Bước đầu nghiên cứu phá vách bào tử nấm linh chi

Tính cấp thiết của đề tài Trong y học cổ truyền phương Đông nấm Linh chi Ganoderma lucium được sử dụng như một loại thượng dược trong một số bài thuốc để điều trị một số căn bệnh, tuy

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là hoàn toàn trung thƣc, chƣa từng đƣợc ai sử dụng để công bố trong bất kỳ công trình nào khác Các thông tin, tài liệu trích dẫn trong luận án đều đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc

Tp Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Đồng Thị Ngọc

Để có được đồ án tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất lớn từ gia đình, thầy cô, bạn bè

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất của mình tôi xin gửi lời cảm ơn đến trường Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh – HUTECH đã tạo cơ hội cho tôi được học tập tại trường, quý thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho chúng tôi trong thời gian học tập tại trường Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn

Thị Hai đã cung cấp chủng nấm Trichoderma hazianum T2; cô Đỗ Thị Tuyến đã

cung cấp cơ chất β-glucan và enzyme cellulase; Th.S Nguyễn Thị Ngọc Yến đã cung cấp bào tử nấm Linh chi; Th.S Trần Thị Ngọc Mai đã cung cấp chế phẩm Viscozyme L Đặc biệt tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Hoài Hương, người đã trực tiếp tận tình hướng dẫn để tôi có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Cùng với đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã có những động viên to lớn trong suốt quá trình học tập giúp tôi hoàn thành chương trình học tập tại trường một cách tốt nhất

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Đồng Thị Ngọc

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ ix

HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

3 Mục đích của đề tài 3

4 Mục tiêu của đề tài 3

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Kết quả đạt được của đề tài 3

7 Hạn chế của đề tài 3

Chương 1: TỔNG QUAN 5

1.1 Nấm Linh chi 5

1.2 Phân loại 5

1.2.1 Phân loại theo khoa học 5

1.2.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc 6

1.3 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi 10

1.3.1 Cuống nấm 10

1.3.2 Mũ nấm 10

1.3.3 Thụ tầng 11

1.3.4 Bào tử nấm Linh chi 11

1.3.5 Chu kỳ sống của nấm Linh chi 15

1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi 16

1.4.1 Dinh dưỡng 16

1.4.2 Nhiệt độ 17

1.4.3 Độ ẩm 17

1.4.4 Không khí 17

1.4.5 Ánh sáng 17

1.4.6 Trị số pH 18

1.5 Thành phần dược tính của nấm Linh chi 18

1.5.1 Thành phần dược tính tổng quát 18

1.5.2 Triterpenoid 19

1.5.3 Hợp chất saponin 23

1.5.4 Những thành phần khác 24

1.6 Công dụng của nấm Linh chi 25

1.6.1 Phòng ngừa ung thư 25

1.6.2 Tăng cường khả năng miễn dịch 25

1.6.3 Khả năng chống oxy hoá 26

1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường 26

1.7 Nghiên cứu về bào tử nấm Linh chi 27

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 30

2.1 Vật liệu – thiết bị - hóa chất 30

2.1.1 Vật liệu 30

2.1.2 Nơi tiến hành 30

2.1.3 Thời gian thực hiện 30

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ 30

2.2 Hóa chất – Môi trường sử dụng 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi 34

2.3.1 Phá vách bào tử bằng lên men khuẩn Lactic 36

2.3.2 Phá vỡ vách bào tử bằng chế phẩm enzyme thương mại 37

2.3.3 Khảo sát phá vách bào tử bằng enzyme nuôi cấy 44

2.3.4 Phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi bằng hỗn hợp enzyme cellulase và dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum T2 50

2.3.5 Phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp lạnh đông kết hợp sử dụng enzyme cellulase và dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum T2 51

2.3.6 Định tính một số hoạt chất sinh học trong dịch trích ly bào tử nấm Linh chi đã qua xử lý vách 52

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 55

3.1 Khả năng phá vách bào tử nấm Linh chi của dịch lên men khuẩn lactic 55

3.2 Khả năng phá vách bào tử nấm Linh chi của chế phẩm enzyme thương mại 56

3.2.1 Chế phẩm Viscozyme L 56

3.2.2 Enzyme cellulase của Novozyme 58

3.3 Enzyme nuôi cấy 61

3.4 Khả năng phá vách bào tử nấm Linh chi khi sử dụng hỗn hợp enzyme cellulase và dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum T2 66

3.5 Phá vách bào tử nấm Linh chi bằng phương pháp lạnh đông kết hợp sử

dụng enzyme cellulase và dịch tăng sinh nấm Trichoderma harzianum

T2 69

3.6 Định tính hoạt chất trong dịch trích ly 70

3.6.1 Định tính triterpenoid – steroid 70

3.6.2 Định tính saponin 72

Chương 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74

4.1 Kết luận 74

4.2 Kiến nghị 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PDA: Potato Dextrose Agar

MRS: Deman, Rogosa and Sharpe

MT1: môi trường 1

MT2: môi trường 2

MT3: môi trường 3

EC: C20032 (enzyme cellulase) 10%

TH: enzyme chitinase trong dịch tăng sinh nấm Trichoderma hazianum T2

BT: bào tử

VK: vi khuẩn

DANH MỤC BẢNG

1 1.1 Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở

các mẫu vật khác nhau (Lê Xuân Thám, 1996)

11

2 1.2 So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận

ở các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi (2.5mg/mL

26

4 2.2 Xác định hoạt tính Viscozyme 1% ở nhiệt độ phòng 38

5 2.3 Khảo sát thời gian xử lý bào tử nấm Linh chi bằng

Viscozyme L1%

39

6 2.4 Đường chuẩn glucose cho enzyme cellulase 40

7 2.5 Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động enzyme

10 3.2 Xác định qua lượng đường khử tạo thành sau các

khoảng thời gian ngâm

55

11 3.3 Hàm lượng glucose (mg/ml) theo thời gian ngâm (h)

bào tử nấm Linh Chi

55

12 3.4 Xác định nhiệt độ tối ưu cho enzyme Cellulase 10% 57

13 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase

10%

58

14 3.6 Xác định nhiệt độ tối ưu cho enzyme chitinase 64

15 3.7 Hoạt tính trung bình của chitinase tại mỗi nhiệt độ 65

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ

HÌNH

7 1.7 Hình thái giải phẫu thể quả và bào tử đảm nấm hồng chi

10 1.10 Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trông bào tử

nấm Linh chi (Bingji Ma et al (2011))

3.2 Bào tử nấm Linh chi sau khi xử lý với Viscozyme L 1% 56

13 3.3 Định tính enzyme chitinase trong chế phẩm cellulase 10% 58

14 3.4 Bào tử nấm Linh chi sau khi xử lý bằng cellulase 10% 60

15 3.5 Vòng phân giải chitin của dịch tăng sinh MT1 trên môi

trường chitin – agar

61

16 3.6 Vòng phân giải chitin của dịch tăng sinh trên MT2 trên

môi trường chitin – agar

61

17 3.7 Vòng phân giải chitin của dịch tăng sinh MT3 trên môi

trường chitin – agar

62

18 3.8 Bào tử nấm Linh chi sau khi ngâm trong dich tăng sinh

nấm Trichoderma haziaum T2 3, 4 ngày ở nhiệt độ phòng

3 2.3 Xác định nhiệt tối ƣu cho enzyme cellulase 41

4 2.4 Xử lý bào tử nấm Linh chi trong dịch tăng sinh nấm

6 2.6 Quy trình phá vách bào tử bằng lạnh đông bào tử kết hợp

chế phẩm enzyme cellulase và enzyme chitinase nuôi cấy

50

8 4.1 Quy trình phá vỡ vách bào tử và trích ly hoạt chất sinh học

từ bào tử đƣợc phá vách nấm Linh chi

74

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong y học cổ truyền phương Đông nấm Linh chi (Ganoderma lucium) được sử

dụng như một loại thượng dược trong một số bài thuốc để điều trị một số căn bệnh, tuy nhiên khi sử dụng nấm Linh chi cho việc điều trị bệnh người ta chỉ chú trọng đến việc phối hợp các vị trong bài thuốc một cách phức tạp và được nấu trong nhiều giờ để tách các hoạt chất trong đó mà không chú ý đến thành phần, biện pháp tách chiết các hoạt chất một cách tối ưu Bên cạnh đó, y học phương Tây cho rằng dược thảo không được xem là một loại thuốc để chữa bệnh mà chỉ có thể xem như một loại thực phẩm chức năng và nấm Linh chi là một trong những loại thảo dược Ngày nay, nấm Linh chi được trồng khá phổ biến và rộng rãi ở một số nước như: Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam,… nên việc sử dụng nấm Linh chi như một loại thực phẩm chức năng giúp hỗ trợ cho sức khỏe, tăng tuổi thọ, phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung bướu

Trong hai thập kỷ qua, các phương pháp phân tích hiện đại đã cho phép xác định một số lượng lớn các hợp chất hóa học có trong quả thể, tơ và bào tử nấm Linh chi như: triterpenoid, steroid, polysaccharide, saponin, chất khoáng, vitamin, amino acid, phenol,… trong đó, triterpenoid, polysaccharide được xem là thành phần chính mang nhiều hoạt tính sinh học của nấm Mặc dù lượng lớn các hoạt chất sinh học đã được tìm ra trong nấm Linh chi nhưng việc phân tích, chiết xuất các hoạt chất sinh học này lại chủ được thực hiện trên quả thể và tơ nấm, có rất ít nghiên cứu thực hiện việc trích ly các hoạt chất trong bào tử của loại nấm này do bào tử nấm linh chi được cấu tạo bởi lớp vách đôi, rất bền vững làm giảm khả năng chiết xuất các chất

Vì vậy, việc nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi là giai đoạn quan trọng cho quá trình phân tích thành phần các chất có trong bào tử này

Để đóng góp một phần nhỏ của mình trong việc nghiên cứu chiết xuất hiệu quả các hoạt chất có trong bào tử nấm Linh chi tôi đã có những nghiên cứu sơ bộ của mình một số phương pháp phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi được thực hiện trong

đồ án tốt nghiệp: “BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁ VÁCH BÀO TỬ NẤM LINH CHI”

Vào thập niên 70 – 80, bắt đầu một trào lưu khảo cứu hóa dược học các nấm Linh chi Chủ yếu ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan và Việt Nam Gần đây một số phòng thí nghiệm ở Hoa Kỳ và vùng Đông Nam á cũng bắt đầu tham gia vào tiến trình này

Năm 1988, Nhật Bản đã điều trị thành công bệnh nược cơ bằng Linh chi theo nguyên tắc điều hoà miễn dịch Bệnh viện Sơn Đông, Trung Quốc dùng “xúp” Linh chi để giải độc và bổ gan có kết quả tốt, trong 70.000 ca trên 90% khỏi bệnh (Lui Xing Jia, 1994) Tác giả cho rằng nấm Linh chi có tác dụng tốt đối với đường tiết niệu, điều hoà rối loạn tuần hoàn não, tránh các cơn kịch phát nghẽn mạch và làm dịu thần kinh,…

Năm 2010, Chaiyavat Chaiyasut*, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun đã công bố công trình nghiên cứu phá vách bào tử nấm Linh chi bằng quá trình lên

men vi khuẩn Lactobacillus plantarum và bào tử nấm Linh chi

3 Mục đích của đề tài

Xây dựng quy trình phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi và trích ly một số hoạt chất sinh học từ bào tử nấm Linh chi đã bị phá vách

4 Mục tiêu của đề tài

Phá vỡ bào tử nấm linh chi

Nội dung:

- Áp dụng lên men lactic

- Áp dụng chế phâm enzyme thương mại

- Áp dụng enzyme nuôi cấy chủng chủng chuyên biệt

- Áp dụng phối hợp chế phẩm thương mại và nuôi cấy chủng chuyên biệt thu

enzyme

- Áp dụng lạnh đông kết hợp enzyme

- Thăm dò khả năng trích ly hoạt chất từ bào tử phá vỡ

5 Phương pháp nghiên cứu

Tổng quan tài liệu và tiến hành thực nghiệm

Đề tài được sử lý số liệu bằng phần mền Excel và Statgraphics

6 Kết quả đạt được của đề tài

Bước đầu tìm ra phương pháp phá vách bào tử nấm Linh chi

Trích ly và định tính triterpenoid – steroid và saponin

Xây dựng quy trình phá bào tử nấm Linh chi và trích ly một số hoạt chất từ bào tử phá vách

7 Hạn chế của đề tài

Các nghiên cứu về phá vách mới tiến hành sơ bộ, chƣa xác định đƣợc tỷ lệ bào tử bị phá vách và định lƣợng thành phần các hoạt chất có trong dịch trích ly bào tử nấm Linh chi

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Nấm Linh chi

Nấm Linh chi hay còn gọi là Linh chi thảo, nấm trường thọ, nấm lim, thuốc thần tiên Cách đây khoảng 2000 năm, nấm Linh chi đã được ghi trong sách “Thần nông thảo” Xưa kia linh chi chỉ được khai thác trong thiên nhiên nên nó là loại thuốc quý, hiếm và rất đắt tiền Từ đầu thế kỷ 17, các nấm Linh chi đã được nuôi trồng ở Trung Quốc, chính bởi chính giá trị dược liệu cao của chúng Ngay từ thời Hoàng

đế, trong các thư tịch cổ đã ghi chép về giá trị của Linh Trong bản thảo cương mục các ghi chép đã chuẩn mực hơn, và nấm Linh Chi ngày càng được coi trọng Cho nên, dễ hiểu là các nhà y dược Việt Nam, kế tục Lý Thời Trân, đã phát hiện Linh Chi ở nước ta và như Lê Quý Đôn đã chỉ rõ đó là “nguồn sản vật quý của đất rừng Đại Nam

1.2 Phân loại

1.2.1 Phân loại theo khoa học

Nấm Linh chi có tên gọi latin là Ganoderma lucium, tên tiếng Anh là Varnished

conk hay Ling Chih (Nguyễn Lân Dũng, 2010)

Vị trí phân loại của nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2010):

- Giới: Nấm – Mycota hay Fungi

Theo trình định danh, có đến 8 lần đặt tên khoa học cho loài này Kể từ lần đầu tiên của Curtis W (1781) cho đến khi P.A Karsten – nhà nấm học Phần Lan xác

định tên chính thức: Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr ) Karst đã mất đến 100

năm (1881)

1.2.2 Phân loại theo hình dạng và màu sắc

Trong bộ “Bản thảo cương mục” (in năm 1995) của Lý Thời Trân, đại danh y Trung Quốc đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành lục bảo Linh chi (6 loại), với màu sắc và tên gọi khác nhau: Thanh chi, Xích chi, Hoàng chi, Bạch chi, Hắc chi, Tử chi

Xích chi: Còn được gọi với những cái tên khác như Linh chi đỏ hay đơn chi, hồng

chi có vị đắng Tên khoa học là Ganoderma lucidum Xích chi giúp ích tâm khí,

chủ vị, tăng trí tuệ Sử dụng linh chi đỏ để tăng cường trí nhớ, bổ trung, phòng tránh các bệnh tim mạch và chữa trị tức ngực

Hình 1.1: Xích chi - Ganoderma lucidum

Thanh chi: Linh chi xanh hay long chi có màu xanh, vị chua Tên khoa học là

Ganoderma genus Thanh chi giúp cho sáng mắt, giúp cho an thần, bổ can khí, nhân

thứ, dùng lâu sẽ thấy thân thể nhẹ nhàng và thoải mái

Hình 1.2: Thanh chi - Ganoderma genus

Bạch chi: Linh chi trắng hay ngọc chi có màu trắng Tên khoa học là Fomitopsis officinalis Bạch chi có vị cay tính bình không độc, ích phế khí, chữa ho nghịch hơi

Hình 1.3: Bạch chi - Fomitopsis officinalis

Hoàng chi: Linh chi vàng hay kim chi, có vị ngọt, màu vàng Tên khoa học là

Laetiporus sulphureus Linh chi vàng có tác dụng ích tì khí, trung hòa, an thần

Hình 1.4: Hoàng chi - Laetiporus sulphureus

Hắc chi: Linh chi đen hay huyền chi có màu đen và vị mặn Tên khoa học là

Polyporus melanopus Hắc chi có tác dụng ích thận khí, khiến cho đầu óc sản khoái

và tinh tường

Hình 1.5: Hắc chi - Polyporus melanopus

Tử chi: Linh chi tím hay Mộc chi, màu tím có vị ngọt Tên khoa học là Ganoderma sinense Tử chi có tác dụng bảo thần, làm cứng gân cốt, ích tinh, da tươi đẹp

Hình 1.6: Tử chi - Ganoderma sinense

Gần đây khi tìm được cách gây giống, những khoa học gia Nhật Bản chứng

minh được rằng những cây nấm màu sắc khác nhau không phải vì khác loại mà chỉ

vì môi trường và điều kiện sinh hoạt khác nhau Thay đổi điều kiện người ta có thể

có được đủ sáu loại từ cùng một giống

Ngoài việc phân loại Linh chi theo màu sắc, còn có thể phân loại nấm Linh chi dực

theo các đặc điểm sau:

- Nhóm nhiệt độ thấp: tai nấm mọc ở nhiệt độ 20oC – 23oC

- Nhóm nhiệt độ trung bình: tai nấm mọc ở 24o

C – 26oC

- Nhóm nhiệt độ cao: tai nấm mọc ở 27oC – 30o.

Vì vậy cho thấy, Linh chi không những đa dạng về chủng loại, mà còn đa dạng về

cả sinh thái, đây là loài nấm mang tính toàn cầu (Patouillard, N 189) Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại Từ khi xác nhập một

chi riêng, là Ganoderma Karst (1981), đến nay tính ra có tới 2000 loài và phổ biến

nhất là Ganoderma lucidum có tới 45 thứ

Ở Việt Nam, loài chuẩn Linh chi Ganoderma lucidum mới được trồng thành công

trong phòng thí nghiệm (1978) Năm 1994 loài nấm lim – một chủng Linh chi đỏ đặc sắc của các rừng lim Bắc Việt Nam đã được Phạm Văn Thụ đưa vào nuôi trồng chủ động

1.3 Đặc điểm sinh học của nấm Linh chi

1.3.1 Cuống nấm

Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5 – 3cm, cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi uốn khúc Lớp vỏ cuống màu nâu, nâu đỏ hoặc nâu đen, bóng, không có lông phủ trên mặt tán nấm

1.3.2 Mũ nấm

Mũ nấm: khi non hình trứng lớn dần hình quạt Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi

khi xòe hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu – vàng cam – đỏ cam – đỏ nâu – nâu tím – nâu đen, được bao phủ bởi sợi không vách ngăn ngang xếp sít nhau kiểu hàng rào và có đầu sợi dầy thêm ra, đường kính đoạn sợi phình to ra 8 - 10μm Chính những tế bào vỏ này tạo nên lớp vỏ bền vững và bóng như vecni cho nấm Lớp

vỏ láng phủ suốt theo cuống Kích thước tán biến động từ 2 – 30cm, dày 0,8 – 2,5cm, cuống dài từ 2,5 – 3,5cm, tròn mập hoặc mảnh (đường kính từ 0,5 – 2,2cm) phần đính cuống hoặc gồ lên hoặc lõm như lõm rốn Thịt nấm dày từ 0,4 – 1,8cm màu vàng kem – nâu nhạt – trắng Nấm mềm dai khi tươi, khi khô chắc cứng và nhẹ Hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùng lớp sợi phình hình chùy, màng rất dày đan kít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mặt trên mũ và bao quanh cuống bởi sự hình thành các chất lacate tan mạnh trong cồn Nhờ lớp laccate láng bóng không tan trong nước đó mà nấm chịu được mưa, nắng Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử

1.3.3 Thụ tầng

Tầng sinh sản (bào tầng, thụ tầng – hymenium) là một lớp ống dày từ 0,2 – 1,7

cm, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng tròn, trắng – vàng ánh xanh, khoảng 3 – 5 ống/mm Đảm đơn bào mang 4 đảm bào tử hình trứng – trứng cụt – hình chùy, không màu, dài 16 - 22μm Thực chất đó là do màng phủ lỗ nảy mầm (germpose) phồng căng hay lõm thụt vào mà thành

1.3.4 Bào tử nấm Linh chi

Cũng như các loài nấm khác, nấm Linh chi khi trưởng thành sẽ sản sinh ra bào tử, tức là hạt giống hữu ích cho đời sau

Bào tử đảm thường được mô tả có dạng trứng cụt Đôi khi có tác giả mô tả là dạng hình trứng có đầu chóp tròn – nhọn Thực ra đó là do chụp phủ lớp nảy mầm hoặc phồng căng, hoặc lõm thụt vào mà tạo thành Mỗi bào tử được bao phủ với hai lớp tường rất khó khăn gọi là sporoderm (FDA 1.8.1999), màu vàng mật ong sáng, chính giữa khối nội chất tụ lại một giọt hình cầu, dạng giọt dầu, kích thước bào tử rất nhỏ dao động ít nhiều khoảng từ 5-6 x 8,5 – 12 μm Vỏ bào tử khá dày, cỡ 0,7 – 1,2 μm, có cấu trúc phức tạp Bào tử nấm Linh chi có hai lớp vỏ rất cứng, khó nảy mầm Bào tử Linh chi có chứa các thành phần giống nấm Linh chi: Polysacharide, triterpenoid, acid béo, acid amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng, với hàm lượng đậm đặc hơn Linh chi từ 7 – 20 lần (Nguyễn Thị Sáu, 2014) Cho đến nay, hơn 150 triterpenoids đã được phát hiện Do những tiến bộ gần đây trong quang phổ hiện đại

và kỹ thuật quang phổ, một loạt các triterpenoids được phân lập từ bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược sĩ Từ năm 1988 các nhà khoa học đã phân lập được 29 triterpenoids bao gồm cả cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng

Bảng 1.1: Biến động kích thước bào tử đảm nấm Linh chi chuẩn ở các mẫu vật khác nhau (Lê Xuân Thám, 1996)

9 – 13 x 6 – 8

7 – 12 x 6 – 8

7 – 12 x 6 – 8 7,5 – 10 x 5 – 6,5

9 – 13 x 5 – 7 8,2 – 11,5 – 13,5x 6,3 – 7,5 – 8,1

9 – 12 x 5,5 – 8

10 – 11,8 x 6,8 – 7,8

7 – 8 x 6 – 8

Đông Dương Nhật Bản Trung Quốc Indonesia Úc Châu Anh Quốc

Bắc Âu Phi Châu Đông Phi Châu Bắc Việt Nam Argentine

Bồ Đào Nha Bắc Mỹ Bắc Mỹ Bắc Âu

Khi Linh chi phóng thích bào tử, nhìn xuyên qua ánh nắng sẽ thấy từng đợt bào

tử bay qua như khói bám vào bề mặt nấm tạo thành một lớp bụi mỏng màu nâu đỏ rất mịn Tuy vậy số lượng bào tử linh chi rất ít Khi thu hoạch 1 tấn nấm Linh chi

sẽ chỉ thu được 1 kg bào tử

Điều hết sức lý thú, mặc dù hình thái bên ngoài rất biến đổi, đa dạng, song về cấu tạo tinh vi của bào tử đảm thì có độ ổn định rất cao, dù là chủng nuôi trồng ở Nhật, Trung Quốc, chủng nấm Lim Hà Bắc hay chủng Đà Lạt

Hình 1.7: Hình thái giải phẫu thể quả và bào tử đảm nấm hồng chi Ganoderma

lucidum

a – đính cuốn bên kiểu lồi

b – đính cuốn bên kiểu lõm c- đính cuống gần tâm kiểu lõm rốn do liền tán (hiếm)

d – cấu trúc đỉnh (apex) bào tử đảm và kiểu phân lớp vỏ

e, f, g – các vị trí bào tử: miệng lồi (e), miệng lõm (f)

Rõ ràng kiến tạo lỗ thủng trên bề mặt lớp vỏ ngoài là phổ biến Lỗ nảy mầm hình tròn, khá lớn, là đặc điểm quan trọng phổ biến ở các loài Ganoderma (đướng kính 3,2 – 4,2μm) Thuật ngữ “germpore” là tương đương định nghĩa “aperture” do Erdtman đưa ra (1952) – là chỉ vùng mà tại đó vỏ bào tử mỏng đi rất nhiều, nơi mầm sợi nấm nguyên thủy (hay mầm ống phấn trong trường hợp của tiểu bào tử ở thực vật) nhú ra khi nảy mầm (germination) Trên lớp vỏ ngoài thấy rõ các trụ chống – chính là khái niệm “gai chống” theo nhiều tác giả khác Đỉnh các trụ nổi gồ

thành các mụn cóc – gò hạt Các trụ chống chính là tầng cột theo phân loại của G.Erdtman (1952) (columellae), các trụ được nối với nhau bởi các vách mỏng chống từ tầng nền tới tầng phủ, chúng tạo thành các xoang rỗng của lớp ngoài, nhờ

đó tạo khả năng bảo vệ cao cho vỏ bào tử

Hình 1.8: Các kiểu bào tử đảm đặc thù của họ Linh chi Ganodermataceae

1: Kiểu miệng rộng, gặp ở Ganoderma và Humphrey a (có mấu lồi đáy bào tử) 2: Kiểu miệng tiêu giảm, gặp ở Haddowia và Amauroderma (lưu ý kiểu bào tử xẻ múi ở Haddowia rất tương đồng với kiểu xẻ rãnh ở Ganoderma

Lớp vỏ trong mỏng hơn, sát ngay bên dưới tầng nền của lớp vỏ bào tử, thường cản quang mạnh do vậy thấy đậm màu dưới kính hiển vi quang học Cấu trúc của lớp

vỏ trong cho đến nay còn chưa được biết rõ

Cần lưu ý rằng: khái niệm “gai chống nhọn” từ màng trong đâm sát màng ngoài của hầu hết các mô tả trước đây không chính xác Thực chất các gai hay chính các cột chống hầu như không nhọn, mà phình đầu thành các u lồi – và chính các u lồi này đội lớp màng phủ trong suốt ngoài cùng (episporium, exosporium hay chính

là tầng phủ tectum), tạo thành các kiến trúc gò hạt – mụn cóc – u nhú trên bề mặt vỏ bào tử Điều này Heim (1962), Hansen (1958), Perreau (1973), Mims et al (1989)

đã từng phân tích và thảo luận nhiều

1.3.5 Chu kỳ sống của nấm Linh chi

Hình 1.9: Chu kì sống của nấm Linh chi

Bào tử đảm đơn bội, trong điều kiện thuận lợi, nảy mầm tạo nên hệ sợi sơ cấp (primary hyphae) - trong thực nghiệm tỷ lệ nảy mầm khá thấp ở nhiệt độ 28oC –

30oC chỉ đạt 3 – 15% Hệ sợi sơ cấp đơn nhân, đơn bội mau chóng phát triển phối hợp với nhau tạo thành hệ sợi thứ cấp (tức hệ sợi song hạch), phát triển và phân nhánh rất mạnh tràn ngập khắp giá thể

Lúc này thường có hiện tượng hình thành bào tử vô tính màng dày - rất dày (gasterospores – Chlamydospores), chúng dễ dàng rụng ra và khi gặp điều kiện phù hợp sẽ nảy mầm cho ra hệ sợi song hạch tái sinh Hệ sợi thứ cấp sẽ phát triển mạnh đạt đến giai đoạn cộng bào tức là các vách ngăn được hòa tan

Tiếp đó là giai đoạn sợi bện kết để chuẩn bị cho sự hình thành mầm móng thể quả (primordial) Đây chính là giai đoạn phân hóa hệ sợi Từ hệ sợi nguyên thủy hình thành các sợi cứng màng dày, ít phân nhánh, bện kết lại thành các cấu trúc bó được cố kết bởi các sợi bện phân nhánh rất mạnh Từ đó hình thành các mầm nấm màu trắng mịn vươn dài thành các trụ tròn mập Phần đỉnh trụ bắt đầu xòe thành tán, trong lúc lớp vỏ láng đỏ cam xuất hiện Tán lớn dần hình thành bào tầng và bắt đầu phát tán bào tử đảm liên tục cho đến khi nấm già sẫm màu, khô tóp và lụi dần trong 3 – 4 tháng

Nấm Linh Chi có thể mọc trên cây gỗ (thường là thuộc bộ đậu Fabales) sống hay

đã chết Quả thể gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng 5 – tháng 11), có thể trên thân cây (cuống thường ngắn), quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây (khi ấy cuống thường dài

và có thể phân nhánh) Nấm thường mọc tốt dưới bóng rợp, ánh sáng khuếch tán nhẹ Do có lớp vỏ láng đỏ Linh Chi có thể chịu nắng rọi – khi đó thường xuất hiện lớp phấn ánh xanh tím, có thể chịu mưa liên tục Ở những vùng thấp rõ ràng là ưu thế của các chủng chịu nhiệt độ cao (28oC – 35oC) như ở vùng châu thổ sông Hồng

và đồng bằng sông Cửu Long (quanh TP Hồ Chí Minh) Ở vùng núi đồi vĩ độ cao (>1000m) thường có các chủng ôn hòa, thích hợp nhiệt độ thấp hơn (21oC –

26oC) – như vùng Đà lạt, Sapa, Tam Đảo, Tây Nguyên,…ở nước ta Nếu theo các

tư liệu cổ thì Linh Chi của vùng rừng sâu, núi cao được coi là linh thiêng quí giá

1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi

1.4.1 Dinh dưỡng

Nguồn cacbon: nguồn cacbon chủ yếu là đường glucose, saccharose, maltose, tinh bột, pectin, lignin, cellulose, hemicelluloses, từ đó chúng tổng hợp năng lượng và

tạo thành các chất cần thiết

Nguồn nitơ hữu cơ: protein, pepton, acid amin, ngoài ra có thể hấp thu urê, muối amon, sulphate amon Nitơ không được quá nhiều làm cho sợi nấm mọc nhiều khó hình thành quả thể

Trong giai đoạn sinh trưởng sợi nấm, tỉ lệ C/N là 25/1 Giai đoạn hình thành thể quả, tỉ lệ là 30/1 hoặc 40/1

Nguyên tố vi lượng: Ca, P, Mg, K nguồn vi lượng đó chỉ thêm trong quá trình nuôi cấy giống mẹ, còn khi trồng thì chúng có trong các nước và nông sản phẩm

1.4.4 Không khí

Nấm Linh chi là loài hiếu khí vì vậy cần thông gió, giữ độ ẩm và nhiệt độ thích hợp Khi nuôi cấy nấm trong tầng lỏng cần lắc 100 – 150 vòng/phút Lắc mạnh dễ làm sợi nấm đứt đoạn

1.4.5 Ánh sáng

Nấm Linh chi cần ánh sáng tán xạ Sợi nấm nuôi trong điều kiện ánh sáng từ 500 –

1200 lux

al (1999)) Trong một nghiên cứu về những thành phần của nấm, Mau et al (2001)

đã xác định được tỷ lệ của các thành phần chủ yếu trong nấm linh chi gồm: tro (1,8%), carbonhydrate (26 - 28%), chất béo thô (3 - 5%), chất xơ (59%) và protein (7 - 8%) Hàm lượng của protein trong nấm linh chi khoảng 7- 8%, thấp hơn so với nhiều loại nấm khác (Chang et al (1996); Mau et al (2001)) Đặc biệt thành phần protein của nấm linh chi có rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất là lysine và leucine Hàm lượng chất béo tổng thấp nhưng chứa nhiều acid béo không bão hòa nhiều nối đôi, đây là các hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con người (Chang et

al (1996); Borchers et al (1999)) Ngoài ra trong nấm còn chứa các glycoprotein và các polysaccharide

Bên cạnh đó, nấm linh chi có chứa rất nhiều những phân tử có hoạt tính sinh học như các terpenoid, các steroid, các phenol, các nucleotide và những dẫn xuất của chúng Hoạt tính sinh học của nấm linh chi có được chủ yếu là do các polysaccharide, peptidoglycan và các triterpene mang lại (Boh et al (2007)

1.5.2 Triterpenoid

Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có cấu trúc hóa học dựa trên cơ sở các phân tử isopren liên kết lại với nhau, công thức tổng quát (C5H8)n với n ≥ 2, tuy isopren là dẫn xuất của terpenoid nhưng pharnesyl pyrophosphate mới là chất liệu cơ bản để sinh tổng hợp terpenoid (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2010) Terpenoid có tác dụng chống viêm, chống lại sự hình thành các khối u và giúp giảm hàm lượng chất béo Triterpene là một phân lớp của terpenoid được phân bố rộng rãi trong giới động vật, thực vật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycosid Cấu trúc hóa học của triterpen có thể

là mạch hở 3, 4, hoặc 5 vòng với 33 khung sườn cacbon chính (Jose D Connolly et

al (1991)) Khối lượng phân tử khoảng từ 400 đến 600 kDa, triterpene có cấu trúc hóa học phức tạp và có khả năng bị oxy hóa cao (Mahato et al (1997)); Zhou et al (2007))

Trong nấm linh chi, cấu trúc hóa học của triterpene có dạng lanostane, đây là chất tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol, quá trình sinh tổng hợp giúp hình thành nên các squalene mạch vòng (Haralampidis et al (2002)) Trong quá trình chiết xuất triterpene, người ta thường sử dụng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, acetone, chloroform, ether hoặc là hỗn hợp của chúng Dịch chiết sau đó sẽ được phân tách bằng nhiều phương pháp khác nhau, có thể dùng HPLC thông thường hoặc HPLC pha nghịch đảo (Chen et al (1999); Su et al (2001)) Những triterpene đầu tiên được Kubota phân tách từ nấm linh chi là ganoderic acid A và B (Kubota et al (1982)) Kể từ khi đó, hơn 100 loại triterpene cùng với cấu hình của

chúng đã được tìm ra Trong số đó, có hơn 50 loại là đặc trưng chỉ được tìm thấy trong nấm linh chi Đa số các triterpene là các ganoderic và lucidenic acid, nhưng cũng có một số loại khác như là ganoderal, ganoderiol và ganodermic acid (Jiang et

al (2008))

Nấm linh chi rất giàu hàm lượng các triterpene, những chất này cũng góp phần tạo nên vị đắng của nấm linh chi Chúng mang nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe, như khả năng chống oxy hóa và giảm hàm lượng chất béo trong cơ thể Tuy nhiên, hàm lượng triterpene trong nấm linh chi lại không ổn định Chúng phụ thuộc rất nhiều vào giống, loài, nơi trồng, điều kiện canh tác cũng như phương pháp chế biến, điều này đã được thể hiện trong một nghiên cứu của Chen và Su được tiến hành vào năm 1999 và 2001 (Chen et al (1999); Su et al (2001))

Cho đến nay, hơn 150 triterpenoids đã được tìm thấy từ quả thể của nấm Linh chi đại diện cho năm lớp cấu trúc chính So với quả thể của nấm Linh chi, các nghiên

cứu về bào tử của nấm Linh chi mới bắt đầu từ năm 1988 ( Hou CY et al (1988)),

cho đến nay đã có 29 loại triterpenoids đã được tìm thấy trong bào tử này Với những tiến bộ gần đây trong quang phổ và trắc phổ kỹ thuật hiện đại, một loạt các triterpenoids được phân lập từ các bào tử của nấm Linh chi và đã thu hút được sự chú ý của các nhà hóa học và dược sĩ Tất cả các triterpenoids trong các bào tử của nấm Linh chi có quá trình tổng hợp tương tự nhau, cụ thể là con đường acid movalonic (MVA) (Bingji Ma et al (2011)) Các Triterpenoids này được bắt đầu từ trans - squalene và sau đó đã được thay đổi bởi quá trình oxy hóa, giảm, khử acid, tạo vòng, sắp xếp lại, tạo ra nhiều loại cấu hình triterpenoids trong bào tử của nấm Linh chi

Triterpenoids được cô lập từ bào tử Linh chi cho thấy khả năng kháng HIV-1 protease, chống khối u, và các hoạt động chống bổ sung Triterpenoids này là thành phần hoạt chất chính của bào tử Linh chi và biểu thị cho các hoạt tính sinh học khác nhau được sử dụng trong dược liệu

Hình 1.10: Cấu trúc không gian của 29 loại triterpenoids trông bào tử nấm Linh chi

(Bingji Ma et al (2011))

Hình 1.11: 29 triterpenoids trong bào tử nấm Linh chi (Bingji Ma et al (2011))

Triterpenoids đƣợc cô lập từ bào tử của nấm Linh chi

Năm triterpenoids đã đƣợc cô lập từ phần trong ether - tan của bào tử của nấm Linh chi và trên cơ sở tính chất hóa học và dữ liệu quang phổ, acid ganopsoreric A (1), acid ganoderic B (2), acid ganoderic C1 (3), acid ganoderic E (4) và

ganodermanontriol (5) được xác định tương ứng (Bingji Ma et al (2011)) Thí nghiệm dược lý cho thấy acid ganopsoreric A có có hoạt tính GTP thấp đối với gan chuột bị tổn thương bởi CCl4 và GaNI (Chen RY et al (1993)) Hai triterpenoids pentacyclic mới, có tên ganosporelactone A (6) và B (7) được cô lập từ bào tử của nấm Linh chi, có thể được bắt nguồn từ khung lanostane thông qua việc hình thành liên kết C18 và C23(Chen RY et al (1991)) Hai triterpenes lanostane kiểu mới, lucidumol A (8) và β - acid ganoderic (9), cùng với một lucidumol B (10) và bảy triterpenoids đã biết, ganodermanondiol (11), ganoderiol F (12), acid ganoderic A (13), acid ganolucidic A (14), và 2, 3, 5 Trong số các hợp chất cô lập, các hợp chất

5, 10, 11 và 14 cho thấy khả năng kháng virus gây suy giảm miễn dịch (kháng HIV)

- 1 protease hoạt động đáng kể với giá trị IC50 với giá trị 20 - 90 mM (Min BS et al (1998))

Sáu triterpenes lanostane loại oxy hóa cao mới, được gọi là ganoderic acid γ (15), acid ganoderic δ (16), acid ganoderic ε (17), acid ganoderic ξ (18), acid ganoderic η (19), acid ganoderic θ (20 ), cùng với ganolucidic axit D (21) và axit ganoderic C2 (22) được phân lập từ các bào tử nấm Các khả năng gây độc của các hợp chất 15-21

đã được thực hiện trong ống nghiệm chống Meth - A và LLC dòng tế bào ung thư (Min BS et al (1998)) Một terpenoid C27 oxy hóa cao mới, lucidenic axit SP1 (23), được phân lập từ một phần CHCl3-tan của bào tử nấm Linh chi cùng với mười một triterpenoids, acid ganoderic C6 (24), acid ganoderic G (25), và 2 , 3, 5, 8, 9,

11, 12, 13, 14

1.5.3 Hợp chất saponin

Saponin là một nhóm chất trao đổi thứ cấp quan trọng trong thế giới thực vật Tên gọi của saoponin bắt nguồn từ từ sapo trong tiếng latinh, có nghĩa là xà phòng Sapnin có tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt Saponin thường ở dạng vô định hình,

có vị đắng Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao, từ 200oC trở lên và có

thể trên 300oC Saponin bị tủa bởi chì acetate, hydroxide barium, sulphate amonium nên lợi dụng chất này để cô lập saponin

Về phương diện hóa học, saponin được xác định gồm các cấu trúc khác nhau: triterpenoids, glucosylated steroids steroidal alkaloids

Khả năng dược tính: trị long đờm, chữa ho, chất phụ gia cho một số vacxin, thông tiểu, kháng viêm, chống khối u

1.5.4 Những thành phần khác

Tiến hành phân tích thân nấm linh chi, người ta còn tìm thấy thành phần chất khoáng như phospho, silicon, sulfur, kali, calcium và magnesium chiếm một tỉ lệ khá cao Bên cạnh đó còn có sắt, nhôm, kẽm, đồng, mangan và strontium với hàm lượng thấp hơn Ngoài ra còn có một số kim loại nặng như chì, cadmium và thủy ngân (Chen et al (1998)) Trong một nghiên cứu của Chiu được tiến hành vào năm

2000, khi phân tích nấm linh chi hoang thuộc loài Ganoderma spp, ông đã xác định

được trong hàm lượng chất khoáng của loại nấm này có chứa 10,2% là kali, calcium

và magnesium Cũng trong một nghiên cứu khác thì Falandysz đã không tìm thấy cadmium và thủy ngân trong những mẫu nấm linh chi, nhưng hàm lượng selenium được xác định là 72 µg/g

Trong thành phần của nấm linh chi (Ganoderma spp) có một chất cũng nhận được

rất nhiều sự quan tâm, đó là germanium Đây là chất có hàm lượng nhiều thứ 5 trong các chất khoáng (489 µg/g) có trong nấm linh chi Chất này tồn tại rất ít ở các loại thực vật trong tự nhiên, chỉ một phần rất nhỏ được tìm thấy trong nhân sâm, lô hội và tỏi Mặc dù germanium không phải là thành phần thiết yếu, nhưng chỉ cần một liều lượng thấp cũng đã có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch, kháng khối u, chống oxy hóa và chống đột biến (Kolesnikova et al (1997))

Những hợp chất khác cũng được tìm thấy trong nấm linh chi đó là các loại enzyme như metalloprotease (đây là loại enzyme có tác dụng trì hoãn quá trình đông máu)

Ngoài ra, ergosterol (provitamin D2), các nucleoside và các nucleotide (như adenosine và guanosine) cũng đã được tìm thấy trong nấm linh chi, đây là những hợp chất có tác dụng ức chế thuận nghịch α-glucosidase và SKG-3

1.6 Công dụng của nấm Linh chi

1.6.1 Phòng ngừa ung thư

Nấm linh chi được sử dụng phổ biến trong quá trình hỗ trợ điều trị ung thư nhằm giúp tăng cường khả năng miễn dịch cho các bệnh nhân bên cạnh áp dụng những liệu pháp chữa trị thông thường Mặc dù hiện nay quá trình điều trị bệnh ung thư đã

có những tiến bộ nhất định thông qua việc chẩn đoán bệnh sớm cũng như những phương pháp hoá trị hiện đại, tuy nhiên việc chữa dứt điểm các căn bệnh này vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn thử thách (theo WHO 2008) Trong quá trình tìm kiếm những phương pháp điều trị và những tác nhân hoá trị mới, người ta đã tìm ra trong hàng trăm loài thực vật, trong đó có cả nấm linh chi, những hoạt chất sinh học có khả năng ngăn chặn quá trình hình thành khối u (Wasser et al (1999); Borchers et

al (2008)) Trong nấm linh chi có một lượng lớn những hợp chất hoá học có thể được chiết xuất từ thân nấm, sợi nấm và bào tử Trong đó, các polysaccharide và triterpene là 2 nhóm hợp chất chính trong nấm linh chi có tác dụng ngăn ngừa ung thư và ngăn chặn quá trình hình thành khối u Một trong những tác dụng mới được tìm thấy của dịch chiết nấm linh chi là có khả năng hỗ trợ điều trị cho các căn bệnh mãn tính, ví dụ như bệnh ung thư và bệnh liên quan đến gan (Bao X et al (2005)) Những thí nghiệm trên động vật đã cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc ức chế sự hình thành và di căn của các tế bào ung thư Tuy nhiên, việc tiến hành những thí nghiệm này trên cơ thể người vẫn còn hạn chế

1.6.2 Tăng cường khả năng miễn dịch

Những tác nhân giúp làm tăng khả năng hoạt động của hệ miễn dịch cũng có tác dụng tăng cường sức khoẻ, qua đó giúp ngăn ngừa bệnh tật Nhiều thành phần trong nấm linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào lympho, các bạch cầu đơn nhân, các tế bào NK (natural killer

cells) (Bao et al (2001); Cao et al (2002)) Trong một nghiên cứu của Chang et al (2009) được tiến hành trên chuột BALB/c cho thấy dịch chiết nấm linh chi chứa nhiều polysaccharide có tác dụng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào spleno và hoạt tính của các đại thực bào và các tế bào NK

Trong một nghiên cứu khác của Wang et al (1997), polysaccharide có trong nấm linh chi có tác dụng làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lympho T và các đại thực bào, bằng cách làm tăng hàm lượng IL- 1β, TNF-α và IL-6 Cũng trong một nghiên cứu khác, quá trình ủ của các đại thực bào và các tế bào lympho T bằng các polysaccharide đã cho thấy hàm lượng TNF- α và INF- γ tăng lên (Zhang et al (1999))

1.6.3 Khả năng chống oxy hoá

Những hợp chất chống oxi hoá trong thực vật có tác dụng ngăn ngừa ung thư cũng như những căn bệnh nan y khác (Collins et al (2005); Benzie et al (2009)) Những hợp chất này có tác dụng bảo vệ các thành phần có trong màng tế bào chống lại những tổn thương do quá trình oxy hoá gây nên, qua đó giúp làm giảm những nguy

cơ gây ra đột biến và ung thư cũng như góp phần bảo vệ các tế bào miễn dịch Những hợp chất có trong nấm linh chi chủ yếu là các polysaccharide và các triterpene cũng có tác dụng chống lại quá trình oxy hoá tế bào (Lee et al (2001); Lin et al (2002); Shi et al (2002); Wachtel-Galor et al (2005))

1.6.4 Điều trị bệnh đái tháo đường

Những thành phần của nấm linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường huyết đối với động vật Các ganoderan A và B là hai polysaccharide được chiết tách

từ thân nấm linh chi, sau khi được tiêm cho chuột bị tiểu đường với liều lượng 100 mg/kg, cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm và tác dụng hạ đường huyết vẫn tiếp tục kéo dài suốt 24 giờ (Hikiko et al (1985)) Cũng trong một thí nghiệm trên chuột, ganoderan B có tác dụng làm tăng lượng insulin, qua đó làm giảm hàm lượng glucose trong máu và điều chỉnh quá trình tổng hợp glucose dưới tác dụng

của các enzyme có sẵn trong gan (Hikiko et al (1989)) Trong một nghiên cứu khác cũng được tiến hành trên chuột, người ta đã chứng minh được rằng một polysaccharide khác có trong nấm linh chi được gọi là ganoderan C cũng có tác dụng hạ đường huyết (Hikiko et al (1989))

1.7 Nghiên cứu về bào tử nấm Linh chi

Trong các nghiên cứu gần đây, bào tử của nấm Linh chi chứa một số hoạt chất sinh học phong phú hơn nhiều so với trong quả thể của chúng (Chaiyavat Chaiyasut et

al, 2010) Tuy nhiên, với bào tử của nấm Linh chi được cấu tạo phức tạp với 2 lớp vách rất cứng và bền vững, hai lớp vách này có thành phần gồm silica (19,01%), canxi (19,01%) và chitin (52,08 - 57,64%) (Jungjing et al, 2007.) nên đã làm hạn chế rất nhiều khả năng thu nhận các hoạt chất sinh học này

Daniel Sliva, Ph.D.,1,2 et al., 2003 đã tiến hình nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư vú trên chuột với các trạng thái khác nhau của nấm Linh chi như: bào tử còn nguyên, bào tử bị phá vỡ, bột quả thể, dịch chiết của quả thể và bào tử với các nguồn cung cấp khác nhau và đã thu được kết quả như bảng 1.2

Bảng 1.2: So sánh khả năng ức chế ung thư vú của các bộ phận ở các trạng thái

khác nhau của nấm Linh chi (2.5mg/mL)

chế tế bào ung thư

Zihanga Trung Quốc Bào tử còn nguyên 89.3%

Jilinc Trung Quốc Bào tử còn nguyên 9.5%

và bào tử

99%

Từ những nhận định và kết quả thí nghiệm nêu trên cho ta thấy việc phá vỡ bào

tử nấm Linh chi nhằm tăng khả năng dược liệu của nó cần được quan tâm Trong những năm gần đây đã có nhiều sáng chế tiết lộ phương pháp phá vỡ vách bào tử nấm Linh chi Ví dụ: JP52041208 tiết lộ quá trình chiết xuất các thành phần sinh học của bào tử bằng phương pháp sử dụng biện pháp cơ học, JP2240026A tiết

lộ việc sử dụng các dung môi để phá vỡ, CN1165032 tiết lộ phương pháp phá vỡ bằng cách sử dụng enzyme hòa tan như lysozyme, cellulose và hemicellulase, lạnh đông và dùng sóng siêu âm Hay theo patent CN 101596220 A của Trung Quốc, bào

tử nấm Linh chi được phá vỡ bằng một số phương pháp sinh học như: sử dụng enzyme hòa tan để thủy phân vách bào tử hay sử dụng một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy lớp vách này nhằm tăng cường hiệu quả sử dụng các hoạt chất sinh học có trong bào tử mà chi phí thấp và hiệu quả tương đối cao Cũng theo patent này ngoài biện pháp sinh học để phá hủy lớp vách của bào tử, còn có thể sử dụng một số biện pháp hóa học như dùng dung dịch có tính acid hay kiềm để làm bào mòn lớp vách, tuy nhiên, với phương pháp hóa học này sẽ làm ảnh hưởng đáng

kể khả năng hoạt động của các hoạt chất sinh học có trong bào tử và dư lượng của các loại hóa chất dùng cho quá trình phá vách bào tử có thể làm ảnh hưởng xấu đến môi trường cũng như sức khỏe Ngoài ra, một số biện pháp vật lý: sóng siêu âm, vi sóng, nhiệt độ thấp, lạnh đông,… cũng được sử dụng nhưng nhìn chung khả năng làm suy yếu lớp vách của bào tử còn thấp và chi phí đầu tư cao

Trong một nghiên cứu khác của Chaiyavat Chaiyasut*, Chakkrapong Kruatama and Sasithorn Sirilun năm 2010 ở Thái Lan, bào tử của nấm Linh chi được phá vỡ bằng

cách lên men với Lactobacillus plantarum với kỹ thuật rất đơn giản, ít chi phí Nó

có thể được sử dụng để sản xuất các loại thực phẩm lên men với các lợi ích từ bào

tử nấm Linh chi và vi khuẩn lên men lactic

Zhang et al (2008) đã đưa ra các phương pháp tách chiết các triterpenes Linh chủ yếu bao gồm:

- Trích ly với methanol hoặc ethanol như các dung môi, sau đó tách trực tiếp của các chất trong chiết xuất;

- Trích ly bởi methanol hoặc ethanol, tiếp theo là tách tổng acidportion bằng cách

xử lý kiềm và tách phân đoạn các triterpene của Linh chi;

- Trích ly acid tổng bằng ether, tiếp theo là methyl hóa diazomethane và sau đó tách Chiết xuất triterpene Linh chi sử dụng ethanol là phương pháp dễ nhất để duy trì các hoạt động của các chất chiết xuất và để tăng quy mô sản xuất của nó Trong một nghiên cứu khác trong patent ME015 đã đưa ra phương pháp trích ly triterpenoids: 3g bột nguyên liệu được trích ly bằng ethanol 95% (v/v) trong 30 phút

Phương pháp định lượng triterpen được Zhang et al đưa ra năm 2008 Triterpenoid tổng số trong dịch trích ly được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở 548,1 nm sử dụng sắc ký lớp mỏng - quang phổ (phân hủy màu) và với acid ursolic làm chất chuẩn

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu – thiết bị - hóa chất

2.1.1 Vật liệu

 Mẫu thí nghiệm

- Bào tử nấm Linh chi được thu thập từ các trại nấm trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh được cung cung cấp bởi Th.S Nguyễn Thị Ngọc Yến Rây bào tử để loại

bỏ một số tạp chất Sấy ở nhiệt độ 40oC Bảo quản trong điều kiện khô ráo

- Giống nấm Trichoderma harzianum T2 được phân lập từ nấm Linh chi trong

đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Thái Minh Hiếu (10DSH), nhận từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trường ĐH Công Nghệ Tp HCM, cơ sở 1, 475A (số cũ: 144/24) Điện Biên Phủ, P 25, Q.Bình Thạnh, Tp.HCM

- Giống khuẩn lên men lactic được phân lập từ nem chua trong đồ án tốt nghiệp của Lê Thị Hồng Thuy (09DSH) nhận từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trường ĐH Công Nghệ Tp HCM, cơ sở 1, 475A (số cũ: 144/24) Điện Biên Phủ, P 25, Q.Bình Thạnh, Tp.HCM

2.1.2 Nơi tiến hành

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học trường ĐH Công Nghệ Tp HCM, cơ sở 1, 475A (số cũ: 144/24) Điện Biên Phủ, P 25, Q.Bình Thạnh, Tp.HCM

2.1.3 Thời gian thực hiện