Phân lập định danh chủng vi khuẩn và ứng dụng sản xuất lên men đạu nành nhằm thu nhận enzyme nattokinase giảm hiên tượng máu đông

Phương pháp tách chiết thu dịch enzyme thôCho 40 ml nước cất hấp khử trùng vào mẫu đậu sau lên men Lắc 200 rpm/1 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng Ly tâm tốc độ 10000 rpm / 1 phút trong15 p

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP - ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN VÀ

ỨNG DỤNG SẢN XUẤT LÊN MEN ĐẬU NÀNH

NHẰM THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE

GIẢM HIỆN TƯỢNG MÁU ĐÔNGGiáo viên hướng dẫn: TS Hoàng Quốc Khánh

HVCH Ngô Đức Duy Sinh viên thực hiện: Huỳnh Nguyễn Ngọc Ngân

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Tác dụng

Phòng chống bệnh cảm cúm, ngộ độc thức

ăn (kiết

lỵ, tiêu chảy cấp ).

Làm chắc xương, tiêu diệt

vi trùng gây bệnh.

Phân giải sợi fibrin trong máu làm tan máu đông.

NỘI DUNG

TỔNG QUAN TÀI LIỆU VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4

PHẦN

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Đậu nành

Nguồn gốc

Phân loại

Giá trị kinh tế

Natto và Enzyme Nattokinase

Tác dụng của enzyme

Nattokinase

Cơ chế làm tan huyết khối của NattokinaseEnzyme Nattokinse

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Đối tượng nghiên cứu

Okame Kokusan Chu-Tsubu Okame Gokuko Tsubu Mini Mizkan Kinno Tsubu

Nguồn mẫu

Cấy trãi trên môi trường MRS

Nuôi ủ ở 37 0 C trong 24 - 48 giờ.

Quan sát, chọn lọc khuẩn lạc riêng rẽ và làm thuần giống

Ly trích và thu nhận DNA Nhân bản đoạn gene bằng phương pháp PCR.

Lên men đậu nành.

Thu dịch enzyme thô.

Định tính protease và thử khả

năng tan huyết khối của dịch

Quy trình thực hiện thí nghiệm

Sản phẩm

Nhuộm Gram Nhuộm Bào tử

Phương pháp phân lập

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Định danh bằng sinh học phân tử

Tách chiết DNA

Nhân bản vùng gene

16s rRNAGiải trình tự gene

So sánh trình tự trên ngân hàng gene NCBIDựng cây phát sinh

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Tách chiết và thu nhận DNA

Thu sinh

khối vi

khuẩn

Thêm 800 - 900μl CTAB

Ủ ở -80 0 C trong 60 phút

Ủ 65 0 C trong 45 phút

Ly tâm 14000 rpm/5phút/4 0 C Thu dịch nổi.

Thêm 500μl PCI (25:24:1)

Thêm 500μl isopropanol (1:1)

Ly tâm 14000 rpm/5phút/4 0 C

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Khuếch đại gene (Polymerase Chain Reaction – PCR)

720C trong 10 phút

Thành phần phản ứng Mater mix 12 µl

Phương pháp lên men đậu nành

Phương pháp tách chiết thu dịch enzyme thô

Cho 40 ml nước cất

hấp khử trùng vào

mẫu đậu sau lên men

Lắc 200 rpm/1 giờ ở điều kiện nhiệt độ

phòng

Ly tâm tốc độ 10000 rpm / 1 phút trong15

phút

Chiết lấy dịch lỏng chứa enzymeBảo quản lạnh

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp khoan lỗ thạch

Chuẩn bị các đĩa

petri chứa môi

trường Skim Milk

Dùng khoan khoan

lỗ trên đĩa thạch

Hút 100 μl dịch enzyme thô vào lỗ

thạch

Ủ 370C trong 24

giờ

Đo đường kính vòng phân giải

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp thử nghiệm khả năng tan huyết khối của dịch chiết enzyme

Cắt huyết lợn đông

thành khối nhỏ,

cho vào đĩa petri

Cân và ghi nhận lại số liệu

Cho vào 2ml dịch chiết enzyme (ở ba

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Kết quả li trích DNA

OKChu OGMi MiKi

Kết quả điện di DNA bộ gene trên gel agarose 1% trong 25 phút

KẾT QUẢ

Kết quả nhân bản đoạn gene (PCR)

Thang OKChu MiKi OGMi

Kết quả nhân bản vùng gene các chủng vi khuẩn trên gel agarose 1%

1000 bp

KẾT QUẢ

Cây phát sinh loài

Staphylococcus hominis strain BUR16B3

Staphylococcus hominis partial

Staphylococcus hominis strain K23

Staphylococcus hominis strain CAU6562

Bacterium UKR A11 Bacterium CulalenE36

OKChu

OGMi

Staphylococcus hominis strain CKT-105

Staphylococcus hominis strain F-39

59 43

65

5

KẾT QUẢ

Kết quả so sánh vùng gene trên ngân hàng dữ liệu gene NCBI

OKChu Staphylococcus hominis strain K23 (89%)Staphylococcus hominis strain BUR16B3 (99%)

Staphylococcus hominis partial (99%)

MiKi Staphylococcus hominis strain CAU6562 (99%)Bacterium UKR A11 (89%)

Bacterium CulalenE36 (90%)

KẾT QUẢ

Kết quả thử nghiệm sinh hóa

Thử nghiệm Urease: dương tính

Môi trường chuyển từ màu vàng

cam sang màu hồng cánh sen

Thử nghiệm Catalase: dương tính

Xuất hiện bọt khí

KẾT QUẢ

Kết quả thử nghiệm sinh hóa

Thử nghiệm Oxidase: âm tính

Không đổi màu

Kết quả định tính protease theo phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường Skim milk 1%

Kết quả định tính Enzyme dựa vào khả năng tan huyết khối lợn

 Kết quả thử nghiệm tan huyết khối lợn của dịch chiết enzyme thu từ mẫu đậu ủ trong 24 giờ

Tên mẫu Nồng độ Khối lượng huyết ban

đầu

Khối lượng huyết sau ủ (4 giờ)

Khối lượng huyết tan

 Kết quả thử nghiệm tan huyết khối lợn của dịch chiết enzyme thu từ mẫu

đậu ủ trong 48 giờ

Tên mẫu Nồng độ Khối lượng huyết ban

đầu

Khối lượng huyết sau ủ(4 giờ)

Khối lượng huyết tan

 Kết quả thử nghiệm tan huyết khối lợn của dịch chiết enzyme thu từ mẫu

đậu ủ trong 72 giờ

Tên mẫu Nồng độ Khối lượng huyết ban

đầu

Khối lượng huyết sau ủ (4 giờ)

Khối lượng huyết tan

 Sơ đồ làm tan huyết khối của dịch chiết enzyme các chủng OKChu, OGMi

và MiKi ở ba hệ số pha loãng nồng độ (10 0 , 10 -1 và 10 -2 )

KẾT QUẢ

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

• Từ 3 mẫu Natto Nhật Bản đã phân lập, làm thuần và chọn lọc được 3 chủng OKChu, OGMi và MiKi Quan sát hình thái khuẩn lạc nhận thấy cả 3 chủng vi khuẩn đều có hình tròn, lồi, bề mặt khuẩn lạc trơn và màu trắng đục Quan sát hình nhuộm Gram dưới kính hiển vị ở độ phóng đại 100X, cả 3 chủng vi khuẩn đều bắt màu tím, Gram dương, nhỏ, hình cầu, đứng đơn lẻ, tụ lại tạo thành chùm hoặc chuỗi Kết hợp với kết quả hình thái học của khuẩn lạc và hình nhuộm Gram và hình nhuộm bào tử có thể kết luận sơ bộ rằng 3 chủng vi khuẩn phân lập được có khả năng thuộc chi Staphylococcus

• Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gene DNA đều tốt

• Kết quả PCR cho thấy cả 3 chủng vi khuẩn đều có vạch nằm tương đương vị trí

1000 bp

• Dựa vào kết quả thu nhận bộ gene DNA và nhân bản vùng gene của 3 chủng OGMi, OKChu và MiKi cùng với so sánh các dữ liệu gene của các chủng trên ngân hàng gen NCBI cho kết quả là: chủng OGMi có mức độ tương đồng với loài Staphylococcus hominis strain CKT-105 là 100%, chủng OKChu có mức độ tương đồng với loài Staphylococcus hominis strain BUR16B3 là 99% và chủng MiKi có

• Từ các kết quả thu được cho thấy loài Staphylococcus hominis có thể có khả năng phân giải sợi fibrin làm tan huyết khối đông.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kiến nghị

 Do lượng thời gian có giới hạn nên quá trình nghiên cứu vẫn còn một số vấn đề chưa được thực hiện Cần thực hiện thêm một số khảo sát:

+ Xây dựng quy trình sản xuất Natto

+ Tinh sạch enzyme Nattokinase

+ Nâng cao các phương pháp thử nghiệm hoạt tính enzyme Nattokinase