng chỉ cần một liều lượng thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch, kháng khối u, chống oxy hóa và chống đột biến (Kolesnikova et al (1997))

Những hợp chất khác cũng được tìm thấy trong nấm linh chi đó là các loại enzyme như metalloprotease (đây là loại enzyme có tác dụng trì hoãn quá trình đông máu) Ngoài ra, ergosterol (provitamin D2), các nucleoside và các nucleotide (như adenosine và guanosine) cũng đã được tìm thấy trong nấm linh chi, đây là những hợp chất có tác dụng ức chế thuận nghịch α-glucosidase và SKG-3

1.1.6 Công dụng của nấm Linh chi

1.1.6.1 Phòng ngừa ung thư

Nấm linh chi được sử dụng phổ biến trong quá trình hỗ trợ điều trị ung thư nhằm giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho các bệnh nhân bên cạnh áp dụng những liệu pháp

chữa trị thông thường Mặc dù hiện nay quá trình điều trị bệnh ung thư đã có những tiến bộ nhất định thông qua việc chẩn đoán bệnh sớm cũng như những phương pháp hoá trị hiện đại, tuy nhiên việc chữa dứt điểm các căn bệnh này vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn thử thách (theo WHO 2008) Trong quá trình tìm kiếm những phương pháp điều trị và những tác nhân hoá trị mới, người ta đã tìm ra trong hàng trăm loài thực vật, trong đó có cả nấm linh chi, những hoạt chất sinh học có khả năng ngăn chặn quá trình hình thành khối u (Wasser et al (1999); Borchers et al (2008)) Trong nấm linh chi có một lượng lớn những hợp chất hoá học có thể được chiết xuất từ thân nấm, sợi nấm và bào tử Trong đó, các polysaccharide và triterpene là 2 nhóm hợp chất chính trong nấm linh chi có tác dụng ngăn ngừa ung thư và ngăn chặn quá trình hình thành khối u Một trong những tác dụng mới được tìm thấy của dịch chiết nấm linh chi là

có khả năng hỗ trợ điều trị cho các căn bệnh mãn tính, ví dụ như bệnh ung thư và bệnh liên quan đến gan (Bao X et al (2005)) Những thí nghiệm trên động vật đã cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc ức chế sự hình thành và di căn của các tế bào ung thư Tuy nhiên, việc tiến hành những thí nghiệm này trên cơ thể người vẫn còn hạn chế

1.1.6.2 Tăng cường khả năng miễn dịch

Những tác nhân giúp làm tăng khả năng hoạt động của hệ miễn dịch cũng có tác dụng tăng cường sức khoẻ, qua đó giúp ngăn ngừa bệnh tật Nhiều thành phần trong nấm linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào lympho, các bạch cầu đơn nhân, các tế bào NK (natural killer cells) (Bao

et al (2001); Cao et al (2002)) Trong một nghiên cứu của Chang et al (2009) được tiến hành trên chuột BALB/c cho thấy dịch chiết nấm linh chi chứa nhiều polysaccharide có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào spleno và hoạt tính của các đại thực bào và các tế bào NK

Trong một nghiên cứu khác của Wang et al (1997), polysaccharide có trong nấm linh chi có tác dụng làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lympho T và các đại thực bào, bằng cách làm tăng hàm lượng IL- 1β, TNF-α và IL-6 Cũng trong một nghiên cứu khác, quá trình ủ của các đại thực bào và các tế bào lympho T bằng các

polysaccharide đã cho thấy hàm lượng TNF- α và INF- γ tăng lên (Zhang et al (1999))

1.1.6.3 Khả năng chống oxy hóa

Những hợp chất chống oxi hoá trong thực vật có tác dụng ngăn ngừa ung thư cũng như những căn bệnh nan y khác (Collins et al (2005); Benzie et al (2009)) Những hợp chất này có tác dụng bảo vệ các thành phần có trong màng tế bào chống lại những tổn thương do quá trình oxy hoá gây nên, qua đó giúp làm giảm những nguy cơ gây

ra đột biến và ung thư cũng như góp phần bảo vệ các tế bào miễn dịch Những hợp chất có trong nấm linh chi chủ yếu là các polysaccharide và các triterpene cũng có tác dụng chống lại quá trình oxy hoá tế bào (Lee et al (2001); Lin et al (2002); Shi

et al (2002); Wachtel-Galor et al (2005))

1.1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường

Những thành phần của nấm linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường huyết đối với động vật Các ganoderan A và B là hai polysaccharide được chiết tách

từ thân nấm linh chi, sau khi được tiêm cho chuột bị tiểu đường với liều lượng 100 mg/kg, cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm và tác dụng hạ đường huyết vẫn tiếp tục kéo dài suốt 24 giờ (Hikiko et al (1985)) Cũng trong một thí nghiệm trên chuột, ganoderan B có tác dụng làm tăng lượng insulin, qua đó làm giảm hàm lượng glucose trong máu và điều chỉnh quá trình tổng hợp glucose dưới tác dụng của các enzyme có sẵn trong gan (Hikiko et al (1989)) Trong một nghiên cứu khác cũng được tiến hành trên chuột, người ta đã chứng minh được rằng một polysaccharide khác có trong nấm linh chi được gọi là ganoderan C cũng có tác dụng hạ đường huyết (Hikiko et al (1989))

1.1.7 Nghiên cứu về bào tử nấm Linh chi

Trong các nghiên cứu gần đây, bào tử của nấm Linh chi chứa một số hoạt chất sinh học phong phú hơn nhiều so với trong quả thể của chúng (Chaiyavat Chaiyasut et al, 2010) Tuy nhiên, với bào tử của nấm Linh chi được cấu tạo phức tạp với 2 lớp vách rất cứng và bền vững, hai lớp vách này có thành phần gồm silica (19,01%), canxi (19,01%) và chitin (52,08 - 57,64%) (Jungjing et al, 2007.) nên đã làm hạn chế rất

nhiều khả năng thu nhận các hoạt chất sinh học này

Daniel Sliva, Ph.D et al., 2003 đã tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư vú trên chuột với các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi như: bào tử còn nguyên, bào tử bị phá vỡ, bột quả thể, dịch chiết của quả thể và bào tử với các nguồn cung cấp khác nhau và đã thu được kết quả như bảng 1.1.2

Bảng 1.2: So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái

khác nhau của nấm Linh chi (2.5mg/mL)

chế tế bào ung thư

ReishiMaxf Mỹ Dịch chiết quả thể

và bào tử

99%

Từ những nhận định và kết quả thí nghiệm nêu trên cho ta thấy việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi nhằm tăng khả năng dược liệu của nó cần được quan tâm Trong những năm gần đây đã có nhiều sáng chế tiết lộ phương pháp phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi Ví dụ: patent JP52041208 tiết lộ quá trình chiết xuất các thành phần sinh học của bào tử bằng phương pháp sử dụng biện pháp cơ học, JP2240026A tiết lộ việc sử dụng các dung môi để phá vỡ, CN1165032 tiết lộ phương pháp phá vỡ bằng cách sử dụng enzyme hòa tan như lysozyme, cellulose và hemicellulase, lạnh đông và dùng sóng

siêu âm Hay theo patent CN 101596220 A của Trung Quốc, bào tử nấm Linh chi được phá vỡ bằng một số phương pháp sinh học như: sử dụng enzyme hòa tan để thủy phân vách bào tử hay sử dụng một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy lớp vách này nhằm tăng cường hiệu quả sử dụng các hoạt chất sinh học có trong bào tử mà chi phí thấp và hiệu quả tương đối cao Cũng theo patent này ngoài biện pháp sinh học

để phá hủy lớp vách của bào tử, còn có thể sử dụng một số biện pháp hóa học như dùng dung dịch có tính acid hay kiềm để làm bào mòn lớp vách, tuy nhiên, với phương pháp hóa học này sẽ làm ảnh hưởng đáng kể khả năng hoạt động của các hoạt chất sinh học có trong bào tử và dư lượng của các loại hóa chất dùng cho quá trình phá vách bào tử có thể làm ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như sức khỏe Ngoài ra, một số biện pháp vật lý: sóng siêu âm, vi sóng, nhiệt độ thấp, lạnh đông… cũng được

sử dụng nhưng nhìn chung khả năng làm suy yếu lớp vách của bào tử còn thấp và chi phí đầu tư cao

Trong một nghiên cứu khác của Chaiyavat Chaiyasut, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun năm 2010 ở Thái Lan, bào tử của nấm Linh chi được phá vỡ bằng

cách lên men với Lactobacillus plantarum với kỹ thuật rất đơn giản, ít chi phí Nó có

thể được sử dụng để sản xuất các loại thực phẩm lên men với các lợi ích từ bào tử nấm Linh chi và vi khuẩn lên men lactic Trong đồ án này, tôi đã thực hiện phá vỡ bằng phương pháp lạnh đông bào tử nấm Linh chi kết hợp sử dụng enzyme dịch nuôi

cấy từ nấm Trichoderma harzianum T2 là nấm mốc kí sinh trên nấm Linh chi cùng

với chế phẩm enzyme Cellulase C32002 của Novozyme để phá vách bào tử nấm Linh chi