BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

 Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm in vitro để phân biệt với các quá trình nuôi cấy tro

1 Giới thiệu 2

2 Tổng quan tài liệu 2

2.1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 2

2.1.1 Nhân giống in vitro 2

2.1.2 Nuôi cấy mô sẹo 13

2.2 Đối tượng thực vật nghiên cứu 15

2.2.1 Hoa cát tường 15

2.2.2 Cây đậu xanh 18

3 Vật liệu và phương pháp 19

3.1 Vật liệu 19

3.2 Phương pháp tiến hành 19

3.2.1 Pha môi trường nuôi cấy 19

3.2.2 Kỹ thuật nhân giống in vitro hoa cát tường bằng phường pháp cấy cụm chồi/cắt đốt thân 26 3.2.3 Kỹ thuật gieo hạt đậu xanh in vitro 28

3.2.4 Kỹ thuật tạo mô sẹo từ cây mầm đậu xanh 29

3.2.5 Kỹ thuật giải phẫu và nhuộm màu, quan sát dưới kính hiển vi 31

4 Kết quả 32

4.1 Nhân giống in vitro hoa cát tường 32

4.2 Gieo hạt đậu xanh in vitro 35

4.3 Tạo mô sẹo từ cây mầm đậu xanh 39

4.4 Giải phẫu và nhuộm màu, quan sát dưới kính hiển vi 40

5 Thảo luận 43

5.1 Lý giải kết quả thí nghiệm 43

5.2 Tại sao lại tạo sẹo? 44

5.3 Tại sao tạo cụm chồi? 44

5.4 Lưu ý 45

6 Kết luận 47

7 Tài liệu tham khảo 48

1 Giới thiệu

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật quý hiếm

Trong những năm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và đem lại hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng Những thành tựu trên đã góp phần to lớn vào việc thúc đẩy sự phát triển nền nông nghiệp công nghệ cao manh tính cạnh tranh trong thị trường quốc tế

2 Tổng quan tài liệu

2.1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào

2.1.1 Nhân giống in vitro

 Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Bao gồm:

 Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành

 Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh

 Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành

 Nuôi cấy mô sẹo (callus)

 Nuôi cấy tế bào đơn

 Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi đã tách

vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần

 Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm (in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm

(in vivo) Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm Đây là hướng đang được ứng dụng rộng rãi Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp

 Cơ sở khoa học:

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống

vô tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân hoá

 Tính toàn năng của tế bào:

Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một

cơ thể hoàn chỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào Qua đó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản phân hoá

 Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào:

- Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã trải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt

- Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá thành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào

Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân…thì giai đoạn tạo mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân… trước đó Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên hoá được biểu diễn theo sơ đồ sau:

→

←

Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và một số gen khác bị ức chế Điều này được xảy ra theo một chương trình

đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen để hình thành một các thể mới Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

 Các ứng dụng:

Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh

tế to lớn thực sự Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro

là việc sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn Mô nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có

hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền

- Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt

- Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa các loại cây trồng khác

- Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus

- Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trong điều kiện tự nhiên, hoặc các cây dễ bị giao phấn

Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền, cúc…), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà phê…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa sợi…) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất

 Các bước trong nhân giống in vitro:

 Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro

 Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu

Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá

- Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975)

Khoai tây: mầm (Morel, 1952) Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976) Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)

Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978) Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh Thường dùng các chất: HgCl 0.1%

xử lý trong 5-10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br…

- Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:

Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962)

Chất hữu cơ: đường sarcaroza Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3)

 Bước 3: nhân nhanh

Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính

Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoá chồi (Weiss và Jaffe, 1969) Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối…

 Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn

nhưng chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ Vì vậy, cần chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh

 Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá,

số rễ, chiều cao cây…)

- Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi…

- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng thích hợp

 Ưu/nhược điểm:

 Ưu điểm:

- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng cây giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm Trong khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20cm

- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài

- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch virus

- Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo ý muốn

- Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một

thời gian ngắn Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36

-1012/năm, như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn

- Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh của thời vụ

- Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong thời gian dài ở điều kiện in vitro

độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh

- Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao

- Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống

 Tính bất định về mặt di truyền

 Sự nhiễm mẫu

 Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy

 Hiện tượng thuỷ tinh hoá

 Phương pháp tạo cụm chồi

- Tạo cụm chồi từ chồi ban đầu

- Tách cụm chồi + cấy chuyền

- Cảm ứng tạo rễ

- Chuyển cây con ra vườn ươm

- Đặc điểm của quá trình hình thành cụm chồi :

 Cần sự phối hợp auxin (nồng độ thấp) với cytokinin (nồng độ cao)

 Loại bỏ chồi ngọn trong đa số trường hợp

 Tốc độ tăng sinh

 Ý nghĩa thực tế

- Phương pháp đơn giản

- Tốc độ nhân giống cao

- Sản phẩm ổn định về mặt di truyền

- Cây con tăng trưởng tốt

 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình

- Kiểu di truyền

- Tuổi sinh lý

- Trạng thái tăng trưởng

- Môi trường nuôi cấy

- Hàm lượng Cytokinin (loại và nồng độ)

- Nhu cầu về nồng độ Cytokinin thay đổi theo từng giai đoạn nuôi cấy, những mô cấy còn non thì cần ít Cytokinin hơn các mẫu đã trưởng thành

- Thông thường trong quá trình tạo chồi, người ta sử dụng Auxin với nồng

độ thấp phối hợp cùng Cytokinin ở nồng độ cao, tỷ lệ Auxin/Cytokinin thường 1/10

- Đôi khi nên để chồi ngọn phát triền trước khi tang nồng độ Cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi bên

- Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắt bỏ ngọn của chồi để các chồi bên phát triển

- Không nên cảm ứng sự tạo thành mô sẹo với nồng độ Cytokinin quá cao

vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến

- Trong một số trường hợp có thể kích thích sự tạo thành chồi bên bằng cách cấy vào môi trường lỏng Môi trường lỏng này cần lắc hay không lắc tùy thuộc vào cây được làm thí nghiệm

- Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh trưởng sinh khối bị thay đổi

Trong phương pháp tạo cụm chồi, chồi ngọn và các chồi bên từ các nách lá cấy vào môi trường có chứa Cytokinin với nồng độ cáo Vai trò của Cytokinin lúc này là ức chế quá trình ưu thế ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển Các chồi bên này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới có bổ sung Cytokinin để tiếp tục tạo ra các chồi khác Sau đó các chồi này được chuyển sang môi trường

ra rễ và đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh

Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng cho nhiều loài thực vật, quy trình nhân chồi thường xuyên được thực hiện theo các bước:

Cây tự nhiên  Khử trùng mẫu  Nhân cụm chồi  Tạo cây in vitro hoàn chỉnh  Trồng cây trong bầu  Trồng cây ngoài tự nhiên

2.1.2 Nuôi cấy mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học…Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô và các cơ quan phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (có vết thương, xử lý các chất điều hoà sinh trưởng thực vật…)

 Sự hình thành mô sẹo

 Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên Nhìn chung sự tạo mô sẹo invitro (nhờ auxin tác động) do 3 quá trình:

- Sự phản phân hóa tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan) bao gồm các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi

- Sự phân chia của các tượng tầng: các tế bào tượng tầng của phần lớn STD dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin thấm chí không cần auxin ngoại sinh như ở các loài cây cỏ hay dây leo

- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) quá trình này được ưu tiên áp dụng ở ĐTD, vì các cây này tượng tầng thiếu và nhu mô khó phản phân hoá so với STD Màu sắc của mô sẹo không giống nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau

và chúng thường có màu vàng, trắng, nâu hay trắng xanh…

 Một số vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo:

- Sự biến tính tế bào do độ già của mẫu

- Sự thay đổi tế bào chất của nhân

- Thời gian duy trì

- Điều kiện nuôi cấy

- Thành phần môi trường, nhất là chất sinh trưởng

 Sự hình thành chồi từ mô sẹo

 Được điều khiển bằng:

- Các chất sinh trưởng đi vào môi trường

- Điều kiện nuôi cấy

- Dịch chiết

- Tỷ lệ cytokinin/auxin

 Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo Thường mô sẹo được hình thành trên môi trường giàu auxin; có thể dùng auxin riêng rẽ hay kết hợp với nhau hoặc có thể kết hợp với cytokinin tuỳ từng loại cây

 Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy Với một số cây thì vấn đề này không quan trọng nhưng cũng có một số cây chịu ảnh hưởng rất lớn

 Quá trình hình thành chồi xảy ra qua 2 giai đoạn:

- Tái phân hóa  xảy ra quá trình chuyển các tế bào biệt hóa thành mô sẹo

- Hình thành các mầm mống cơ quan  sử dụng các phương pháp phù hợp  tổng hợp DNA và protein xảy ra rất mạnh, hàm lượng đường cũng tang  các mô sẹo  hình thành cấu trúc hình thái  tạo chồi

 Tính bất định về mặt di truyền của Nuôi cấy mô sẹo

 Biến dị tế bào soma ( biến dị về chất lượng, số lượng và năng suất và biến

dị này không di truyền)

 Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không lặp lại

 Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số lần cấy chuyền

 So sánh vi nhân giống và nuôi cấy mô sẹo:

 Vi nhân giống: tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh  khử trùng  đưa vào nuôi cấy ở môi trường phù hợp  chồi  chồi nhân lên  tách chồi  chuyển sang môi trường mới và quy trình cứ thế được lặp lại

 Cho hệ số nhân giống thấp hơn, nhưng các chồi nhân giữ lại được những đặc điểm của phôi gốc, ít hoặc không bị thay đổi về mặt di truyền

2.2 Đối tượng thực vật nghiên cứu

- Tên khoa học: Eustoma grandiflorum

- Tên khác: Lisianthus, Prairie Gentian, Texas bluebell, Tulip Gentian,

Bluebell, Lire de san pedro

 Đặc điểm sinh trưởng

- Hoa cát tường là loài hoa dại có nguồn gốc từ Bắc mỹ Là loài cây có khả năng chịu rét tương đối trên đồng cỏ và được biết đến với nhiều màu sắc

khác nhau, có loại cánh đơn và cánh kép

- Màu nguyên thủy là màu xanh, dần dần đã có sự xuất hiện đa dạng về

màu sắc như hồng, trắng, trắng pha tím, trắng pha hồng,

- Đây là loài hoa khá thanh lịch không chỉ được bán như các loại hoa cắt

cành mà còn được biết đến dưới dạng hoa chậu nghệ thuật

- Hoa Cát tường phát triển tốt ở điều kiện 70 – 80 Klux (ánh sáng tự nhiên) Do vậy vào mùa xuân hay mùa hè có cường độ ánh sáng cao nên thường phải che lưới cho hoa Hoa cát tường thích hợp với vụ dài ngày,

có số giờ chiếu sáng trong ngày tối ưu là 16 giờ trong ngày thì sẽ cho

chất lượng bông cao nhất

- Nhiệt độ tối thích cho hoa cát tường sinh trưởng và phát triển là từ 18 –

20 độ C vào ban ngày và 15 – 18 độ C vào ban đêm Nhiệt độ vào ban đêm thấp hơn 15 độ C sẽ làm trì trệ quá trình sinh trưởng của cây Vào ban ngày khi nhiệt độ cao hơn 28 độ C sẽ làm cho hoa nở sớm, rút ngắn quá trình sinh trưởng của hoa và cho hoa kém chất lượng Tùy theo từng chủng loại giống mà có yêu cầu về nhiệt độ và quang chu kỳ khác nhau,

do vậy trước khi trồng nên tìm hiểu chủng loại giống mà bố trí mùa vụ

thích hợp

- Độ ẩm khoảng 70% được xem là lý tưởng nhưng sau khi nụ đầu tiên được hình thành thì việc giảm độ ẩm xuống dưới 70% sẽ làm gia tăng

chất lượng của hoa

- Tính cả thời gian từ lúc gieo hạt cho đến khi cây ra hoa là từ 20 –23 tuần

 Các chủng loại hoa Cát tường

 Giống hoa kép

- Nhóm Avilia: nhóm này thích hợp ở điều kiện ánh sáng yếu và nhiệt độ mát Do vậy nhóm giống này thường trồng vào vụ đông Các màu thường là trắng ngà, viền xanh, hồng cánh sen, đỏ tía

- Nhóm Balboa: nhóm này thích hợp nhiệt độ và cường độ ánh sáng cao hơn Phug hợp trồng vụ xuân đến hè Phát triển tốt ở điều kiện quang chu

kỳ ngày dài Các màu thường là xanh, viền xanh, xanh tía

- Nhóm Catalina: thích hợp với điều kiện ngày dài và thời tiết ấm áp Các màu thường là xanh tía và màu vàng

- Nhóm Candy: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và quang chu

kỳ ngày ngắn Nhóm này cho hoa nở đồng loạt và có nhiều màu để chọn lựa

- Nhóm Echo: Nhóm này là nhóm phổ biến trong giống hoa cát tường.Không thích hợp với cường độ ánh sáng quá cao hay thấp, thích hợp cho vụ đông xuân Các màu phổ biến trong giống này là xanh bóng, xanh tía, hồng, hồng tía, trắng tuyền

- Nhóm Mariachi: Nhóm này thích hợp trồng trong chậu Đặc điểm giống này là có số cánh hoa nhiều, cánh hoa mỏng hơn các giống khác nên nhìn rất đẹp Các màu phổ biến trong giống này là trắng, hồng, hồng nhạt, xanh…

 Giống hoa đơn

- Nhóm Flamenco: là nhóm thích hợp với cường độ ánh sáng cao và quang chu kỳ ngày dài Thân hoa dài và mạnh Các màu là xanh bóng, hồng, vàng, trắng

- Nhóm Heidi: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và quang chu

kỳ ngày ngắn Có nhiều màu để chọn lựa

- Nhóm Laguna: là nhóm thích hợp với cường độ ánh sáng cao và quang chu kỳ ngày dài Thân hoa dài khoảng 48 cm, một cây trung bình có 3 thân và 25 nụ hoa Có 02 màu là xanh đậm và xanh tía

- Nhóm Malibu: thích hợp với cường độ ánh sáng trung bình và trong mùa xuân và mùa thu Có nhiều màu là hoa cà, xanh đậm, trắng, hồng, trắng viền xanh

- Nhóm Yodel: Thân hoa dài khoảng 45 – 50cm Có nhiều màu là xanh đậm, xanh, hoa cà, hồng phấn, hồng, trắng

2.2.2 Cây đậu xanh

 Đặc điểm sinh trưởng

- Đậu xanh là cây ăn hạt, thân thảo, phân bố rộng rãi ở các nước Đông và Nam Á, khu vực Đông Dương

- Cây đậu xanh (đỗ xanh) có danh pháp khoa học Vignaradiata, có kích thước hạt nhỏ (đường kính khoảng 2 - 2,5 mm)

- Thời gian sinh trưởng của đậu xanh thay đổi tùy theo giống, mùa vụ và biện pháp canh tác (tưới, phân bón …).Thông thường nếu trồng trong mùa nắng cây sẽ bắt đầu cho thu hoạch từ 56 - 63 ngày và chấm dứt thu hoạch 64 - 72 ngày Trồng vào mùa mưa sẽ hái quả khi đạt 65 - 70 ngày

và chấm dứt vào 68 - 80 ngày

- Thời gian sinh trưởng của đậu xanh có thể được chia làm 5 thời kỳ:

 Thời kỳ mọc mầm

 Thời kỳ cây non

 Thời kỳ tăng trưởng chậm

 Thời kỳ trổ hoa

 Thời kỳ phát triển Thành phần của đậu xanh: ẩm 14g, protein 23g, lipid 2.4g, gluxit 53.1g, xel luloza 2.4g, tro 2.4g, Ca 64mg, P 377mg, Fe 4.8mg, B1 30µg, B2 0.72mg, PP 0.15mg, C 2.4mg, β carotene 4mg

3 Vật liệu và phương pháp

3.1 Vật liệu

- Đậu xanh : công ty Xuân Hồng

- Hoa Cát Tường: PTN CNSH, bộ môn CNSH, đại học Bách Khoa TPHCM

không cân hóa chất cho mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước nhiều loại dung dịch đậm đặc, khi cần sử dụng chỉ việc pha với nước cất theo tỉ lệ là có thể

sử dụng

Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock), dung dịch mẹ được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh Thông thường pha các dung dịch mẹ là: stock đa lượng, stock trung lượng, stock vi lượng, Fe-EDTA, stock vitamin, chất điều hòa sinh trưởng

 Khoáng đa lượng

- Cân và dùng nước cất hoà tan lần lượt từng chất trong bécher cho tan hoàn toàn

- Pha đúng thự tự → dung dịch không tạo tủa

 Pha môi trường:

 Pha môi trường nhân giống hoa cát tường

- Các bước tiến hành:

 Lấy khoảng 180 ml nước cất cho vào cốc 500ml

 Cho lần lượt các dung dịch mẹ đa pha sẵn vào theo đúng thứ tự: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, inositol, trung lượng với lượng như trong bảng → khuấy đều

 Cân đủ saccharose, khuấy đều cho đường tan hết

 Sau đó cho thêm 0.6ml dd BA

 Định mức bằng ống đong 300ml dung dịch

 Chỉnh pH khoảng 5.8 ± 0.01 bằng máy hiệu chỉnh pH Cho thêm một

ít nước cất vào

 Cân agar cho vào dung dịch, vừa đun sôi vừa khuấy đều đến tan hết

 Rót dung dịch vào các chai đã được rửa kỹ bằng xà phòng, mỗi chai khoảng 20ml

 Đánh dấu, ghi tên lên các chai Làm nút bông, bao gói cho từng chai

 Đem hấp khử trùng ở điều kiện 1 atm, 1210

C, trong 15 phút

 Quy trình làm nút bông, bao gói:

 Lấy một lượng bông gòn vừa đủ, dùng miếng gạc nhỏ gói lại thành hình cầu, sao cho gắn vừa khít miệng chai mà không quá rộng (nút sẽ

bị lọt vào trong chai) hay quá chật ( cây khó trao đổi khí), khi dùng tay giật nút bông ra thì ta nghe tiếng “póc” nhỏ là được

 Dùng tờ giấy úp lên chai đã gắn nút bông, gấp nếp 2 đầu tờ giấy và ép sát vào thành chai, sau đó dùng thun cột lại

 Dùng tờ giấy gói petri lại

 Hấp khử trùng toàn bộ các chai môi trường + petri đã bao gói

 Pha môi trường gieo hạt đậu xanh và môi trường tạo mô sẹo từ cây mầm đậu xanh

- Mỗi nhóm (3 người) pha 30 chai Cần pha 600ml môi trường

- Giống như pha môi trường nhân giống hoa cát tường, chỉ khác lượng saccharose và agar và có bổ sung 2,4-D (môi trường tạo mô sẹo)

Thành phần cơ bản môi trường MS (600ml)

Vitamin và amino acid 0.6ml

Điều kiện môi trường

pH môi trường 5,8 ± 0,01 Hấp tiệt trùng 1210C, 1atm, 15p