Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào...9 1.5.1.. Đồ thị thể hiện sự sinh trưởng của tb tại pha log ở pH=7...26 KHẢO SÁT ẢNH H
Trang 1MỤC LỤC
1 TỔNG QUAN 5
1.1 Mục tiêu bài thí nghiệm 5
1.2 Tổng quan về nấm men 5
1.3 Tổng quan về giống Saccharomyces Cerevisiae 6
1.3.1 Đặc tính sinh học 7
1.3.2 Hình thức sinh sản 7
1.4 Sinh trưởng và phát triển của nấm men 8
1.4.1 Giai đoạn tiềm phát (lag phase) 8
1.4.2 Giai đoạn tăng trưởng cấp luỹ thừa (log phase) 9
1.4.3 Giai đoạn ổn định 9
1.4.4 Giai đoạn suy vong 9
1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào 9
1.5.1 Môi trường nuôi cấy 9
1.5.2 Nhiệt độ 10
1.5.3 pH của môi trường 10
1.5.4 Tốc độ sục khí và khuấy trộn 10
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 11
2.1 Vật liệu 11
2.2 Phương pháp 11
2.2.1 Chuẩn bị môi trường 11
2.2.2 Chuẩn bị giống vi sinh vật 11
2.2.3 Khảo sát động học sinh trưởng của nấm men trong nuôi cấy mẻ 12
2.2.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm men, tỉ lệ tế bào nấm men sống, tỉ lệ tế bào nảy chồi 12
2.2.5 Tính toán các thông số động học sinh trưởng của nấm men 15
3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 16
3.1 Tổng số tế bào nấm men 16
Trang 23.2 Tỷ lệ tế bào nảy chồi và chết 17
3.3 Quá trình sinh trưởng của tế bào và nồng độ đường theo thời gian 21
4 KẾT LUẬN 29
5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
DANH MỤC BẢNG Bảng 1: So sánh tỷ lệ tế bào nảy chồi ở 4 khoảng pH (4,5,6,7) 21
Bảng 2: Các thông số so sánh 27
Trang 3DANH MỤC HÌN
Hình 1 Một số loài nấm men 5
Trang 4Hình 2 Nấm men Saccharomyces Cerevisae 6
Hình 3 Tế bào nấm men S cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng phương pháp tạo chồi 7
Hình 4 Đồ thị thể hiện sự sinh trưởng và phát triển của nấm men qua các giai đoạn 7
Hình 5 Cấu tạo buồng đếm hồng cầu 13
Hình 6: Đồ thị thể hiện tổng số tế bào nấm men theo thời gian 15
Hình 7 Đồ thị thể hiện tỉ lệ tế bào nảy chồi và chết theo thời gian ở pH=4 16
Hình 8 Đồ thị thể hiện tỉ lệ tế bào nảy chồi và chết theo thời gian ở pH=5 17
Hình 9 Đồ thị thể hiện tỉ lệ tế bào nảy chồi và chết theo thời gian ở pH=6 19
Hình 10 Đồ thị thể hiện tỉ lệ tế bào nảy chồi và chết theo thời gian ở pH=7 20
Hình 11 Đồ thị tốc độ sinh trưởng của tb và nồng độ đường theo thời gian ở pH=4 21
Hình 12 Đồ thị sự sinh trưởng của tb tại pha log ở pH=4 22
Hình 13 Đồ thị tốc độ sinh trưởng của tb và nồng độ đường theo thời gian ở pH=5 23
Hình 14 Đồ thị thể hiện sự sinh trưởng của TB biểu diễn tại pha log ở pH=5 23
Hình 15 Đồ thị tốc độ sinh trưởng của tb và nồng độ đường theo thời gian ở pH=6 24
Hình 16 Đồ thị thể hiện sự sinh trưởng của tb tại pha log ở pH=6 25
Hình 17 Đồ thị tốc độ sinh trưởng của tb và nồng độ đường theo thời gian ở pH=7 26
Hình 18 Đồ thị thể hiện sự sinh trưởng của tb tại pha log ở pH=7 26
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH MÔI TRƯỜNG LÊN ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN TRONG QUÁ TRÌNH
NUÔI CẤY MẺ
1 TỔNG QUAN
Trang 51.1 Mục tiêu bài thí nghiệm
Nắm vững kiến thức về động học sinh trưởng
Nhận xét được ảnh hưởng của pH lên động học sinh trưởng của nấm men
Hoàn thiện các thao tác và các kĩ năng quan sát dưới kính hiển vi
để sản xuất rượu trắng, rượu vang, bia, làm bột nở bánh mì, tạo sinh khối giàu protein vàvitamin, sản xuất enzyme, sản xuất acid acitric từ tự nhiên, sản xuất riboflavin (vitamin
Trong đó, loài Saccharomyces Cerevisiae hiện được sử dụng như một công cụ đắc
lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vục cho sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của kỹ
thuật di truyền Để nấm men Saccharomyces Cerevisiae có thể phát triển tốt, cho năng
suất cao, người ta phải kiểm soát và điều chỉnh các yếu tố có ảnh hưởng quan trọng đến
sự sinh trưởng của nấm men như: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, tỷ lệ giống…Để có thểhiểu rõ hơn tầm quan trọng của một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởngcủa nấm men là pH nên trong bài thực hành này nhóm chúng em được tìm hiểu về đề tài :
“Ảnh hưởng của pH môi trường lên động học sinh trưởng của nấm men trong quá trìnhnuôi cấy mẻ”
Trang 6Hình 1 Một số loài nấm men: A – Lactobacillus-johnsonii; B – Candida; C –
Lactobacillus Acidophilus; D – Sacccharomyces cerevisiea 1.3 Tổng quan về giống Saccharomyces Cerevisiae
bánh mì nên thường được gọi là men bánh mì, là một loại vi sinh vật thuộc chi
nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay Nó được dùng rộng rãitrong quá trình lên men làm bánh mì, rượu, bia.[3]
S.cerevisiae có hình dáng tế bào là hình cầu, hình ovan hay elip Thường có 1 – 4
bào tử trong nang, ít khi có 8 bào tử.[3]
Saccharomyces cerevisiae là một trong những loài sinh vật nhân chuẩn được khoa
học dùng nhiều nhất, cùng với E.coli là hai loài sinh vật mô hình phổ biến nhất
Trang 7Hình 2 Nấm men Saccharomyces Cerevisae
1.3.1 Đặc tính sinh học
Các nghiên cứu di truyền học được tiến hành ở Saccharomyces cerevisiae đã từ
hơn 70 năm nay Đối tượng này kết hợp trong nó hai tính chất tuyệt vời:
tính chủ yếu điển hình của Eukaryote và có ty thể với bộ gen DNA nhỏ, giống với
vi khuẩn nên nó có thể nuôi trong môi trường dịch thể hay đặc và tạo khuẩn lạctrên môi trường thạch
nấm men quy mô lớn trong các nồi lên men và dễ dàng thu nhận sinh khối tế bào
1.3.2 Hình thức sinh sản
Sinh sản vô tính theo kiểu nảy chồi: ở điều kiện thuận lợi nấm men
Saccharomyces cerevisiae sinh sôi nảy nở nhanh Khi một chồi xuất hiện, các enzyme
thủy phân xuất hiện làm phân giải phần polysaccharide của thành tế bào làm cho chồichui ra khỏi tế bào mẹ Vật chất mới được tổng hợp sẽ huy động đến chồi làm chồi phình
Trang 8to lên, xuất hiện vách ngăn giữa chồi và tế bào mẹ Chồi tách ra khỏi tế bào mẹ và hìnhthành tế bào mới.[4]
Hình 3 Tế bào nấm men S cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng phương pháp
tạo chồi
1.4 Sinh trưởng và phát triển của nấm men
Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men diễn biến qua 4 giai đoạn
Hình 4 Đồ thị thể hiện sự sinh trưởng và phát triển của nấm men qua các giai đoạn
1.4.1 Giai đoạn tiềm phát (lag phase)
Là giai đoạn từ lúc cấy nấm men vào môi trường đến lúc chúng bắt đầu sinh sản
Ở giai đoạn này, chúng còn phải thích nghi với điều kiện môi trường mới
Trong giai đoạn này, tế bào nấm men trải qua những biến đổi lớn về hình thái vàsinh lý, kích thước tăng lên đáng kể và chúng trở nên nhạy cảm với những tác động bênngoài Số lượng tế bào nấm men ở giai đoạn này là không tăng hoặc tăng không đáng kể
Trang 91.4.2 Giai đoạn tăng trưởng cấp luỹ thừa (log phase)
Số lượng và sinh khối tế bào trong giai đoạn tăng theo cấp số nhân Khả năngthích ứng với những điều kiện không thuận lợi của môi trường ngoài tăng lên rõ rệt, đồngthời xuất hiện chức năng lên men rượu
Giai đoạn này thuận tiện để xác định năng lượng sinh sản, thời gian nảy chồi,nhưng không nên đánh giá kích thước của tế bào cũng như những dấu hiệu khác củakhuẩn lạc Do trong thời kỳ đầu của giai đoạn này, tốc độ sinh sản của tế bào thườngnhanh hơn tốc độ tạo thành tế bào chất nên kích thước của tế bào có phần nhỏ đi
1.4.3 Giai đoạn ổn định
Số lượng tế bào trong giai đoạn này không tăng nữa, có thể là do sự cân bằng giữa
số sinh ra và chết đi Song kích thước tế bào tăng lên rõ rệt Quá trình lên men rượu cũngbắt đầu
1.4.4 Giai đoạn suy vong
Số lượng tế bào giảm xuống do có hiện tượng tiêu hủy Lượng protein và acidnucleic giảm xuống, glycogen và treganose hoàn toàn tiêu biến
Như vậy có thể thấy số lượng tế bào nấm men đạt cao nhất ở giai đoạn logarit,song sinh khối tế bào lại đạt cao nhất ở giai đoạn ổn định vì khối lượng tế bào ở giai đoạnnày lớn
1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào
1.5.1 Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn hydratcarbon,nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lượng như K, Na, Mg, Ca và vitamin
Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trường mà nguồn
carbon duy nhất là tinh bột, phát triển tốt hơn trên môi trường đường với nguồn nguyênliệu được nấu chín
Môi trường nước chiết giá đậu cũng được sử dụng để nuối cấy nấm men do trongđậu chứa hàm lượng protein cao, là nguồn thức ăn tốt cho nấm men Ngoài ra, còn có các
Trang 10vitamin A1, B1, B2, C, E, K và các chất kích thích tố tăng trưởng khác Tuy nhiên, vitamin
C trong nước chiết giá đậu có thể làm hạn chế sự phát triển của nấm men
Ngoài ra, nấm men có thể được nuôi cấy trong một số môi trường như: môi trườngcám, môi trường rỉ đường hay dung dịch đường được acid hóa với pH=4, nước bã rượu,môi trường thủy phân từ cellulose thực vật, môi trường dịch kiềm sulfit (thành phần chủyếu là đường pentose)
Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh: còn nhiệt độ thấp khoảng
1.5.3 pH của môi trường
pH tối ưu cho nấm men khoảng 4.5 – 5.6 Ở pH=4, tốc độ tích lũy sinh khối giảm,pH=3 – 3.5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào
tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị ảnh hưởng bởi
pH nên chất lượng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trường nằm ngoài khoảng 4.5 –5.6
1.5.4 Tốc độ sục khí và khuấy trộn
Trong quá trình nuôi cấy, cần giữ cho dịch men liên tục bão hòa oxy hòa tan.Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây tác động âm trên hoạt động sống của tế bàonấm men Oxy không khí di chuyển vào tế bào nấm men qua 2 giai đoạn: đầu tiên oxyđược hòa tan vào môi trường nuôi cấy sau đó nấm men mới hấp thụ oxy vào trong tế bào
chỉ cần 1 phần nhỏ oxy bơm vào là được nấm men sử dụng, phần còn lại bị mất đi do cácquá trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt của môi trường
Trang 112 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu
Chủng vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae
Hóa chất sử dụng trong môi trường nuôi cấy:
2.2.1 Chuẩn bị môi trường
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy như sau:
(g/l)
Peptone(g/l)
tra nồng độ đường tổng trước khi sử dụng
2.2.2 Chuẩn bị giống vi sinh vật
Nấm men (Saccharomyces cerevisiae) dạng đông khô được sử dụng làm chủng
trong 24 giờ trên máy lắc xoay vòng với tốc độ 120rpm Nấm men được kiểm tra các chỉtiêu (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỉ lệ tế bào sống, (c) tỉ lệ tế bào nảy chồi và (d) đường tổng
Môi trường chuẩn bị giống:
Trang 12Saccharose(g/l)
Peptone(g/l)
Dịch chiếtgiá*
(ml)
pH
*Dịch chiết giá: 100g giá đậu xanh (đã rửa sạch), thêm 1000ml nước cất Đun sôi
30 phút Thu phần dịch trong Bổ sung nước cho đủ 1000ml
2.2.3 Khảo sát động học sinh trưởng của nấm men trong nuôi cấy mẻ
Sau quá trình nhân giống, nấm men (10ml) được bổ sung vào 190 ml môi trườngM2b đã được tiệt trùng bình nuôi cấy Quá trình nuôi cấy mẻ được tiến hành ở nhiệt độphòng (30oC), lắc 120rpm (hoặc nuôi cấy tĩnh) Trong suốt quá trình nuôi cấy, bắt đầu từgiờ thứ 0, mỗi 1 giờ các chỉ tiêu (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỉ lệ tế bào sống và (c) tỉ lệ tếbào nảy chồi và (d) nồng độ đường khử và đường tổng số sẽ được kiểm tra
Các thông số động học sinh trưởng của nấm men sẽ được tính toán để rút ra kếtluận
2.2.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào nấm men, tỉ lệ tế bào nấm men
sống, tỉ lệ tế bào nảy chồi
Có thể sử dụng buồng đếm để định lượng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn nhưnấm men, bào tử nấm mốc với độ phóng đại x100 đến x400 Với tế bào vi khuẩn, dokích thước nhỏ, nên phải sử dụng buồng đếm Petroff-Hasser Phương pháp đếm trực tiếpcòn giúp quan sát được hình thái tế bào Kết quả đếm được là tổng số tế bào có trongmẫu, không phân biệt được tế bào còn sống hay đã chết (chỉ phân biệt được tế bào nấmmen sống/chết khi tiến hành nhuộm với dung dịch methylen blue)
2.2.4.1 Cấu tạo buồng đếm hồng cầu
Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phẩn lõm
gồm 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông gồm có 16 ô vuông nhỏ Vì thế, diện tích của một hình
Trang 13Hình 5 Cấu tạo buồng đếm hồng cầu 2.2.4.2 Cách tiến hành
methylen blue (pha trong D.W) trong 30 giây
đếm (nơi tiếp giáp với lamelle) Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ
Trang 14chế mao dẫn Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không giannằm giữa buồng đếm và lamelle được trám đầy bởi huyền phù nấm men, còncác rãnh xung quanh thì không bị dính ướt.
vật kính x10 và x40 để quan sát Điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa trập
để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ Thông thường ta chọnmột ô trung tâm và bốn ô nằm ở bốn góc hoặc năm ô theo đường chéo (các ôđánh dấu x) Có thể sử dụng máy ảnh kỹ thuật số để chụp hình buồng đếm ởvật kình x10 để sau này sử dụng đếm số lượng tế bào nấm men
vào buồng đếm, phải đếm các tế bào nằm trên hai đường kẻ kể nhau đượcchọn của từng ô
Số tế bào nấm men (N) trên 1.0 ml mẫu:
N=(a /b ×400 /0.1)×103×10 n
Trong đó:
N: số tế bào trên 1.0 ml mẫu cho vào buồng đếm
a: số tế bào trên 5 ô vuông lớn
b: số ô vuông nhỏ trên 5 ô vuông lớn (16x5=80)
400: tổng số ô vuông nhỏ trong 25 ô vuông lớn
0.1: thể tích (mm2) mẫu chứa trên ô trung tâm
103: số chuyển mm2 thành ml (103 mm2 = 1ml)
10n: độ pha loãng mẫu
2.2.5 Tính toán các thông số động học sinh trưởng của nấm men
n = t/t d
N t = N o /2n = N o 2t/t d
Trang 15td: thời gian số tế bào nhân đôi (thời gian thế hệ)
Nt: số tế bào ở thời điểm t
No: số tế bào ở thời điểm ban đầu Nt: số tế bào ở thời điểm tµ: hẳng số tốc độ sinh trưởng (ở đây được xem là tốc độ gia tăng sốlượng tế bào trên một đơn vị số lượng tế bào)
St: nồng độ cơ chất (carbohydrate) ở thời điểm t
So: nồng độ cơ chất (carbohydrate) ở thời điểm 0 giờ Các số liệu đo đạc và các thông số động học sinh trưởng sẽ được biểu diễn bằngcác bảng và đồ thị bao gồm: (1) bảng số liệu của quá trình lên men, (2) đồ thị diễn tảđườn cong sinh trưởng của nấm men, (3) xác định thời gian thế hệ ở log phase, (4) hằng
số tốc độ sinh trưởng ở log phase và (5) YN/S tại cuối log phase
Các kết quả sẽ được mô tả, so sánh, giải thích và biện luận để làm sáng tỏ ảnhhưởng của điều kiện thí nghiệm đến kết quả đo đạc và tính toán thu nhận được
3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Trang 163.1 Tổng số tế bào nấm men
Hình 6: Đồ thị thể hiện tổng số tế bào nấm men theo thời gian
Từ biểu đồ trên cho thấy tổng số tế bào lớn nhất khi pH = 5 và thấp nhất khi pH=7.Khi bắt đầu nuôi cấy nấm men trong môi trường mới (tại t = 0 (h)), tổng số tế bào trongkhoảng xấp xỉ 1500 – 1700 tế bào Mức này được ổn định trong khoảng 1h sau đó tế bàobắt đầu sinh trưởng mạnh nhất tại pH= 5, tại pH= 4 và 6 tổng số tế bào tương đương vớinhau và kém nhất là pH= 7
- pH = 5, tổng số tế bào cực đại khoảng 5610 tế bào tại giờ thứ 4,6,7
- pH = 6, tổng số tế bào cực đại khoảng 3800 tế bào tại giờ thứ 3,6
- pH = 4, tổng số tế bào cực đại khoảng 3700 tế bào tại giờ thứ 4
- pH = 7, tổng số tế bào cực đại khoảng 3000 tế bào tại giờ thứ 3,7
Theo nghiên cứu của Audrey Serra và công sự đã kết luận rằng pH không có ảnh
hưởng đáng kể đến tăng trưởng S.cerevisiae và trong tất cả các thí nghiệm của ông pH
Trang 17Đồ thị thể hiện tỉ lệ tế bào nảy chồi và chết
theo thời gian ở pH=4
%tb nảy chồi
%tb chết
Hình 7 Đồ thị thể hiện tỉ lệ tế bào nảy chồi và chết theo thời gian ở pH=4
Trong 1 giờ đầu tiên, % tế bào nảy chồi có tăng nhưng không nhiều (từ 1.3% tănglên 2.4%) trong khi % tế bào chết trong giai đoạn này tăng cao (từ 12.5% tăng lên30.7%) Giai đoạn này đang ở pha lag, do nấm men mới được chuyển vào môi trườngmới, chưa thích nghi kịp nên nhiều tế bào nấm men bị chết, một số ít tế bào bắt đầu thíchnghi và nảy chồi
Trong 2 giờ tiếp theo, giai đoạn này đang ở pha log Tế bào đã dần thích nghi vớimôi trường mới do đó tỷ lệ tế bào nảy chồi tăng lên, tỷ lệ tế bào chết giảm xuống, tronggiờ thứ 2, tỷ lệ tế bào chết có tăng nhưng không nhiều (tăng 6.3%) nguyên nhân có thể domột số tế bào không thích nghi hoặc sai số trong quá trình lấy mẫu và quá trình đếm
Trong 2 giờ kế tiếp, tế bào vẫn đang ở pha log, tỷ lệ tế bào chết giảm mạnh (giảm14.5%) do tế bào nấm men đang sinh trưởng, tốc độ tăng trưởng cao nên tế bào chết giảmmạnh, tỷ lệ tế bào nảy chồi trong 2 giờ này hầu như không có sự thay đổi lớn có thể do tếbào nảy chồi tăng trưởng nhanh đã tách thành 2 tế bào độc lập
Trong 1 giờ kế tiếp, tỷ lệ tế bào nảy chồi và tế bào chết có giảm nhưng ít, đang ởgiai đoạn ổn định