Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm linh chi ganoderma licidum kết hợp enzyme và siêu âm

Giả sử hàm lượng polysaccharide tổng và lipid trong mẫu không siêu âm là 100% từ đó tính ra được% polysaccharide tổng và lipid của các mẫu còn lại nhằm so sánh ảnh hưởng của siêu âm lên

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THIẾT LẬP QUY TRÌNH PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM

LINH CHI GANODERMA LUCIDUM KẾT HỢP VỚI

ENZYME VÀ SIÊU ÂM

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : ĐẶNG THỊ KIM TUYỀN

TP Hồ Chí Minh, 2018

trích dẫn trong đồ án này đều được ghi rõ nguồn gốc.

TP Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Kim Tuyền

sắc đến họ vì đã giúp tôi đạt được thành quả như hôm nay.

Lời đầu tiên tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Thànhphố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện để tôi được học tập thật tốt tại trường trong thời gianqua và quý Thầy (Cô) của Viện Khoa học Ứng dụng lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự hào vì

đã được học tập tại đây Bên cạnh đó, để hoàn thành được bài báo cáo này, tôi xin chânthành cảm ơn TS Nguyễn Hoài Hương đã tận tình chỉ dạy tôi, cho tôi thêm động lựcmỗi khi gặp khó khăn, nhờ có cô tôi mới có thể hoàn thành tốt nhất đề tài của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn làm đồ án tại phòng thí nghiệmCông nghệ Sinh học, trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và các emNguyễn Bảo Trân, Nguyễn Ngọc Gia Bảo và Hồ Lí Hải Vân (15DSH) đã giúp đỡ tôi

và nhóm thực hiện đề tài nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Ngoài ra tôi cũng xin cảm ơn quý Thầy (Cô), các anh chị phụ trách phòng thínghiệm khoa Dược, trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ tôi

về thiết bị và dụng cụ để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các bạn bètôi, đã luôn quan tâm, động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành báo cáo

Trong quá trình hoàn thiện báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót nhất định

mà tôi chưa thể khắc phục nên tôi rất mong nhận được sự góp ý của quý Thầy (Cô) để

đề tài này được hoàn chỉnh hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Đặng Thị Kim Tuyền

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 4

1.1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi 4

1.1.1.1 Phân loại 5

1.1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi 8

1.1.2 Bào tử nấ m Linh chi 9

1.2 Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 12

1.2.1 Các polysaccharide và peptidoglycan 15

1.2.2 Triterpenes 17

1.2.3 Saponin 22

1.2.4 Acid béo 23

1.2.5 Các thành phầ n khác 24

1.3 Công dụng của nấm Linh chi và bào tử Nấm Linh chi 24

1.3.1 Phòng chống ung thư 26

1.3.2 Khả năng kháng oxi hóa 27

1.3.3 Điều trị bệnh đái tháo đường 28

1.3.4 Điều trị các bệnh về tim mạch 28

1.3.5 Tăng cường hệ miễn dịch 29

1.4 Phương pháp phá vỡ và trích ly hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi 29

1.4.1 Enzyme chitinase 30

1.4.2 Giới thiệu về siêu âm phá tế bào 33

1.4.2.1 Khái niệm 33

1.4.2.2 Bản chất của sóng âm 34

1.4.2.3 Nguyên lý tác động của sóng siêu âm 34

1.4.2.4 Tác động của sóng siêu âm lên tế bào 36

1.4.2.5 Ứng dụng của sóng siêu âm 36

1.4.2.6 Thiết bị phát sóng siêu âm 37

1.4.3 Các phương pháp phá vỡ bào tử nấm Linh chi 38

1.4.4 Phương pháp trích ly hoạt chất thu dầu bào tử 41

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

2.1 Vật liệu nghiên cứu 46

2.1.1 Vật liệu 46

2.1.2 Nơi thực hiện 46

2.1.3 Thời gian thực hiệ n 46

2.1.4 Thiết bị - dụng cụ và hóa chất 46

2.1.4.1 Thiết bị 46

2.1.4.2 Dụng cụ 47

2.1.4.3 Hóa chất – Môi trường nuôi cấy 48

2.2 Phương pháp nghiên cứu 52

2.2.1 Thu enzyme chitinase bằng lên men thể rắn 54

2.2.1.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma harzianum T2 trên môi trường thạch PDA 55

2.2.1.2 Phương pháp hoạt hóa Trichoderma harzianum T2 5

5 2.2.1.3 Thu enzyme dịch trích ly bằng phương pháp tăng sinh trên môi trường rắn 55

2.2.1.4 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum T2 tối ưu hóa để thu enzyme chitinase 55

2.2.2 Khả o sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử nấm Linh chi 56

2.2.2.1 Phá vách bào tử nấm linh chi bằng phương pháp lạnh đông kết hợp sử dụng enzyme thương mại Cellulase (EC), dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum T2 (DTL) và siêu âm 57

2.2.2.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu 57

2.2.3 Khả o sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lý bào tử 60

2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học 61

2.2.4.1 Quy trình trích ly hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi 63

2.2.4.2 Định tính một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi 65

2.2.4.3 Định lượng một số hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi sau khi bị phá vỡ 67 2.2.4.4 Phương pháp kháng oxi hóa DPPH 69

2.2.4.5 Phương pháp thử độc tính tế bào artemia 71

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73

3.1 Thu enzyme chitinase trên môi trường lên men thể rắn 73

3.2 Ảnh hưởng c ủa siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi 74

3.3 Ảnh hưởng c ủa các chế độ tiền xử lí lạnh đông 78

3.4 Định tính thành phần hóa học sau khi phá vỡ bào tử nấm Linh chi 79

3.4.1 Định tính thành phầ n hóa học trong dịch phá vỡ bào tử 80

3.4.1.1 Định tính protein 81

3.4.1.2 Định tính saponin 82

3.4.1.3 Định tính polysaccharide 85

3.4.1.4 Định tính triterpenoid 85

3.4.2 Định tính thành phần hóa học còn lại trong vỏ bào tử phá vỡ bằng enzyme kết hợp siêu âm 87

3.4.2.1 Định tính protein 87

3.4.2.2 Định tính saponin 87

3.4.2.3 Định tính polysaccharide 88

3.4.2.4 Định tính triterpenoid 88

3.5 Định lượng các ho ạt chất thu được từ dịch phá vỡ và bào tử bị phá vỡ 90

3.5.1 Định lượng polysaccharide trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu âm và mẫu siêu âm bằng phương pháp Phenol – Sulfuric 90

3.5.2 Định lượng lipid trong dịch trích ly và bào tử của mẫu không siêu âm và mẫu siêu âm bằng phương pháp Adam – Rose – Gottlieb 92

3.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa 97

3.7 Thử độc tính tế bào trên Artemia nauplii 101

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 104

4.1 Kết luận 104

4.2 Kiến nghị 104

TÀI LIỆU THAM KHẢO 106

Tài liệu tiếng Việt 106

Tài liệu tiếng Anh 106

PHỤ LỤC A 1

PHỤ LỤC B 13

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PDA: Potato Dextro Agar

EC: Enzyme Cellulase C20032

DTL: Dịch trích ly

A.nauplii: atermia nauplii

DPPH: 1,1 - Diphenyl - 2 - picryl – hydrazyl

Trolox: 6 – Hydroxy – 2, 5, 7, 8 - tetramethychroman - 2 – carboxylic

CMC: Sodium carboxymethyl cellulose

DNS: acid - 2 - hydroxyl - 3,5 – dinitrobenzoic

DMSO: Dimethyl sulfoxit

ĐC: Đối chứng

KSA: Không siêu âm

SA: Siêu âm

SA 75%: Siêu âm độ khuếch đại 75%

SA100%: Siêu âm độ khuếch đại 100%

PHC: Pha hữu cơ

PN: Pha nước

DI: Diethyl ether

HE: Hexane

BT: Bào tử

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác

nhau (Lê Xuân Thám, 1996) 10

Bảng 1.2 Thành phần dược tính của nấm Linh chi 12

Bảng 1.3 Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi (Li JJ và cộng sự (2014)) 15

Bảng 1.4 So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2,5 mg/mL) 27

Bảng 1.5 Những nghiên cứu về phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi trên Thế giới 39

Bảng 1.6 Các phương pháp trích ly 41

Bảng 1.7 Các dung môi trong chiết xuất lipid của Ganoderma lucidum (CN1099455C) 44

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thử độc tính tế bào trên artemia nauplii 71

Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải chitin của enzyme chitinase thu được từ hai môi trường cơ chất (mm) 73

Bảng 3.2 Bảng so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi qua các ngày ủ enzyme 75

Bảng 3.3 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi qua các ngày 76

Bảng 3.4 Kết quả so sánh ảnh hưởng c ủa các chế độ tiền xử lí lạnh đông 78

Bảng 3.5 Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly bằng hai dung môi 81

Bảng 3.6 Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng diethyl ether 82

Bảng 3.7 Bảng ghi nhận kết quả chiều cao cột bọt (cm) bền theo thời gian khi định tính saponin theo thử nghiệm Fontan – Kaudel trích ly bằng hexane 84

Bảng 3.8 Kết quả định tính saponin khi trích ly bằng hai dung môi 85

Bảng 3.9 Kết quả định tính polysaccharide khi trích ly bằng hai dung môi 85

Bảng 3.10 Kết quả định tính triterpenoid khi trích ly bằng hai dung môi 86

Bảng 3.11 Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính thành phần hóa học trong dịch phá

vỡ bằng hai dung môi 86

Bảng 3.12 Kết quả định tính protein theo thử nghiệm biuret khi trích ly vỏ bào tử 87

Bảng 3.13 Kết quả định tính saponin theo thử nghiệm tạo bọt, Fontan - Kaudel khi trích ly vỏ bào tử 88

Bảng 3.14 Kết quả định tính polysaccharide theo thử nghiệm Molisch khi trích ly vỏ bào tử 87

Bảng 3.15 Kết quả định tính triterpenoid theo thử nghiệm Liebermann-Burchard khi trích ly vỏ bào tử 88

Bảng 3.16 Bảng tổng kết các thử nghiệm định tính phần vỏ bào tử 88

Bảng 3.17 Bảng tổng kết các thử nghiệm tất cả các pha khi trích ly dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử 89

Bảng 3.18 Hàm lượng polysaccharide có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm 91

Bảng 3.19 Bảng phân tích hàm lượng polysaccharide trong hai pha khi trích ly lỏng lỏng dịch phá vỡ bào tử bằng diethyl ether và hexane từ 100 g bào tử không siêu âm và siêu âm 92

Bảng 3.20 Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm 92

Bảng 3.21 Giả sử hàm lượng polysaccharide tổng và lipid trong mẫu không siêu âm là 100% từ đó tính ra được% polysaccharide tổng và lipid của các mẫu còn lại nhằm so sánh ảnh hưởng của siêu âm lên hàm lượng polysaccharide và lipid trong bào tử nấm Linh Chi 93

Bảng 3.22 Tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH c ủa đối chứng dương Trolox 97

Bảng 3.23 Tỉ lệ phần trăm (%) quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào tử 97

Bảng 3.24 Bảng giá trị IC50 (µg/ml) của các mẫu dầu bào tử 98

Bảng 3.25 Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất trong dung dịch nuôi c ấy Artemia nauplii của PHC SA (mg/ml) 101

Bảng 3.26 Tỉ lệ phần trăm chết của ấu trùng Artemia nauplii theo nồng độ hoạt chất trong dung dịch nuôi c ấy Artemia nauplii của BT SA (mg/ml) 102

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A), nấm mọc trong tự nhiên (B) và

nấm trồng (C) 5

Hình 1.2 Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần 11

Hình 1.3 Hình thái gi ải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum 11

Hình 1.4 Các kiể u hình bào t ử đặc thù của họ nấm Linh chi 12

Hình 1.5 Cấu trúc của Ganodermasides 14

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của polysaccharide trong nấm Linh chi 17

Hình 1.7 Công thức của một số triterpene trong nấm Linh chi (Kubota và cộng sự, 1982; Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba và cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48: 2905-7; Sato và cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887- 90; Budavari và cộng sự, 1989) 19

Hình 1.8 Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng sự, 2011) 20

Hình 1.9 Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma và cộng sự, 2011) 21

Hình 1.10 Các dạng s ản phẩm của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi 26

Hình 1.11 Cấu trúc chitin 31

Hình 1.12 Cơ chế ho ạt động của hệ enzyme chitinase 32

Hình 1.13 Quá trình phân hủy chitin thành chitosan và cellulose 33

Hình 1.14 Quá trình hình thành, phát triển và vỡ của bọt khí 36

Hình 1.15 Thiết bị phát sóng siêu âm dạng thanh 38

Hình 1.16 Máy phá mẫu, tế bào bằng sóng siêu âm Qsonica Q500 39

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 54

Hình 2.2 Sơ đồ thu enzyme chitinase bằng môi trường lên men thể rắn 54

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của siêu âm trong phá vỡ bào tử nấm Linh chi 57

Hình 2.4 Buồng đếm hồng c ầu Neubauer 58

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chế độ tiền xử lí bào tử 60

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học 62

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình trích ly bào t ử sau khi phá vỡ 64

Hình 2.8 Phương trình phản ứng định tính polysaccharide 66

Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải enzyme chitinase thu được từ hai môi trường cơ chất (mm) 73

Hình 3.2 Khả năng phân giải chitin của enzyme thu được từ hai môi trường 74

Hình 3.3 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của độ khuếch đại đến tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi qua các ngày 76

Hình 3.4 Bào tử nấm Linh chi soi dưới kính hiển vi (X400) 76

Hình 3.5 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng c ủa siêu âm lên tỉ lệ phá vỡ bào tử nấm Linh chi 77 Hình 3.6 Biểu đồ so sánh tỉ lệ phá vỡ (%) bào tử nấm Linh chi qua các chế độ tiền xử lí 79

Hình 3.7 Hai pha dịch trích ly lỏng lỏ ng bằng diethyl ether 81

Hình 3.8 Biểu đồ polysaccharide tổng (%) có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào t ử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm 92

Hình 3.9 Hàm lượng lipid có trong dịch phá vỡ bào tử và vỏ bào tử từ 100g bào tử phá vỡ vách bằng enzyme kết hợp siêu âm và không siêu âm. 93

Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của siêu âm đến hàm lượng polysaccharide tổng số và lipid có trong bào tử nấm Linh chi sau khi phá vỡ. 94

Hình 3.11 Quy trình đề nghị phá vách bào tử nấm Linh chi kết hợp enzyme và siêu âm 96

Hình 3.12 Biểu đồ so sánh tỉ lệ phần trăm quét gốc tự do DPPH của các mẫu dầu bào tử 98

Hình 3.13 Đường chuẩn DPPH của mẫu pha hữu cơ không siêu âm và siêu âm 99

Hình 3.14 Đường chuẩn DPPH của mẫu bào tử không siêu âm và siêu âm 99

Hình 3.15 Biểu đồ so sánh giá trị IC50 ( g/ml) của các mẫu dầu bào tử 100

Hình 3.16 Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ dầu bào tử PHC SA (mg/ml) 102

Hình 3.17 Phần trăm tỉ lệ chết của ấu trùng Artemia nauplii theo log nồng độ dầu bào

tử BT SA (mg/ml) 103

ĐẶT VẤN ĐỀTính cấp thiết của đề tài

Từ xưa đến nay, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được cho là một loại dược

liệu và đã có không ít người sử dụng làm thuốc Theo các tài liệu nghiên cứu, nấmLinh chi có nhiều công dụng trong việc hỗ trợ điều hòa huyết áp, tăng khả năng miễndịch cho cơ thể, hỗ trợ giải độc và cải thiện bệnh viêm gan mãn tính, xơ gan, thần kinhsuy nhược Có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạtchất và xác định tác dụng dược lý của nấm Linh chi như: Germanium, acid ganoderic,acid ganodermic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans, adenosin, beta – D – glucan…(đặc biệt trong nấm Linh chi có hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 -

8 lần) Các nhà khoa học Việt Nam tìm thấy trong nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố

vi lượng cần thiết cho sự vận hành và chuyển hóa của cơ thể như: đồng, sắt, kalium,magnesium, natrium, calcium Trong đó, triterpenoid và polysaccharide được xem làthành phần chủ yếu có trong nấm được chú ý nhiều nhất Chính vì lí do đó mà hiện nayviệc trồng và sử dụng nấm Linh chi đang trở nên rất phổ biến và được nhiều ngườiquan tâm

Bên cạnh đó, phần bào tử do nấm Linh chi phóng thích ra cũng có nhiều côngdụng bổ ích nhưng lại ít được quan tâm nghiên cứu trích ly hoạt chất Bào tử nấm Linhchi được cho là tinh chất của nấm Linh chi chứa nhiều chất dinh dưỡng và các đặc tínhdược lý, là sản phẩm rất tốt cho sức khỏe Tuy nhiên, cấu tạo bào tử nấm Linh chi gồm

2 lớp vỏ cứng, việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi để thu triệt để hoạt chất bên trong bào

tử là điều đáng được quan tâm

Ngày nay đã có các phương pháp nghiên cứu phá vỡ bào tử nấm Linh chi bằng

cơ học kết hợp enzyme… Phương pháp phá vỡ sử dụng biện pháp cơ học vẫn chưamang lại hiệu quả tối ưu Theo nghiên cứu của Ma Jingjing và cộng sự từ trường Đạihọc Vũ Hán, Trung Quốc (2007), vách bào tử nấm Linh chi chứa 57,64% là chitin, việc

sử dụng enzyme chitinase và cellulase trong việc phá vỡ bào tử nấm Linh chi là bướckhông thể thiếu Nhóm sinh viên HUTECH đã phân lập nấm Trichoderma từ nấm Linhchi phục vụ cho việc phá vách bào tử Ngoài ra, việc kết hợp với enzyme

thương mại giúp phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi, kết quả đã đạt được từ nghiên cứucủa sinh viên Nguyễn Thanh Liên Khương (khóa 13DSH) là 53.5% Trong khi đó đểtăng hiệu suất phá vỡ thì việc ứng dụng siêu âm giúp tăng tỉ lệ phá vỡ đến 74.3% Vìmuốn góp phần nâng cao tỉ lệ phá vỡ và chiết xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào

tử nấm Linh chi, nên nhóm thực hiện đề tài tiếp tục nghiên cứu các chế độ tiền xử và

áp dụng siêu âm trước và sau khi ủ bào tử với dịch enzyme Kết quả được trình bày

trong đồ án tốt nghiệp “Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi

Ganoderma licidum kết hợp enzyme và siêu âm”.

Mục đích: Thu hồi hoạt chất từ bào tử nấm Linh chi.

Mục tiêu: Thiết lập quy trình phá vách bào tử nấm Linh chi Ganoderma

licidum kết hợp enzyme và siêu âm.

- Khảo sát ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý lên tỉ lệ phá vỡ bào tử

- Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm lên thành phần hóa học, hoạt tính sinh họccủa bào tử nấm Linh chi

Kết quả đạt được của đề tài:

- Xác định môi trường lên men thể rắn thu enzyme chitinase để phá vỡ bào tửnấm Linh chi

- Thiết lập được chế độ tiền xử lý bào tử trước khi phá vỡ

- Thiết lập được quy trình phá vỡ bào tử kết hợp enzyme và siêu âm

- So sánh được thành phần polysaccharide tổng và lipid tổng của bào tử phá

vỡ bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm

- So sánh được hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết từ bào tử phá vỡ

bằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm

- Xác định được độc tính tế bào trên Artemia của cao chiết từ bào tử phá vỡbằng enzyme và kết hợp enzyme với siêu âm.

Hạn chế của đề tài:

- Chưa tối ưu hóa được thông số phản ứng enzyme như vận tốc khuấy đảoquy mô Phòng thí nghiệm

- Chưa tối ưu hóa được thông số siêu âm do hạn chế về thiết bị

- Hạn chế về việc khảo sát triterpenoid và các thành phần hoá học, hoạt tínhsinh học khác của bào tử phá vỡ

Phương pháp nghiên cứu

- Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm

- Đề tài được xử lí số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và Statisticals Analysis Systems (SAS)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

1.1.1 Giới thiệu về nấm Linh chi

Nấm Linh chi (tiếng Anh: Lingzhi mushroom) có tên khoa học là Ganoderma

lucidum, thuộc họ Nấm Lim (Ganodermataceae) Nấm Linh chi còn có những tên khác

như Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung được phân bố rộng rãi ở các nước ÁĐông và thường mọc trên các thân cây khô hoặc đã chết Ở một số nước Châu Á nhưTrung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan… nấm Linh chi được sử dụng như một loại dược thảothiên nhiên giúp cải thiện sức khỏe, tăng cường khả năng kháng tế bào ung thư

Đây là một loại nấm lớn, màu tối, vỏ ngoài nhẵn bóng và nhìn giống như một khúc gỗ

Trong tiếng Latin thì lucidus có nghĩa là “sáng bóng” hay “rực rỡ” và điều này cũng

tương thích với hình dáng bên ngoài của nấm Linh chi Ở mỗi nơi nấm Linh chi đượcgọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji(Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan) Ngoài ra còn một số tên gọi khác như nấm vạnniên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc) Theo 2 cuốn sách rất nổi tiếng mô

tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing – Thần Nông BảnThảo Kinh” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán), tác phẩm chuyêntập hợp những kinh nghiệm về dược thực vật từ đời Hán trở về trước và “Ben CaoGang Mil – Bản Thảo Cương Mục” của “Li Shi Zhen – Lí Thởi Trân” (1590 trướcCông nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6 chủng nấm được biết đến tại thời điểmlúc bấy giờ Trong đó có hơn 250 loại nấm Linh chi được đề cập Tuy nhiên, trong cácvăn bản cổ chỉ đề cập nhiều đến khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi đỏ

Hình 1.1: Nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) (A),

nấm mọc trong tự nhiên (B) và nấm trồng (C)

1.1.1.1 Phân loại

Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010)

Giới: Nấm – Mycota hay FungiNgành: Nấm thật – EumycotaNgành phụ: BasidiomycotinaLớp: Hymenomycetes

Lớp phụ: HymenomycetidaeBộ: Ganodermatales

Họ: GanodermataceaeChi: Ganoderma

Loài: Ganoderma lucidum

Từ thời cổ xưa có rất nhiều nhà nghiên cứu (cả ở Trung Quốc và phương Tây) đãtìm hiểu về loại nấm này và họ cũng đã đưa ra rất nhiều hệ thống để phân loại nấmLinh chi Những nhà nghiên cứu Trung Quốc cổ đại đã chia nấm Linh chi thành rấtnhiều loại khác nhau dựa vào thể quả cũng như hình dáng bên ngoài của nấm

Ở phương Tây, theo trình định danh có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này

Kể từ lần đặt tên đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học

Phần Lan xác định tên chính thức Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst đã mất

đến 100 năm (1881) Kể từ đó nấm Linh chi đỏ đã trở thành một đại diện tiêu biểu chochủng loại nấm này Về sau, đặc điểm phân loại của nấm Linh chi đã được thay đổi bởimột số nhà khoa học khác như Donk, Murrill, Furtano và Steyaert, sau khi họ đã tìm

ra những đặc tính khác của nấm Linh chi như các bào tử của nấm Linh chi có hình quảtrứng, lớp ngoài của thành tế bào tương đối mỏng và trong suốt, ngược lại lớp trongcủa thành tế bào lại dày, màu vàng nâu và có nhiều nốt nhỏ Cũng từ đó, nấm Linh chikhông còn được phân loại dựa vào màu sắc hay hình dạng bên ngoài nữa

Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh yTrung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màusắc và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi

- Xích Chi - Nấm Linh chi đỏ: còn được gọi là Đơn chi, Hồng chi có vị đắng,

thường được tìm thấy ở trên núi Huo Ganoderma lucidum là đại diện chính cho loài

nấm này Những đặc điểm của nấm Linh chi đỏ chính là nắp nấm có hình dạng giốngnhư quả thận hoặc hình bán nguyệt, màu nâu đỏ Thân nấm có dạng giống như mộtthân cây, cùng màu hoặc đậm hơn so với nắp nấm Nấm Linh chi đỏ giúp ích tâm khí,chủ vị, tăng trí tuệ Sử dụng Linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránhcác bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực

- Tử chi - Nấm Linh chi tím: còn được biết đến với tên gọi là Linh chi gỗ, màu tím

có vị ngọt Đặc điểm của loại nấm này là nắp nấm có màu nâu hoặc nâu tím Thể quả

có màu nâu, bào tử của chúng lớn hơn nấm Linh chi đỏ Ganoderma sinense là đại

diện của loài nấm này Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươiđẹp.

- Hoàng chi - Linh chi vàng: còn gọi là Kim chi, loại nấm này có màu vàng tím, có

vị ngọt Một cây nấm lớn có thể nặng khoảng 5 kg hoặc hơn, còn cây nấm non thì nặng

khoảng 1,5 đến 2 kg Laetiporus sulphureus là đại diện của loài nấm này Khi tươi thì

nấm này sẽ chứa rất nhiều nước, có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần

- Bạch chi - Linh chi trắng: còn gọi là nấm Linh chi ngọc bích, có màu trắng Theo

như Bao Puzi mô tả thì đây là loại nấm không có chất béo, Fomitopsis officinalis là đại

diện cho loài nấm này Loại nấm này có thể quả màu trắng, hình dáng giống như mộtcái móng ngựa Một cây nấm lớn có thể nặng đến nhiều kilogram Loại nấm nàythường mọc trên cây thông và một số loại cây lá kim khác Bạch chi có vị cay, tínhbình, không độc, ích phế khí, chữa ho nghịch hơi

- Hắc chi - Linh chi đen: còn gọi là nấm Linh chi xuân hay Huyền chi có màu đen

và vị mặn Loại nấm này thường mọc ở trong những thung lũng, nắp nấm bên ngoài cómàu đen bên trong có màu đỏ, thường mọc trên các thân cây, có vị mặn và đắng

Amauroderma rugosum và Polyporus melanopus là 2 đại diện chính của loài nấm này.

Cả cuống và nắp của 2 loại nấm này đều có màu đen Hắc chi có tác dụng ích thận khí,khiến cho đầu óc sản khoái và tinh tường

- Thanh chi – Linh chi xanh: còn gọi là nấm Linh chi rồng Theo Bao Puzi miêu tảthì nấm Linh chi xanh có hình dáng giống như những sợi lông của chim bói cá

Coriolus versicolar là đại diện tiêu biểu cho loài nấm này Đặc điểm của loài này là mũ

nấm cứng và bề mặt được bao phủ bởi những sợi lông ngắn Thanh chi giúp cho sángmắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng vàthoải mái

Trong mỗi loài nấm Linh chi lại được chia ra rất nhiều loại khác nhau Ví dụ như

nấm Linh chi đỏ thì có Ganoderma lucidum và Ganoderma tsugae được biết đến nhiều nhất Đối với Linh chi tím thì có Ganoderma neojaponicum và Ganoderma sinense.

Tuy nhiên, trong lĩnh vực trồng trọt, y dược và nha khoa, người ta chỉ tập trung nghiêncứu 2 loại đó là Linh chi đỏ và Linh chi tím

Gần đây khi đã tìm ra được phương pháp gây giống, những nhà khoa học NhậtBản chứng minh được rằng những cây nấm có màu sắc khác nhau không phải vì khácloại mà chỉ vì môi trường và điều kiện sống khác nhau Nếu thay đổi điều kiện người ta

có thể có được sáu loại từ cùng một giống

Ngoài cách phân loại Linh chi theo màu sắc, người ta còn có thể phân loại Linhchi theo các đặc điểm như:

 Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 200C – 230C

 Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 240C – 260C

 Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 270C – 300C

Do đó, có thể thấy rằng Linh chi không những đa dạng về chủng loại mà còn đadạng về sinh thái, đây là loại nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N 189) Linh chithuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại, từ khi xác lập một chi riêng là

Ganoderma Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ biến nhất là Ganoderma lucidum có tới 45 loại.

Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành công

trong phòng thí nghiệm năm 1978 Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi đỏđặc sắc của các rừng cây Lim miền Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào nuôitrồng chủ động

1.1.1.2 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi

- Cuống nấm: dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3cm, cuống

nấm ít phân nhánh, đôi khi uốn khúc Lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen,bóng, không có lông phủ trên mặt tán nấm

- Mũ nấm: khi non hình trứng, lớn dần hình quạt Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi

khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tiarãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâuđen, được bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang xếp sít nhau kiểu hàng rào và có đầusợi dày thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 – 10 μm Chính những tế bào vỏnày tạo nên lớp vỏ bền vững và bóng như vecni cho nấm Lớp vỏ láng phủ suốt theocuống Kích thước tán biến động từ 2 – 30 cm, dày 0,8 – 2,5 cm, cuống dài từ 2,5 - 3,5

cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính từ 0,5 – 2,2 cm) phần đính cuống hoặc gồ lênhoặc lõm như lõm rốn Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8 cm màu vàng kem – nâu nhạt – trắng.Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ Hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùnglớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trênmặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan mạnh trong cồn.Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu được mưa, nắng Ởlớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào

- Thụ tầng: Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ

0,2 – 1,7 cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5ống/mm Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy, khôngmàu, dài 16 - 22μm Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpore) phồng cănghay lõm thụt vào mà thành

1.1.2 Bào tử nấm Linh chi

Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào tử,tức là hạt giống hữu ích cho đời sau Bào tử thường được mô tả có dạng trứng cụt Đôikhi có tác giả mô tả là dạng hình trứng có đầu chóp tròn - nhọn Thực ra đó là do chụpphủ lớp nảy mầm hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành Mỗi bào tử đượcbao phủ với hai lớp vách rất khó phá vỡ gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999), màu vàngmật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu, kíchthước bào tử rất nhỏ dao động khoảng từ 6,5 x 8,0 µm đến 9,6 x 12,6 µm Vách bào tửgồm hai lớp liên kết giữa exosporium và endosporium, có độ dày 0,8 x 1,0 µm và 11 x

14 µm, có cấu trúc phức tạp Bào tử nấm Linh chi có hai lớp vách rất cứng, khó nảy 9

mầm (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016) Một số nghiên cứu về kích thước bào

tử nấm Linh chi được trình bày trong bảng dưới đây (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác

nhau (Lê Xuân Thám, 1996)

1972, Steyaert 8,5 – 10,8 – 13 x 5,5 – 8,5 Indonesia, Úc châu

1994, Tham và cộng sự 8 – 10,5 x 5 x 7 Lạng Sơn, Việt Nam

Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào tửbay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất mịn

Tuy vậy số lượng bào tử Linh chi rất ít Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi sẽ chỉ thuđược 1 kg bào tử.

Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấutạo tinh vi của bào tử thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, TrungQuốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt

Hình 1.2 Bào tử nấm Linh chi dưới kính hiển vi được phóng to 3000 lần

a) Bào tử nấm Linh chi chưa bị phá vỡb) Bào tử nấm Linh chi bị phá vỡ vách

Hình 1.3 Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi Ganoderma lucidum

Hình 1.4 Các kiểu hình bào tử đặc thù của họ nấm Linh chi

1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử).2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử xẻmúi ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma)

Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường cảnquang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học Cấu trúc của lớp vỏtrong cho đến nay còn chưa được biết rõ Cần lưu ý rằng: khái niệm – “gai chống nhọn”

từ màng trong đâm sát màng ngoài của hầu hết các mô tả trước đây không chính xác.Thực chất các gai hay chính các cột chống hầu như không nhọn, mà phình đầu thànhcác u lồi - và chính các u lồi này đội lớp màng phủ trong suốt ngoài cùng (episporium,exosporium hay chính là tầng phủ tectum), tạo thành các kiến trúc gò hạt - mụn cóc - unhú trên bề mặt vỏ bào tử Điều này Heim (1962), Hansen (1958), Perreau (1973),Mims và cộng sự (1989) đã từng phân tích và thảo luận nhiều

1.2 Thành phần hóa học chủ yếu của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

Trong đề tài nghiên cứu năm 2005 của Nguyễn Minh Khang, thành phần dượctính của nấm Linh chi được phân như sau:

Bên cạnh đó, nấm Linh chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh họcnhư các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất củachúng Hoạt tính sinh học của nấm Linh chi có được chủ yếu là do các polysaccharide,peptidoglycan và các triterpene mang lại (Boh và cộng sự, 2007; Zhou và cộng sự,2007).

Địa điểm sinh trưởng của nấm Linh chi cũng được xem là yếu tố ảnh hưởng đếnhàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi Trong một nghiên cứu vềhoạt tính sinh học của 11 mẫu sản phẩm nấm Linh chi được trồng ở Nhật Bản, người tanhận thấy sự chênh lệch về hàm lượng triterpenoid giữa các mẫu dao động trongkhoảng từ 0 – 7,8% và hàm lượng các polysaccharide dao động trong khoảng từ 1,1 -5,8% (Lu và cộng sự, 2012) Sự khác nhau về hàm lượng của các hoạt tính sinh họctrong các sản phẩm thương mại cũng chịu ảnh hưởng bởi quá trình chế biến hoặc chiếtxuất, qua đó cho thấy chiết xuất bằng nước sẽ cho hàm lượng triterpenoid ít hơn khichiết xuất bằng ethanol (Lu và cộng sự, 2012) Bên cạnh đó, điều kiện sinh trưởng cũngảnh hưởng đến hàm lượng của các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi (Lu vàcộng sự, 2012).

Trước kia, việc thu thập bào tử Ganoderma lucidum rất khó nên điều này làm cho

việc nghiên cứu chức năng cũng như các hoạt chất sinh học có trong bào tử cũng trởnên khó khăn, do đó cũng chỉ tập trung nghiên cứu vào thể quả của nấm Linh chi Hiệnnay, việc trồng nấm Linh chi đã trở nên phổ biến hơn, việc thu thập dễ dàng cũng tạo

nhiều điều kiện để nghiên cứu về bào tử Ganoderma lucidum Ganodermasides A, B, C

và D là dẫn xuất ergosterol phân lập từ chiết xuất methanol của bào tử Ganoderma

lucidum (Jue Wang và cộng sự, 2017) Cấu trúc của Ganodermasides A, B, C và D được

thể hiện trong hình 1.5

Hình 1.5 Cấu trúc của Ganodermasides

A, B, C và D 1 đại diện cho A, 2 đại diện cho B, 3 đại diện cho C, 4 đại diện cho D;1:

R1= H, R2= OH, R3= H;2: R1= H, R2= H, R3= OH;3: R1= OH, R2, R3=O;

4:R1=OH,R2=H,R3=H

Bào tử Linh chi có chứa các thành phần giống nấm Linh chi: Polysaccharide,triterpenoid, acid béo, acid amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng,… với hàm lượngđậm đặc hơn Linh chi từ 7 - 20 lần (Cheng CR và cộng sự, 2010) Bào tử nảy mầm cóhoạt tính sinh học cao hơn bào tử không nảy mầm, có thể thấy việc thu các hợp chấtsinh học phụ thuộc vào việc vách bào tử có bị vỡ hay không (Carlos Ricardo Soccol vàcộng sự, 2016)

Bảng 1.3 Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong thể quả và bào tử nấm Linh chi (Li

hạ đường huyết, chống loét, chống lại sự hình thành khối u và tăng cường khả năng

miễn dịch (Miyazaki và cộng sự, 1981; Hikino và cộng sự, 1985; Tomoda và cộng sự,1986; Bao và cộng sự, 2002; Wachtel Galor và cộng sự, 2004) Người ta thường chiếtxuất các polysaccharide trong nấm Linh chi bằng nước nóng sau đó tiến hành kết tủachúng bằng dung dịch ethanol hoặc methanol Đôi khi cũng có thể chiết xuất bằng nước

và dung dịch kiềm Theo kết quả phân tích, thành phần chủ yếu trong polysaccharide

của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum - polysaccharides: GL - PSs) là đường glucose

(Bao và cộng sự, 2002; Wang và cộng sự, 2002) Ngoài ra, GL - PSs cũng có cấu trúcpolymer mạch thẳng, bao gồm: xylose, mannose, galactose và fucose với nhiều vị tríliên kết p hoặc a khác nhau như 1 - 3, 1 - 4 và 1 - 6 với các dạng đồng phân - D hay L(Lee và cộng sự, 1999; Bao và cộng sự, 2002) Khả năng chống lại sự hình thành khối ucủa GL - PSs phụ thuộc vào cấu hình mạch nhánh cũng như tính tan của polysaccharidenày (Bao và cộng sự, 2002; Zhang và cộng sự, 2001) Ngoài ra, nấm Linh chi cũng cóchứa một mạng lưới chitin, đây là thành phần mà cơ thể người không tiêu hóa được vàđóng vai trò tạo nên độ cứng cho nấm Linh chi (Upton và cộng sự, 2000)

Có rất nhiều peptidoglycan có hoạt tính sinh học trong nấm Linh chi đã đượcphân lập, bao gồm proteoglycan (GLPG) có tác dụng kháng virus (Li và cộng sự,2005), tăng cường miễn dịch (Ji và cộng sự, 2007) và F3 là một glycoprotein trong cấutrúc có chứa fucose (Chien và cộng sự, 2004)

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của polysaccharide trong nấm Linh chi

1.2.2 Triterpenes

Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có độ dài mạch carbon là một bội số của 5, ví dụnhư menthol (monoterpene) và β - carotene (tetraterpene) Phần lớn các terpenoid thuộcnhóm alkene, một số có chứa những nhóm chức năng, đa phần các terpenoid có cấutrúc mạch vòng Những hợp chất này được tìm thấy trên rất nhiều loài thực vật.Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảmhàm lượng chất béo Terpenoid được tìm thấy trong các loại thực vật thuộc nhóm bạch

quả, ví dụ như hương thảo (Rosemarinus officinalis) và nhân sâm (Panax ginseng) có

tác dụng tăng cường sức khỏe (Mahato và cộng sự, 1997; Mashour và cộng sự, 1998;Haralampidis và cộng sự, 2002).

Triterpene là một phân lớp của terpenoid và có độ dài mạch carbon là 30 Khốilượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc hóa học phức tạp và

có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato và cộng sự, 1997; Zhou và cộng sự, 2007) Nhiềuloài cây có khả năng tổng hợp triterpene trong quá trình sinh trưởng và phát triển Một

số có chứa nhiều triterpene trong nhựa, qua đó giúp các cây này chống lại các loại bệnh.Mặc dù có hàng trăm loại triterpene đã được phân lập từ rất nhiều loại thực vật khácnhau và phân nhóm này cũng đã cho thấy có rất nhiều tiềm năng nhưng hiện nay có rất

ít những ứng dụng của triterpene được sử dụng trong thực tế

Trong nấm Linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng lanostane, đây là chấttham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình thànhnên các squalene mạch vòng (Haralampidis và cộng sự, 2002) Trong quá trình chiếtxuất triterpene, người ta thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol,acetone, chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng Dịch chiết sau đó sẽ được phântách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông thường hoặc HPLCpha nghịch đảo (Chen và cộng sự, 1999; Su và cộng sự, 2001) Những triterpene đầutiên được Kubota phân tách từ nấm Linh chi là ganoderic acid A và B (Kubota và cộng

sự, 1982) Kể từ khi đó, hơn 100 loại triterpene cùng với cấu hình của chúng đã đượctìm ra Trong số đó, có hơn 50 loại là đặc trưng chỉ được tìm thấy trong nấm Linh chi

Đa số các triterpene là các ganoderic và lucidenic acid, nhưng cũng có một số loại khácnhư là ganoderal, ganoderiol và ganodermic acid (Nishitoba và cộng sự, 1984; Sato vàcộng sự 1986; Budavari và cộng sự, 1989 ; Gonzalez và cộng sự 1999 ; Ma và cộng sự2002; Akihisa và cộng sự 2007 ; Zhou và cộng sự 2007; Jiang vàcộng sự 2008; Chen vàcộng sự 2010)

Hình 1.7 Công thức của một số triterpene trong nấm Linh chi (Kubota và cộng sự,

1982; Helv Chim Acta 65: 611-9; Nishitoba và cộng sự, 1984; Agric Biol Chem 48:2905-7; Sato và cộng sự, 1986; Agric Biol Chem 50: 2887 - 90; Budavari và cộng sự,

1989)

Nấm Linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phầntạo nên vị đắng của nấm Linh chi Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sứckhỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể Tuynhiên, hàm lượng triterpene trong nấm Linh chi lại không ổn định Chúng phụ thuộc rấtnhiều vào giống, loài, nơi trồng, điều kiện canh tác cũng như phương pháp chế biến,điều này đã được thể hiện trong một nghiên cứu của Chen và Su được tiến hành vàonăm 1999 và 2001 (Chen và cộng sự, 1999; Su và cộng sự, 2001)

Cho đến nay, hơn 150 triterpenoids đã được tìm thấy từ thể quả của nấm Linh chiđại diện cho năm lớp cấu trúc chính So với thể quả của nấm Linh chi, các nghiên cứu

về bào tử của nấm Linh chi mới bắt đầu từ năm 1988 (Hou CY và cộng sự, 1988) và có

29 loại triterpenoids đã được tìm thấy trong bào tử này Với những tiến bộ gần đâytrong quang phổ và trắc phổ kỹ thuật hiện đại, một loạt các triterpenoids được phân lập

từ các bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học vàdược sĩ Tất cả các triterpenoids trong các bào tử của nấm Linh chi có quá trình tổnghợp tương tự nhau, cụ thể là con đường acid movalonic (MVA) (Bingji Ma và cộng sự,

đổi bởi quá trình oxy hóa, giảm, khử acid, tạo vòng, sắp xếp lại, tạo ra nhiều loại cấuhình triterpenoids trong bào tử của nấm Linh chi.

Triterpenoids được cô lập từ bào tử Linh chi cho thấy khả năng kháng HIV-1protease, chống khối u, và các hoạt động chống bổ sung Triterpenoids này là thànhphần hoạt chất chính của bào tử Linh chi và biểu thị cho các hoạt tính sinh học khácnhau được sử dụng trong dược liệu

Hình 1.8 Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi

(Bingji Ma và cộng sự, 2011)

Hình 1.9 Tên của 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma

và cộng sự, 2011)

Triterpenoids được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi: năm triterpenoids thu được

từ phần tan trong ether của bào tử của nấm Linh chi và trên cơ sở tính chất hóa học và

dữ liệu quang phổ, acid ganopsoreric A (1), acid ganoderic B (2), acid ganoderic C1 (3),

acid ganoderic E (4) và ganodermanontriol (5) được xác định tương ứng (Bingji Ma vàcộng sự, 2011) Thí nghiệm dược lý cho thấy acid ganopsoreric A có có hoạt tính GTPthấp đối với gan chuột bị tổn thương bởi CC14 và GaNI (Chen RY và cộng sự, 1993).Hai triterpenoids pentacyclic mới, có tên ganosporelactone A (6) và B (7) được cô lập

từ bào tử của nấm Linh chi, có thể được bắt nguồn từ khung lanostane thông qua việchình thành liên kết C18 và C23 (Chen RY và cộng sự, 1991) Hai triterpenes lanostanekiểu mới, lucidumol A (8) và p - acid ganoderic (9), cùng với một lucidumol B (10) vàbảy triterpenoids đã biết, ganodermanondiol (11), ganoderiol F (12), acid ganoderic A(13), acid ganolucidic A (14), và 2, 3, 5 Trong số các hợp chất cô lập, các hợp chất 5,

10, 11 và 14 cho thấy khả năng kháng virus gây suy giảm miễn dịch (kháng HIV) - 1protease hoạt động đáng kể với giá trị IC50 với giá trị 20 - 90 μM (Min BS và cộng sự,1998)

6 loại lanostane - triterpenes mới có tính oxy hoá cao, được gọi là ganoderic acid

γ (15), acid ganoderic δ (16), acid ganoderic ε (17), acid ganoderic ξ (18), acidganoderic η (19), acid ganoderic θ (20), cùng với ganolucidic acid D (21) và acid

ganoderic C2 (22) thu được từ các bào tử nấm Các khả năng gây độc của các hợp chất

15 - 21 đã được thực hiện in vitro chống dòng tế bào ung thư Meth - A và LLC (Min BS

và cộng sự, 1998) Một terpenoid C27 có hoạt tính oxy hóa cao mới, lucidenic axit SP1(23), thu được từ một phần CHCl3 - tan của bào tử nấm Linh chi cùng với 11triterpenoids, acid ganoderic C6 (24), acid ganoderic G (25), và 2, 3, 5, 8, 9, 11, 12, 13,

14 (Bingji Ma và cộng sự, 2011)

1.2.3 Saponin

Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo - xà phòng (vì tạo bọt như xàphòng), là một nhóm glycosid lớn, được tìm thấy rộng rãi trong thực vật Người ta cũngphân lập được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao

- Độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mấtcác chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán,

ốc sên

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao gây nôn mửa, đi lỏng

- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b -hydroxysteroid khác

Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin Ví dụ:sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol.Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid

trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt.

Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người tadùng 3 dung môi này để tủa saponin Saponin có thể bị tủa bởi chì acetate, barihydroxyde, ammoni sulfat

Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponintrong quá trình chiết xuất Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogeninthường dễ kết tinh hơn saponin Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid,saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm

Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia ra: saponin triterpenoid

và saponin steroid

1.2.4 Acid béo

Người ta thu được lipid của bào tử bị phá vỡ bằng sắc kí lỏng CO2 siêu tới hạn tìmthấy có 15 loại acid béo, các hợp chất chính là acid palmitic (6,12%), acid stearic(4,97%), acid oleic (67,11%) và acid linoleic (9,63%) (Gao P và cộng sự, 2012) Chen

và cộng sự (2013) đã xác định và định lượng 9 acid béo, phần lớn trong số đó là acidoleic (C18:1; 57,5%), acid linoleic (C18:2; 13,4%), acid palmitic (C16:0; 19,6% ), acidhexadecenoic (C16:1; 2,2%), và acid linolenic (C18:3; 0,5%) và Liu và cộng sự (2007) xácđịnh được 18 acid béo Hoạt tính của acid béo thu được từ bào tử gồm acidnonadecanoic và acid cis-9-nonadecenoic có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào khối u

và gây độc cho tế bào hồng cầu (HL-60) (Gao P và cộng sự, 2012)

1.2.5 Các thành phần khác

Tiến hành phân tích thân nấm Linh chi, người ta còn tìm thấy thành phần chấtkhoáng như phospho, silicon, sulfur, kali, calcium và magnesium chiếm một tỉ lệ khácao Bên cạnh đó còn có sắt, nhôm, kẽm, đồng, mangan và strontium với hàm lượngthấp hơn Ngoài ra còn có một số kim loại nặng như chì, cadmium và thủy ngân (Chen

và cộng sự, 1998) Trong một nghiên cứu của Chiu được tiến hành vào năm 2000, khi

phân tích nấm Linh chi hoang thuộc loài Ganoderma spp, ông đã xác định được trong

hàm lượng chất khoáng của loại nấm này có chứa 10,2% là kali, calcium vàmagnesium Cũng trong một nghiên cứu khác thì Falandysz đã không tìm thấycadmium và thủy ngân trong những mẫu nấm Linh chi, nhưng hàm lượng seleniumđược xác định là 72 pg/g

Trong thành phần của nấm Linh chi (Ganoderma spp) có một chất cũng nhận

được rất nhiều sự quan tâm, đó là germanium Đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5trong các chất khoáng (489 pg/g) có trong nấm Linh chi Chất này tồn tại rất ít ở cácloại thực vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm, lô hội

và tỏi (Mino và cộng sự, 1980) Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu,nhưng chỉ cần một liều lượng thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch,kháng khối u, chống oxy hóa và chống đột biến (Kolesnikova và cộng sự, 1997)

Những hợp chất khác cũng được tìm thấy trong nấm Linh chi đó là các loạienzyme như metalloprotease (đây là loại enzyme có tác dụng trì hoãn quá trình đôngmáu) Ngoài ra, ergosterol (provitamin D2), các nucleoside và các nucleotide (nhưadenosine và guanosine) (Wasser và cộng sự, 2005; Paterson và cộng sự, 2006; Kim vàcộng sự, 2004) cũng đã được tìm thấy trong nấm Linh chi, đây là những hợp chất cótác dụng ức chế thuận nghịch a-glucosidase và SKG-3

Trong lớp vách sporoderm còn phát hiện được các chất vô cơ như magie, nhôm,silicon, phosphate, lưu huỳnh, clo, kali, canxi, sắt và niken, một số chất có hàm lượngcao như silicon (19,01%) và canxi (24,31%) (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016)

1.3 Công dụng của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

Một số dạng sản phẩm từ nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi đang có hiện nay:

- Trà túi lọc nấm Linh chi: bồi bổ sức khỏe, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể,điều hòa tim mạch, hạ cholesterol, phòng và chống viêm gan, an thần, tăng trí nhớ,tăng tuổi thọ.

- Bột Nấm Linh chi: bồi bổ sức khỏe và hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnh ung thư, xơ gan, điều hòa huyết áp, tiểu đường, tăng cường hệ miễn dịch, chống lão hóa…

- Viên nang dầu bào tử: Chống oxy hóa, trung hòa các gốc tự do, giảm Cholesteroltrong máu, chống xơ vữa động mạch, ổn định huyết áp, giải độc gan Chữa mất ngủ,giúp da dẻ mịn màng, giảm sạm nám tàn nhang Hỗ trợ tăng hồng cầu cho bệnh nhânung thư Giúp đào thải độc tố trong gan cho bệnh nhân ung thư, bệnh mãn tính, người hay tiếp xúc rượu bia, stress

- Bột bào tử nấm Linh chi: Tăng cường hệ thống miễn dịch, cô lập và diệt các tếbào ung thư, chống viêm nhiễm, bảo vệ gan, tăng cường chức năng chức năng gan,thải độc chống dị ứng, điều hoà huyết áp, nhịp tim, tăng lượng oxy trong máu, giảm cholesterol, dùng tốt cho bệnh nhân tiểu đường

Hình 1.10 Các dạng sản phẩm của nấm Linh chi và bào tử nấm Linh chi

Riêng đối với bào tử nấm Linh chi có thể được sử dụng dưới dạng còn nguyênhoặc bị phá vỡ, nhưng có nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng bào tử bị phá vỡ có hoạt tínhsinh học cao hơn so với bào tử còn nguyên Bào tử còn nguyên đã được tìm thấy trong

phân người và động vật, như vậy bào tử Ganoderma lucidum không thể được tiêu hóa

trong cơ thể, nhưng cũng có báo cáo cho rằng bào tử với lớp vách còn nguyên vẹn cóthể hoạt động khi uống vào trong cơ thể (Carlos Ricardo Soccol và cộng sự, 2016)

1.3.1 Phòng chống ung thư

Nấm Linh chi được sử dụng phổ biến trong quá trình hỗ trợ điều trị ung thưnhằm giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho các bệnh nhân bên cạnh áp dụng nhữngliệu pháp chữa trị thông thường Mặc dù hiện nay quá trình điều trị bệnh ung thư đã cónhững tiến bộ nhất định thông qua việc chẩn đoán bệnh sớm cũng như những phươngpháp hoá trị hiện đại, tuy nhiên việc chữa dứt điểm các căn bệnh này vẫn còn gặp rấtnhiều khó khăn thử thách (theo WHO 2008) Trong quá trình tìm kiếm những phươngpháp điều trị và những tác nhân hoá trị mới, người ta đã tìm ra trong hàng trăm loàithực vật, trong đó có cả nấm Linh chi, những hoạt chất sinh học có khả năng ngăn chặnquá trình hình thành khối u (Wasser và cộng sự, 1999; Borchers và cộng sự, 2008).Trong nấm Linh chi có một lượng lớn những hợp chất hoá học có thể được chiết xuất từthân nấm, sợi nấm và bào tử Trong đó, các polysaccharide và triterpene là 2 nhóm hợpchất chính trong nấm Linh chi có tác dụng ngăn ngừa ung thư và ngăn chặn quá trìnhhình thành khối u, điều này đã được chứng minh trong những nghiên cứu của Yuen vàcộng sự (2005) cũng như của Zaidman và cộng sự (2005) Một trong những tác dụngmới được tìm thấy của dịch chiết nấm Linh chi là có khả năng hỗ trợ điều trị cho cáccăn bệnh mãn tính, ví dụ như bệnh ung thư và bệnh liên quan đến gan (Bao và cộng sự,2005) Những thí nghiệm trên động vật đã cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc ức chế

sự hình thành và di căn của các tế bào ung thư Tuy nhiên, việc tiến hành những thínghiệm này trên cơ thể người vẫn còn hạn chế

Daniel Sliva và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế tế bàoung thư vú trên chuột với các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi như: bào tử còn