THÍ NGHIỆM HÓA SINH

THÍ NGHIỆM HÓA SINHBÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINHXÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTHXÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ LIPASEKHẢO SÁT HOẠT ĐỘ INVERTASEKHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME UREASE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA VÀ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HÓA SINH THỰC

PHẨM

Giảng viên hướng dẫn : T.s Trịnh Khánh Sơn

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1:

XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH

1 Mục đích bài thí nghiệm

- Biết được các thao tác làm bài thí nghiệm,

- Trình bày được nguyên tắc, trình tự tiến hành, tính toán kết quả và đánh giásai số cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm

2 Nguyên tắc

Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân tinhbột đến dextrin Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàntoàn 1 mg tinh bột đến dextrin sau 30 phút ở 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa

B1: Chuẩn bị dịch chiết amylase: Mẫu enzyme được pha loãng 200 lần

B2: Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase

Lưu ý:

Khi cho hồ tinh bột vào ống nghiệm, phải thực hiện đồng đều, liên tục theo

số giây, để thời gian phản ứng xảy ra trong mỗi ống nghiệm là như nhau, để có kếtquả chính xác nhất

Lấy ống nghiệm còn lại (số11) cho vào 3 ml nước cất, 2 giọt thuốc thử Iodinetrong KI, so sánh màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzymethấp nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột thành dextrin

5 Tính kết quả và nhận xét

a) Mẫu trong 300C

Lần 1 Lần 2

- Một đơn vị Gohlgemuth (W) ứng với 300C

Trong đó : F- Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủyphân hoàn toàn tinh bột ( ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)Dựa vào kết quả thí nghiệm ta chọn F = 64 và F = 32

Vậy số đơn vị Wohlgemuth có trong dịch chiết enzyme pha loãng 200 lần là

Nw = 48000 22627.42

b) Mẫu trong 370C

Chạy excel Nw= 80 0 tính trong 1ml dịch trích enzyme

Vậy số đơn vị Wohlgemuth có trong dịch chiết enzyme pha loãng 200 lần là :

Nw = 16000 0

KẾT QUẢ

Ở 300C thì Nw = 48000 22627.42

Ở 370C thì Nw= 16000 0

 Nguyên nhân gây sai số :

+Pipet, ống nghiệm, dụng cụ thí nghiệm bị nhiễm

+Cho lượng iodine trong KI không đều vào các ống nghiệm

+Sai số nhiệt độ trong bể điều nhiệt

+Thao tác thí nghiệm chưa chuẩn xác

+ Enzyme rất nhạy với nhiệt độ, có thể bị giảm hay mất hoạt tính khi không bảoquản cản thận trong quá trình thí nghiệm

+ Thời gian thực hành không chính xác, kết thúc phản ứng không đúng lúc

Nồng độ enzyme càng lớn thì lượng tinh bột bị thuỷ phân càng nhiều Nhưng khivượt quá nồng độ tới hạn vận tốc phản ứng sẽ chậm lại.

Quá trình thủy phân tinh bột đến dextrin, thêm NaCl vào nhằm giúp tăng hoạt độcủa enzym giúp quá trình thủy phân đạt hiệu quả cao

Ngoài ra trong quá trình thủy phân 30 phút, có thêm H2SO4 10% vào để ứcchế hoạt động của enzym để quá trình thủy phân dừng lại

Nồng độ enzyme giảm dần từ ống 1 đến ống 10 do đó, phản ứng thủy phântinh bột cũng giảm dần Tinh bột không bị thủy phân hoàn toàn, một phần còn sót lại

sẽ phản ứng với iodine tạo ra dung dịch có màu xanh của iodine, màu càng đậm khinồng độ enzyme càng thấp, hoạt độ enzyme càng yếu Màu xanh thể hiện rõ nhất ởống nghiệm 10 – khi mà nồng độ enzyme rất thấp, có thể không còn enzyme để cóthể thủy phân tinh bột

Dựa vào màu sắc của từng ống nghiệm sau quá trình thủy phân tinh bột đếndextrin với sự xúc tác của enzym amylase thì ta thấy:

Ở nhiệt độ 37oC, ống nghiệm số 1,2,3,4 gần như mất màu hoàn toàn chỉ còn lạimàu của Iodine =>quá trình thủy phân gần như hoàn toàn

Ở nhiệt độ phòng, ống nghiệm số 1,2,3,4,5,6 gần như mất màu hoàn toàn chỉcòn lại màu của Iodine => quá trình thủy phân gần như hoàn toàn

Vậy một trong những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân là nhiệt độ

2 Dụng cụ - hóa chất

 Dụng cụ: Cối chày sứ, Erlen 10ml, Pipet 1ml, 10ml, Ống đong, Burret, Cốc100ml, 250ml, Tủ ấm

 Hóa chất và cách pha hóa chất:

- Đệm acetat pH=4.7 (trộn CH3COOH 1N và CH3COONa 1N theo tỉ lệ 1:1)

Gọi a là số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm

b là số ml NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng

 a -b là số ml NaOH để chuẩn độ lượng acid tự do sinh ra do lipase trích ly

 Vậy công thức tính hoạt độ của lipase (X):

X = (a-b)x10xk/m

Với k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N

- Thêm toluene vào có tác dụng làm diệt khuẩn

Lưu ý

- Khi pha đệm acetate phải chính xác, đúng tỉ lệ, pH= 4.7 vì khi pha thấp hơntrở thành sút, cao hơn thì thành acid

- NaOH 0.1N phải pha chính xác nồng độ, sau đó dùng H2SO4.1N để xác định

hệ số k Phải sử dụng ống chuẩn đậy lại để không bị hút ẩm

- Khi thêm dầu đậu nành, đệm acetate, toluene vào bình erlen chứa đậu nànhnghiền nhỏ xong thì lấy giấy nilon bịt lại để tránh bị hư

7 Bàn luận mở rộng

- Các yếu tố ảnh hưởng sai số:

o Pha hóa chất không chính xác nồng độ, không đúng tỷ lệ

o Khi chuẩn độ, màu của dịch enzyme đục nên khó quan sát lúc chuyểnmàu, không nhìn thấy rõ nên dẫn đến hao hụt số ml NaOH chuẩn độ

BÀI BÁO CÁO SỐ 3: KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ INVERTASE

1 Nguyên tắc

Invertase là một enzyme thủy phân saccharose thành glucose và fructose Dựa vào tính chất iodine trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để xác định glucose sinh ra bằng cách định phân iodine dư với dung dịch Na2S2O3

Dịch enzyme đã bị đun cách thủy (ml) 0 0 10

- Saccharose bị enzyme đăc hiệu thủy phân thành glucose

- Đun cách thủy để vô hoạt enzyme dừng phản ứng thủy phân để xác định

- Đúng hoạt độ của enzyme invertase

 Qui trình xác định glucose và các phản ứng hóa học diễn ra:

 Cho vào erlen 10ml iodine 0.1N và 15ml NaOH 0.1N

Lúc này ta có phản ứng xảy ra trong dd như sau:

(1) I2 + 2NaOH NaIO + NaI + H2O

(2) C5H11O5CHO + NaIO + NaOH => C5H11O5COONa + NaI + H2O

Dãy ống

nghiệm

ở nhiệt độ phòng để

30 phút

Đun cách thủy 10phút

Hút 5ml hỗnhợp dịch cho vào erlen 250ml

Xác địnhglucose

(3) I2 + 3NaOH+ RCHO => RCOONa + 2NaI + 2H2O

Và sodium hypoiodite cũng nhanh chóng và dễ dàng phản ứng và tạo ra sodium iodate :

(4) 3NaIO => NaIO3 + 2 NaI

Kết hợp (1) với (4) ta được:

(5) 3I2 + 6 NaOH => NaIO3 + 5 NaI+ 3 H2O

- Khi NaIO dư tức I2 dư thì phản ứng (5) sẽ diễn ra

- Phản ứng số (3) có sự tham gia của glucose nên cần nhỏ NaOH từ từ để lượng glucose phản ứng hết, vì ngay khi NaOH dư thì phản ứng (4) có cơ hội xảy

ra làm lượng glucose cần chuẩn độ không có NaIO và NaOH để phản ứng Cùng với đó, khi phản ứng số (4) xảy ra trước sẽ gây ra sai số vì phản ứng (7) xảy ra tạo

ra I2

 Sau khi để yên bình trong bóng tối 20 phút cho thêm 2ml H2SO4 1N thì:(6) NaIO + NaI + H2SO4=>I2 + Na2SO4 + H2O

(7) NaIO3 + 5 Nal + 3H2SO4 => 3I2 + 3Na2SO4 + 3H2O

- Lượng NaIO dư và NaIO3 do phản ứng (5) tạo ra sẽ tác dụng với acid tạo

ra lại I2

Định phân lượng iodine vừa được tạo ra tương đương với lượng iodine thừa bằng Na2S2O3 0.05N với chỉ thị hồ tinh bột 1%

(8) I2 + 2Na2S2O3 => 2 NaI + Na2S4O3

- Khi bỏ chỉ thị hồ tinh bột vào erlen thì do có iodine nên tạo phức màu, khi chuẩn

độ phản ứng (8) xảy ra, khi I2 được chuẩn độ hết hỗn hợp mất màu phức ta dừng chuẩn độ Nghi số liệu và tính kết quả

Mẫu trước khi định phân:

Mẫu sau khi định phân:

- Công thức:

(V1-V2)*A*B/(1000*20*2*a*b*t*m)Trong đó:

- V1: số ml cần để định phân dung dịch ở ống nghiệm 1

- V2: số ml cần để định phân dung dịch ở ống nghiệm 2

- B: tổng thể tích trích ly enzyme có được từ m (g)

- a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose

- b: thể tích trích ly enzyme vào mỗi ống nghiệm

- t: thời gian thủy phân

Hoạt độ invertase: (18.9- 9.05)*20*100/(1000*20*2*5*10*1)=9.85x10-3 (mol/g.phút)

- Đối với ống nghiệm số 3 ta vẫn áp dụng công thức vì có thể khi enzyme invertase bị bất hoạt glucose vẫn được ra trong điều kiện làm thí nghiệm:

a=(13.5- 9.05)*20*100/(1000*20*2*5*10*1)=4.45x10-3 (mol/g.phút)

 Và a có thể xem là sai số của thí nghiệm

5 Nhận xét và nguyên nhân sai số.

• Do máy móc và dụng cụ đo thiếu chính xác, thiếu tinh vi

• Do người đo với trình độ tay nghề chưa cao, khả năng các giác quan bị hạn chế

• Do điều kiện ngoại cảnh bên ngoài tác động tới, như thời tiết thay đổi, mưa gió, nóng lạnh bất thường

• Lấy mẫu không chính xác

• Thời gian để enzyme phân hủy của từng ống thí nghiệm không giống nhau

• Pha hóa chất không đúng nồng độ ảnh hưởng đến kết quả

 Cách khắc phục:

• Thao tác tiến hành thí nhiệm phải chính xác, nhỏ từng giọt chất chuẩn để xác định đúng điểm dừng thí nghiệm

• Thực hiện thí nghiệm nhiều lần để xác định kết quả chính xác nhất

• Phải canh đúng thời gian thủy phân của từng ống nghiệm

 Ưu điểm: thí nghiệm đơn giản, ít sai số, điểm nhận biết rõ ràng khi 1 giọt dư Na2S2O3 làm dung dịch chuyển từ màu nâu sang trắng

 Nhược điểm: thao tác và phương pháp cách chuẩn độ ảnh hưởng lớn đến kết quả, phải canh đúng thời gian thủy phân của từng ống nghiệm

6 Bàn luận

Nhiệt độ và tốc độ pha loãng có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình thủy phânsaccharose trong thiết bị phản ứng liên tục Khi tăng nhiệt độ từ 35 lên 55oC, hoạttính của enzyme trong những giờ thủy phân đầu tiên sẽ tăng; tuy nhiên, hoạt tínhcủa enzyme sẽ giảm nhanh trong những giờ thủy phân tiếp theo Còn khi tăng tốc độpha loãng thì năng suất hoạt động của phản ứng sẽ tăng, tuy nhiên hiệu suất thủyphân sẽ giảm

BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 4: KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ

ENZYME UREASE

1 Nguyên tắc

Urease là một enzyme thủy phân đặc hiệu urea theo phản ứng:

NH2 -CO-NH2 + H2O → NH3 + CO2

Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene

tetramine và giải phóng acid carbonic

2(NH4)2CO3 + 6HCHO → (CH2)6N4 + 2H2CO3 + 6H2O

2 Cách pha hóa chất

- Formol trung tính: cho 10ml dung dịch 10% formol vào erlen, bổ sung 2ml 0.5% phenolphtalein Nhỏ từng giọt NaOH 0.2N vào erlen cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt của phenolphtalein Ghi nhận lượng NaOH 0.2N đã sử dụng ( Vml ).Căn cứ tỉ lệ dung dịch formol 10% và NaOH 0.2N đã sử dụng, tiến hành điều chế 100ml formol 10% trung hòa ( không sử dụng phenolphtalein)

- Phenolphtalein 1%: 0.1g phenolphtalein được pha với 50ml ethanol và 50ml nước cất

3 Tiến hành

3.1 Điếu chế dung dịch urease

- Xay nhiễu đậu nành nguyên hạt thành bột để phá vỡ tế bào giải phóng

enzyme

- Lọc và thu dịch lọc để trách sự ngăn cản của enzyme với cơ chất, lấy dịch enzyme với thể tích chính xác và để quá trình chuẩn độ được thuận lợi

- Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene

tetramine và giải phóng acid carbonic sau đó chuẩn độ lượng acid sinh ra bằng NaOH

DD Urease đã đun cách thủy (ml) 0 0 5

Thực hiện dãy ống nghiệm sau:

- Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene

tetramine và giải phóng acid carbonic sau đó chuẩn độ lượng acid sinh ra bằng NaOH

- Ống 1 là mẫu thử không có cơ chất

- Ống 3 là mẫu có cơ chất và dịch enzyme đã được đun cách thủy để vô hoạt

enzyme Để xác định lượng urea đã bị thủy phân khi không có hoạt động của

[S]=số mol ure ban đầu 0

Đồ thị biểu diễn phương trình động học của Michaelis-Menten tại 30°C

Đồ thị biểu diễn phương trình động học của Michaelis-Menten tại 40°C

 Tính toán kết quả tại 40°C:

Ta có phương trình y= (113,56.x + 274,26).103 Có đồ thị cắt trục 1/V tại 1/Vmax và trục 1/S tại -1/Km

 Tính toán kết quả tại 30°C:

Ta có phương trình y= (100,36x + 586,13).103 Có đồ thị cắt trục 1/V tại 1/Vmax và trục 1/S tại -1/Km

Vậy tại nhiệt độ 30oC vận tốc thủy phân của enzyme bé hơn ở nhiệt độ 40o

 Giải thích công thức và cách lập đồ thị biểu diễn phương trình động học của Michealis- Menten:

- Trên cùng một hệ trục tọa độ vẽ 2 đường cong biễu diễn đường cơ chất bị thủy phân theo nồng độ cơ chất ban đầu ở 2 nhiệt độ ( Y1 và Y2 theo [S])

- Vẽ đường thẳng biễu diễn sự biến thiên của 1/v theo 1/[S] ở 2 nhiệt độ thủy phân

Trong đó: v= d(S)/dt = Y/20 (v là vận tốc phản ứng thủy phân)

Đây là đồ thị biễu diễn phương trình động học của Michaelis-Menten:

Khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chỉ một cơ chất

Gọi: v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES

v-1 là vận tốc của phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E và S

[ES] =

Nếu đặt Km= k-1+k2/ k1(Km: gọi là hằng số Michalis Menten)

Ta có: [ES] = [E0][S]/ Km+[S]

Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là: V = k2 [ES]

Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được: v = (4)

Qua đây ta thấy nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme cànglớn Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất Vmax= k2[E0] Thay vào phương trình (4) ta được: v = Vmax (5)

Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis Menten Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chấtcàng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn

Sự biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất

Khi tăng [S] thì v phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì v đạt đếngiá trị Vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S]

Khi Km = [S] thì v0 =1/2 Vmax

Năm 1934 Lineweaver và Burk, trên cơ sở của phương trình (5) đã nghịch đảo

Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk

Trong đó:

V1, V2: số ml NaOH 0.05N dùng định phân dung dịch trong ống nghiệm 1 và 2a: thể tích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm

A: tổng thể tích enzyme có được từ m(g) bột đậu nành

t: thời gian thủy phân (phút)

m: khối lượng mẫu cân

Ý nghĩa của việc nghiên cứu động học enzyme

Việc nghiên cứu động học enzyme có những ý nghĩa quan trọng về :

- Biết được cơ chế phân tử về sự tác động của enzyme

- Cho phép ta hiểu biết được mối quan hệ về mặt lượng của quá trình enzyme

- Thấy được vai trò quan trọng cả về mặt lý thuyết lẫn thực hành: khi lựa chọncác đơn vị hoạt động enzyme người ta cần phải biết những điều kiện tốt nhất đối vớihoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đến hoạtđộng của chúng

- Là điều kiện cần thiết để thực hiện tốt các bước tinh chế enzyme

Ngoài các tác nhân như nồng độ cơ chất, chất hoạt hóa, pH môi trường,… thìnhiệt độ cũng là một trong những tác nhân ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme

Vì thế thực nghiệm khảo sát động học enzyme là một rất hữu ích bổ trợ chokiến thức chuyên môn

6 Những nguyên nhân và phương pháp hạn chế sai số :

• Nguyên nhân :

Thao tác thí nghiệm :

- Canh thời gian không chuẩn xác

- Chuẩn độ không chính xác

- Thao tác khi thêm hóa chất cho thừa hoặcthiếu

• Hướng khắc phục : tỉ mĩ trong thao tác tí nghiệm, lặp đi lặp lại nhiềulần