PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE (MH) VÀ GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM TRÊN HEO

Đề tài “Phân lập, định danh Mycoplasma hyopneumoniae MH và gây bệnh thực nghiệm trên heo” được thực hiện trong vòng 6 tháng từ ngày 1/2/2010 đến ngày 1/8/2010, tiến hành tại xí nghi

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y

************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH MYCOPLASMA

TRÊN HEO

Họ và tên sinh viên : LÊ THỊ TUYẾT TOAN Lớp : DH05TY

Ngành : Thú Y Niên khoá : 2005 - 2010

Tháng 08/2010

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y

************

LÊ THỊ TUYẾT TOAN

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH MYCOPLASMA

TRÊN HEO

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ nghành Bác sĩ thú y

Giáo viên hướng dẫn:

TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH

TS NGUYỄN ĐÌNH QUÁT BSTY LÂM THỊ TÚ ANH

Tháng 08/2010

XÁC NHẬN VỀ VIỆC SỬA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Họ tên sinh viên thực tập: Lê Thị Tuyết Toan

Tên đề tài: “Phân lập, định danh Mycoplasma hyopneumoniae (MH) và gây

bệnh thực nghiệm trên heo”

Đã hoàn thành luận văn theo yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến

nhận xét, đóng góp của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa ngày:

Giáo viên hướng dẫn

LỜI CẢM ƠN

 Xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Ban chủ nhiệm khoa Chăn Nuôi Thú Y Trường Đại Học Nông Lâm

Cùng toàn thể quý thầy cô Trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dạy , truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu của tôi

 Trân trọng biết ơn sâu sắc:

TS Nguyễn Thị Phước Ninh

TS Nguyễn Đình Quát

BSTY Lâm Thị Tú Anh

đã tận tình dạy bảo , hướng dẫn em trong suốt thời gian học và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

 Chân thành cảm ơn:

Ban Giám Đốc Bệnh Viện Thú Y Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Ban Giám Đốc Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi trường Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

Ban quản lý Trạm Thú Y quận Bình Thạnh

Ban Giám đốc xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong

Và tất cả các anh chị đang làm việc, nghiên cứu ở các cơ quan trên đã tạo điều kiện thuân lợi, giúp đỡ tôi rất nhiều khi thực tập

 Kính dâng lòng biết ơn sâu sắc đến ba má , và những người thân trong gia đình đã hết lòng chăm lo, nuôi dưỡng cho con có được ngày hôm nay

 Cuối cùng xin cảm ơn tất cả những người bạn đã luôn luôn chia xẻ , động viên giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm đại học qua Xin chân thành cảm ơn

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài “Phân lập, định danh Mycoplasma hyopneumoniae (MH) và gây bệnh

thực nghiệm trên heo” được thực hiện trong vòng 6 tháng từ ngày 1/2/2010 đến ngày 1/8/2010, tiến hành tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong, Bệnh Viện Thú Y và Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM Nghiên cứu theo dõi biểu hiện gây bệnh của MH trên heo thử nghiệm sau khi đã phân lập và định danh được MH nhằm góp phần làm chính xác hơn trong việc xây dựng phương pháp chẩn đoán MH trong phòng thí nghiêm

Với các phương pháp như: quan sát và đánh giá bệnh tích đại thể trên phổi heo thịt, chọn mẫu bệnh phẩm có bệnh tích đặc trưng để phân lập MH trên môi trường canh và thạch Friis’ và xác định MH bằng kỹ thuật PCR Sau đó thực hiện một số phản ứng sinh hóa đồng thời gây bệnh cho heo từ canh MH đã được phân lập và định danh

Chúng tôi có được kết quả như sau: Tỷ lệ phổi có bệnh tích chung trong đánh giá là 96,71 % (147/152), mức độ tổn thương trung bình trên những phổi có bệnh tích chung là 39,298 % Tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng do MH trên heo thịt giết

mổ là 68,7 % (101/147) Điểm trung bình của các phổi nghi ngờ do MH là 1,9 điểm Mức độ tổn thương trung bình của các phổi nghi ngờ do MH thì thùy tim phổi có mức độ tổn thương lớn nhất, và phổi phải cao hơn phổi trái Việc phân lập MH từ mẫu phổi nghi ngờ trên môi trường thạch Friis’ cho kết quả dương tính 27,27 %, môi trường canh cho kết quả dương tính là 22,73 % Kỹ thuật PCR để xác định MH trên phổi có bệnh tích nghi ngờ cho kết quả dương tính là 13,64 % MH phân lập được có phản ứng sinh hóa gồm lên men glucose, digitonin dương tính, phản ứng thủy phân arginine, urea âm tính Sau 7 tuần gây bệnh thử nghiệm, 3 heo được nhỏ mũi canh MH cho kết quả là 2 heo có bệnh tích đại thể, vi thể nghi ngờ MH và kết quả phân lập, PCR dương tính với MH

MỤC LỤC

TRANG

Trang tựa i

Phiếu xác nhận của giáo viên hướng dẫn ii

Lời cảm tạ iii

Tóm tắt iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt ix

Danh sách các bảng x

Danh sách các hình xi

Danh sách các sơ đồ và biểu đồ xii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 3

2.1 Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm 3

2.1.1 Lịch sử và phân bố địa lý 3

2.1.1.1 Lịch sử bệnh 3

2.1.1.2 Phân bố địa lý 4

2.1.2 Căn bệnh 4

2.1.3 Đặc điểm Mycoplasma 5

2.1.3.1 Đặc điểm sinh học của Mycoplasma 5

2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấy 6

2.1.3.3 Sức đề kháng 7

2.1.3.4 Phân bố tự nhiên 7

2.1.4 Đặc điểm của MH 7

2.1.5 Đặc điểm dịch tễ MH 9

2.1.5.1 Loài vật mắc bệnh 9

2.1.5.2 Chất chứa căn bệnh

9

2.1.5.3 Đường xâm nhập

9

2.1.5.4 Cách lây lan và truyền bệnh

9

2.1.6 Cơ chế sinh bệnh 10

2.1.7 Triệu chứng 11

2.1.8 Bệnh tích 11

2.1.8.1 Bệnh tích đại thể 11

2.1.8.2 Bệnh tích vi thể 12

2.1.9 Chẩn đoán

13 2.1.9.1 Chẩn đoán lâm sàng phân biệt 13

2.1.9.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 13

2.1.10 Điều trị

14 2.1.11 Phòng bệnh

15 2.2 Những phương pháp phát hiện MH

16

2.2.1 Quan sát bệnh tích đại thể

3.1 Thời gian và địa điểm 22

3.2.1 Thời gian 22

3.2.2 Địa điểm 22

3.2 Đối tượng nghiên cứu 22

3.3 Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm 22

3.3.1 Dụng cụ 22

3.3.2 Vật liệu 23

3.4 Nội dung 23

3.5 Phương pháp tiến hành 24

3.5.1 Bố trí lấy mẫu 24

3.5.2 Đánh giá mức độ hư hại của phổi 24

3.5.2.1 Đánh giá bệnh tích hư hại trên phổi không đặc trưng cho MH theo công thức Christensen (1999) 25

3.5.2.2 Đánh giá bệnh tích hư hại nghi ngờ MH 25

3.5.3 Phân lập MH từ mẫu phổi nghi bệnh 26

3.5.3.1 Quy trình phân lập MH 26

3.5.3.2 Thu thập mẫu 26

3.5.3.3 Xử lý mẫu 27

3.5.4 Định danh MH từ mẫu phổi nghi bệnh 27

3.5.4.1 Phản ứng PCR 27

3.5.4.2 Phản ứng sinh hóa 30

3.5.5 Gây bệnh thực nghiệm trên heo 32

3.5.5.1 Đếm đơn vị đổi màu CCU (Colour Changing Unit) 32

3.5.5.2 Gây bệnh thực nghiệm trên heo 33

3.6 Công thức tính 33

3.7 Xử lý số liệu 34

Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 35

4.1 Kết quả đánh giá bệnh tích đại thể trên phổi 35

4.1.1 Đánh giá bệnh tích chung trên phổi 35

4.1.1.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích 35

4.1.1.2 Đánh giá mức độ hư hại trên phổi có bệnh tích 36

4.1.1.3 Các bệnh tích thường gặp trên phổi khảo sát 37

4.1.2 Đánh giá bệnh tích đại thể trên phổi có tính định hướng do MH 39

4.1.2.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH 39

4.1.2.2 Đánh giá bệnh tích trên phổi nghi ngờ do MH 40

4.2 Kết quả phân lập MH trên môi trường canh và thạch Friis’ 43

4.3 Kết quả xác định MH bằng kỹ thuật PCR từ mẫu phổi 46

4.4 Kết quả phản ứng sinh hóa 48

4.5 Kết quả nuôi heo thử nghiệm 49

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Đề nghị 56

Tài liệu tham khảo 57

Phụ lục 60

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APP : Actinobacillus pleuropneumoniae

BHI : Brain Heart Infusion broth

CCU : colour changing unit

DNA : deoxyribonucleic acid

dNTP : deoxyribonucleic triphosphate

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid

IHA : Indirect hemagglutination

kb, kDa : kilobase pair, kilo dalton

PRRSV : Porcine reproductive and respriratory syndrome virus

PBS : phosphate buffered saline

PCR : Polymerase Chain Reaction

PPLO : Pleuro – Pneumoniae – Like – Organism

SPF : Specific Pathogen Free

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Bố trí lấy mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ MH 24

Bảng 3.2 Đếm đơn vị đổi màu CCU 32

Bảng 3.3 Bố trí thử nghiệm gây bệnh trên heo 33

Bảng 4.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích trong đánh giá 35

Bảng 4.2 Mức độ tổn thương chung trên phổi 36

Bảng 4.3.Các bệnh tích thường gặp trên phổi heo đánh giá 38

Bàng 4.4 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH trong đánh giá 39

Bảng 4.5 Điểm trung bình bệnh tích nghi ngờ do MH trên phổi 42

Bảng 4.6 Kết quả phân lập MH từ phổi có bệnh tích nghi ngờ 43

Bảng 4.7 Kết quả xác định MH từ mẫu canh phân lập bằng kỹ thuật PCR 45

Bảng 4.8 Kết quả xác định MH bằng kỹ thuật PCR từ mẫu phổi 46

Bảng 4.9 Kết quả thực hiện phản ứng sinh hóa 48

Bảng 4.10 Kết quả nuôi heo thử nghiệm 50

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR 20

Hình 4.1 Khuẩn lạc nghi ngờ MH sau 10 ngày nuôi cấy với độ phóng đại 100 lần 44

Hình 4.2 Môi trường canh nuôi cấy dương tính MH 44

Hình 4.3 Kết quả chạy PCR mẫu phân lập trên canh Friis’ 45

Hình 4.4 Kết quả điện di mẫu chạy PCR từ phổi 47

Hình 4.5 Kết quả thử sinh hóa glucose, arginine, urea dương tính 48

Hình 4.6 Kết quả thử sinh hóa digitonin 49

Hình 4.7 Phổi heo thử nghiệm có bệnh tích nhục hóa đối xứng 2 bên thùy tim 52

Hình 4.8 Heo số 1: có bệnh tích vi thể đặc trưng MH (Bạch cầu lympho tăng sinh quanh tiểu phế quản Vách phế nang sung huyết, tăng sinh và hơi dày lên) 52

Hình 4.9 Heo số 2: viêm phổi sợi huyết, hóa gan lan rộng (có kết hợp APP) Bạch cầu và hồng cầu chiếm hết các phế nang và lan cả vào tiểu phế quản 53

Hình 4.10 Heo số 3: một số vùng có phế nang viêm dính lại, có những chỗ phổi xẹp 53

Hình 4.11 Khuẩn lạc nghi ngờ MH được phân lập từ phổi heo gây bệnh thực nghiệm (sau 7 ngày nuôi cấy với độ phóng đại 100 lần) 54

Hình 4.12 Kết quả chạy PCR mẫu phân lập trên thạch Friis’ của heo thử nghiệm 54

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 24

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập MH 26

Sơ đồ 2.3 Sơ đồ cấy thuần MH 30 Biểu đồ 4.1 Mức độ tổn thương trung bình của thùy phổi có bệnh tích nghi ngờ MH40

Biểu đồ 4.2 Mức độ tổn thương trung bình của phổi có bệnh tích nghi ngờ MH 41

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Mycoplasma hyopneumoniae (MH) là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi địa phương, một bệnh truyền nhiễm rất phổ biến trên heo, lây lan nhanh Tuy chúng không làm cho tỷ lệ chết nhiều nhưng tỷ lệ mắc bệnh lại cao và làm suy giảm

hệ miễn dịch dẫn đến mở đường cho các bệnh kế phát do vi sinh vật nguy hiểm khác như virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV), virus cúm heo,

Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe đàn heo Heo bệnh sẽ chậm lớn, tăng tỉ lệ loại thải, giảm hiệu quả sử dụng thức ăn, kéo dài thời gian nuôi

và tăng chi phí thuốc điều trị Điều này đã gây thiệt hại kinh tế không nhỏ đến nhà chăn nuôi, đặc biệt là chăn nuôi heo công nghiệp, góp phần làm giảm sự tăng trưởng kinh tế của nước nhà

Không những thế MH thuộc nhóm vi sinh vật đặc biệt, việc phân lập còn gặp nhiều khó khăn do MH có sức chịu đựng kém, chậm tăng trưởng, đòi hỏi môi trường nuôi cấy giàu dưỡng chất, dễ bị vấy nhiễm bởi các tác nhân khác (Quinn, 1994) Nhưng việc phân lập, nuôi cấy MH lại được xem là rất quan trọng cho các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm và trong các ứng dụng sau khi tìm ra chính xác MH như cần thử nghiệm kháng sinh đồ để xác định những kháng sinh nhạy cảm trong việc điều trị, hay cần chủng MH để công cường độc trong việc thử nghiệm vaccine, hoặc chúng ta có thể nghiên cứu về MH như tiến hành ứng dụng thử một số phản ứng sinh hóa đặc trưng: lên men glucose, phản ứng thủy phân arginine, urea, digitonin Bên cạnh đó tiến hành dùng kỹ thuật PCR để chẩn đoán nhanh MH được xem là hiệu quả nhất Đồng thời, gây bệnh trên thú thí nghiệm để xem xét đặc tính gây bệnh của gốc MH phân lập được cũng rất cần thiết cho công tác nghiên cứu

Xuất phát từ thực tế trên được sự đồng ý của bộ môn Vi Sinh Truyền Nhiễm, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Phước Ninh, TS Nguyễn Đình Quát, BSTY

Lâm Thị Tú Anh chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập, định danh Mycoplasma

hyopneumoniae (MH) và gây bệnh thực nghiệm trên heo”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Định danh MH trên mẫu phổi heo thịt có bệnh tích nghi ngờ bằng phương pháp phân lập kết hợp kỹ thuật PCR để kiểm tra một số đặc tính sinh hóa và xác định khả năng gây bệnh của MH sau khi gây bệnh thực nghiệm trên heo, góp phần đánh giá các phương pháp chẩn đoán MH trong phòng thí nghiệm

1.2.2 Yêu cầu

Thu thập mẫu phổi trên heo nghi ngờ nhiễm MH

Đánh giá mức độ tổn thương chung của phổi qua bệnh tích đại thể theo phương pháp của Christensen (1999) và cho điểm bệnh tích của phổi có bệnh nếu nghi ngờ

do Mycoplasma hyopneumoniae theo phương pháp của Rice (2000)

Phân lập MH trên môi trường Friis’ từ mẫu phổi heo có bệnh tích nghi ngờ Ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định và định danh MH Thử một số phản ứng sinh hóa như lên men glucose, phản ứng thủy phân arginine, urea, digitonin trên những gốc MH phân lập và định danh được

Gây bệnh trên heo thử nghiệm 50 ngày tuổi bằng gốc MH phân lập và định danh được

Chương 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm

Bệnh viêm phổi địa phương thường gọi là bệnh suyễn heo hay viêm phổi dịch

vùng là một loại bệnh truyền nhiễm do Mycoplasma hyopneumonia (MH) gây ra

Bệnh làm xáo trộn đường hô hấp và có diễn biến kéo dài, với đặc điểm gây viêm phế quản, phổi tiến triển chậm (Trần Thanh Phong, 1996)

Tuy không gây cho heo tỷ lệ chết cao nhưng bệnh lại là nguyên nhân chính gây thiệt hại kinh tế một cách đáng kể Vì thường tồn tại ở thể mãn tính nên bệnh làm cho heo ho kéo dài, chậm lớn, sức đề kháng yếu, ảnh hưởng đến các chỉ tiêu tăng trọng, hiệu quả sử dụng thức ăn bị giảm sút, làm tỷ lệ loại thải, thời gian nuôi và chi phí thức ăn lại tăng lên rõ rệt Heo bệnh sẽ tăng chỉ số chuyển hóa thức ăn khoảng

25 %, giảm tăng trọng 15 - 20 %, thậm chí có nhiều trường hợp không tăng trọng sau vài tháng nuôi dưỡng (Trần Thanh Phong, 1996)

Đặc biệt, bệnh diễn biến phức tạp và gây nhiều thiệt hại hơn khi có sự tạp nhiễm cùng các vi sinh vật khác, với điều kiện chăn nuôi không tốt và tình trạng quản lý yếu kém Bởi vậy mà hiện nay bệnh viêm phổi địa phương là bệnh đường

hô hấp trên heo phổ biến nhất và gây thiệt hại kinh tế lớn nhất cho tất cả các nước trên thế giới

2.1.1 Lịch sử và phân bố địa lý

2.1.1.1 Lịch sử bệnh

Vào những năm 1898, Norcard và Roux phân lập vi khuẩn trên phổi những bò

bị bệnh viêm phổi và đặt tên là vi khuẩn PPLO (Pleuro – Pneumoniae – Like –

organism) Mãi đến năm 1929 hai ông mới đề nghị đặt tên là Mycoplasma (trích dẫn

bởi Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001) Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Kobe (người Đức) đã phát hiện ra bệnh viêm phổi mãn tính trên heo vào năm 1933

và Kobe gọi đó là bệnh cúm heo

Trong những năm đầu và giữa thập kỷ 20, hàng loạt các cuộc nghiên cứu về bệnh này trên heo đã được tiến hành Vì chúng gây ra triệu chứng hô hấp mãn tính trên heo, nên từ lâu vẫn bị nhầm lẫn với bệnh cúm heo Phải mãi đến năm 1952, Betls và Beveridge mới phân biệt được hai bệnh này (trích dẫn bởi Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

Đến năm 1965, Mare và ctv đã phân lập được một loài Mycoplasma trên heo bị

viêm và gây bệnh thực nghiệm, từ đó đề nghị đặt tên là Mycoplasma

hyopneumoniae (MH) (trích dẫn bởi Nguyen Tat Toan, 2004)

2.1.1.2 Phân bố địa lý

Năm 1948, Pullar phát hiện ra bệnh này ở khắp lục địa Úc Bệnh này cũng được thấy ở Anh do Gunrujani (1951) và Ben (1952, 1956) tìm ra và họ gọi đó là bệnh viêm phổi do virus Sau đó rất nhiều công bố khác cho thấy bệnh xuất hiện ở khắp các nước Pháp, Mỹ, Thụy Sỹ, Hungari, Bỉ, Phần Lan Bệnh cũng có ở châu Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam) và Châu Phi Kể từ sau khi được phát hiện, bệnh lan nhanh, mạnh xảy ra ở nhiều quốc gia trên thế giới và gây thiệt hại không ít cho nghành chăn nuôi, đặc biệt là nghành chăn nuôi heo công nghiệp

Ở Việt Nam, bệnh này được phát hiện vào năm 1959 ở miền Bắc Hiện nay bệnh xảy ra phổ biến ở hầu hết các trại trong nước (Trần Thanh Phong, 1996)

Trong 6 giống của lớp Mollicutes thì giống Mycoplasma có số lượng loài phong phú nhất với hơn 80 loài đã được mô tả Theo Barbara (1999), Mycoplasma

có hơn 13 loài gây bệnh trên heo, với các loài phổ biến nhất là:

M hyopneumoniae (phổ biến nhất): gây bệnh viêm phổi địa phương

M hyorhinis: gây viêm khớp và viêm đa thanh dịch mãn tính ở heo 3 - 10 tuần tuổi

M synoviae: gây viêm khớp ở heo 12 - 14 tuần tuổi

M floculare: không gây bệnh nhưng thường có mặt trong đường hô hấp của heo…

Theo Razin và ctv (1998), Mycoplasma thuộc lớp Mollicutes bởi vì không có

thành tế bào, được bao bọc bởi màng nguyên sinh chất có 3 lớp Trong phân loại,

việc thiếu thành tế bào được dùng để phân biệt Mycoplasma với các vi khuẩn khác Hiện nay có 183 loài trong lớp Mollicutes và 105 loài trong giống Mycoplasma đã

được báo cáo (Waites và ctv, 2003) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006)

2.1.3 Đặc điểm Mycoplasma

2.1.3.1 Đặc điểm sinh học của Mycoplasma

Đặc điểm hình thái: Mycoplasma có nhiều hình thái: hình cầu, hình ovan, hình

sợi, hình xoắn hay hình sao Kích thước từ 0,2 - 0,8 µm, thay đổi tùy theo hình dạng của chúng Vì kích thước nhỏ, chúng dễ dàng qua lọc kích thước 0,45 µm

Mycoplasma chủ yếu ở dạng hình cầu, tuy nhiên hình thái có thể thay đổi, gồm hình quả lê, hình bình thót cổ với đầu cực nhọn, hình sợi với chiều dài thay đổi và sợi mảnh hình xoắn ốc Do có những sợi dài giống như nấm nên được đặt tên là

Mycoplasma (Myco tiếng latinh nghĩa là nấm)

Đặc điểm cấu tạo: Mycoplasma chưa có thành tế bào vững chắc như ở vi

khuẩn, chỉ là lớp màng nguyên sinh chất dày 75 - 100 A Chúng rất dễ biến đổi hình

dạng và khó bắt màu với các thuốc nhuộm thông thường Mycoplasma được coi là

thuộc nhóm gram âm và muốn quan sát dưới kính hiển vi quang học người ta phải nhuộm bằng phương pháp nhuộm Giemsa

Trong tế bào Mycoplasma có thể tìm thấy các hạt ribosome với đường kính 20

nm và những sợi nhân, nhưng người ta không tìm thấy những chất đặc trưng đối với

thành tế bào vi khuẩn (như diaminopimelic hay các mucopeptit) Mycoplasma có cả

DNA và RNA, chúng mang bộ gen nhỏ nhất trong tất cả cơ thể sống tự do (khoảng

từ 580 kb đến 1380 kb và có ít hơn 300 gene) Tổng thành phần guanine và cytosine trong DNA thấp (23 - 40 %); tỷ lệ đó phân bố không đều trên bộ gen, có những vùng rất cao lại có những vùng rất thấp (Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009)

Đặc điểm sinh sản: Mycoplasma không có khả năng sinh sản theo lối phân đôi

như ở tế bào vi khuẩn do không chứa mesosome, cơ quan điều khiển việc tạo thành vách ngăn khi phân chia tế bào Người ta quan sát thấy hai hình thức sinh sản khác

nhau ở Mycoplasma Trong trường hợp thứ nhất, từ một thể hình cầu có thể phát

triển thành những thể sợi hay những thể có đa hình dạng Trường hợp thứ hai, từ một thể hình cầu phát triển thành một thể có hình dạng bất kỳ, thể này phình to ra, bên trong xuất hiện một hạt nhuộm màu rất đậm, tiếp đó hạt này phân cắt thành nhiều hạt nhỏ nằm xung quanh một khối tế bào chất, được bao bọc bởi một màng mỏng Về sau mỗi hạt nhỏ với một ít tế bào chất bao quanh sẽ được giải phóng và tạo thành một cá thể mới Các thể hình cầu cũng có khả năng nảy chồi

2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấy

Nuôi cấy và phân lập Mycoplasma rất khó vì nó đòi hỏi dinh dưỡng môi trường khá cao, mọc chậm, dễ bị lấn át bởi các vi khuẩn khác và nấm Hầu hết các

Mycoplasma sống kị khí tùy nghi hoặc hiếu khí, cần bổ sung 5 - 10 % CO2, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH 7 - 8 Trong môi trường thạch, khuẩn lạc của Mycoplasma có dạng trứng chiên kích thước nhỏ, đường kính 0,02 - 0,5 mm sau 2 - 6 ngày nuôi cấy

có thể quan sát bằng kính lúp hoặc kính hiển vi (Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên, 2001)

Để có dinh dưỡng cho nuôi trường nuôi cấy, người ta dùng dịch chiết tim bò, peptone, chất chiết nấm men và huyết thanh với các chất bổ sung

2.1.3.3 Sức đề kháng

Mycoplasma rất mẫn cảm với sự khô hạn, tia tử ngoại và các chất sát trùng vì không có thành peptidoglycan để bảo vệ Ở nhiệt độ 45 - 55oC hầu như chúng bị tiêu diệt trong vòng 15 phút, nhưng có thể tồn tại đến 17 ngày trong môi trường nước mưa ở nhiệt độ 2 - 70C (Tô Minh Châu, 2000) Trong phổi tồn tại 2 tháng ở -

250C, 9 - 11 ngày ở nhiệt độ 1 - 60C và chỉ 3 - 7 ngày ở nhiệt độ 17 - 250

C Chúng không mẫn cảm với sulfonamide, penicillin và các kháng sinh tác động lên thành tế bào nói chung nhưng có thể bị ức chế bởi các kháng sinh tác động lên quá trình sinh tổng hợp protein hay acid nhân như chlortetracyclin, tylosin, gentamycin và erythromycin…

2.1.3.4 Phân bố tự nhiên

Mycoplasma có thể sống ký sinh hay hoại sinh, tuy nhiên phần lớn sống ký

sinh Mycoplasma chỉ sống và phát triển mạnh ở một số vật chủ cụ thể (dải thích nghi hẹp), ví dụ những loài gây bệnh cho người thì hoàn toàn khác biệt với các loài

gây bệnh ở động vật khác như găm nhấm hoặc nhai lại Mycoplasma gây bệnh tự

nhiên ở động vật có vú, chim, bò sát, chân đốt, thực vật và cá Những loài

Mycoplasma gây bệnh hay không gây bệnh đều có thể tìm thấy trên màng nhày đường hô hấp, tiêu hóa, sinh dục và tuyến vú (Đỗ Tiến Duy, 2004)

2.1.4 Đặc điểm của MH

Ngoài những đặc điểm chung của giống Mycoplasma, MH có những đặc điểm

riêng như sau: MH có khuẩn lạc hình tròn, lồi nhưng không có dạng hình trứng

chiên như các Mycoplasma khác, không xuyên qua bề mặt thạch, kích thước khuẩn

lạc từ 200 - 400 µl (sau 5 - 10 ngày nuôi cấy) Mọc tốt nếu có 5 – 10 % CO2 Theo Friis (1974) thì khuẩn lạc MH có thể nhìn thấy được sau 2 ngày nuôi cấy và gia tăng kích thước từ từ sau khoảng 10 ngày ủ và đạt tối đa 14 ngày, tuy nhiên kích thước này còn phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy

Cấu trúc kháng nguyên gồm nhiều loại: lactate dehydrogenase protein: 36 kDa;

các protein có khối lượng phân tử: 40, 43, 64, 74, 97 kDa (giúp phân biệt với M

flocculare, M hyorhinis)

Đặc tính sinh hóa: Gardella và ctv (1983) báo cáo một số phản ứng sinh hóa

của MH (Bảng 2.1) giúp phân biệt với các loài Mycoplasma khác, đặc biệt là

Mycoplasma gây bệnh trên heo :

Bảng 2.1 Một số phản ứng sinh hóa để xác định MH

MH hiện diện trong lòng ống của phế quản, phần lớn được tìm thấy giữa những tế bào lông rung và phần đỉnh của vi nhung mao trên tế bào biểu mô khí quản và một số khác thì nằm tự do trong lòng ống, nó tiếp xúc với màng plasma của

vi nhung mao xuyên qua capsule hoặc nằm tự do trong lòng ống của phế quản (Masanori Taijma, 1982) (trích dẫn bởi Văn Minh Tâm, 2005)

Theo Quách Tuyết Anh (2003), MH có khả năng phát tán trong không khí với đường kính từ 3 - 3,5 km do đó bệnh dễ lây lan từ trại này sang trại khác nhất là trong điều kiện thời tiết lạnh, khí hậu ẩm

2.1 5 Đặc điểm dịch tễ MH

2.1.5.1 Loài vật mắc bệnh

Trong tự nhiên: MH chỉ gây bệnh trên heo Heo ở tất cả các lứa tuổi đều có thể mắc bệnh nhưng bệnh trầm trọng ở heo con và heo nái mới đẻ Heo sơ sinh thường

cảm nhiễm từ mẹ hoặc từ môi trường, trong điều kiện môi trường nuôi xấu có thể phát bệnh lúc 1 tháng tuổi hoặc giai đoạn sau cai sữa Heo thịt giai đoạn 30 - 70 kg, giai đoạn cuối nuôi thịt cũng dễ mắc bệnh Giống heo ngoại nhập có tỉ lệ mắc bệnh cao hơn giống heo lai và heo thuần giống nội (Quách Tuyết Anh, 2003) Khi heo được 20 tuần tuổi, tỷ lệ bệnh có thể đến 100 % (Robert, 2003) (trích dẫn bởi Đặng Thị Thu Hường, 2005)

Trong phòng thí nghiệm: heo con từ 10 - 21 ngày tuổi được chọn làm động vật thí nghiệm

2.1.5 2 Chất chứa căn bệnh

Mầm bệnh tập trung chủ yếu ở tổ chức phổi, hạch phổi và chất tiết đường hô hấp Năm 1972, Goodwin chứng minh rằng MH cũng có thể phân lập được từ mẫu ngoáy mũi của thú bệnh Ngoài ra trong các hạch bạch huyết dọc khí quản cũng chứa nhiều MH, do đó có thể phân lập MH từ các hạch bạch huyết này (Nguyễn Như Pho, 1999) Heo khỏi bệnh vẫn mang MH trong đường hô hấp từ vài tháng đến cả năm

2.1.5.3 Đường xâm nhập

MH xâm nhập chủ yếu qua đường hô hấp

2.1.5.4 Cách lây lan và truyền bệnh

MH chủ yếu lây truyền qua đường hô hấp Sự tiếp xúc trực tiếp là điều kiện lý tưởng để bệnh truyền từ heo bệnh, heo mang trùng tới heo khỏe MH tồn tại trong đàn bằng cách truyền lây từ heo mẹ sang heo con, từ heo nái sang heo thịt, từ heo lớn sang heo nhỏ Một vài heo nhiễm bệnh trong đàn khi tiếp xúc trực tiếp với heo khỏe, hoặc sau một vài cơn ho sẽ bài xuất mầm bệnh qua các hạt chất tiết lơ lửng trong không khí, heo khỏe mạnh hít phải sẽ mắc bệnh, từ đó hình thành một đàn heo nhiễm bệnh mới

Mầm bệnh có thể phát tán trong không khí với đường kính lớn hơn 3,2 km Nếu yếu tố môi trường, điều kiện chăn nuôi, vệ sinh chăm sóc kém sẽ tạo điều kiện thuận lợi để mở đường cho MH xâm nhập và gây bệnh

Bệnh thường kéo dài và khó dập tắt, khó tiêu diệt do heo khỏi bệnh vẫn mang mầm bệnh trong một thời gian dài với bệnh tích ở phổi Bệnh lây lan mạnh trong các ổ dịch mới làm chết nhiều heo ở giai đoạn đầu, dần dần bớt trầm trọng và trở thành dịch lẻ tẻ, lây lan chậm, số con ít, bệnh trở nên âm ỉ nhưng nếu nhập heo mới hoặc đưa heo mắc bệnh vào đàn mới thì bệnh phát ra mạnh mẽ (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

2.1.6 Cơ chế sinh bệnh

Mặt trong của hệ thống phế quản có rất nhiều lông rung, các lông rung này giữ

nhiệm vụ đẩy các chất cặn bẩn trong đường hô hấp ra ngoài Do Mycoplasma có

đặc tính kết dính và sản sinh độc tố trên tế bào vật chủ nên sau khi theo đường hô hấp vào trong cơ thể, MH định vị ở đỉnh lông rung hoặc tiếp xúc trực tiếp với vi nhung mao, sản sinh độc tố, tấn công làm tê liệt hệ thống lông rung, sau đó gây thoái hóa, hoại tử các lông rung, phá hỏng hệ thống tiết dịch nhầy, thậm chí làm hư hại tế bào biểu mô Từ đó để lại các tổn thương trên niêm mạc phế quản tạo hiện tượng viêm phế quản và vùng rìa của các thùy phổi, làm suy giảm chức năng hô hấp

và làm chảy nước mũi (Baskrville, 1972) (trích dẫn bởi Đỗ Tiến Duy, 2004)

Ngay sau khi gắn với biểu mô đường hô hấp, nó kích động bạch cầu trung tính tràn vào niêm mạc khí – phế quản, gây mất một lượng lớn lông rung, kích thích sự tăng sinh rất mạnh của bạch cầu lympho trong mô lympho vùng phế quản và lôi cuốn tế bào nhân vào mô kẽ của tiểu phế quản – phế nang Ngoài ra, những yếu tố độc lực của MH làm giảm hoạt động thực bào của bạch cầu trung tính trong phổi và làm thay đổi cấu tạo hóa học của chất nhầy, dẫn đến nhiễm trùng phổi thứ phát các

vi sinh vật khác như Pasteurella, Streptococcus, Haemophilus, Actinobacillus, hay nhiễm virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRSV), Aujeszky làm cho

diễn biến bệnh nặng hơn, gây các bệnh điển hình như viêm phổi thùy lớn, viêm màng phổi, viêm phổi hóa mủ…con vật có thể chết nhanh và nhiều hơn

Khi sức đề kháng của cơ thể gia súc tốt thì Mycoplasma sẽ tạm thời bị cô lập

Nếu sức đề kháng của cơ thể kém (do điều kiện vệ sinh nuôi dưỡng kém, thời tiết

thay đổi đột ngột…) trạng thái cân bằng bị phá vỡ Mycoplasma sẽ tăng độc lực,

sinh sản nhanh và tấn công từ thùy tim sang thùy đỉnh rồi thùy hoành cách mô tạo bệnh tích đại thể và vi thể đặc trưng của bệnh

2.1.7 Triệu chứng

MH gây nên bệnh viêm phổi thường nhất ở thể mãn tính, với triệu chứng dễ thấy là ho lâu hết và chậm lớn Thời gian nung bệnh biến đổi có thể từ 1 - 3 tuần lễ, heo nhiễm bệnh với nhiều thể khác nhau thường gặp nhiều ở thể mãn tính hơn thể cấp tính Ở thể cấp tính, bệnh chủ yếu phát sinh ở đàn heo chưa từng nhiễm bệnh lần nào, tử số thấp 2 – 10 % tăng lên 20 – 80 % khi điều kiện nuôi dưỡng kém, thân nhiệt tăng trong nhiều ngày, kém ăn, da nhợt nhạt, xuất hiện xáo trộn hô hấp như kịt mũi, chảy nhiều nước mũi, ho nhiều, thở khó, thường thở thể bụng; có thể xáo trộn

hô hấp nhẹ và tăng lymphocyte khi lấy máu kiểm tra Với thể mãn tính heo ho khô, dai dẳng, không thấy sốt; thở khó, khò khè về đêm, gầy còm, lông xù xơ xác (Trần Thanh Phong, 1996)

Trong giai đoạn đầu thì heo ho kéo dài và liên tục vài tuần cho đến cả tháng, một số heo không ho hoặc ho chút ít, cường độ ho mạnh nhất thấy trên heo vỗ béo Thú chết do nhiễm các vi khuẩn thứ cấp và stress xảy ra lúc heo 4 - 6 tháng tuổi (Ross, 1992) (trích dẫn bởi Đặng Thị Thu Hường, 2005)

Những heo mắc bệnh, khả năng hồi phục rất chậm, tăng trọng hằng ngày giảm

15 – 20 %, tiêu tốn thức ăn (cho kg tăng trọng) tăng hơn 25 % (so với bình thường) Thậm chí có nhiều trường hợp không tăng trọng sau vài tháng nuôi dưỡng (Trần Thanh Phong, 1996)

lại, cứng và nhạt màu giống như màu thịt, lúc này phổi đã bị nhục hóa, cắt ra có dịch lỏng màu trắng xám, có bọt, chất phổi dày đặc lại, không còn xốp như bình thường nữa Sau 10 – 20 ngày vùng nhục hóa chuyển sang màu vàng hoặc xám rất cứng giống như tụy tạng, gọi là phổi tụy tạng hóa Cắt phổi bệnh thấy nhiều bọt, nhiều vùng hoại tử màu vàng trắng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

Khí quản và phế quản có nhiều dịch viêm đục, có thể có mủ

Màng phổi có thể bị viêm làm phổi dính vào lồng ngực

Hạch phổi sưng to 2 – 5 lần bình thường

Nếu kế phát các vi khuẩn khác trong đường hô hấp thì bệnh tích có thêm các dấu hiệu sau:

Nếu ghép với P multocida sẽ làm viêm thùy phổi kể cả những vùng sâu bên

trong, phổi viêm và tụ nhiều máu

Nếu ghép với các vi khuẩn sinh mủ như Streptococcus suis, Corynebacterium

pyogenes thì gây viêm phổi hóa mủ

Nếu ghép với APP sẽ gây bệnh tích viêm màng phổi làm phổi dính sườn

Nếu ghép với Haemophilus parasuis sẽ gây viêm phổi xuất huyết, toàn bộ phổi

viêm xuất huyết nặng ở phần trên (Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009)

2.1.8 2 Bệnh tích vi thể

Có sự tập trung các bạch cầu trung tính trong lòng ống và chung quanh đường thở cũng như trong phế nang Có sự gia tăng số lượng bạch cầu lympho quanh các mao quản, quanh tiểu phế quản và quanh các mô của tiểu phế quản Khoảng 10 – 15 ngày có thể thấy bệnh tích rõ ràng, ngày càng tích tụ nhiều dịch chất và tế bào đơn nhân lớn, vách liên phế nang dày hơn Bệnh tích nặng vào 17 – 40 ngày sau khi cảm nhiễm Những nốt lympho tăng sinh mạnh mẽ đặc biệt là trong đường thở Vùng bệnh tích đang lành có nhiều phế nang bị xẹp, khí thũng Quan sát bệnh tích vi thể thấy hệ thống lông rung bị bào mòn, lòng phế quản có nhiều chỗ tổn thương làm phế quản dày lên, bên trong chứa nhiều dịch chất và tế bào bạch cầu, đây là nguyên nhân chính gây hẹp phế quản từ đó gây ra hiện tượng khó thở cho heo Bệnh tích bị

ảnh hưởng đáng kể bởi cảm nhiễm thứ cấp, stress, không khí bị ô nhiễm và quản lý kém (Quách Tuyết Anh, 2003)

2.1.9 Chẩn đoán

2.1.9 1 Chẩn đoán lâm sàng phân biệt

Khi chẩn đoán bệnh cần dựa vào đặc điểm dịch tễ học là bệnh xảy ra trong điều kiện vệ sinh, nuôi dưỡng, chăm sóc kém và phát triển chậm

Triệu chứng lâm sàng giúp chúng ta định hướng nghi ngờ bệnh suyễn heo bao gồm ho kinh niên, ho lúc di chuyển, heo chậm lớn và còi cọc, tử số thấp, bệnh chậm phát triển, lây lan mạnh, bệnh thường tái phát

Bệnh tích khá đặc trưng nhưng không chuyên biệt vì có trường hợp bệnh tích tương tự nhưng lại do tác nhân khác, đó là có nhiều vùng bị gan hóa, nhục hóa, tụy tạng hóa mang tính đối xứng

2.1.9.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Việc chẩn đoán MH bằng nuôi cấy phân lập thường gặp nhiều khó khăn do

MH cần môi trường nuôi cấy chuyên biệt, khó mọc, mọc chậm và thường bị vấy nhiễm bởi các vi khuẩn khác hiện diện trên phổi Tuy nhiên việc phân lập MH được xem là “tiêu chuẩn vàng” cho việc kết luận sự hiện diện của MH trên heo và được

sử dụng để so sánh với các phương pháp khác trong chẩn đoán nghi ngờ MH (Trần Thị Dân và ctv, 2005)

Các phương pháp huyết thanh học tỏ ra có hiệu quả trong việc chẩn đoán MH gồm có phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA), phản ứng kết hợp bổ thể (CF), phản ứng ELISA và phản ứng miễn dịch huỳnh quang Trong đó, kỹ thuật ELISA gián tiếp với Tween 20 được phát triển bởi Nicolet (1980) và Bommeli

(1983) tỏ ra khá hữu hiệu khi phát hiện kháng thể kháng MH, phản ứng chéo với M

flocculave được loại trừ tối đa nhờ Tween 20.Ngoài ra có thể dùng Xquang để chẩn đoán bệnh Nếu heo mắc bệnh này thì vành tim và đường huyết quản xám mờ đi Bệnh mới bắt đầu thì thấy mờ ở mõm tim trước Nếu cảm nhiễm càng lâu thì diện tích mờ càng rộng Nếu bệnh nặng thì vùng phổi mờ, xơ, bong ra (Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009)

Kỹ thuật PCR cũng được nhiều nhà khoa học quan tâm Người đặt nền móng cho kỹ thuật PCR là Kary Mullis (1985) Tiếp theo đó là Mattson và ctv (1995) đã dùng kỹ thuật PCR để phát hiện nhanh chóng và đặc hiệu MH trong dịch mũi và nước rửa khí phế quản của phổi bệnh Calsamiglia (1998) cho rằng phương pháp PCR có độ chính xác cao và ít tốn kém thời gian (trích dẫn bởi Nguyễn Tất Toàn, 2004)

2.1.10 Điều trị

Do không có thành tế bào nên MH đề kháng với các kháng sinh tác động lên thành tế bào vi khuẩn như các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam, nhưng lại rất nhạy cảm với các kháng sinh có hướng tác động khác Hiện nay, có rất nhiều kháng sinh được dùng trong việc điều trị và phòng bệnh suyễn heo Tuy nhiên, việc lựa chọn kháng sinh nên dựa vào phạm vi tác động và hiệu quả điều trị

Theo Nguyễn Như Pho (1999) bệnh có thể điều trị bằng các loại kháng sinh nhóm tetracyline, macrolide và quinolone

Phạm Sỹ Lăng và Trương Văn Dung (2002) cho biết khi dùng tylosin ở liều 20 mg/ kg thể trọng, tiêm bắp thịt, dùng liên tục trong 6 ngày, ngưng 5 ngày, tiếp tục dùng trong 5 ngày nữa đã cho kết quả là heo khỏi bệnh về lâm sàng (thở bình thường, hết ho, ăn khỏe) Bên cạnh đó cần kết hợp cho heo sử dụng thêm các loại thuốc trợ sức như vitamin B2, vitamin C…và chăm sóc nuôi dưỡng tốt

Nguyễn Ngọc Nhiên (1992) đã dùng tylosin kết hợp với streptomycin hoặc kanamycin với liều 30 mg/ kg thể trọng cho biết heo khỏi bệnh 80 – 90 % Ngoài ra, theo Nguyễn Hữu Vũ (1993) tiamulin thường được sử dụng để diệt cả MH và các vi khuẩn khác trong đường hô hấp Khi dùng với liều 20 mg/ kg thể trọng kết hợp dùng kanamycin cũng ở liều 20 mg/ kg thể trọng, heo khỏi bệnh 85 – 90 % (Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009)

Tuy nhiên, khi bệnh biểu hiện triệu chứng ra thì hệ thống lông rung đã bị hư hại, việc điều trị bằng kháng sinh chỉ giúp diệt MH chứ không giúp tái tạo hệ thống lông rung Khi yếu tố bảo vệ bị mất đi, thú dễ dàng tái nhiễm các mầm bệnh gây viêm phổi chỉ một thời gian ngắn sau khi ngừng dùng thuốc

2.1.11 Phòn g bệnh

Để kiểm soát bệnh trên động vật nói chung và bệnh suyễn heo nói riêng, cần thực hiện tốt các biện pháp quản lý trong chăn nuôi Do đó, cần phải tạo ra môi trường thuận lợi cho đàn heo như chuồng trại sạch sẽ, thông thoáng, nhiệt độ ấm áp

và mật độ heo trong chuồng vừa phải Đồng thời phải cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để nâng cao sức đề kháng cho con vật

Kiểm tra kỹ trước khi mua heo về và phải cách ly theo dõi 2 tháng trước khi cho nhập đàn Thường xuyên theo dõi con thú bằng các phản ứng PCR, phản ứng huyết thanh học trên đàn nái đẻ để loại thải những cá thể dương tính

Chương trình cùng vào cùng ra (all in all out) có thể là phương pháp hiệu quả

để kiểm soát bệnh trên những đàn đã nhiễm bệnh

Ở các trại heo cung cấp giống, để xây dựng đàn heo không nhiễm MH cần sử dụng kháng sinh liên tục cho con nái từ giai đoạn cuối quá trình mang thai cho đến khi cai sữa Cai sữa sớm và nuôi cách ly những heo con này trong điều kiện vệ sinh

và chăm sóc tốt Trong quá trình nuôi cho đến khi trưởng thành phải kiểm tra thường xuyên bằng cách mổ khám kiểm tra bệnh tích phổi hoặc bằng các phản ứng huyết thanh học Thực hiện thường xuyên biện pháp này sẽ tạo ra đàn heo giống không có bệnh suyễn heo (Trần Văn Trường, 2009)

Phòng bệnh bằng vaccine: biện pháp sử dụng vaccine để phòng ngừa bệnh cũng đang được quan tâm Mặc dù vaccine không hoàn toàn ngăn ngừa được bệnh nhưng làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh tích trên phổi Tiêm vaccin cho heo nái mang thai giúp cho lượng kháng thể heo con nhận được qua sữa đầu cao gấp 3 lần so với bình thường (Clack, 1999) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thanh Trúc, 2006)

Cách tốt nhất là phối hợp các biện pháp vệ sinh và tiêm phòng vaccine cho heo sau khi sinh và cho đàn heo nái (Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009)

2.2 Những phương pháp phát hiện MH

2.2.1 Quan sát bệnh tích đại thể

Phương pháp này rất hữu dụng, quyết định phương hướng cho các bước chẩn đoán tiếp theo Tuy nhiên, phương thức này không chính xác, chủ quan và bị nhầm lẫn vì có nhiều tác nhân gây bệnh hình thành cùng một loại bệnh tích

2.2.2 Quan sát bệnh tích vi thể

Hạn chế của phương pháp này cũng giống như đánh giá bệnh tích đại thể, do ngoài môi trường có nhiều virus hay vi khuẩn gây bệnh khác cũng gây ra những bệnh tích tương tự Đồng thời, bênh tích do MH gây ra không đặc trưng cho viêm

phổi do Mycoplasma Do vậy trong thực tế bệnh xảy ra là sự nhiễm trùng phức hợp

nên làm cho việc chẩn đoán khó và phức tạp hơn

2.2.3 Phân lập MH

2.2.3.1 Môi trường nuôi cấy

Vì bản chất bộ gen MH không có hầu hết các gen sinh tổng hợp acid amin, acid béo, tiền chất và các vitamin, chúng phải phụ thuộc vào vật chủ để phát triển nên MH rất khó nuôi cấy thành công trên môi trường không có tế bào Do đó môi trường nuôi cấy MH đòi hỏi phải có nhiều dưỡng chất đồng thời thêm chất ức chế các vi sinh vật khác Và môi trường Friis’ được xem là thông dụng hơn cả để làm nền tảng tạo ra môi trường dùng trong phân lập MH

Công thức môi trường canh Friis’ (theo Kirchhoff và Rosengarten, 1984)

Huyết thanh heo đã bất hoạt bổ thể 300 ml

Công thức môi trường thạch Friis’: từ môi trường canh trên cho thêm thạch nguyên chất (6 g trong 1 lít môi trường)

2.2.3.2 Ý nghĩa của các thành phần trong môi trường nuôi cấy MH

BHI (Brain heart infusion broth): thành phần này được dùng như chất căn bản

trong môi trường nuôi cấy của nhiều Mycoplasma khác nhau do chứa nhiều chất

dinh dưỡng

Yeast extract: chất chiết nấm men tươi, là chất dịch lỏng chiết ra từ nấm men đã được lên men Mặc dù chưa được xác định một cách chính xác, nhưng chất chiết này có thể chứa nhiều nucleic acid và tiền chất của nucleic acid

Huyết thanh: cung cấp acid béo và cholesterol dễ đồng hóa và không độc, thỏa mãn tổng hợp màng

Phenol red: là một chất chỉ thị màu để kiểm tra sự phát triển của MH

Penicillin: ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn Gram dương

Thalium acetate: cản trở sự phát triển của vi khuẩn Gram âm và nấm

DNA: kích thích sự phát triển của nhiều loại Mycoplasma khác nhau

Điều kiện tối hảo để nuôi cấy MH là ở nhiệt độ 370C, yếm khí 5 - 10 % CO2

2.2.4 Nguyên lý của một số phản ứng sinh hóa

 Lên mên đường glucose

Mycoplasma được chia thành 2 nhóm lớn, lên men và không lên men mà đặc biệt là glucose Vì thế, xét nghiệm về biến dưỡng glucose là một trong những xét

nghiệm bắt buộc để xác định đặc tính của Mycoplasma Khi Mycoplasma lên men

đường, sản xuất acid làm pH của môi trường giảm làm cho chất chỉ thị màu (phenol red) trong môi trường sẽ chuyển từ đỏ sang vàng (Razin và Cirillo, 1983) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Phước Ninh, 2009)

 Thủy phân arginine

Theo Barile (1983), một số loài Mycoplasma có khả năng thủy phân arginine

qua con đường sử dụng 3 enzyme thủy phân là arginine deiminase, ornithine carbamoyltransferase và carbamate kinase Arginine bị biến đổi thành citrulline, rồi

thành ornithine và carbamate phosphate, sau đó bị thủy phân tạo thành NH3, CO2

và sản xuất ATP như sau:

Carbamoyl phosphate + H2O + ADP NH3 + CO2 + ATP

Hoạt động thủy phân arginine trong môi trường canh MH làm PH kiềm tính, chỉ thị màu thường sử dụng là phenol red, màu của ống canh chuyển từ hồng sang

đỏ (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2009)

 Thủy phân urea

Theo Razin (1983) Mycoplasma thủy phân urea tạo CO2 và NH3, cách đơn giản để xác định hoạt tính này là quan sát sự kiềm hóa của môi trường nuôi cấy Dựa trên căn bản sự hình thành MnO2 từ MnCl2 cùng với sự hiện diện của NH3 do thủy phân urea (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2009)

2NH3 + 2H2O 2NH4OH+ + 2OH

-MnCl2 + 2OH- MnO2 + 2HCl

 Thử nghiệm sự nhạy cảm digitonin

Thử nghiệm này dựa trên nhu cầu sterol cho sự tăng trưởng của Mycoplasma

để phân biệt với Acholeplasma (không cần sterol) Digitonin đã thấm trong đĩa giấy

sẽ ức chế Mycoplasma phát triển, tạo thành vòng ức chế xung quanh đĩa (Tully,

1983) (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Phước Ninh, 2009)

2.2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.2.5.1 Giới thiệu sơ lược về PCR

PCR là một kỹ thuật dùng để khuyếch đại đoạn gen lên hàng triệu bản do Karl Mullis và ctv phát minh vào năm 1985 Việc làm tăng một số lượng lớn các bản sao của đoạn gen di truyền nào đó sảy ra trong một thời gian ngắn nhờ hoạt động của men DNA polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này Càng ngày kỹ

thuật PCR càng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học, kỹ thuật khác nhau

2.2.5.2 Nguyên lý của kỹ thuật PCR

Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm: DNA cần quan tâm, một enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt, hai đoạn nucleotide mồi, 4 loại dNTP, dung dịch đệm cho phản ứng và magnesium Các thành phần phản ứng nói trên được trộn đều và phản ứng được đặt vào trong một máy luân nhiệt

Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase Nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt để bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự DNA, ta sẽ tổng hợp được đoạn DNA nằm giữa hai mồi Kỹ thuật PCR đòi hỏi chúng ta phải biết trình tự các đầu tận cùng của đoạn DNA cần khuyếch đại, để tạo nên các oligonucleotide bổ sung chúng Đoạn mồi tác động lên đầu 3’ – 5’ gọi là mồi xuôi Đoạn mồi tác động lên đầu 5’ – 3’ gọi là mồi ngược

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

Bước 1 (biến tính DNA): ở điều kiện nhiệt độ cao (thường là 94o

C – 95oC trong vòng 30 giây – 1 phút), phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn Chính hai mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch

bổ sung

Bước 2 (ủ bắt cặp): nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40o

C – 70oC tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài

30 – 60 giây tuỳ thuộc vào kích thước sản phẩm khuếch đại

Bước 3 (kéo dài): nhiệt độ được tăng đến 720

C; dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch

khuôn Mạch mới tạo thành từ mồi được nối dài Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuyếch đại

Trong phản ứng PCR, một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp lại nhiều lần, làm gia tăng số lượng sản phẩm theo cấp số nhân Theo tính toán sau 30 đến 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao

Hình 2.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR (Phạm Hùng Vân, 2008) (trích dẫn bởi

Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009)

Sau phản ứng PCR, các DNA sản phẩm có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose rồi nhuộm bởi ethidium bromide và quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm)

2.3 Sơ lược một số nghiên cứu về phân lập MH và ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán MH

Trong suốt hơn 50 năm qua, đã có không ít các cuộc nghiên cứu về dịch viêm phổi địa phương truyền nhiễm trên heo do MH gây ra Trong đó công trình nghiên cứu không thể không nhắc đến là của Mare và Switer vào năm 1965 đã thành công trong việc phân lập được MH từ phổi heo bị viêm và gây bệnh thực nghiệm

94 - 950C Biến tính

40 – 700C Bắt cặp

720C Kéo dài

Chu kỳ 1 Chu kỳ 2

Chu kỳ 3

Chu kỳ 4

Quách Tuyết Anh (2003) áp dụng 4 quy trình ly trích DNA và thực hiện 2 phương pháp PCR để xác định MH từ DNA đã ly trích rồi so sánh kết quả của 2 phương pháp đó

Nguyễn Tất Toàn (2004) đã so sánh và đánh giá các phương pháp chẩn đoán

MH trên heo trong các trại chăn nuôi vùng Lyzon, Phillipine Cho kết quả: kỹ thuật PCR đạt cao nhất 50 %, tiếp đến là chẩn đoán lâm sàng, bệnh tích đại thể, bệnh tích

vi thể và cuối cùng là phương pháp phân lập MH

Trần Thị Dân và ctv (2005) đã xác định tuổi nhiễm MH ở trại chăn nuôi heo bằng cách phân lập và kiểm tra PCR

Nguyễn Thành Lâm (2005) đã khảo sát bệnh tích trên phổi và ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện MH trên heo thịt được đưa đến xí nghiệp Nam Phong

Nguyễn Thị Phước Ninh và ctv (2006) đã dùng môi trường thạch Friis’ và kỹ thuật PCR để phân lập MH trên mẫu phổi heo bị nhục hóa Ngoài ra những vi khuẩn khác cũng phân lập được trong 80 mẫu phổi nhục hóa là: Staphylococcus spp., E coli, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica và Actinobacillus pleuropneumoniae

Võ Thị Hoàng Sang (2006) đã phân lập MH và ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định MH trên heo thịt tại xí nghiệp Nam Phong

Hoàng Văn Đức (2008) đã phân lập và ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện

MH trên phổi heo thịt tại một trại chăn nuôi công nghiệp ở Đồng Nai

Huỳnh Lê Ngọc Diễm (2008) đã phân lập và ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định MH, so sánh mức độ gây bệnh của MH trên heo cai sữa và heo thịt

Nguyễn Ngọc Hoa Xuân (2009) đã chẩn đoán bệnh do Mycoplasma

hyopneumoniae dựa vào bệnh tích đại thể, phân lập và kết hợp với kỹ thuật PCR trên phổi heo thịt có bệnh tích nghi ngờ được giết mổ tại xí nghiệp Nam Phong

So với các nghiên cứu về MH từ 2003 đến 2009, chúng tôi có thêm việc tiến hành gây bệnh thực nghiệm trên heo bằng những chủng MH phân lập và định danh được để xác định khả năng gây bệnh và góp phần đánh giá các phương pháp chẩn đoán MH trong phòng thí nghiệm

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 Thời gian và địa điểm

3.2 Đối tượng nghiên cứu

Phổi heo thịt có bệnh tích nghi ngờ do MH qua bệnh tích đại thể

Heo thử nghiệm 50 ngày tuổi, gây bệnh bằng gốc MH đã phân lập và định danh được Nguồn heo được lấy từ một hộ chăn nuôi gia đình nhỏ ở huyện Bình Chánh, Tp HCM Heo chưa từng điều trị kháng sinh, không tiêm phòng vaccine

MH (heo mẹ cũng không tiêm phòng vaccine MH), và đã được lấy máu làm ELISA cho kết quả âm tính với MH trước khi đem về nuôi thử nghiệm

3.3 Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm

3.3.1 Dụng cụ

Dụng cụ thu thập mẫu: bao nylon sạch, thùng đá, đá khô, kéo vô trùng, bút ký hiệu mẫu

Dụng cụ xử lý, phân lập tại phòng thí nghiệm: kéo, nhíp vô trùng, cốc thủy tinh

1000 ml, 2 cốc thủy tinh 100 ml, ống nghiệm vô trùng, bao nylon sạch, bao nylon

chịu nhiệt, khay đựng mẫu vô trùng, pipet, đầu côn, máy vortex, bếp từ, bình đựng mẫu nuôi cấy, tủ ấm

Dụng cụ làm phản ứng PCR: pipet, đầu côn, eppendorf, máy vortex, tủ sấy, máy PCR, bồn điện di

Dụng cụ mổ khám: dao mổ, kéo, nhíp

3.3.2 Vật liệu

Phổi heo, nước cất 2 lần

Hóa chất dùng trong nuôi cấy: huyết thanh heo, chất chiết từ nấm men (yeast extract), phenol red, dung dịch đệm PBS

Hóa chất dùng trong ly trích DNA: buffer A, SDS 20 %, proteinasek, phenol, chloroform, isoamyl alcohol, ethanol, natri acetate

Hóa chất dùng trong PCR: mồi, buffer, MgCl2, dNTP, Taq, nước tinh sạch

3.4 Nội dung

Đánh giá mức độ tổn thương, điểm bệnh tích của phổi có bệnh tích nghi do

MH qua bệnh tích đại thể

Phân lập và định danh MH từ mẫu phổi nghi bệnh bằng môi trường Friis’ và

kỹ thuật PCR, thử phản ứng sinh hóa từ các chủng MH đã phân lập và định danh được

Đánh giá khả năng gây bệnh của MH bằng những gốc MH đã phân lập và định danh được

3.5 Phương pháp tiến hành

Phổi Đánh giá bệnh tích đại thể

Bệnh tích nghi ngờ do MH

Phân lập MH

Môi trường Friis’

Khuẩn lạc nghi ngờ Canh đổi màu vàng PCR

Định danh MH

Nuôi heo thử nghiệm Thử phản ứng sinh hóa

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 3.5.1 Bố trí lấy mẫu

Bảng 3.1 Bố trí lấy mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ

3.5.2 Đánh giá mức độ tổn thương của phổi

Sau khi heo bị giết mổ, phổi được lấy ra và treo trên giá Chúng tôi tiến hành quan sát toàn bộ phổi, sau đó quan sát từng thùy phổi, kiểm tra sự tổn thương dựa

vào bệnh tích, màu sắc, kích thước, bề mặt cắt của mô phổi

3.5.2.1 Đánh giá mức độ tổn thương trên phổi không đặc trưng cho MH theo công thức Christensen (1999) (Christensen, 1999)

Tỷ lệ (%) tổn thương được cho điểm từ 0 - 100 cho điểm trung bình trên từng thùy Tính tỷ lệ (%) tổn thương phổi trái và phổi phải sau cùng tính trung bình tổn thương cho toàn phổi

Tỷ lệ tổn thương trung bình của thùy phổi (%) = ∑ phần trăm bệnh tích trên thùyphổi/ ∑ phổi đánh giá

Tỷ lệ tổn thương phổi trái Pt = (Đt × 5)+(Gt×6)+(Ht×29)/ 40

Tỷ lệ tổn thương phổi phải Pp = (Đp × 11)+(Gp × 10)+(Hp × 34)+(Tp × 5)/ 60

Tỷ lệ tổn thương toàn phổi = (Pt × 40)+(Pp × 60)/ 100

Đt: Tỷ lệ tổn thương thùy đỉnh trái Gt: Tỷ lệ tổn thương thùy giữa trái Ht: Tỷ lệ tổn thương thùy hoành cách mô trái Pt: Tỷ lệ tổn thương cả phổi trái

Đp: Tỷ lệ tổn thương thùy đỉnh phải Gp: Tỷ lệ tổn thương thùy giữa phải Hp: Tỷ lệ tổn thương thùy hoành cách mô phải Tp: Tỷ lệ tổn thương thùy phụ

Pp: Tỷ lệ tổn thương phổi phải

3.5.2.2 Đánh giá cho điểm bệnh tích nghi ngờ MH

Theo Rice (2000) đánh giá điểm bệnh tích trên phổi có tính định hướng MH được tiến hành cho điểm từ 0 - 4 Cho điểm bệnh tích trên từng thùy phổi, sau cùng tính điểm cho tất cả các phổi đánh giá và cho điểm tối đa là 28 trên 7 thùy phổi của từng phổi

Điểm 0: Không có bệnh tích

Điểm 1: Bệnh tích bao phủ trên bề mặt phổi nhỏ hơn 25 %

Điểm 2: Bệnh tích bao phủ trên bề mặt phổi chiếm 25 - 50 %

Điểm 3: Bệnh tích bao phủ trên bề mặt phổi chiếm 50 - 75 %

Điểm 4: Bệnh tích bao phủ trên bề mặt phổi chiếm trên 75 %

Bệnh tích đại thể nghi ngờ MH dựa vào những biểu hiện như: Bệnh tích hiện diện (hóa gan, nhục hóa, tụy tạng) 2 bên phổi ở thùy đỉnh, thùy tim, phần trước thùy hoành cách mô và thùy phụ Bệnh tích thể cấp tính phổi có màu hồng, phù; thể mãn tính phổi có màu đỏ sậm đến xám, phổi xẹp có sự phân ranh giới rõ ràng giữa vùng bệnh tích và phổi bình thường Hạch lympho phế quản và hạch lympho màng trung thất sưng lớn

3.5.3 Phân lập MH từ mẫu phổi nghi bệnh

5 - 10 % CO2 tiếp tục cấy chuyển qua 2-4lần

đó bằng cách: lấy kéo cắt phần phổi mang bệnh tích đặc trưng (lấy cả phần diện tích xung quanh tiếp giáp với phần phổi mang bệnh tích đó), cho mỗi phổi vào một bao

Định danh

Nghi ngờ