Nghiên cứu thu nhận chiết có khả năng kìm hãm α glucosidase từ nấm linh chi

Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm chất chiết AGIs từ nấm linh chi cho sản xuất thử nghiệm thực phẩm cho người thừa cân và bệnh đái tháo đường .... Biết được những tác dụng quý của các hoạt ch

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

MAI XUÂN ĐẠI

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẤT CHIẾT

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm

ơn và các thông tin được trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Mai Xuân Đại

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc đến TS Vũ Thị Kim Oanh – Bộ môn Công nghệ sau thu hoạch, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và TS Nguyễn Đức Tiến – Viện Cơ Điện nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch Đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Đồng thời tôi xin được cảm ơn các anh, chị ở Bộ môn Nghiên cứu Phụ phẩm nông nghiệp – Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tạo điều kiện giúp

đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận văn

Mai Xuân Đại

iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xii

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu - yêu cầu đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn của luận văn 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Giới thiệu chung về nấm linh chi 4

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật của nấm Linh chi 4

2.1.2 Thành phần hóa học 6

2.1.3 Ứng dụng nấm Linh chi trong điều trị bệnh 8

2.2 Chất kìm hãm α-GLUCOSIDASE (α-GLUCOSIDASE INHIBITOR) (AGIs) 10

2.2.1 Enzyme α-glucosidase 10

2.2.2 Thu nhận AGIs 11

2.2.3 Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ 15

2.3 Ứng dụng sóng siêu âm trong chiết xuất 17

2.4 Nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng AGIs trên thế giới 22

2.5 Nghiên cứu và ứng dụng AGIs ở Việt Nam 24

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 26

3.1 Nguyên liệu, thiết bị và hóa chất 26

3.1.1 Nguyên liệu 26

3.1.2 Hóa chất và thiết bị 26

3.2 Thời gian và địa điểm 27

3.2.1 Địa điểm 27

3.2.2 Thời gian 27

3.3 Nội dung nghiên cứu 27

3.3.1 Khảo sát, lựa chọn nấm Linh chi (Ganoderma Lucidium) nguyên liệu cho chiết xuất hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (AGIs) 27

3.3.2 Xác định điều kiện chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi 27

3.3.3 Xác định điều kiện làm khô của chất chiết từ nấm Linh chi 28

3.4 Phương pháp nghiên cứu 28

3.4.1 Phương pháp nghiên cứu tổng quát 28

3.4.2 Khảo sát, lựa chọn nấm Linh chi (Ganoderma Lucidium) nguyên liệu cho chiết xuất hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (AGIs) 29

3.4.3 Phương pháp chiết xuất 29

3.4.4 Xác định điều kiện làm khô của chất chiết từ nấm Linh chi 30

3.4.5 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 33

3.4.6 Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa sinh 34

3.4.7 Phương pháp phân tích cảm quan 43

3.4.8 Phương pháp xử lý thống kê 44

Phần 4 Kết quả và thảo luận 45

4.1 Khảo sát, lựa chọn nấm linh chi (Ganoderma lucidium) nguyên liệu cho chiết xuất hoạt tính kìm hãm α -Glucosidase (AGIs) 45

4.2 Điều kiện chiết xuất AGIs từ nấm linh chi 46

4.2.1 Ảnh hưởng của loại dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi 46

4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi 48

4.2.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và Linh chi nguyên liệu đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi 49

4.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi 50

v

4.2.5 Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết

xuất AGIs từ nấm Linh chi 52

4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs từ nấm linh chi 54

4.4 Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm AGIS từ nấm linh chi 55

4.5 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm chất chiết AGIs từ nấm linh chi cho sản xuất thử nghiệm thực phẩm cho người thừa cân và bệnh đái tháo đường 56

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Kiến nghị 59

Tài liệu tham khảo 60

Phụ lục 72

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

AGIs alpha-Glucosidase inhibitor (chất kìm hãm α-glucosidase) (chất

ức chế α-glucosidase) CFU Colony forming unit (số đơn vị khuẩn lạc)

ĐTĐ Đái tháo đường

IC 50 Nồng độ kìm hãm 50% (Haft maximal inhibitory concentration)

p NPG p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside

RP – HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (Reverse phase-high

performance liquid chromatography) TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TPCN Thực phẩm chức năng

WHO World Health Organization – Tổ chức Y tế thế giới

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Các mẫu nấm Linh chi thu thập dùng cho nghiên cứu 26 Bảng 3.2 Tỷ lệ phối trộn các thành phần tạo ra sản phẩm bột hoà tan dạng 31 Bảng 3.3 Mười trật tự trình bày mẫu tuân theo nguyên tắc hình vuông Williams

tương ứng với 5 mẫu khảo sát 32 Bảng 4.1 Chất lượng dinh dưỡng của mẫu nấm Linh chi nguyên liệu 45 Bảng 4.2 Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của các mẫu nấm Linh chi

nguyên liệu 45 Bảng 4.3 So sánh phương pháp chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi bằng sử dụng

sóng siêu âm và không sử dụng sóng siêu âm 54 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô sấy chân không và thời gian cô đến chất

lượng cảm quan, hoạt tính kìm hãm α-glucosidase chế phẩm AGIs từ nấm Linh chi 55 Bảng 4.5 Kết quả phân tích hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, dinh dưỡng và các

chỉ tiêu lý hóa của chế phẩm AGIs từ nấm Linh chi 55 Bảng 4.6 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật, kim loại nặng và các chất

không mong muốn trong sản phẩm chế phẩm AGIs 56 Bảng 4.7 Kết quả điểm đánh giá cảm quan cho các chỉ tiêu của sản phẩm bột

AGIs Linh chi hoà tan 57

AGIs từ nấm Linh chi 48 Hình 4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung nguyên liệu: môi ethanol 50% đến chiết

xuất hoạt chất AGIs từ nấm Linh chi 49 Hình 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiết xuất hoạt chất AGIs từ nấm Linh chi 51 Hình 4.5 Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến hoạt tính kìm

hãm α-glucosidase (AGIs) của dịch chiết xuât từ nấm Linh chi 53 Hình 4.6 Sơ đồ quy trình chiết xuất hoạt chất AGIs từ nấm Linh chi 58

ix

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Mai Xuân Đại

Tên luận văn: “Nghiên cứu thu nhận chất chiết có khả năng kìm hãm α- Glucosidase từ

Nội dung nghiên cứu

- Xác định chất lượng dinh dưỡng và khả năng kìm hãm α- glucosidase của chiết xuất nấm Linh chi

- Xác định điều kiện chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi

- Xác định điều kiện làm khô của chất chiết từ nấm Linh chi

Phương pháp nghiên cứu

b) Xác định điều kiện chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi

- Ảnh hưởng của loại dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi: loại dung môi nước cất, ethanol 96%, methanol 96%, isopropy alcohol 96%

- Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi: nồng độ dung môi 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 96 %

- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi: nhiệt

độ 25, 35, 45, 55, và 65 ± 2oC

- Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và Linh chi nguyên liệu đến khả năng chiết

xuất AGIs từ nấm Linh chi: tỉ lệ Linh chi nguyên liệu/dung môi: 1/6, 1/8, 1/10, 1/12, 1/14, 1/16, 1/18

-Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi: thời gian : 0, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22 phút và cường độ sóng siêu âm: 0 (không siêu âm), 2, 4, 6, 8 W/cm2

c) Xác định điều kiện làm khô của chất chiết từ nấm Linh chi

- Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs: nhiệt độ 50, 60, 70, 80, 90 và 100oC

- Phương pháp phân tích :

a) Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki et

al (1999)

b) Phương pháp xác định các chỉ tiêu hóa sinh

 Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi; hàm lượng protein tổng số theo phương pháp Kjeldahl; hàm lượng lipid theo phương pháp Sohxlet, hàm lượng cellulose; lượng β- Glucan được xác định bằng phương pháp phenol- sulfuric; lượng trietrpenoid được xác định bằng phương pháp đo mật độ chiết quang và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp quét gốc tự do DPPH theo phương pháp của Shimada et al (1992)

c) Phương pháp phân tích các chỉ tiêu an toàn thực phẩm, chất lượng dinh dưỡng

+ Xác định E.coli theo TCVN 6846:2007; Xác định Salmonella theo TCVN 4829:2005; Xác định Staphylococcus aureus theo TCVN 4830:2005; Xác định

Clostridium perfringens theo TCVN 4991:2005; Xác định Bacillus cereus theo TCVN

4992:89; Xác định aflatoxin theo TCVN 7596:2007; Xác định tổng số vi sinh vật hiếu

khí, theo TCVN 4884:2005; Tổng bào tử nấm men – mốc TCVN 6265:2007 ; Xác định Coliforms, theo TCVN 4882:2007

+ Xác định hàm lượng chì, theo AOAC 994.02; Xác định Asen, theo AOAC 952,13; Xác định hàm lượng cadimi, theo AOAC 2000; Xác định hàm lượng thủy ngân, theo AOAC 971,21; Xác định hàm lượng đồng, theo ISO 8294:1994; Xác định hàm lượng 3-MCPD, theo TCVN 7731: 2007

- Phương pháp phân tích cảm quan: Số liệu được xử lý trên phần mềm thống kê Irristat 5.0 và phần mềm Microsoft Excel

Kết quả chính và kết luận

- Lựa chọn được nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) nguyên liệu cho chiết xuất

hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (AGIs) tại cơ sở ở Hưng Yên;

- Tối ưu hóa quá trình tách chiết nấm Linh chi để thu được hoạt tính α-

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Mai Xuan Dai

Thesis title: Study extract acquisition capable of inhibiting α-Glucosidase from

Ganoderma lucidum

Educational organization: Vietnam National University and Agriculture

Research Objectives

Using Ganoderma to obtain the active ingredient that inhibits α-Glucosidase, meeting food safety and hygiene standards, used for functional food processing up to TCVN standards, contributing to diversifying health protection food products in the Vietnamese market

Research content

- Determination of nutritional quality and ability to inhibit α-glucosidase of Ganoderma extract;

- Determining conditions for extracting AGIs from Ganoderma lucidum;

- Determine the drying conditions of Ganoderma extract

Materials and Methods

- Experimental arrangement method:

a) Determination of nutritional quality and resistance of α-glucosidase of Ganoderma extract

- Ganoderma strain: Ganoderma is collected in 5 different localities of Sa Pa, Hung Yen, Thanh Hoa, Da Lat and Ninh Binh Evaluation criteria: moisture (%), cellulose (%), lipid (%), protein (%), polysaccharide (mg%), β- glucan (mg%), triterpenoid (mg%) and inhibitory activity α- glucosidase (AGIs) (%)

b) Determine conditions for extracting AGIs from Ganoderma lucidum

- Effects of solvents on the ability of extracting AGIs from Ganoderma: type of distilled water, 96% ethanol, 96% methanol, 96% isopropy alcohol;

- Effect of solvent concentration on the ability of extracting AGIs from

Ganoderma lucidum: solvent concentration 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 96%;

- Effect of temperature on ability of extracting AGIs from Ganoderma lucidum:

temperature of 25, 35, 45, 55, and 65 ± 2oC;

- The effect of the ratio of solvent and lingzhi to the ability of extracting AGIs

xiii

from Ganoderma lucidum: the ratio of lingzhi of raw material / solvent: 1/6, 1/8, 1/10,

1/12, 1/14, 1/16, 1/18;

- The effect of time and intensity of ultrasound on the ability to extract AGIs

from Ganoderma lucidum: time: 0, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22 minutes and intensity of

ultrasound : 0 (without ultrasound), 2, 4, 6, 8 W / cm2

c) Determine the drying conditions of reishi mushroom extracts

- Influence of evaporative temperature, drying of inoculants on quality of AGIs: temperature of 50, 60, 70, 80, 90 and 100oC

+ Testing application of AGIs to create instant powder of AGIs

- Analytical methods:

a) Methods of determining the inhibitory activity of α-glucosidase according to Toomoyuki et al (1999)

b) Methods of determining biochemical criteria

Determination of moisture by drying method to constant weight, total protein content by Kjeldahl method and lipid content by Sohxlet method, cellulose content, β-Glucan content determined by phenol-sulfuric method, The amount of trietrpenoid was determined by the refractive density measurement, and the antioxidant activity was

assessed by DPPH free radical scans according to Shimada et al (1992)

c) Methods of analyzing food safety and nutritional quality criteria

+ Determination of E.coli, according to TCVN 6846: 2007; Determination

of Salmonella, according to TCVN 4829: 2005; Determination of Staphylococcus

aureus, according to TCVN 4830: 2005; Determination of Clostridium perfringens,

according to TCVN 4991: 2005; Determination of Bacillus cereus, according to

TCVN 4992: 89; Determination of aflatoxin, according to TCVN 7596: 2007; Determine the total number of aerobic microorganisms, according to TCVN 4884: 2005; Total yeast spores - molds TCVN 6265: 2007; Determine Coliforms, according to TCVN 4882: 2007

+ Determination of lead content, according to AOAC 994.02; Determination of arsenic, according to AOAC 952.13; Determination of cadmium content, according to AOAC 2000; Determination of mercury content, according to AOAC 971.21; Determination of copper content, according to ISO 8294: 1994; Determination of content for 3-MCPD, according to TCVN 7731: 2007

- Method of sensory analysis: Data were processed on Irristat 5.0 statistical software and Microsoft Excel software

Main findings and conclusions

- Select Ganoderma lucidum as raw material for α-glucosidase inhibiting extract

(AGIs) at the facility in Hung Yen;

- Optimize Ganoderma lucidum extract process to obtain α- glucosidase activity:

Determine the conditions affecting the extraction process of AGIs extracted

from Ganoderma lucidum using ultrasound, as follows: Ganoderma lucidum/ethanol

50% = 1/10, treated by ultrasonic waves intensity of 8 w/cm2, 20 kHz, at a temperature

of 45oC for 18 minutes

- Determining the drying conditions, she collected AGIs extract from Ganoderma

lucidum extract: she dried vacuum at -0.8 atm at 60 ± 2ºC

1

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm Linh chi được xếp hàng đầu trong danh mục nấm dược liệu và từ lâu

đã được xem là dược liệu quý trong đông y Biết được những tác dụng quý của các hoạt chất trong nấm Linh chi, ngày càng nhiều nơi trên thế giới quan tâm nghiên cứu và bào chế các sản phẩm có thành phần hoạt chất từ nấm Linh chi, trong đó có Việt Nam Ngày nay, qua nhiều công trình nghiên cứu khoa học hiện đại đã xác định được trên 100 hợp chất, dẫn xuất của nấm Linh chi và đã được chứng minh có tác dụng chữa bệnh, hỗ trợ cho hệ thống miễn dịch, thần kinh,

phòng chống bệnh, bồi bổ sức khỏe và kéo dài tuổi thọ (De Clercq et al., 2006)

Nấm Linh chi chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh học như triterpenoid, polysaccharide, meroterpenoid, sesquiterpenoid, steroid, alkaloid,… Qua nhiều nghiên cứu từ các phòng thí nghiệm, các hợp chất này được tuyên bố là có khả

năng chống lại các chất độc (Koyama et al., 1997), chống ung thư ( Ha et al.,

2000) và khối u (Chen and Zhong, 2011) và cũng có khả năng chống viêm và

kháng oxy hóa (Chan et al., 2008) Cùng đó, các hoạt chất sinh học có tác dụng

dược lý mạnh của nấm Linh chi đều có bản chất Triterpennoid và polysacharide trong đó có cả hoạt chất kìm hãm α-glucosidase (AGIs) Cơ chế tác dụng là AGIs kết hợp với α- glucosidase ở ruột làm kìm hãm sự thủy phân tạo thành glucose, ngăn hấp thụ glucose đường huyết sau ăn, có tác dụng chống bệnh đái tháo đường và thừa cân béo phì (Holman, 1998)

Trên thế giới đã có các nghiên cứu về chiết xuất và ứng dụng hoạt chất AGIs từ nấm Linh chi AGIs được tìm thấy trong nhiều trong quả thể nấm Linh chi, được đánh giá cao về hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, ứng dụng hỗ trợ trị bệnh ĐTĐ và thừa cân béo phì Sử dụng nấm Linh chi để thu nhận hoạt chất AGIs đang là hướng mới cho chất chiết xuất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase Sản phẩm AGIs từ nấm Linh chi hiện đang được phát triển, với mục đích hỗ trợ kiểm soát đường huyết, hỗ trợ kiểm soát thừa cân béo phì Trong thời gian gần đây, ở trong nước đã có một số nghiên cứu được tiến hành nhằm phát triển công nghệ và sản phẩm mới từ nấm Linh chi Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ mới, đặc biệt là công nghệ chiết xuất có hỗ trợ bằng siêu âm để chiết xuất các hoạt chất sinh học từ nấm Linh chi vẫn còn rất hạn chế Việc nghiên cứu

ứng dụng sóng siêu âm để chiết xuất các hoạt chất sinh học từ nấm Linh chi nhằm tạo ra các sản phẩm thương mại có ý nghĩa khoa học và có tính thiết thực

vì có thể mang lại lợi ích về kinh tế xã hội ở Việt Nam

Chính vì thế, việc nghiên cứu thu nhận AGIs từ các nguồn nấm Linh chi nguyên liệu trong nước và hướng ứng dụng ở điều kiện hiện tại của Việt Nam là

vấn đề cấp thiết, mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao“Nghiên cứu thu nhận chất chiết có khả năng kìm hãm α- glucosidase từ nấm Linh chi” là một việc làm

cấp thiết hiện nay

1.2 MỤC TIÊU - YÊU CẦU ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu

Sử dụng nấm Linh chi để thu nhận được hoạt chất kìm hãm α-glucosidase đạt chỉ tiêu an toàn vệ sinh thực phẩm, dùng cho chế biến thực phẩm chức năng đạt TCVN, góp phần đa dạng hóa sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe trên thị trường Việt Nam

- Xác định điều kiện làm khô của chất chiết từ nấm Linh chi

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nước ta có nguồn nguyên nấm dược liệu nói chung và nấm Linh chi là rất đa dạng và phong phú Trong sản xuất AGIs từ thiên nhiên cho hiệu quả giảm đường huyết đối với người bệnh ĐTĐ cao, sử dụng an toàn và không có tác dụng phụ Đó là lý do thúc đẩy nghiên cứu chọn các nấm Linh chi sản xuất trong nước làm nguyên liệu để chiết xuất AGIs

Các nấm Linh chi khảo sát và lựa chọn từ các nguồn nguyên liệu mẫu nấm Linh chi tại các hộ sản xuất ở các tỉnh khác nhau: Sa Pa (Lào Cai), TP Hưng Yên, Thạch Thành (Thanh Hóa), Đơn Dương (Đà Lạt), Yên Khánh (Ninh Bình)

Phương thức chiết xuất chất chiết hoạt tính kìm hãm α-glucosidase với

hỗ trợ chiết xuất bằng sóng siêu âm

- Về mặt khoa học, đề tài đã đưa ra một số điểm mới:

+ Bước đầu đã lựa chọn được nấm Linh chi nguyên liệu ở Việt Nam cho chiết xuất dịch chiết có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao;

+ Bước đầu xác định được quy trình chiết xuất, thu nhận chất chiết hoạt tính kìm hãm α-glucosidase AGIs từ nấm Linh chi với hỗ trợ sóng siêu âm và ứng dụng chế phẩm chất chiết AGIs từ nấm Linh chi cho sản xuất bột uống liền;

- Kết quả luận án là công trình ở Việt Nam nghiên cứu bước đầu về thu nhận chất chiết hoạt tính kìm hãm α-glucosidase AGIs từ nấm Linh chi bằng hỗ trợ sóng siêu âm (từ việc lựa chọn nấm Linh chi nguyên liệu, các điều kiện chiết AGIs, làm khô dịch chiết tạo chế phẩm chất chiết AGIs từ nấm Linh chi), góp phần làm phong phú thêm nguồn thu các chất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase để ngăn ngừa bệnh ĐTĐ và béo phì

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM LINH CHI

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật của nấm Linh chi

2.1.1.1 Nguồn gốc

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được tìm thấy ở nhiều nơi trên thế

giới Nó thường mọc trên những thân cây mục hay còn gọi là Linh chi thảo, do vậy nhiều tác giả đã cho rằng đây là một loại cây cỏ thực ra Linh chi là một loại nấm Trong tự nhiên, nấm Linh chi chỉ mọc ở rừng rậm, ít ánh sáng và có

độ ẩm cao, thường thấy xuất hiện trên những thân cây mục (Nguyễn Hữu Đống

và cs., 2000)

Trung Quốc được coi là cái nôi phát hiện nấm Linh chi, từ đầu thế kỷ 17 nấm Linh chi đã được biết đến, nuôi trồng và sử dụng như nguồn dược liệu quý Tại Nhật Bản, đến năm 1971, hai giáo sư của trường đại học Kyoto là Yukio Naoi và Zenzabuno Kasai đã nghiên cứu thành công công nghệ gây giống và từ

đó nấm Linh chi mới sản xuất được ở quy mô lớn (Lê Xuân Thám, 1996)

2.1.1.2 Phân loại

Tên gọi: Nấm Linh chi, Nấm lim, Nấm trường thọ…

Tên khoa học: Ganoderma lucidum

Nấm Linh chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay (Nguyễn Lân Dũng, 2001):

Giới (regnum): Nấm (Fungi);

Ngành (phylum): Nấm đảm (Basidiomycota);

Lớp (class): Agaricomycetes;

Họ (familia): Nấm gỗ (Ganodermataceae);

- Cổ Linh chi: Tên khoa học là Ganoderma applanatum (Pers) Past, còn

5

gọi là Linh chi đa niên nhiều tầng và có hàng chục loài khác nhau Đây là các loài nấm gỗ không cuống hoặc cuống rất ngắn, có nhiều tầng, mỗi năm thụ tầng lại phát triển thêm một lớp mới chồng lên Mũ nấm hình quạt, màu từ nâu xám đến đen sẫm, bề mặt trên sù sì thô ráp Nấm rất cứng, cứng như gỗ lim nên còn gọi là nấm lim

- Linh chi: Tên khoa học là Ganoderma lucidum (Leyss ex fr) kart, có

nhiều loài khác nhau Kết quả thống kê cho thấy, chủng loại Linh chi rất phong phú, ước tính thống kê trên thế giới có trên 200 loài nấm Linh chi, có loài hình nấm nhưng mũ không tròn mà nhăn nheo, có loài hình giống như trái thận, có loài giống như sừng hươu

Hình 2.1 Các loại nấm Linh chi

2.1.1.3 Đặc điểm thực vật của nấm Linh chi

Nấm Linh chi thường có ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trong tự nhiên, nấm thường chỉ có ở nơi rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm cao (Trương Thị Hòa và cs., 2001)

Linh chi có cấu tạo 2 phần: Phần cuống và mũ nấm Cuống nấm biến dị rất lớn từ rất ngắn 0,5 cm; cho đến dài cỡ hàng 5 - 10 cm hoặc rất dài 20 – 25 cm Cuống có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm do quá trình lên tán mà thành

Mũ nấm dạng thận gần tròn, đôi khi xoè hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàng nâu, vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím hoặc nâu đen, nhẵn bóng như láng vecni Kích thước tán biến động từ 2 – 30 cm; dày 0,8 - 2,5 cm

Thịt nấm dày từ 0,4 - 1,8 cm; màu vàng kem, nâu nhạt hoặc trắng Nấm mềm, dai khi tươi và trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, hệ sợi kiểu trimitic, đầu tận cùng của sợi phình hình chuỳ, màng rất dày đan khít vào nhau tạo thành lớp

vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh cuống (Nguyễn Đức Tiến, 2006)

2.1.2 Thành phần hóa học

Cho đến nay, các nhà khoa học đã tìm ra nấm Linh chi có chứa các hoạt chất quý như triterpenoid, polysaccharide, peptid, steroid, acid amin, khoáng chất (Dược liệu học, 2013), và không no (Nguyễn Anh Dũng, 1995), protein, alkaloid,

nucleosid (Huang S Q., 2010), ergosterol (American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium) và các vitamin (Gow T et al, 2008; Paterson R.,

2006) Hàm lượng một số thành phần hợp chất chính trong nấm Linh chi gồm: nước 12-13%; cellulose 54-56%; lignin 13-14%; hợp chất có nitơ 1,6-2,1%; hợp chất phenol 4-5%; chất béo 1,9-2%; kali 1,9-2%; natri 0,08-0,12%; canxi 1-1,2% (Ngô Thanh Vân, 2016)

Trong số các thành phần hóa học của nấm Linh chi thì polysaccharide và triterpenoid được chú ý hơn cả vì những tác dụng sinh học đáng kể của chúng

(Bao X et al, 2001; Iris F et al, 2011)

2.1.2.1 Polysaccharide

Các polysaccharide được phân lập từ bào tử, quả thể và sợi nấm Linh chi

hoặc tách từ dung dịch môi trường nuôi cấy nấm (Huie C et al, 2004)

Polysaccharide là một trong những thành phần có hàm lượng cao của G lucidum (Dược liệu học, 2013) gồm các polysaccharide trung tính (β-1→3, β-

1→6 homo D-glucan); glucan có tính acid và polyglycan; hetoroglucan liên kết protein; arabinoxyoglucan (một heteroglucan phân nhánh cao); heteroglycan với liên kết β-1→4 và peptidoglycan (ganderan A, B và C) (Phạm Bảo Trương,

2015) Dây nối (1,3)-β-D-glucan làm cho mạch polysaccharide có dạng xoắn tương tự như tinh bột (1,3)-β-D-glucan tan trong nước nóng và tan một phần trong nước lạnh Dung dịch nước của các (1,3)-β-D-glucan ở nồng độ cao có độ

nhớt cao (Dược liệu học, 2013)

Các β-glucan trong thể quả của Linh chi có thể có cùng khối lượng phân

tử nhưng khác nhau về mức độ phân nhánh Khối lượng phân tử của các chất này

vào khoảng 1.050.000 ĐVC Dây nhánh trong các β-glucan của Linh chi thường

1→6 (20) Tỉ lệ phân nhánh thay đổi từ 1/3 – 1/23 Các heteropolysaccharide

7

trong Linh chi cấu tạo bởi các đường D-glucose, D-galactose, D-mannose, L-(

hay D-)-arsbinose, D-xylose hay L-fucose (Dược liệu học, 2013; Iris F et al,

2011)

Hình 2.2 Công thức đơn vị polysaccharide- proteoglycan chiết xuất từ

Ganoderma lucidum 2.1.2.2 Triterpenoid

Terpen là hợp chất tự nhiên mà bộ khung cacbon của nó bao gồm một

cấu trúc khung C30 (Iris F et al, 2011) Cấu trúc hóa học của các triterpenoid

trong nấm Linh chi dựa trên lanostan, là một chất chuyển hóa của lanosterol

(Gow T et al, 2008; Iris F et al, 2011) Các triterpenoid của nấm Linh chi đã

nhận được những chú ý đáng kể do những tác dụng dược lý nổi bật của chúng

(Boh B et al, 2007; Cheng P et al, 2013)

Các triterpenoid đầu tiên được phân lập từ Linh chi là acid ganoderic A và

B Đến hiện nay các nghiên cứu cho thấy đã có hơn 100 triterpenoid, trong số đó

có hơn 50 triterpenoid đã được tìm thấy trong Linh chi Phần lớn đó là acid ganoderic và lucidenic, những triterpenoid khác như ganoderals, ganoderiols, và acid ganodermic cũng đã được xác định (Nguyễn Hữu Đống và cs, 2000)

Cấu trúc hóa học của triterpenoid dựa trên cấu trúc của lanostane, nó là một chất chuyển hóa của lanosterol, sinh tổng hợp dựa trên sự tạo vòng của các squalene

Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của lanosterol và ba trong số nhiều hợp chất

phân lập từ Ganoderma lucidum

Arisawa và cộng sự đã xác định cấu trúc của một số triterpenoid:

+ Ganodermenonol: 26 - hydroxy - 5 α - lanosta - 7,9 (11) 24 - trien -one + Ganodermadiol: 5 α - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 β 26 - diol

+ Ganodermatriol: 5 α - lanosta - 7,9 (11).24 - trien - 3 β 26,27 – triol Trong các nhóm Ganodermic acid, Wang và cộng sự đã chứng minh được hiệu lực ức chế kết tụ cầu ở người và xác định cấu trúc phân tử của Ganoderic acid S: Lanosta - 7,9 (11) 24 - trien - 3 β, 15 α - diacetoxy - 26 - oic acid

2.1.3 Ứng dụng nấm Linh chi trong điều trị bệnh

2.1.3.1 Khả năng chống ung thư và khối u

Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy ảnh hưởng có lợi của nấm Linh chi như là một liệu pháp bổ trợ cho bệnh nhân ung thư Các nghiên cứu cho thấy, polysaccharide (GPL) trong nấm Linh chi thể hiện khả năng chống ung thư bằng cách kích thích chức

năng miễn dịch (Gao et al., 2005) GLP có thể kích hoạt tế bào lympho T và tế bào

lympho B, đại thực bào, tế bào tua (DCs) và tế bào tiêu diệt tự nhiên (NKs), thúc đẩy tăng sinh tế bào lympho, tăng cường thực bào, tăng sản xuất cytokine và làm tăng

thêm tính độc hại trung gian của các tế bào tiêu diệt tự nhiên (Chan et al., 2008)

9

Trong y học cổ truyền Trung Quốc, nấm Linh chi là một trong những loại thảo dược được kê đơn rộng rãi để điều trị khối u Một số phần được chiết xuất từ GLP cũng được phát hiện có tính chống tạo mạch và chống tăng sinh, góp phần tạo nên cơ chế

chống lại khối u (Zengtao et al., 2011)

2.1.3.2 Khả năng chống viêm và chống oxy hóa

Trên mô hình thí nghiệm của Soniamol et al (2009), chiết xuất chloroform của

nấm Linh chi cho thấy tác dụng ức chế chống lại chứng viêm gây ra ở cả hai mô hình thí nghiệm Các carrageenan gây ra viêm mãn tính cấp tính đã bị ức chế bởi các chiết xuất Hiệu quả đã được chứng minh từ sự ức chế phù chân ở người

Kết quả của một số cuộc điều tra hiện nay cho thấy chiết xuất chloroform của nấm Linh chi có khả năng đáng kể để ức chế sự hình thành gốc tự do và hoạt động nhặt gốc tự do Khả năng chống chống oxy hóa cho thấy sự hoạt động ở các mức độ

khác nhau (Cadena et al., 1996) Chế độ ăn uống của con người có chứa nấm dược

liệu có dặc tính chống oxy hóa sẽ giúp con người tránh được các thiệt hại do hoạt động này gây ra Tính chất dược liệu của nấm Linh chi có thể là do hoạt tính chống

oxy hóa đáng kể của nó (Sheena et al., 2003)

2.1.3.3 Ứng dụng khả năng kháng vi rút của các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Mục tiêu của nghiên cứu trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do virus và vi khuẩn là việc phát hiện ra tác dụng cụ thể ức chế virus và vi khuẩn mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường Các tác dụng phụ không mong muốn của thuốc kháng sinh, thuốc chống virus và sự xuất hiện các chủng kháng thuốc đột biến đã khiến các nhà nghiên cứu điều tra về hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus của nấm Linh chi Hijikata and Yamada (1988) trong một nghiên cứu dịch trích ly bằng nước nóng của nấm Linh chi (tương đương với 36 hoặc 72 g nấm khô mỗi ngày) được sử dụng như điều trị cho 4 bệnh nhân cao tuổi bị đau dây thần kinh Cách điều trị này đã làm giảm đáng kể cơn đau và thúc đẩy việc chữa lành các tổn thương, mà không phát hiện bất cứ độc tính ngay cả ở liều rất cao

Để đánh giá các tác dụng kháng khuẩn của nấm Linh chi, một số nghiên cứu

trên động vật sử dụng nấm Linh chi đã được thực hiện Theo Ohno et al (1998)

Những con chuột được tiêm dịch trích ly của nấm Linh chi với liều lượng (2

mg /1 cá thể chuột) cho thấy mức độ cải thiện tỉ lệ sống rõ rệt (> 80% so với 33% ở nhóm đối chứng)

2.1.3.4 Ứng dụng điều trị gan và tổn thương dạ dày của các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Dịch trích ly bằng nước và nước nóng của nấm Linh chi đã được tìm thấy có tác dụng mạnh trong việc điều trị tổn thương gan Trong một nghiên cứu của

Shieh et al (2001) khi trích ly nấm Linh chi bằng nước đã được đưa vào đường

miệng chuột thấy có tác dụng ức chế chống lại sự hình thành của malondialdehyde (MDA), trong gan và thận chuột

2.1.3.5 Ứng dụng điều trị đái tháo đường của các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

Những thành phần của nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng

hạ đường huyết đối với động vật Các ganoderan A và B là hai polysaccharide được chiết tách từ thân nấm Linh chi, sau khi được tiêm cho chuột bị tiểu đường với liều lượng 100 mg/kg, cho thấy hàm lượng glucose trong máu giảm và tác

dụng hạ đường huyết vẫn tiếp tục kéo dài suốt 24 giờ (Hikino et al (1985))

Cũng trong một thí nghiệm trên chuột, ganoderan B có tác dụng làm tăng lượng insulin, qua đó làm giảm hàm lượng glucose trong máu và điều chỉnh quá trình

tổng hợp glucose dưới tác dụng của các enzyme có sẵn trong gan (Hikino et al

(1989)) Trong một nghiên cứu khác cũng được tiến hành trên chuột, người ta đã chứng minh được rằng một polysaccharide khác có trong nấm Linh chi được gọi

là ganoderan C cũng có tác dụng hạ đường huyết (Hikino et al (1989); Tomoda

et al (1986))

INHIBITOR) (AGIs)

2.2.1 Enzyme α-glucosidase

2.2.1.1 Sơ lược về enzyme

Enzyme là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein và có trong mọi tế bào sinh vật Trong cuộc sống, nhờ có enzyme mà xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học với một hiệu suất rất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH

Hoạt tính của enzyme chịu tác động bởi nhiều yếu tố Tác nhân kìm hãm là các phân tử làm giảm hoạt tính của enzyme, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tử làm tăng hoạt tính của enzyme (Phạm Thị Trân Châu và cs., 2009)

11

2.2.1.2 Giới thiệu về enzyme α –glucosidase

Enzyme α-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase, glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α–D-glucosidase, transglucosidase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase

(nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân)

Enzyme glucosidase là enzyme thủy phân thuộc nhóm glucosidase (α-, β-

và α-1,3-glucosidase) là enzyme exohydrolysis có chức năng thủy phân từ đầu khử đến đầu không khử của oligosaccharide chứa các α-D-glucose nối với nhau bằng liên kết 1-4 glycosides Enzyme glucosidase có thể có nhiều nguồn gốc khác nhau: Từ vi khuẩn, nấm mốc, đường tiêu hóa động vật việc khác nhau về nguồn gốc α-glucosidase có thể dẫn đến sự khác biệt về pH hoạt động, khoảng nhiệt độ hoạt động, hoạt độ của enzyme những thông số này chỉ có thể thu nhận được qua thực nghiệm trên một α-glucosidase cụ thể Enzyme α-glucosidase được phân chia theo cấu trúc chính gồm có gen mã hóa lysosomal α-glucosidase dài khoảng 20 kb Enzyme α-glucosidase hoạt động ở pH tối ưu từ là 4 - 4,5 α-glucosidase có khả năng phân cắt các liên kết α -1 →4, α-1 →3 và α-1 →2 D

glucoside có thể hấp thụ trực tiếp vào máu (De Melo et al., 2006) α-glucosidase

có tác dụng xúc tác thủy phân đường maltose và đường sucrose

2.2.2 Thu nhận AGIs

Việc tìm kiếm các AGIs có ý nghĩa rất lớn trong các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm… Đã có nhiều hợp chất được tìm thấy trong tự nhiên hoặc tổng hợp có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase Tuy nhiên, những tác nhân kìm hãm α-glucosidase tổng hợp bằng con đường hóa học hiện nay thường gây nhiều phản ứng phụ Vì vậy, việc tìm kiếm các hoạt chất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase vẫn đang được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Thông thường, việc nghiên cứu các AGIs luôn bắt đầu từ các hợp chất có trong tự nhiên vì nguồn rất phong phú, đa dạng và ít phản ứng phụ Do đó, các nhà khoa học trên thế giới thường sử dụng những phương pháp sàng lọc hoạt tính kìm hãm enzyme này để định hướng trong nghiên cứu Nhiều nước đã công bố trên các tạp chí quốc tế về các thực vật, vi sinh vật có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase với mục đích sử dụng trong lĩnh vực thực phẩm chức năng, dược phẩm, cũng như đã chiết

xuất được nhiều hợp chất có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase

Năm 1970, người ta đã nhận ra rằng việc sử dụng các AGIs có thể kiểm

soát sự hấp thụ carbonhydrat và giúp hỗ trợ điều trị cho những người mắc bệnh ĐTĐ một cách hiệu quả Bản chất của các chất kìm hãm là các flavonoid, pseudooligosaccharide, thiosugar, iminosugar, carbasugar,… có nguồn gốc chủ

yếu từ thực vật và vi sinh vật (De Melo et al., 2006)

Hiện nay, các AGIs được chia thành các nhóm chính: Disaccharide, iminosugar, thiosugar, pseudoaminosugar, carbasugar và các hợp chất không

có liên kết glucosidic AGIs có thể tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: Chiết xuất từ thực vật, động vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc

bằng con đường vi sinh vật (Zhang et al., 2006)

2.2.2.1 Các AGIs từ tổng hợp

Các AGIs từ tổng hợp như: kojibiose (2-alpha-D-glucosyl-D-glucose) là hợp chất thuộc nhóm chất disaccharide, nó là sản phẩm caramen hóa của glucose, 3-O-(-D-Glucopyranozyl)-1-deoxynojirimycin, Isofagomin và Noeuromycin là hợp chất thuộc nhóm chất iminosugar, Valiolamin, Hydroxyvalidamin và Voglibose là hợp chất thuộc nhóm chất carbasugar và pseudoaminosugar, X = O; S; Se; N Tetrahydroxyazepan là hợp chất thuộc nhóm chất thiosugar và các hợp chất không có

liên kết glycosidic (De Melo et al., 2006)

2.2.2.2 Các AGIs từ động vật

Năm 2009, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc đã khám phá ra chất

chiết xuất từ Stichopus japonicas (Hải Sâm) có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase

Nghiên cứu cho thấy nếu chiết hải sâm bằng hexan ở tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là 0,5 mg/ml thì hoạt tính kìm hãm α-glucosidase từ nấm men là 68% và từ dịch chiết Hải Sâm đã thu được ba loại AGIs (Nguyen and Kim, 2009)

2.2.2.3 Các AGIs từ vi sinh vật

Chen et al (2007) cho thấy hoạt tính kìm hãm α-glucosidase của Touchi từ Aspergillus Oryzae (A Oryzae) lên men cao hơn hẳn so với các sản phẩm lên men ở các loài khác Hơn thế nữa, A oryzae được xác nhận là chủng nấm có đặc tính an

toàn, dễ phát triển và phân lập AGIs chiết xuất từ Touchi có thể được bổ sung vào các sản phẩm: Các sản phẩm chế biến nông sản và thủy sản (mứt, bánh mì, bánh gạo, ngũ cốc, các sản phẩm chế biến từ đỗ tương, bột cá, xúc xích cá, thực phẩm có chứa trứng, các loại thực phẩm đóng hộp; các sản phẩm sữa và chế biến từ sữa (bơ, phô mai, sữa đặc, sữa bột), nước giải khát lên men lactic; miso, nước tương, các loại hương vị, phụ gia và các loại TPCN bổ sung dinh dưỡng khác (Kawabata, 2000) Kết quả này chính là nền tảng cho nghiên cứu chuyên sâu về tuyển chọn chủng nấm

13

mốc A oryzae đặc hiệu cho quá trình hình thành AGIs với hoạt tính kìm hãm

α-glucosidase đạt hiệu quả cao trong điều kiện ở Việt Nam Nguyễn Đức Tiến và cs

(2014) đã phân lập và tuyển chọn được A oryzae T6 ở Việt Nam cho khả năng

hình thành hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao từ 19 mẫu mốc được lấy ở một

số cơ sở sản xuất tương đã phân lập, tuyển chọn và định danh bằng phương pháp

giải trình tự gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 được A oryzae T6 cho khả năng hình

thành hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao từ mẫu đỗ đen mốc ở Cựu Đà, Thanh

Oai, Hà Nội Nguyễn Đức Tiến và cs (2013,2014) sử dụng đỗ đen xanh lòng (Vigna Cylindrica Skeels) lên men bằng Aspergillus oryzae T6 để sản xuất chế

phẩm AGIs ức chế enzym α-glucosidase dùng cho bệnh nhân ĐTĐ, thừa cân và béo phì Xác định được quy trình thu nhận chế phẩm AGIs bằng phương pháp lên men rắn, xốp trên môi trường đỗ đen xanh lòng (Vigna Cylindrica Skeels) của

Việt Nam nhờ A oryzae T6, Xác định được bản chất của AGIs này là peptide có

khối lượng phân tử 926,4861 Da Peptide AGIs trong đỗ đen lên men chiếm 0,183 % Bước đầu ứng dụng chế phẩm AGIs trong sản xuất bột ăn liền cho người bệnh đái tháo đường và béo phì

Các nghiên cứu thử nghiệm trên chuột chứng minh salacinol có hoạt tính kìm hãm sự tăng nồng độ đường trong máu mạnh hơn acarbose Một vài nghiên cứu lâm sàng cho thấy salacinol có tác dụng kiểm soát lượng đường trong máu Tại Nhật Bản, salacia oblonga đã được bán như một thực phẩm chức năng (TPCN)

và nó cũng được biết đến ở Mỹ với tên gọi Saptrangi hay Ponkora

Ye et al (2002) đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết một loại thảo mộc Trung Quốc có tên là Ramulus mori (Sangzhi) trên chuột Kết quả

cho thấy chuột bị gây ĐTĐ bằng alloxan được uống dịch chiết này đã làm giảm lượng đường huyết sau ăn, ổn định lượng đường trong máu lúc đói Tuy nhiên chất chiết này không gây ảnh hưởng đến sự hấp thụ glucose trong ruột non ở chuột bình thường

Nilubon et al (2007) đã công bố dịch chiêt bằng methanol từ lá cây hoa sữa phơi khô (Alstonia scholaris) có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ruột non

chuột AGIs đã được tìm thấy trong dịch chiết này là 3-O-β-d-xylopyranosyl

Trong đó, (-)-lyoniresinol 3-O-β-d-glucopyranoside có hoạt tính kìm hãm sucrase

là một trong những hướng được quan tâm

2.2.2.5 Các AGIs từ nấm Linh chi

Shin-Duk Kim and Hong Joon Nho (2004) cho biết chất ức chế glucosidase, SKG-3 từ các quả thể nấm Linh chi và các đặc tính hóa lý của nó được đặc trưng Đó là một chất ức chế có thể đảo ngược cao và hiệu quả của α-

4,6 µg / ml, sự ức chế SKG-3 của α-glucosidase là cạnh tranh

Sri Fatmawati et al (2011) đã nghiên cứu chất ức chế α-Glucosidase có

tiềm năng đáng kể như là một loại thuốc bệnh tiểu đường loại 2 vì nó ngăn cản quá trình tiêu hóa carbohydrate Việc tìm kiếm các thành phần giảm α-glucosidase dẫn đến các thành phần hoạt tính của nấm Linh chi thể hiện đã tăng

(521.5µM) Phần trung tính được phân tích bằng sắc ký cột silica gel và p-HPLC lặp đi lặp lại để cung cấp một hợp chất hoạt động, (3β,24E)-lanosta-7,9(11),24-trien-3,26 diol(ganoderolB) Nó được tìm thấy có sự ức chế α-glucosidase cao,

Theo Jin T et al (2017) đã nghiên cứu ba meroterpenoids mới, ganoleucin

AC, cùng với năm meroterpenoids được chiết xuất từ các quả thể của nấm

15

linh chi Cấu trúc của các hợp chất mới được phân tích quang phổ Tác dụng ức chế α-glucosidase đã được thử nghiệm in vitro Các hợp chất kìm hãm α-glucosidase từ cả nấm men và niêm mạc ruột non của chuột Ganomycin I, chất

ức chế mạnh nhất chống lại α -glucosidase đã được tổng hợp và đánh giá về khả năng sinh học in vivo của nó Kết quả dược lý cho thấy ganomycin I có tác dụng hạ đường huyết mạnh và hiệu quả, hạ đường huyết và tác dụng nhạy cảm với insulin ở chuột KK-A y

Theo Kai W et al (2017), các nhóm chất farnesyl hydroquinones ganomycin J,

ganomycin B, ganomycin I và triterpene-farnesyl hydroquinone liên hợp ganoleuconin M và ganoleuconin O trong nấm Linh chi có khả năng kìm hãm α-glucosidase tốt với IC50 trong khoảng 7,8 đến 21,5 μM Công trình này cung cấp bằng chứng hóa học và sinh học cho việc sử dụng chiết xuất nấm Linh chi làm thuốc thảo dược và thực phẩm bổ sung cho kiểm soát các triệu chứng tăng đường huyết

và mỡ máu cao

2.2.3 Cơ sở khoa học sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ

Định nghĩa bệnh đái tháo đường (ĐTĐ): Bệnh ĐTĐ hay còn gọi là bệnh tiểu

đường, là một bệnh do rối loạn chuyển hóa carbohydrate khi hoocmon insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động vào cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu cao hơn 7 mmol/l ĐTĐ liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid, lipid, protid và điện giải Những rối loạn này thường dẫn tới hôn mê và tử vong trong thời gian ngắn nếu không được điều trị kịp thời Tăng đường huyết kéo dài sẽ gây ra rất nhiều biến chứng nguy hiểm ở nhiều phủ tạng đặc biệt là mắt, bệnh tim, mạch vành, tai biến mạch máu não, suy thận, thần kinh, biến chứng gây mù lòa và rất nhiều biến chứng cấp tính khác

đe dọa đến tính mạng người bệnh Riêng biến chứng tim mạch ở những người mắc bệnh tiểu đường tăng gấp 2 - 3 lần so với những người bình thường Theo ước tính, tuổi thọ trung bình của bệnh nhân tiểu đường giảm khoảng 5 - 10 năm so với người không bị tiểu đường (Bạch Mai, 2007)

Phân loại và phương pháp điều trị: Theo Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization – WHO) bệnh ĐTĐ phân thành hai nhóm sau (Tomoyuki

O., 1999; WHO, 2006):

Bệnh ĐTĐ typ 1 hay còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin (nồng độ insulin giảm thấp hoặc mất hoàn toàn): Những người mắc bệnh ĐTĐ loại 1, họ sẽ phải tiêm insulin thường xuyên trong cả cuộc đời vì cơ thể họ không có khả năng tạo ra hormon này

Bệnh ĐTĐ typ 2 hay còn gọi là ĐTĐ không lệ thuộc insulin: Phụ thuộc vào tình trạng của bệnh nhân, phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường hoạt động Chỉ bệnh nhân ĐTĐ loại 2 mới dùng thuốc uống kết hợp với những chất đặc hiệu nhằm làm giảm lượng đường huyết Bệnh nhân có thể dùng riêng thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháp tiêm insulin

Phương pháp kìm hãm α-glucosidase trong điều trị ĐTĐ loại 2 được ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin cũng như kích thích sự sản sinh insulin … như các phương pháp khác

Cho đến nay, ĐTĐ vẫn là bệnh chưa thể chữa khỏi hoàn toàn Thuốc chữa bệnh ĐTĐ được chia thành nhóm: Biguanides, Sulphonylurea, Glinidines, Thiazolidinediones, chất kìm hãm dipeptidyl peptidase IV và AGIs

Các nghiên cứu trên thế giới đã làm sáng tỏ cơ sở khoa học về sử dụng AGIs để điều trị bệnh ĐTĐ như: Tinh bột hoặc đường (sucrose), còn được gọi là carbohydrate Cấu tạo carbohydrate gồm hai hay nhiều monosaccharide (glucose hoặc fructose) Để cơ thể hấp thụ được, carbohydrate sẽ phân cắt hoàn toàn thành các monosaccharide nhờ hệ thống enzyme tiêu hóa Dưới tác dụng của amylase, tinh bột phân cắt thành maltose Maltose và sucrose là các disaccharide, dưới tác dụng của α-glucosidase các disaccharide sẽ phân cắt thành các monosaccharide ở ruột non AGIs có thể kìm hãm hoạt tính α-glucosidase nên ngăn cản sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide làm cho quá trình tổng hợp insullin diễn ra dễ dàng hơn (Nilubon, 2007)

Hình 2.4 Mô phỏng tiêu hóa carbohydrate (tinh bột và đường sucrose)

trong cơ thể ( CBC Co., Ltd (2008))

glycemic và cản trở sự có mặt glucose trong máu (Kato et al., 1991)

2.3 ỨNG DỤNG SÓNG SIÊU ÂM TRONG CHIẾT XUẤT

Định nghĩa sóng siêu âm: Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan

truyền dao động của các phần tử trong không gian có tần số lớn hơn giới hạn trên

ngưỡng nghe của con người, tức là trên 16 kHz (Jayasooriya et al., 2004)

Phân loại sóng âm: Dựa vào tần số, sóng siêu âm được chia làm 3 loại,

Siêu âm tần số thấp (siêu âm năng lượng cao) (20 – 100 kHz): Khi đó có sự hình thành và vỡ ra của các bong bóng khí có kích thước lớn sẽ làm cho nhiệt độ và áp suất tăng cao Do đó có khả năng làm thay đổi tính chất hóa lý của nguyên liệu Ngày nay siêu âm tần số thấp được ứng dụng, vô hoạt enzyme, tăng hiệu quả quá

trình chiết xuất cũng như tăng tốc độ các phản ứng hóa học (Knorr et al., 2004; McClements, 1995; Roberts, 1993; Zheng et al., 2006) Siêu âm tần số cao (siêu

âm năng lượng thấp) (100kHz-2MHz): Khi tần số cao, kích thước các bong bóng khí khá nhỏ nên quá trình sủi bọt diễn ra nhẹ nhàng, không làm thay đổi tính chất hóa lý của nguyên liệu nên thường dùng trong phân tích, xác định tính chất hóa

lý, thành phần cấu trúc và trạng thái vật lý của thực phẩm (Fellows, 2000;

Jayasooriya et al., 2004; Knorr et al., 2004; McClements, 1995) Siêu âm chẩn

đoán (5-10MHz): Không có hiện tượng sủi bong bóng và là dòng âm thanh để đo

hệ số tốc độ và hấp thụ của sóng trong môi trường, dùng trong y học, phân tích

hóa học Phạm vi ứng dụng sóng siêu âm là bảo quản thực phẩm, vô hoạt vi sinh

vật (Sala et al., 1995; Mañas et al., 2000; Pagán et al., 1999), khuấy trộn, đồng hóa và nhũ hóa (Mason et al., 1996), phá bọt, quá trình lọc (Kobayashi et al., 2003), quá trình sấy, chiết xuất và kết tinh (Chendke et al., 1975)

Nguyên lý tác động của sóng siêu âm:

Cơ chế xâm thực khí của sóng siêu âm: Khi sóng siêu âm truyền vào môi

trường chất lỏng, các chu trình kéo và nén liên tiếp được tạo thành Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở rất gần nhau nhờ liên kết hóa học Khi

có sóng siêu âm, trong chu trình nén các phân tử ở gần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa Áp lực âm trong chu trình kéo đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành những bọt khí nhỏ Trong quá trình dao động, bọt khí ổn định có thể thành bọt khí tạm thời Sóng siêu âm rung động những bọt khí này, tạo nên “sốc sóng” Bọt khí ổn định có thể lôi kéo những bọt khí khác vào trong trường sóng, kết hợp lại với nhau và tạo thành dòng nhiệt nhỏ (Kuldiloke, 2002) Các bọt khí tạm thời có kích cỡ thay đổi rất nhanh, chỉ qua vài chu trình chúng bị vỡ ra, hình thành những điểm có nhiệt độ và áp suất rất cao

(5000K và 50000kPa) đạt được trong bong bóng nổ (Sala et al., 1995) Hiện tượng

xâm thực khí mở đầu cho rất nhiều phản ứng do có sự hình thành các ion tự do trong dung dịch; thúc đẩy phản ứng hóa học nhờ có sự trộn lẫn các chất phản ứng với nhau; hỗ trợ chiết xuất các chất tan như enzyme từ tế bào động vật, thực vật,

Hình 2.5 Quá trình hình thành, phát triển và vỡ tung của bọt khí

19

Ứng dụng của sóng siêu âm trong công nghệ thực phẩm: Đối với các thiết

bị siêu âm giống nhau thông qua điều chỉnh cường độ siêu âm hay thời gian siêu

âm cũng sẽ ảnh hưởng lớn đến quá trình xử lí nếu sự thay đổi này được là đáng

kể Nhiệt độ càng cao gây ra các chuyển động nhiệt hỗn loạn cùng với tác động gây rung động của sóng siêu âm càng làm hạt dễ dàng bị phá vỡ hơn

Xử lý siêu âm sẽ làm tăng tốc độ và sản lượng việc lên men, như đẩy

mạnh quá trình sản xuất ethanol từ sinh khối (Chaplin et al., 1990) Ngày nay các

thiết bị siêu âm công suất lớn ứng dụng chiết xuất trong sản xuất các chế phẩm

sinh học (Balachndran et al., 2006; Bisio et al., 1985; Daren et al., 2010) Ấn Độ

đã ứng dụng rộng công nghệ siêu âm để chiết xuất các hợp chất tự nhiên như actemisin, chè xanh, thực vật cho thấy chiết xuất nghệ tây với tỷ lệ chất rắn : dung môi Ethylen dichlorid là 1:5, phương pháp chiết xuất thông thường ở

hiệu suất thu hồi dầu đạt 85-90%, khi đó chiết xuất bằng siêu âm ở nhiệt độ phòng sau 3 lần chiết xuất x 30 phút với thời gian 1 giờ 30 phút cho hiệu suất thu hồi dầu đạt 90 – 95% Chiết xuất thanh hao, phương pháp chiết xuất thông

thường với tỷ lệ chất rắn: dung môi n- hexan là 1:6, sau 9 lần chiết xuất x 5 giờ

với tổng thời gian chiết 45 giờ cho hiệu suất thu hồi dầu đạt 85-90%, khi đó

chiết bằng siêu âm với tỷ lệ chất rắn: dung môi n- hexan là 1:8, sau 4 lần chiết

xuất x 30 phút với thời gian 2 giờ cho hiệu suất thu hồi dầu đạt 90 - 95%

(Balachndran et al., 2006) Chiết xuất chè xanh ở nhiệt độ phòng có tỷ lệ chất

rắn: dung môi ethyl acetat là 1 : 5, chiết thông thường sau 4 lần chiết xuất x 2 giờ với tổng thời gian chiết 45 giờ cho hiệu suất thu hồi dầu đạt 65-70%, khi đó chiết bằng siêu âm sau 3 lần chiết xuất x 30 phút với 1 giờ 30 phút cho hiệu

suất thu hồi dầu đạt 85 - 90% (Sulman et al., 2000)

Chai Junhong et al (2010), chiết xuất polysaccharides từ nấm Đầu khỉ

bằng công nghệ sóng siêu âm, tiến hành 2 lần trong thời gian 45 phút, nhiệt độ 60°C, tỷ lệ nguyên liệu / dung môi lỏng = 1/15, so với chiết xuất truyền thống bằng nước ấm cho thấy chiết xuất sóng siêu âm giảm tới 4/5 thời gian và lượng

polysaccharides tăng thêm 40% (Chai et al., 2010) XiaoPing Chen et al (2010)

chiết xuất polysaccharides từ nấm Linh chi bằng sóng siêu âm trong nước ở nhiệt

42% đến 75% (Chen et al., 2010) Nghiên cứu khác của Sheng-Quan et al

(2010), xử lý nguyên liệu bằng sóng siêu âm, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là

1/11,6 cho hiệu suất chiết tăng 115,56% so với chiết bằng nước nóng (Huang et al., 2010) Ding-long et al chiết xuất polysaccharide từ Linh chi bằng siêu âm ở

phương pháp chiết xuất thẩm thấu là 5,44% trong 180 phút, trộn thông thường là 7,35%, cho thấy chiết xuất bằng siêu âm có lợi thế tiết kiệm thời gian, năng

lượng, hiệu quả chiết xuất cao (Yang et al., 2012) Nghiên cứu của Wenbo Zhang

et al (2011) và nghiên cứu của NIAN Bao-yi et al cũng cho thấy chiết xuất

Lentinan hỗ trợ bằng sóng siêu âm giúp giảm được chi phí trong sản xuất, nhiệt

độ và rút ngắn thời gian chiết xuất… (Zhang et al., 2011) Bin-jie and

Zhao-zhong sử dụng phương pháp siêu âm trong chiết xuất polysaccaride từ nấm bờm

xuất, cho hiệu suất chiết xuất trên 40% (so với tổng số polysaccharide), thời gian chiết ngắn hơn phương pháp chiết bằng nước nóng truyền thống là 4-5 lần Nguyễn Đức Tiến và cs (2018) nghiên cứu về một số ảnh hưởng dung môi, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết xuất sử dụng sóng siêu âm đến

khả năng chiết xuất AGIs từ đỗ đen (Vigna cylindrica Skeels) lên men của Aspergillus oryzae T6 Kết quả cho thấy quá trình chiết xuất AGIs từ đỗ đen lên men của Aspergillus oryzae T6 đạt hiệu quả tốt nhất khi sử dụng dung môi

ethanol 50% với tỷ lệ trọng lượng nguyên liệu /thể tích dung môi là 1/6 (w/v) ở

chiết xuất AGIs tăng cao hơn 1,26 lần so với chiết xuất không sử dụng sóng siêu

âm trong 120 phút, cho thấy tiềm năng ứng dụng sóng siêu âm trong chiết xuất

hoạt chất AGIs từ đỗ đen lên men của A.oryzae T6 hữu hiệu hơn phương pháp

chiết xuất thông thường không sử dụng sóng siêu âm là rút ngắn thời gian chiết

và thu nhận hoạt chất AGIs cao Nguyễn Đức Tiến và Phạm Anh Tuấn (2016) nghiên cứu chiết xuất fucoidan từ rong mơ, đã nghiên cứu sự kết hợp giữa chiết xuất fucoidan từ rong mơ bằng dung môi và sóng siêu âm tần số 20 kHz được sử dụng để tối ưu các thông số đã cho thấy chiết xuất bằng nước khử ion, cường độ

chiết xuất thu được hàm lượng fucoidan cao (tăng cao hơn 3,77 lần so với chiết xuất không siêu âm trong 60 phút) Cho thấy tiềm năng ứng dụng sóng siêu âm trong chiết xuất fucoidan từ rong mơ cho sản xuất các sản phẩm bảo vệ sức khoẻ (kháng đông tụ máu, kháng ung thư, kháng viêm, kháng virút, chống oxi hóa…

21

với tiềm năng ứng dụng lớn trong các lĩnh vực mỹ phẩm, thực phẩm chức năng

và dược phẩm) mang lại hiệu quả hơn so với phương pháp chiết xuất thông thường không sử dụng sóng siêu âm: rút ngắn thời gian chiết xuất, hàm lượng

fucoidan thu được cao hơn Nguyễn Đức Tiến và Phạm Anh Tuấn (2018) nghiên cứu trích ly β-D-Glucan từ nấm H erinaceus cho chế biến thực phẩm bảo vệ sức

khoẻ (cho chữa bệnh về dạ dày, loét tá tràng, hỗ trợ chữa ung thư dạ dày, ung thư thực quản, ung thư đại trực tràng, giúp chống mệt mỏi, chống quá trình oxy hóa, chống lão hóa và tăng cường miễn dịch…), đã sử dụng sóng siêu âm cho trích ly

β-D-Glucan từ nấm H erinaceus, đã nghiên cứu sự kết hợp giữa trích ly bằng

dung môi là nước nóng với sử dụng sóng siêu âm tần số 20kHz được sử dụng để tối ưu các thông số đã cho thấy trích ly bằng nước khử ion, cường độ siêu âm 8

thu hàm lượng β-D-Glucan cao (tăng cao hơn 1,58 lần so với trích ly không siêu

âm trong 180 phút) Cho thấy tiềm năng ứng dụng sóng siêu âm trong trích ly

β-D-Glucan từ Hericium erinaceus mang lại hiệu quả hơn so với phương pháp trích

ly thông thường không sử dụng sóng siêu âm: rút ngắn thời gian trích ly, hàm lượng β-D-Glucan thu được cao hơn Nguyễn Đức Tiến và cs (2018) xác định

được điều kiện thích hợp cho trích ly fucoxanthin từ S mcclurei là trích ly bằng

ethanol 80%, tỷ lệ dung môi: nguyên liệu là 5 (w: w), ở cường độ siêu âm

ly fucoxanthin và hoạt tính chống ô xy hóa của dịch trích ly đạt hiệu quả cao, khả năng trích ly fucoxanthin cao hơn 53% so với trích ly không siêu âm trong 1 giờ

Có thể thấy tiềm năng ứng dụng sóng siêu âm trong trích ly fucoxanthin từ S mcclurei hữu hiệu hơn phương pháp trích ly thông thường không sử dụng sóng

siêu âm về chất lượng và thời gian Chế phẩm fucoxanthin tạo ra được ứng dụng cho bào chế viên thực phẩm bảo vệ sức khỏe “fucoGlucan100” giúp hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày, tá tràng và đại tràng Cho thấy tiềm năng sử sóng siêu âm khai thác fucoxanthin từ rong mơ ở Việt Nam để sử dụng trong dược phẩm, thực phẩm để ngăn ngừa và điều trị các bệnh mãn tính, fucoxanthin giúp hỗ trợ chống béo phì, giảm mỡ vùng bụng, tác động hiệu ứng chống viêm và chống oxy hóa trong cơ thể, chống bệnh đái tháo đường, ngăn ngừa bệnh đau dạ dày, ung thư ruột kết, ung thư tá tràng, bệnh bạch cầu, gan và tuyến tiền liệt, làm đẹp da, giữ

ẩm cho da, trị mụn trứng cá Nguyễn Đức Tiến và cs (2015) xác định được một

số thông số thích hợp cho quá trình chiết tách Diterpenoid và β-glucan từ nấm

Hericium erinaceus là chiết Diterpenoid bằng EtOH 80%; tỷ lệ DM/NL là 6/1;

Chiết xuất β-glucan bằng nước cất, tỷ lệ DM/NL là 5/1, cường độ sóng siêu

Diterpenoid thu được cho sản lượng đạt 8,28% so với nguyên liệu: chứa 14,65% Diterpenoid, độ ẩm 21,26% Chế phẩm β-glucan đạt sản lượng 13,24% so với nguyên liệu: chứa 71,13% β-glucan, độ ẩm 16,61% Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng sóng siêu âm cho chiết xuất trong triển khai

sản xuất chế phẩm Diterpenoid và β-glucan từ nấm Hericium erinaceus ở Việt

Nam ứng dụng trong thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, dược phẩm giúp duy trì tăng trưởng tế bào thần kinh, chống khối u, chống HIV, tăng cường miễn dịch, tác dụng hạ đường huyết và khả năng kháng khuẩn

Phân tích kết quả trên cho thấy chiết xuất bằng siêu âm có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp thông thường không sử dụng nhiệt, số lần chiết ít hơn nên tiết kiệm được dung môi, tỷ lệ thu hồi cao hơn Cơ chế của sóng siêu âm giúp làm tăng khả năng chiết xuất của các qui trình chiết xuất truyền thống, là dựa trên tạo một áp lực lớn xuyên qua dung môi và tác động đến tế bào vật liệu, tăng khả năng truyền khối tới bề mặt phân cách, phá vỡ thành tế bào trên bề mặt

và bên trong của vật liệu, thoát chất tan được dễ dàng

2.4 NGHIÊN CỨU, THỬ NGHIỆM VÀ ỨNG DỤNG AGIs TRÊN THẾ GIỚI

Các thành phần của nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hạ

đường huyết ở động vật với (liều 100 mg/kg) Theo Seto et al (2002) khi uống

dịch nước Linh chi chiết xuất bằng nước nóng (0,03 mg/1 cá thể chuột) trong 4 tuần đã thấy được mức độ giảm glucose trong máu ở những con chuột béo phì và đái tháo đường Trong một nghiên cứu khác những con chuột bị tiểu đường được điều trị bằng nấm Linh chi trong 30 ngày Sau khi điều trị, phát hiện nồng độ insulin huyết thanh tăng (so với nhóm bệnh tiểu đường nontreated) và mức độ glucose giảm một cách phụ thuộc vào liều lượng uống dịch chiết xuất nấm Linh chi Tuy nhiên, các nghiên cứu này được thực hiện chủ yếu ở động vật

Wenli Hou et al (2008) đã nghiên cứu hoạt tính chống đái tháo đường tiềm tàng của chiết xuất ethyl acetate của lá Lagerstroemia speciosa (LSL) đã

được nghiên cứu bằng xét nghiệm ức chế α ‐amylase và α‐glucosidase Sáu triterpen pentacyclic (axit oleanolic, axit arjunolic, axit asiatic, axit maslinic, axit

chế α ‐glucosidase của chiết xuất EtOAc Động lực của ức chế axit corosolic cũng đã được thảo luận Kết quả từ nghiên cứu này có thể cung cấp bằng chứng khoa học cho LSL trong điều trị bệnh tiểu đường trong y học cổ truyền

Ma et al (2015) đã nghiên cứu nấm Linh chi là một loại nấm được sử

dụng rộng rãi như một loại thuốc bổ để tăng cường tuổi thọ và sức khỏe Chiết xuất của nấm Linh chi đã được công nhận là một điều trị bổ trợ thay thế cho bệnh tiểu đường Trong số nhiều thành phần có hoạt tính sinh học của nấm Linh chi là polysacarit, proteoglycan, protein và triterpenoids đã được chứng minh là có tác dụng hạ đường huyết Nấm Linh chi đã được báo cáo là có hoạt động hạ đường huyết bằng cách tăng nồng độ insulin huyết tương và giảm lượng đường trong huyết tương ở chuột Protein tyrosine phosphatase 1B là một mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn trong điều trị bệnh tiểu đường và proteoglycan trong nấm Linh chi

có thể ức chế enzyme này trong ống nghiệm Hơn nữa, triterpenoids trong nấm Linh chi đã được chứng minh là có hoạt tính ức chế aldose reductase và α-glucosidase có thể ức chế tăng đường huyết sau ăn Ngoài ra, một loại protein Ling Zi-8 được chiết xuất từ nấm Linh chi làm giảm đáng kể sự xâm nhập tế bào lympho và tăng khả năng phát hiện kháng thể của insulin ở chuột mắc bệnh tiểu đường Tổng quan này tóm tắt hầu hết các nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của polysaccaride, proteoglycan, protein và tritrerpenoids từ nấm Linh chi như một hướng dẫn cho nghiên cứu trong tương lai

Theo Fang Wang et al (2015), đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của bào tử

nấm Linh chi đối với sự chuyển hóa đường và lipit ở chuột mắc tiểu đường loại 2 Nghiên cứu này có thể chỉ ra rằng bột bào tử nấm Linh chi có thể mang lại hiệu quả có lợi về việc giảm mức đường huyết bằng cách thúc đẩy tổng hợp glycogen và ức chế quá trình tạo glucone Trong khi đó, điều trị bằng bột bào tử nấm Linh chi cũng liên quan đến việc cải thiện các thành phần lipid máu thông qua việc điều hòa cân bằng nội môi cholesterol ở chuột mắc bệnh tiểu đường loại 2

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu thu nhận sản phẩm chứa AGIs ứng dụng cho sản xuất sản phẩm chức năng từ nguồn thực phẩm mà chủ yếu là nấm Linh chi với hoạt chất khác nhau

2.5 NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG AGIs Ở VIỆT NAM

Ở Việt Nam có khoảng 4,5 triệu người mắc bệnh ĐTĐ, dự tính đến năm

2025 có khoảng 7 triệu người mắc bệnh ĐTĐ trong đó bệnh ĐTĐ type 2 chiếm trên 90% Những năm gần đây, trên thị trường, TPCN cho người mắc bệnh ĐTĐ

có giá trị từ vài trăm nghìn đến vài triệu như: viên giáp xác Tianshi, táo xoắn Tianshi, oyster Plus, tinh dầu hoa anh thảo Hiện nay để chữa bệnh ĐTĐ người

ta thường dùng các nhóm thuốc sulphonylurea và biguanidses Ngoài ra các thuốc có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cũng được sử dụng nhiều, nhưng các thuốc này chủ yếu được chỉ định cho những người đã mắc bệnh Hiện nay, ở nước ta chưa có nhiều công trình nghiên cứu nghiên cứu sâu về thu nhận AGIs từ nấm Linh chi để chế biến thực phẩm, thuốc cho người ĐTĐ mà mới chỉ tập trung vào tạo sản phẩm dinh dưỡng hay tạo sản phẩm chức năng chứa hàm lượng cao nattokinase hay chứa peptide chuyển hóa angiotensin Trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu và sản xuất TPCN cho người bệnh ĐTĐ như Nguyễn Đức Tiến (2015) đã đưa ra công nghệ sản xuất hoạt chất AGIs từ đỗ

đen lên men bằng Aspergillus oryzae ứng dụng cho người thừa cân và người bệnh ĐTĐ; Đặng Hồng Ánh và cs (2007) đã nghiên cứu công nghệ sản xuất bột

lá dâu tằm giàu DNJ và ứng dụng trong một số sản phẩm TPCN cho người bệnh

ĐTĐ; Quản Lê Hà và cs (2011) nghiên cứu cho thấy đỗ đen lên men có hoạt tính

kìm hãm lớn hơn so với đỗ tương; hoạt tính kìm hãm đối với α-glucosidase từ động vật: Đỗ đen : 77%, đỗ tương: 49.5% Hoạt tính kìm hãm với các loại α-

glucosidase từ vi sinh vật: Đỗ đen: 65 % với α-glucosidase từ bacillus lichenifomis, 62% α-glucosidase từ Aspergillus niger, 45% với α-glucosidase A oryzae Đỗ tương: 31% với α-glucosidase từ Bacillus lichenifomis, 22.4% α- glucosidase từ Aspergillus niger, 28% với α-glucosidase A oryzae

Hiện trong nước chưa có công trình công bố nghiên cứu AGIs từ nấm Linh chi và thu nhận AGIs này cho chế biến sản phẩm chức năng Đây là một hướng nghiên cứu cần thiết để sản xuất AGIs này làm nguyên liệu chế biến thực phẩm cho người ĐTĐ, thừa cân và béo phì

Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nước ở lĩnh vực chọn nấm Linh chi phù hợp cho hoạt tính kìm hãm α-glucosidase, đến quá trình chiết xuất, thu

Chính vì vậy, việc nghiên cứu chọn nấm Linh chi nguyên liệu có hoạt tính kìm hãm α-glucosidasecao và nghiên cứu các điều kiện chiết xuất AGIs, các điều thu nhận tạo chế phẩm AGIs và hướng ứng dụng AGIs này cần được thực hiện