KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VIRÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VIRÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HỒ HUỲNH MAI KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VIRÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 102009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HỒ HUỲNH MAI KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VIRÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.62.50 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN 2. TS. HỒ THỊ KIM HOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 102009 i KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VIRÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG HỒ HUỲNH MAI Hội đồng chấm luận văn: 1. Chủ tịch: 2. Thư ký: 3. Phản biện 1: 4. Phản biện 2: 5. Ủy viên: ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HIỆU TRƯỞNG ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên: Hồ Huỳnh Mai, sinh ngày 15 tháng 12 năm 1974, tại huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang. Con của Ông Hồ Văn Dư và Bà Phạm Thị Loan. Tốt nghiệp Trung học phổ thông tại Trường Trung học phổ thông Mỹ Phước Tây, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang, năm 1992. Tốt nghiệp Đại học ngành Thú y hệ tại chức tại Đại học Nông lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Sau đó làm việc tại Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang. Tháng 92005 theo học Cao học ngành Thú y tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh. Tình trạng gia đình: độc thân. Điạ chỉ liên lạc: 133 Lý Thường Kiệt, phường 5, TP. Mỹ Tho, Tiền Giang. Điện thoại: 0919213371 Email: hhmai2005gmail.com iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác; đồng thời trong luận văn có sử dụng một phần kết quả của đề tài nghiên cứu khoa học và công nghệ cấp Bộ (đã được Chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng kết quả này trong luận văn). Người cam đoan Hồ Huỳnh Mai iv LỜI CẢM TẠ Chân thành cám ơn PGS.TS TRẦN THỊ DÂN TS. HỒ THỊ KIM HOA Đã giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong việc thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Cảm ơn tất cả quý thầy cô Khoa Chăn nuôi Thú y, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu. Chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang, các bạn đồng nghiệp đã nhiệt tình hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học và đề tài nghiên cứu này. v TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trên heo giết mổ dương tính dịch tả heo, xác định nhóm di truyền của virút dịch tả heo tại Tiền Giang” được thực hiện từ tháng 032007 đến tháng 022008. Khảo sát trên 3.438 heo đưa vào các lò mổ của huyện Chợ Gạo và thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang với phương pháp chẩn đoán lâm sàng, tổ chức lấy mẫu, xét nghiệm để chẩn đoán vi thể và cận lâm sàng bằng các kỹ thuật của phòng thí nghiệm (ELISA, cắt mẫu vi thể, RTPCR) chúng tôi có kết quả như sau: 1. Trên lâm sàng, tần suất da xuất huyết chiếm tỷ lệ cao (63,75%) ở heo nghi bệnh dịch tả. 2. Xét nghiệm mẫu lách của heo có biểu hiện nghi bệnh dịch tả bằng kỹ thuật ELISA, tỷ lệ dương tính với kháng nguyên E2 của virút DTH chiếm 29,17%. 3. Biểu hiện đặc trưng ở heo dương tính với kháng nguyên E2 của virút DTH bao gồm: da xuất huyết điểm (64,29%), viêm kết mạc mắt (52,86%); van hồi manh tràng loét hình cúc áo (77,14%), hạch màng treo ruột xuất huyết (61,43%), thận xuất huyết (60%), lách nhồi huyết (42,86%). Các bệnh tích vi thể hiện diện với tần suất cao là hạch màng treo ruột xuất huyết rìa (77,5%), thận xuất huyết vùng tuỷ (77,5%), xuất huyết tiểu thể Malpighi (75%), hư hại vỏ bao thận (72,5%) và lách hư hại mô bạch huyết (67,5%) cùng với nhồi huyết và xuất huyết (62,5%). 4. Các chủng virút DTH thực địa ở Tiền Giang thuộc nhóm 2 với phân nhóm 2.1 và 2.2, có mối quan hệ gần với các chủng virút DTH đang lưu hành ở Việt Nam (mức độ tương đồng từ 92,62% đến 99,47%). Trong khi đó, chủng virút DTH trong vắcxin (GenBank) lại thuộc nhóm 1 với phân nhóm 1.1. vi SUMMARY Title: “Surveying clinical signs and lesions in slaughtered pigs positive to Classical Swine Fever virus (CSFV), and defining genetic groups of CSF virus in Tien Giang province” The aim of this study was to observe the clinical signs and lesions in pigs at some slaughterhouses in Tien Giang province, which were positive to ELISA test for the classical swine fever virus. In addition, phylogenetic analysis of the E2gene fragment isolated from the samples by RTPCR was conducted. The observation was carried out in 3,438 pigs slaughtered at four slaughterhouses in Tien Giang province since March 2007 to February 2008. The results of clinical diagnosis and laboratory examination (ELISA, microscopic section, RTPCR) were summarized as followed. 1. Pigs of suspectedCSF signs showed skin haemorrhage at high rate (63.75%). 2. Only 29.17% pigs of suspectedCSF were positive to E2 antigen of CSF virus by ELISA. 3. The typical lesions of the positive pigs included skin haemorrhage (64.29%), conjunctivitis (52.86%), ulcers in the large intestine (77.14%), haemorrhage in the mesentery lymph nodes (61.43%), haemorrhage in kidneys (60%), infarcts in the spleen (42.86%), haemorrhage in the kidney inner (77.5%), haemorrhage in Malpighi (75%), degeneration of kidney envelope (72.5%), and damage of lymph tissue of spleen (67.5%). 4. All CSF virus strains detected in Tien Giang in this study belonged to genogroup 2 (subgroup 2.1 and 2.2), which had close relation to the strains detected in other provinces in Viet Nam (homology levels of 92.62% to 99.47%), and were distantly clustered from the vaccine strains (which belong to subgroup 1.1). vii MỤC LỤC Trang tựa Trang chuẩn y ........................................................................................................... i Lý lịch cá nhân ........................................................................................................ ii Lời cam đoan ........................................................................................................... iii Cảm tạ ..................................................................................................................... iv Tóm tắt .................................................................................................................... v Summary .................................................................................................................. vi Mục lục .................................................................................................................... vii Danh sách các chữ viết tắt ....................................................................................... x Danh sách các hình và sơ đồ .................................................................................... xi Danh sách các bảng ................................................................................................. xii Chương 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu ....................................................................................................... 2 1.3 Yêu cầu .......................................................................................................... 2 Chương 2. TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 2.1 Đặc điểm sinh học của virút DTH ............................................................... 3 2.1.1 Lịch sử phát hiện ................................................................................... 3 2.1.2 Phân loại ................................................................................................ 3 2.1.3 Đặc điểm cấu tạo và phân bố nhóm virút DTH ................................... 5 2.1.3.1 Đặc điểm hình thái ......................................................................... 5 2.1.3.2 Cấu tạo và chức năng các protein của virút DTH ......................... 5 2.1.3.3 Phân bố .......................................................................................... 7 2.1.4 Độc lực của virút DTH .......................................................................... 10 2.2 Đường xâm nhập và cơ chế sinh bệnh của virút DTH trong cơ thể vật chủ 10 2.3 Dấu hiệu lâm sàng bệnh DTH ...................................................................... 11 2.3.1 Nhiễm sau khi sinh ................................................................................ 11 Trang viii 2.3.2 Nhiễm trước khi sinh và phát bệnh muộn ............................................. 12 2.4 Bệnh tích ....................................................................................................... 13 2.4.1 Bệnh tích đại thể .................................................................................... 13 2.4.2 Bệnh tích vi thể ..................................................................................... 14 2.5 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh DTH trong phòng thí nghiệm ........... 14 2.5.1 Phân lập virút DTH trên tế bào nuôi cấy ............................................. 15 2.5.2 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang (FAT fluorescent antibody test) ...... 16 2.5.3 Kỹ thuật miễn dịch peroxidase (Imunoperoxidase) .............................. 16 2.5.4 Kỹ thuật ELISA (Enzyme linked imunosorbent assay) ........................ 16 2.5.4.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên ...................................... 16 2.5.4.2 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể ............................................. 17 2.5.5 Kỹ thuật trung hòa virút (Virus neutralization test) ............................. 17 2.5.6 Kỹ thuật RT PCR ................................................................................ 18 2.6 Vắcxin phòng chống bệnh DTH .................................................................. 21 Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................ 22 3.1 Thời gian và địa điểm ................................................................................... 22 3.2 Nội dung và phương pháp thực hiện ............................................................. 22 3.2.1 Đối tượng khảo sát và trình tự nội dung thực hiện ................................ 22 3.2.2 Chỉ tiêu khảo sát .................................................................................... 23 3.2.3 Cách tiến hành ....................................................................................... 23 3.3 Xử lý số liệu .................................................................................................. 28 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 29 4.1 Biểu hiện lâm sàng trên heo nghi bệnh DTH ................................................ 29 4.2 Sự hiện diện của kháng nguyên E2 trong lách heo nghi bệnh ....................... 30 4.3 Biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trên heo dương tính E2 ............................. 30 4.3.1 Biểu hiện lâm sàng trên heo dương tính E2 ............................................ 31 4.3.2 Bệnh tích đại thể trên heo dương tính E2 ............................................... 34 4.3.3 Các dạng bệnh tích vi thể trên heo dương tính E2 .................................. 38 4.3.3.1 Các dạng bệnh tích vi thể trên thận ................................................. 39 ix 4.3.3.2 Các dạng bệnh tích vi thể trên lách ................................................. 40 4.3.3.3 Các dạng bệnh tích vi thể trên hạch màng treo ruột ....................... 41 4.4 Định trình tự chuỗi nucleotide từ gien E2 của virút DTH .......................... 42 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 48 5.1 Kết luận .......................................................................................................... 48 5.2 Đề nghị........................................................................................................... 49 Tài liệu tham khảo ................................................................................................... 50 Phụ lục ..................................................................................................................... 57 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt BVDV Bovine viral diarrhoea virus Virút gây bệnh tiêu chảy bò BDV Border disease virus Virút gây bệnh Border ở cừu CPE Cytopathic effect Bệnh tích tế bào CSFV Classical swine fever virus Virút gây bệnh dịch tả heo cổ điển DTH Dịch tả heo ELISA Enzyme linked immunosorbent assay Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn kết với enzym FAT Flourescent antibody test Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang kDa Kilo Dalton NCBI National Center for Biotechnology Information Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ Sinh học (Hoa Kỳ) nt Nucleotide OD Optical density Mật độ quang học ORF Open reading frame Khung đọc mở PK15 Pig kidney Tế bào thận heo RNA Ribonucleic acid Axít nhân RNA RTPCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi khuếch đại gen phiên mã ngược TCID50 Tissue culture infectious doses 50 Liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy NTR Nontranslated region Vùng không mã hoá xi DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 2.1: Mối quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Pestivirus dựa trên chuỗi trình tự của gien Npro....................................................................... 4 Hình 2.2: Cấu trúc bộ gien và hình thái của virút DTH ......................................... 5 Hình 2.3: Cây di truyền thể hiện mối quan hệ giữa 3 nhóm chính của virút DTH và các nhóm phụ của chúng dựa trên gien E2 ...................... 8 Hình 2.4: Cây di truyền của một số chủng virút DTH ở Việt Nam và khu vực khi phân tích đoạn gien E2 của chúng ...................................................... 9 Hình 2.5: ELISA “kẹp chả” .................................................................................... 17 Hình 2.6: Qui trình RT PCR ................................................................................. 19 Hình 4.1: Viêm kết mạc mắt (heo dương tính E2) ................................................. 32 Hình 4.2: Xuất huyết da (vùng tai) ......................................................................... 32 Hình 4.3: Lách nhồi huyết ...................................................................................... 37 Hình 4.4: Thận xuất huyết (vùng vỏ và vùng tuỷ) .................................................. 37 Hình 4.5: Hạch màng treo ruột xuất huyết ............................................................. 38 Hình 4.6: Nốt loét ở van hồi manh tràng, ruột loét hình cúc áo ............................. 38 Hình 4.7: Thận xuất huyết với nhiều hồng cầu trong tiểu thể Malpighi ................. 40 Hình 4.8: Lách nhồi huyết, hồng cầu tụ thành đám lớn dưới vỏ bao lách ............. 41 Hình 4.9: Hạch xuất huyết ở rìa, nốt bạch huyết suy giảm .................................... 42 Hình 4.10: Cây di truyền vùng biến động (190 nt) của gien E2 ............................ 45 Sơ đồ 3.1: Trình tự nội dung khảo sát và phân tích mẫu ......................................... 23 xii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các kỹ thuật thường sử dụng để chẩn đoán bệnh DTH ......................... 15 Bảng 2.2: So sánh các đặc tính của các kỹ thuật chẩn đoán dùng để phát hiện virút và các thành phần của virút DTH .................................. 19 Bảng 2.3: Các loại vắcxin DTH được phép lưu hành ở Việt Nam ...................... 21 Bảng 3.1: Phân bố mẫu thu thập ............................................................................. 22 Bảng 3.2: Các chủng virút DTH tham chiếu từ Việt Nam ................................... 26 Bảng 3.3: Các chủng virút DTH tham khảo trên thế giới ....................................... 27 Bảng 4.1: Tần suất các biểu hiện lâm sàng trên heo nghi bệnh DTH ..................... 29 Bảng 4.2: Tần suất các biểu hiện lâm sàng ở heo dương tính E2 ........................... 31 Bảng 4.3: Phân bố của biểu hiện lâm sàng ghép trên heo dương tính E2 ............... 34 Bảng 4.4: Tần suất ghép 2 biểu hiện lâm sàng của heo dương tính E2 ................... 34 Bảng 4.5: Tỷ lệ của các bệnh tích đại thể ở các cơ quan nội tạng trên heo dương tính E2 ........................................................................... 35 Bảng 4.6: Tỷ lệ các dạng bệnh tích vi thể trên thận ................................................ 39 Bảng 4.7: Tỷ lệ các dạng bệnh tích vi thể trên lách ................................................ 41 Bảng 4.8: Tỷ lệ các dạng bệnh tích vi thể trên hạch màng treo ruột ...................... 42 Bảng 4.9: Các chủng virút trong bệnh phẩm được giải trình tự vùng gien E2....... 42 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hơn 100 năm được biết đến, bệnh dịch tả heo (DTH) đã gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi của nhiều quốc gia trên thế giới, kể cả Việt Nam. Nếu trước những năm 60 của thế kỷ XX, bệnh DTH thường nổ ra ồ ạt, mãnh liệt thì hiện nay bệnh lại có tính chất âm ỉ, thầm lặng bởi các chủng virút độc lực thấp (Nguyễn Tiến Dũng và ctv, 2002). Đây cũng là nguyên nhân chính để giải thích sự thất bại của các chương trình kiểm soát bệnh DTH tại một số quốc gia (Terpstra, 1991). Kết quả chẩn đoán bệnh DTH của Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang bằng phương pháp ELISA cho thấy các mẫu bệnh phẩm từ heo có dấu hiệu đặc trưng của bệnh DTH vẫn có thể âm tính với bệnh này (Nguyễn Việt Nga và ctv, 2005). Chính vì thế, chẩn đoán dựa vào dịch tễ và lâm sàng bệnh DTH chỉ có giá trị khi kèm theo kết quả cận lâm sàng. Ngoài ra, sự phù hợp giữa kết quả cận lâm sàng và dấu hiệu lâm sàng cần được đánh giá lại sau một thời gian diễn biến thay đổi của bệnh. Bên cạnh đó, việc xác định chủng virút gây bệnh DTH có vai trò quyết định trong chương trình kiểm soát bởi lẽ chủng virút của vắcxin và chủng virút gây bệnh thực địa không phù hợp thì chiến lược tiêm phòng sẽ thất bại. Một số tác giả (Kim Văn Phúc và ctv, 2004; Hồ Thu Hương và ctv, 2004; Bùi Nghĩa Vượng và ctv, 2006; Nguyễn Thế Vinh và ctv, 2007) đã khảo sát về chủng virút DTH trên các mẫu từ Hà Tây, Nghệ An, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, TP. Cần Thơ, TP. Hải Phòng và TP. Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, cho đến nay ở Tiền Giang vẫn chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này. 2 Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang, dưới sự hướng dẫn của PSG.TS. Trần Thị Dân và TS. Hồ Thị Kim Hoa, chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trên heo giết mổ dương tính dịch tả heo, xác định nhóm di truyền của virút dịch tả heo tại Tiền Giang”. 1.2. Mục tiêu Xác định tần suất của triệu chứng và bệnh tích trên heo có kết quả ELISA dương tính với virút DTH để định hướng cho việc chẩn đoán lâm sàng. Xác định sự phân bố của các chủng virút DTH thực địa tại một số địa bàn tỉnh Tiền Giang. 1.3 Yêu cầu Ghi nhận triệu chứng và bệnh tích đại thể trên heo nghi ngờ bệnh DTH. Xét nghiệm kháng nguyên E2 bằng kỹ thuật ELISA từ mẫu lách của heo nghi ngờ bệnh dịch tả. Đánh giá bệnh tích vi thể trên lách, hạch màng treo ruột và thận của những heo có mẫu lách dương tính với kháng nguyên E2. Thực hiện RT PCR trên các mẫu lách dương tính với kháng nguyên E2 nhằm xác định trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gien E2, từ đó định nhóm di truyền của virút DTH dựa trên GenBank. 3 Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Đặc điểm sinh học của virút DTH 2.1.1 Lịch sử phát hiện Ở Hoa kỳ, năm 1810 có một bệnh giống như bệnh DTH được mô tả tại bang Tennesee. Đến năm 1833, bệnh DTH mới được báo cáo chính thức tại bang Ohio. Năm 1885, Salmon và Smith xác định căn bệnh này là do vi trùng. Mãi đến năm 1903, Dorset và Schweinitz đã khẳng định bệnh DTH là do virút với chứng minh huyễn dịch bệnh phẩm không có vi trùng nhưng vẫn gây bệnh DTH. Từ năm 1822 – 1862, có nhiều quốc gia ở Châu Âu xuất hiện bệnh DTH như Pháp (1822), Đức (1833), Anh (1862). Ngoài ra, bệnh DTH cũng được báo cáo ở Nam Mỹ (1899) và Nam Phi (1900) (dẫn liệu van Oirschot, 1999). Năm 1921, sau khi phát hiện bệnh DTH Châu Phi do một loại virút khác gây ra, các nhà khoa học đã sử dụng thuật ngữ “dịch tả heo cổ điển” (classical swine fever CSF) cho bệnh DTH của thế kỷ XIX nhằm phân biệt với DTH Châu Phi, cho đến nay thuật ngữ này vẫn còn được sử dụng (Lê Hồng Phong, 1999). 2.1.2 Phân loại Virút DTH (Classical swine fever virus – CSFV) thuộc giống Pestivirus, họ Flaviviridae. Họ Flaviviridae có 3 giống (Flavivirus, Hepacivirus và Pestivirus). Ngoài CSFV, giống Pestivirus có 2 loài khác là virút gây bệnh tiêu chảy bò (Bovine viral diarrhoea virus, BVDV type 1 và type 2) và virút gây bệnh Border ở cừu (Border disease virus – BDV) (Wengler và ctv, 1995; Becher và ctv, 2003) (Hình 2.1). 4 Hình 2.1: Mối quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Pestivirus dựa trên chuỗi trình tự của gien Npro (Becher và ctv, 2003) 4 5 2.1.3 Đặc điểm cấu tạo và phân bố nhóm virút DTH 2.1.3.1 Đặc điểm hình thái Virút DTH có hệ gien RNA chuỗi đơn, mạch dương, dài khoảng 12,3 kb; có vỏ bọc bên ngoài, đường kính 4050 nm, dạng hình cầu, đối xứng khối 20 mặt, có một nucleocapside đường kính 29 nm. Khối lượng phân tử khoảng 60 x 106 Da (Trần Đình Từ, 1999). 2.1.3.2 Cấu tạo và chức năng các protein của virút DTH Cấu tạo Phân tử RNA của virút DTH gồm vùng 5’ không mã hoá (5’ nontranslated region, 5’NTR), một khung đọc mở (open reading frame – ORF) và vùng 3’ không mã hóa (3’NTR). ORF mã hóa 1 polyprotein chứa khoảng 3.900 axít amin gồm 4 protein cấu trúc (C, protein của nucleocapsid; Erns (E0), E1 và E2, các glycoprotein vỏ) và 8 protein không cấu trúc (Npro, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) (Dong và Chen, 2007). Hình 2.2: Cấu trúc bộ gien và hình thái của virút DTH (Beer và ctv, 2007) protein cấu trúc Kháng thể lõi protein C võ võ mặt cắt siêu mỏng nhuộm bản âm 6 Các protein của virút DTH Erns, E1, E2 (vùng A1,2,3, B, C và D) là các glycoprotein của vỏ virút, mục tiêu của kháng thể trung hòa. Erns hay E0 (trước đây được gọi là gp4448) và E2 (trước đây được gọi là gp55) phân bố ở bề mặt ngoài virion tham gia vào việc kết dính và xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm. E0 có hoạt tính ribonuclease đối với uridine và có thể bị ức chế bởi ion kẽm (Dong và Cheng, 2007). Glycoprotein màng (transmembrane glycoprotein) E1 (gp33) tạo phức hợp với E2 (E1–E2 heterodimer) bằng cầu nối disulfide. Các nhánh kỵ nước của E1 vươn ra, đóng vai trò truyền các tín hiệu khởi đầu hay ngừng lại (stopbegintransfer signals) cho quá trình di chuyển E0, E1, E2 trong hệ thống võng nội chất (endoplasmic reticulum ER) của tế bào (Dong và Cheng, 2007). Glycoprotein E2 có thể được dùng phân biệt dịch tả heo và BVDV với BDV (van Oirschot, 1999). Npro (Nternimal protease) (còn gọi là p23) là một autoprotease duy nhất, chỉ có trong giống Pestivirus. Npro nhanh chóng tự cắt khỏi nucleocapsid protein C (p14). Protein p7 có kích thước nhỏ hiện diện ở hai dạng E2p7 và p7, được tìm thấy trong tế bào nhiễm virút, nhưng không thấy ở virion trưởng thành (Dong và Cheng, 2007). NS3 (p80) có 3 hoạt tính: serine proteinase (đầu N), RNA helicase và nucleoside triphosphatase (RNAstimulated NTPase) (đầu C) (Brown và ctv, 2002; Zhang và ctv, 2003). NS4A là một phosphoprotein, đồng yếu tố (cofactor) của serine proteinase NS3, cần cho sự phân tách NS4B5A và NS5A5B để phóng thích NS4A, NS4B, NS5A và NS5B. Cả hai, NS4B và NS5A, được cho rằng là những thành viên của nhóm replicase và protein NS5B là một RNA polymerase (RNAdependent RNA polymerase) (Dong và Cheng, 2007). Trong số các protein virút, E0 và E2 là hai kháng nguyên chủ yếu được dùng để sản xuất vắcxin (Dong và Cheng, 2007). Nghiên cứu của Konig và ctv (1995) cho thấy sau khi nhiễm virút, kháng thể kháng virút DTH được hình thành chống lại 2 protein cấu trúc Erns, E2 và protein không cấu trúc P80 (NS3). E2 có tính sinh miễn dịch cao nhất trong số các protein của CSFV. Hầu hết các kháng thể 7 trung hòa được sinh ra trong cơ thể vật chủ nhằm vào glycoprotein này. E2 còn là một yếu tố xác định độc lực (virulence determinant) của virút. Glycoprotein Erns (E0) là mục tiêu kế tiếp của các kháng thể trung hòa. Các nghiên cứu cho thấy Erns cũng góp phần xác định độc lực virút (Dong và Cheng, 2007). Uttenthal và ctv (2001) đã chứng minh, heo sau khi tiêm chủng vắcxin E2 hoặc Erns có thể được bảo hộ sau khi công cường độc virút DTH. Điều này không xảy ra ở vắcxin E1. Tác giả còn cho biết, kháng thể kháng Erns chỉ được phát hiện khi dùng kháng nguyên Erns tái tổ hợp. Do vậy, kỹ thuật ELISA được thiết kế không thể phát hiện kháng thể ở heo được tiêm chủng vắcxin Erns mà chỉ phát hiện kháng thể của heo nhiễm DTH tự nhiên hoặc heo đã chủng vắcxin thông dụng. 2.1.3.3 Phân bố Paton và ctv (2000a) đã vẽ các cây di truyền (phylogenetic tree) dựa trên phân tích các đoạn nucleotide của các gien mã hóa E2 (190 nt), NS5B (490 nt) và 5’ NTR (150 nt) từ nhiều chủng virút DTH. Kết quả cho thấy sự phân bố các chủng virút này trên cả 3 cây di truyền tương tự nhau. Cây di truyền được vẽ dựa vào phân tích đoạn nucleotide của gien mã hóa E2 (190 nt) từ 100 chủng virút DTH phân lập khắp nơi trên thế giới cho thấy các chủng virút này phân bố thành 3 nhóm chính, mỗi nhóm có 3 4 nhóm phụ (Hình 2.3). Các chủng virút phân lập từ Châu Âu vào những thập niên 19201970 thuộc nhóm 1, chủ yếu là nhóm phụ 1.1. Trong khi đó, các chủng ở Châu Âu phân lập trong những thập niên 19801990 thuộc nhóm 2. Tất cả những chủng vắcxin phân tích (Thái Lan, Hàn Quốc, Đức) đều thuốc nhóm phụ 1.1. Virút phân lập ở các quốc gia châu Á phân bố vào các nhóm khác nhau, tùy theo thời gian phân lập. Ví dụ, các chủng phân lập ở Thái Lan vào thập niên 1980 phân bố chủ yếu vào nhóm phụ 1.2, trong khi các chủng phân lập vào thập niên 1990 phân bố vào nhóm phụ 2.2 và 3.3. Tương tự, các chủng ở Maylaysia phân lập vào thập niên 1960 thuộc nhóm phụ 1.2, và phần lớn các chủng phân lập vào thập 8 niên 19801990 thuộc nhóm phụ 2.1. Nhóm 3 chủ yếu gồm các chủng virút phân lập ở Châu Á (Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật và Đài Loan). Hình 2.3: Cây di truyền thể hiện mối quan hệ giữa 3 nhóm chính của virút DTH và các nhóm phụ của chúng dựa trên gien E2 (Paton và ctv, 2000a) Nhóm phụ 2.2: Nhóm phụ 1.2: Chủng vắc xin Nhóm phụ 2.1: Nhóm phụ 1.3: Nhóm phụ 1.1: Chủng vắc xin Nhóm phụ 3.3: Nhóm phụ 3.4: Nhóm phụ 3.2: Nhóm phụ 3.1: Nhóm phụ 2.3: 9 Hình 2.4: Cây di truyền của một số chủng virút DTH ở Việt Nam và khu vực khi phân tích đoạn gien E2 của chúng (Nguyễn Thế Vinh và ctv, 2007) Kiểu gien 10 Kết quả phân tích của Nguyễn Thế Vinh và ctv (2007) cho thấy các chủng virút DHT phân lập ở Việt Nam, từ những heo có triệu chứng bệnh tích của bệnh thuộc nhóm phụ 2.1 và 2.2. Trong khi đó, phần lớn các chủng phân lập từ Thái Lan sử dụng trong nghiên cứu này thuộc nhóm 1 và 3. Đặc biệt, virút vắcxin chủng C và chủng GPE phân bố trong nhóm phụ 1.1. 2.1.4 Độc lực của virút DTH Nguyễn Tiến Dũng (2002) cho biết đến nay virút DTH chỉ có một loại kháng nguyên mặc dù các nhà nghiên cứu đã tìm ra sự khác biệt của một số chủng virút và phân chia chúng thành các nhóm khác nhau với độc lực khác nhau. Dựa vào độc lực của virút DTH, SzentIvanyi (1984) đã chia các chủng virút DTH thành hai nhóm. Nhóm 1 là các chủng cường độc như chủng Alfort, chủng Rovac, chủng ALD, chủng C. Nhóm 2 là các chủng độc lực thấp, chủ yếu gây rối loạn sinh sản như chủng 331 và nhiều chủng khác phân lập được từ những heo bị bệnh mãn tính. Sự khác nhau về độc lực của hai nhóm là yếu tố chính gây ra những dấu hiệu lâm sàng khác nhau trên các ca bệnh (Cheville và Mengeling, 1989; dẫn liệu của Too và Seneque, 2002). Bằng kỹ thuật huỳnh quang trực tiếp với một cặp kháng thể đơn dòng, có thể phân biệt được kháng nguyên virút DTH tự nhiên và virút DTH trong vắcxin ở heo sau 2 tuần tiêm phòng vắcxin DTH chủng C nhược độc (van Oirschot, 1999). Tốc độ lây lan của bệnh DTH sẽ thay đổi theo độc lực của virút. Tuy nhiên, vấn đề này còn chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như giống, tuổi, sự cạnh tranh miễn dịch và điều kiện dinh dưỡng (van Oirschot, 1999). 2.2 Đường xâm nhập và cơ chế sinh bệnh của virút DTH trong cơ thể vật chủ Virút DTH vào cơ thể chủ yếu qua đường tiêu hóa. Ngoài ra, virút còn có thể xâm nhập qua đường hô hấp, niêm mạc mắt, đường sinh dục. Các vết thương ở da cũng là đường xâm nhập của virút. Hạch amiđan là một trong những vị trí đầu tiên nơi virút nhân lên sau khi xâm nhập vào vật chủ. Trong điều kiện tự nhiên, 7 giờ sau khi xâm nhập vào cơ thể heo, virút vào hạch amiđan, hạch vùng hầu họng (đây là vị trí nhân lên đầu tiên). Mười sáu giờ 11 sau, virút vào hệ thống lâm ba rồi vào máu (trong các đại thực bào) gây ra hiện tượng máu nhiễm virút lần thứ nhất (dẫn liệu Trần Đình Từ, 1999). Theo hệ tuần hoàn, virút đến định vị, sinh sản và phá hủy những tế bào nội mạc mao mạch, những mảnh vỡ sẽ tụ lại thành vật tắc mạch, dẫn đến nhồi huyết ở lách, xuất huyết và hoại tử ở ruột. Năm đến sáu ngày sau khi nhiễm, máu nhiễm virút lần thứ hai xảy ra, lúc này xuất hiện những triệu chứng, số lượng virút trong máu sẽ đạt tối đa vào ngày thứ 7. Đa số heo bệnh cấp tính thường bị chết do rối loạn tuần hoàn nghiêm trọng. Sự suy giảm miễn dịch đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự phụ nhiễm vi sinh vật khác (Trần Thanh Phong, 1996). Như vậy, virút DTH có độc lực sẽ có mặt ở khắp các tổ chức, biểu mô sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ 5 6 ngày (van Oirschot, 1999). Ngoài ra, virút còn có thể tồn tại trong bạch cầu và đại thực bào gây ra sự lưu nhiễm dai dẳng. Trường hợp nhiễm trùng qua phôi thai trong tử cung, có thể không dẫn đến chết phôi nhưng dẫn đến hiện tượng dung nạp miễn dịch (Trần Thanh Phong, 1996). Một số chủng virút có độc lực yếu không gây bệnh lâm sàng cho heo trưởng thành mà chỉ gây bệnh cho bào thai heo, gây ra rối loạn sinh sản như hấp thụ phôi (phải phối lại), chết thai (thai gỗ, thai chết lưu), hoặc chết yểu, dạng này còn được gọi là DTH bẩm sinh (congential CSF) hay DTH phát muộn (late onset CSF) (Nguyễn Tiến Dũng, 2002). 2.3 Dấu hiệu lâm sàng bệnh DTH Tùy thuộc vào độc lực của virút và phản ứng của cơ thể heo mà bệnh DTH có các thể bệnh khác nhau. 2.3.1 Nhiễm sau khi sinh (1) Thể quá cấp Xuất hiện đột ngột không có triệu chứng ban đầu, heo đột nhiên sốt cao 41 42oC, phần da mỏng ửng đỏ, chết nhanh trong 24 đến 48 giờ (Trần Thanh Phong, 1996). 12 (2) Thể cấp tính Thường bắt đầu với vài heo có biểu hiện lờ đờ và kém ăn. Heo sốt 4142oC, táo bón, bỏ ăn, mệt mỏi, ủ rũ, ít vận động, nằm chồng chất lên nhau, số lượng bạch cầu giảm mạnh ( 72 giờ 8 giờ Giá thành Thấp Thấp Cao Trung bình Bước 1: biến tính Bước 2: bắt cặp Bước 3: kéo dài 20 Một số phương pháp chẩn đoán phân biệt giữa các loài thuộc giống Pestivirus Phản ứng trung hòa có thể dùng để phân biệt virút DTH và BVDV nhưng không thể phân biệt BVDV và BDV. Khi nuôi cấy tế bào, virút DTH không gây bệnh tích tế bào (CPE); trong khi đó, BDV có 1 nhóm gây CPE và nhóm còn lại không gây CPE. BDV thuộc nhóm CPE có cả protein P80 và P125, còn virút không gây CPE chỉ có P125 (Thiel và ctv, 1991). Để phân biệt trường hợp nhiễm virút DTH và BVDV trong máu, có thể dùng kỹ thuật ELISA cạnh tranh với kháng thể đơn dòng (Moennig, 1990). Chẩn đoán phát hiện bệnh do virút DTH ở Việt Nam Bùi Quang Anh và ctv (2000) thăm dò phát hiện kháng nguyên virút DTH trong đàn heo giết mổ và chăn nuôi tại một số tỉnh vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IF), phản ứng ELISA và phản ứng trung hòa trên thỏ. Kết quả dương tính đối với IF là 35% và ELISA là 33,5%, trung hòa trên thỏ 28%. Trần Thị Dân và ctv (2003) sử dụng xét nghiệm ELISA và ghi nhận heo âm tính P125 có dấu hiệu lâm sàng và bệnh tích gần giống heo dương tính P125. Lê Văn Hùng và ctv (2003) ứng dụng RTPCR để chẩn đoán DTH tại năm tỉnh thành phố ở phía Nam; kết quả cho thấy, nếu lấy mẫu trên những heo còn sống nghi DTH thì khi xét nghiệm chỉ có 361 mẫu dương tính chiếm 4,9%, trong khi mẫu được lấy từ những heo chết nghi DTH thì dương tính khá cao (57 mẫu dương tính chiếm 71,4%). Từ năm 20022003, Kamakawa và ctv đã tiến hành khảo sát bệnh DTH ở các đàn heo và các trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RTPCR khuếch đại đoạn gien 5’NTR. Kết quả cho thấy bệnh DTH hiện diện ở tất cả các trại khảo sát. Phạm Hồng Sơn (2004) sử dụng phản ứng ngăn trở hồng cầu gián tiếp trong việc phát hiện kháng nguyên dịch tả heo. Hồ Thu Hương và ctv (2004) so sánh 4 phương pháp chẩn đoán virút DTH (phân lập virút, phản ứng huỳnh quang kháng thể, phản ứng ELISA và RTPCR) từ mẫu được bảo quản ở các điều kiện khác nhau. Theo các tác giả, việc lựa chọn phương pháp chẩn đoán phải dựa vào chất lượng mẫu. Bùi Nghĩa Vượng và ctv 21 (2006) chẩn đoán bệnh DTH bằng phương pháp RTPCR với mẫu máu lấy bằng giấy thấm, tác giả chứng tỏ rằng có thể phát hiện được virút DTH từ các mẫu giấy thấm máu khô giữ ở 370C trong 10 tháng. Nguyễn Thế Vinh và ctv (2007) nghiên cứu phân tích di truyền virút DTH phân lập ở Việt Nam bằng cách phân tích đoạn gien E2 của 20 mẫu virút DTH và so sánh chúng với một số chủng đã được giới thiệu trên thế giới. Kết quả đưa ra là các chủng virút DTH thuộc nhóm 2 đang là tác nhân chính gây bệnh DTH ở Việt Nam. 2.6 Vắcxin phòng chống bệnh DTH Thông tin được ghi nhận từ thú y cơ sở cập nhật trong thời gian gần đây (2006 – 2007) cho thấy ở Tiền Giang vắcxin DTH được sử dụng phổ biến là vắcxin chủng C của Công ty Navetco (72,5%), kế đến là vắcxin của Công ty Merial, Pháp (17,5%), Công ty Fort Dodge Animal Health của Brazil (7,5%). Các loại vắcxin khác chỉ chiếm tỷ lệ 2,5%. Theo khảo sát của Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE, 2003), virút DTH chủng C được sử dụng làm vắcxin nhiều nhất. Chủng này không phát hiện trong cơ thể heo sau khi tiêm vắcxin 2 – 3 tuần. Bảng 2.3: Các loại vắcxin DTH được phép lưu hành ở Việt Nam STT Tên vắcxin Chủng virút Nhà sản xuất 1 Dịch tả lợn C Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương 2 Dịch tả lợn C Phân viện Thú y miền Trung 3 Dịch tả heo C Công ty thuốc thú y Trung ương II 4 Porcillis Pesti C Công ty Intervet Hà Lan 5 Porcillis CSF live GPE Công ty Intervet Ấn Độ 6 HC Vac (Hog cholera vaccin) C Công ty Korea Microbiological Lab. Hàn Quốc 7 Pest – Vac C Công ty Fort Dodge Animal Health – Brazil 8 Cholera Vac® C Công ty Pfizer – Croatia 9 Live Hog Cholera Vaccine C Công ty Katasato Institute Nhật 10 Pestiffa C Công ty Merial – Pháp 11 Coglapest Thiverval Công ty Cevasante Animale – Pháp 12 Suigen Swine Fever C Công ty Virbac – Pháp 13 BSLHC GPE Công ty Bestar Laboratories – Singapore (Theo Quyết định số 042006QĐBNN ngày 12012006 của Bộ Nông nghiệpPTNT) 22 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm Thời gian khảo sát từ tháng 32007 đến 22008. Khảo sát được thực hiện tại 4 cơ sở giết mổ heo (lò mổ) thuộc địa bàn thành phố Mỹ Tho và huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang. Việc phân tích mẫu được thực hiện tại Phòng Xét nghiệm của Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang, Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và Bệnh xá Thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Các mẫu cần được giải trình tự nucleotide được gửi đến Công ty Nam Khoa, TP. Hồ Chí Minh. 3.2 Nội dung và phương pháp thực hiện 3.2.1 Đối tượng khảo sát và trình tự nội dung thực hiện Tất cả những heo được đưa đến lò mổ để hạ thịt, tập trung khảo sát heo có một trong các biểu hiện lâm sàng nghi ngờ bệnh dịch tả. Heo nghi ngờ bệnh DTH (heo bệnh) có một trong các biểu hiện lâm sàng: da xuất huyết, viêm kết mạc mắt, gầy ốm, đi đứng xiêu vẹo. Một số heo nghi ngờ bệnh tại các lò mổ được lấy mẫu (lách, hạch màng treo ruột và thận). Phân bố mẫu thu thập được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1: Phân bố mẫu thu thập Địa điểm Lò mổ gia súc Số bộ mẫu Thành phố Mỹ Tho Xã Tân Mỹ Chánh 60 Phường 10 60 Huyện Chợ Gạo Thị trấn Chợ Gạo 60 Xã Long Bình Điền 60 Tổng số bộ mẫu 240 23 Sơ đồ 3.1: Trình tự nội dung khảo sát và phân tích mẫu Ghi chú: (): chỉ xét nghiệm vi thể các mẫu hạch ruột, thận khi mẫu lách dương tính với ELISA. 3.2.2 Chỉ tiêu khảo sát Các chỉ tiêu khảo sát gồm có: (1) tần suất heo dương tính với kháng nguyên E2 của virút DTH (gọi tắt là dương tính E2) bằng kỹ thuật ELISA (2) tần suất heo dương tính E2 phân tích theo triệu chứng và bệnh tích (đại thể và vi thể) (3) sự thay đổi trình tự nucleotide của sản phẩm RTPCR thuộc gien E2 (190 nt) 3.2.3 Cách tiến hành 3.2.3.1 Ghi nhận triệu chứng và bệnh tích đại thể trên heo nghi ngờ bệnh DTH Thu thập thông tin Khảo sát thực hiện tập trung ở heo có trọng lượng bình quân từ 10 – 50kg. Heo có biểu hiện nghi ngờ bệnh DTH (heo bệnh) Mẫu lách Mẫu dương tính RT PCR Vi thể Định trình tự chuỗi gien E2 Đối chiếu Phát hiện E2 bằng kỹ thuật ELISA Mẫu hạch ruột, thận () 24 Heo bệnh được quan sát kỹ lưỡng và ghi nhận vào phiếu điều tra (phụ lục kèm theo) tất cả các biểu hiện lâm sàng trước khi giết mổ. Bệnh tích trên các cơ quan: thanh quản, phổi, gan, lách, thận, hạch màng treo ruột, túi mật, bàng quang, van hồi manh tràng được ghi nhận. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu Mỗi heo bệnh được lấy một bộ mẫu (lách, hạch màng treo ruột và thận) tại vùng có bệnh tích sau khi giết mổ. Mỗi loại lấy khoảng 5gram cho vào túi nylon vô trùng. Bảo quản trong thùng bảo ôn có đá vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu lách được chia ra làm 2 phần, một phần mẫu lách bảo quản ở 20oC, một phần mẫu lách cùng với mẫu thận, hạch màng treo ruột được cố định trong dung dịch formol 10%. 3.2.3.2 Xét nghiệm kháng nguyên E2 bằng kỹ thuật ELISA từ mẫu lách của heo nghi ngờ bệnh dịch tả Mẫu lách heo nghi bệnh được xét nghiệm bằng kỹ thuật ELISA để phát hiện heo dương tính với kháng nguyên E2 tại Phòng Xét nghiệm Chi cục Thú y Tiền Giang. Các mẫu có kết quả dương tính được gọi là “heo dương tính E2” trong luận văn. Bộ kit CSFV Antigen Test của hãng IDEXX theo phương pháp ELISA được dùng để phát hiện kháng nguyên E2 của virút DTH. Đây là phản ứng ELISA kẹp chả, phát hiện nhanh và đặc hiệu tình trạng nhiễm DTH bởi kháng thể đơn dòng kháng lại những epitope của E2. Xử lý mẫu: Một phần mẫu lách được cắt ra từng mãnh nhỏ, nghiền nhuyễn, cho dung dịch PBS vào để thu huyền dịch tế bào (tỷ lệ mẫu so với dịch PBS là 20%), ly tâm 5.000 vòng10 phút, thu dịch tế bào, bỏ cặn. Phản ứng ELISA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Đọc kết quả bằng máy ELISA với chương trình Xchek. Điều kiện để kết quả được chấp nhận: 25 ODPC (giá trị OD đối chứng dương) > 0,3 ODNC (giá trị OD đối chứng âm) < 70% ODPC Cách đọc kết quả: ODthực = ODmẫu (hoặc ODđối chứng dương) ODđối chứng âm Nếu ODthực ≥ 0,3 → mẫu dương Nếu ODthực < 0,2 → mẫu âm Nếu 0,2 < ODthực ≤ 0,3 → mẫu nghi ngờ 3.2.3.3 Đánh giá bệnh tích vi thể trên lách, hạch màng treo ruột và thận của những heo có mẫu lách dương tính với E2 Thận, lách, hạch màng treo ruột từ heo dương tính kháng nguyên E2 của virút DTH được gửi làm tiêu bản để đánh giá bệnh tích vi thể (40 mẫu cho mỗi loại cơ quan; Bệnh xá Thú y, Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh). Quan sát mẫu tiêu bản dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100 và 400 lần. 3.2.3.4 Thực hiện RT PCR trên các mẫu lách dương tính với E2 nhằm xác định trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gien E2 để định chủng virút DTH Lách từ heo dương tính với kháng nguyên E2 bằng kỹ thuật ELISA được ly trích RNA và thực hiện phản ứng RTPCR khuếch đại gien E2 tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. Việc thực hiện phản ứng RTPCR khuếch đại gien E2 nhằm sử dụng sản phẩm PCR để giải trình tự nucleotide của đoạn được nhân lên. Quy trình RTPCR khuếch đại 671 nucleotide của gien E2 dựa theo tài liệu của Paton và ctv (2000) được điều chỉnh cho phù hợp với các hóa chất sẵn có ở Việt Nam. Trình tự cặp mồi phản ứng (Paton và ctv, 2000): Mồi xuôi: 5′ AGR CCA GAC TGG TGG CCN TAY GA3′ Mồi ngược: 5′TTY ACC ACT TCT GTT CTC A 3′ 26 Chu trình nhiệt: Giai đoạn 1: 50oC trong 30 phút Giai đoạn 2: 94oC trong 3 phút Giai đoạn 3: Bước 1: 94oC trong 1 phút Bước 2: 54oC trong 1 phút Bước 3: 72oC trong 1 phút Giai đoạn 4: 72oC trong 10 phút. Sản phẩm RTPCR đoạn gien E2 có 671 bp. Giải trình tự nucleotide và vẽ cây di truyền (phylogenetic tree) Các sản phẩm PCR dương tính được tinh sạch và gửi giải trình tự nucleotide (11 mẫu) tại Công ty Nam Khoa TP. Hồ Chí Minh. Mối liên quan kiểu gien của các chuỗi nucleotide này cùng một số chuỗi nucleotide tham khảo từ các nghiên cứu trên thế giới cũng như từ các nghiên cứu khác ở Việt Nam được phân tích và biểu diễn qua cây di truyền (phylogenetic tree) (Bảng 3.2 và 3.3). Bảng 3.2: Các chủng virút DTH tham chiếu từ Việt Nam Chủng virút Vùng Năm phân lập Phân nhóm Vùng gien được giải trình tự nucleotide DNVN Đồng Nai 2004 2.1 E2 QNVN Quảng Ngãi 2004 2.2 E2 (Phạm Phong Vũ – Cơ quan Thú y Vùng VI) 35 chu kỳ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HỒ HUỲNH MAI

KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VI-RÚT

DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HỒ HUỲNH MAI

KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN CỦA VI-RÚT

DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG

KHẢO SÁT BIỂU HIỆN LÂM SÀNG VÀ BỆNH TÍCH TRÊN HEO GIẾT

MỔ DƯƠNG TÍNH DỊCH TẢ HEO, XÁC ĐỊNH NHÓM DI TRUYỀN

CỦA VI-RÚT DỊCH TẢ HEO TẠI TIỀN GIANG

HỒ HUỲNH MAI

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch:

2 Thư ký:

3 Phản biện 1:

4 Phản biện 2:

5 Ủy viên:

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên: Hồ Huỳnh Mai, sinh ngày 15 tháng 12 năm 1974, tại huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang

Con của Ông Hồ Văn Dư và Bà Phạm Thị Loan

Tốt nghiệp Trung học phổ thông tại Trường Trung học phổ thông Mỹ Phước Tây, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang, năm 1992

Tốt nghiệp Đại học ngành Thú y hệ tại chức tại Đại học Nông lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Sau đó làm việc tại Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang

Tháng 9/2005 theo học Cao học ngành Thú y tại Đại học Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Tình trạng gia đình: độc thân

Điạ chỉ liên lạc: 133 Lý Thường Kiệt, phường 5, TP Mỹ Tho, Tiền Giang Điện thoại: 0919213371

Email: hhmai2005@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác; đồng thời trong luận văn có sử dụng một phần kết quả của đề tài nghiên cứu khoa học và công nghệ cấp Bộ (đã được Chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng kết quả này trong luận văn)

Người cam đoan

Hồ Huỳnh Mai

Chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang, các bạn đồng nghiệp đã nhiệt tình hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học và đề tài nghiên cứu này

TÓM TẮT

Đề tài “Khảo sát biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trên heo giết mổ dương tính dịch tả heo, xác định nhóm di truyền của vi-rút dịch tả heo tại Tiền Giang” được

thực hiện từ tháng 03/2007 đến tháng 02/2008 Khảo sát trên 3.438 heo đưa vào các

lò mổ của huyện Chợ Gạo và thành phố Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang với phương pháp chẩn đoán lâm sàng, tổ chức lấy mẫu, xét nghiệm để chẩn đoán vi thể và cận lâm sàng bằng các kỹ thuật của phòng thí nghiệm (ELISA, cắt mẫu vi thể, RT-PCR) chúng tôi có kết quả như sau:

1 Trên lâm sàng, tần suất da xuất huyết chiếm tỷ lệ cao (63,75%) ở heo nghi bệnh dịch tả

2 Xét nghiệm mẫu lách của heo có biểu hiện nghi bệnh dịch tả bằng kỹ thuật ELISA, tỷ lệ dương tính với kháng nguyên E2 của vi-rút DTH chiếm 29,17%

3 Biểu hiện đặc trưng ở heo dương tính với kháng nguyên E2 của vi-rút DTH bao gồm: da xuất huyết điểm (64,29%), viêm kết mạc mắt (52,86%); van hồi manh tràng loét hình cúc áo (77,14%), hạch màng treo ruột xuất huyết (61,43%), thận xuất huyết (60%), lách nhồi huyết (42,86%) Các bệnh tích vi thể hiện diện với tần suất cao là hạch màng treo ruột xuất huyết rìa (77,5%), thận xuất huyết vùng tuỷ (77,5%), xuất huyết tiểu thể Malpighi (75%), hư hại vỏ bao thận (72,5%) và lách hư hại mô bạch huyết (67,5%) cùng với nhồi huyết và xuất huyết (62,5%)

4 Các chủng vi-rút DTH thực địa ở Tiền Giang thuộc nhóm 2 với phân nhóm 2.1 và 2.2, có mối quan hệ gần với các chủng vi-rút DTH đang lưu hành ở Việt Nam (mức độ tương đồng từ 92,62% đến 99,47%) Trong khi đó, chủng vi-rút DTH trong vắc-xin (GenBank) lại thuộc nhóm 1 với phân nhóm 1.1

SUMMARY

Title: “Surveying clinical signs and lesions in slaughtered pigs positive to Classical Swine Fever virus (CSFV), and defining genetic groups of CSF virus in Tien Giang province”

The aim of this study was to observe the clinical signs and lesions in pigs at some slaughterhouses in Tien Giang province, which were positive to ELISA test for the classical swine fever virus In addition, phylogenetic analysis of the E2-gene fragment isolated from the samples by RT-PCR was conducted

The observation was carried out in 3,438 pigs slaughtered at four slaughterhouses in Tien Giang province since March 2007 to February 2008 The results of clinical diagnosis and laboratory examination (ELISA, microscopic section, RT-PCR) were summarized as followed

1 Pigs of suspected-CSF signs showed skin haemorrhage at high rate (63.75%)

2 Only 29.17% pigs of suspected-CSF were positive to E2 antigen of CSF virus by ELISA

3 The typical lesions of the positive pigs included skin haemorrhage (64.29%), conjunctivitis (52.86%), ulcers in the large intestine (77.14%), haemorrhage in the mesentery lymph nodes (61.43%), haemorrhage in kidneys (60%), infarcts in the spleen (42.86%), haemorrhage in the kidney inner (77.5%), haemorrhage in Malpighi (75%), degeneration of kidney envelope (72.5%), and damage of lymph tissue of spleen (67.5%)

4 All CSF virus strains detected in Tien Giang in this study belonged to genogroup 2 (subgroup 2.1 and 2.2), which had close relation to the strains detected

in other provinces in Viet Nam (homology levels of 92.62% to 99.47%), and were

MỤC LỤC

Trang tựa

Trang chuẩn y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Cảm tạ iv

Tóm tắt v

Summary vi

Mục lục vii

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các hình và sơ đồ xi

Danh sách các bảng xii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Đặc điểm sinh học của vi-rút DTH 3

2.1.1 Lịch sử phát hiện 3

2.1.2 Phân loại 3

2.1.3 Đặc điểm cấu tạo và phân bố nhóm vi-rút DTH 5

2.1.3.1 Đặc điểm hình thái 5

2.1.3.2 Cấu tạo và chức năng các protein của vi-rút DTH 5

2.1.3.3 Phân bố 7

2.1.4 Độc lực của vi-rút DTH 10

2.2 Đường xâm nhập và cơ chế sinh bệnh của vi-rút DTH trong cơ thể vật chủ 10 2.3 Dấu hiệu lâm sàng bệnh DTH 11

2.3.1 Nhiễm sau khi sinh 11

Trang

2.3.2 Nhiễm trước khi sinh và phát bệnh muộn 12

2.4 Bệnh tích 13

2.4.1 Bệnh tích đại thể 13

2.4.2 Bệnh tích vi thể 14

2.5 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh DTH trong phòng thí nghiệm 14

2.5.1 Phân lập vi-rút DTH trên tế bào nuôi cấy 15

2.5.2 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang (FAT- fluorescent antibody test) 16

2.5.3 Kỹ thuật miễn dịch peroxidase (Imunoperoxidase) 16

2.5.4 Kỹ thuật ELISA (Enzyme linked imunosorbent assay) 16

2.5.4.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên 16

2.5.4.2 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể 17

2.5.5 Kỹ thuật trung hòa vi-rút (Virus neutralization test) 17

2.5.6 Kỹ thuật RT- PCR 18

2.6 Vắc-xin phòng chống bệnh DTH 21

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 22

3.1 Thời gian và địa điểm 22

3.2 Nội dung và phương pháp thực hiện 22

3.2.1 Đối tượng khảo sát và trình tự nội dung thực hiện 22

3.2.2 Chỉ tiêu khảo sát 23

3.2.3 Cách tiến hành 23

3.3 Xử lý số liệu 28

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Biểu hiện lâm sàng trên heo nghi bệnh DTH 29

4.2 Sự hiện diện của kháng nguyên E2 trong lách heo nghi bệnh 30

4.3 Biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trên heo dương tính E2 30

4.3.1 Biểu hiện lâm sàng trên heo dương tính E2 31

4.3.2 Bệnh tích đại thể trên heo dương tính E2 34

4.3.3 Các dạng bệnh tích vi thể trên heo dương tính E2 38

4.3.3.1 Các dạng bệnh tích vi thể trên thận 39

4.3.3.2 Các dạng bệnh tích vi thể trên lách 40

4.3.3.3 Các dạng bệnh tích vi thể trên hạch màng treo ruột 41

4.4 Định trình tự chuỗi nucleotide từ gien E2 của vi-rút DTH 42

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Đề nghị 49

Tài liệu tham khảo 50

Phụ lục 57

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BVDV Bovine viral diarrhoea virus Vi-rút gây bệnh tiêu chảy bò BDV Border disease virus Vi-rút gây bệnh Border ở cừu CPE Cytopathic effect Bệnh tích tế bào

CSFV Classical swine fever virus Vi-rút gây bệnh dịch tả heo cổ điển

immunosorbent assay

Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn kết với enzym

FAT Flourescent antibody test Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang

Biotechnology Information

Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ Sinh học (Hoa Kỳ)

nt Nucleotide

RT-PCR Reverse transcriptase

polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi khuếch đại gen phiên mã ngược

TCID50 Tissue culture infectious

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 2.1: Mối quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Pestivirus dựa trên

chuỗi trình tự của gien Npro 4

Hình 2.2: Cấu trúc bộ gien và hình thái của vi-rút DTH 5

Hình 2.3: Cây di truyền thể hiện mối quan hệ giữa 3 nhóm chính của vi-rút DTH và các nhóm phụ của chúng dựa trên gien E2 8

Hình 2.4: Cây di truyền của một số chủng vi-rút DTH ở Việt Nam và khu vực khi phân tích đoạn gien E2 của chúng 9

Hình 2.5: ELISA “kẹp chả” 17

Hình 2.6: Qui trình RT- PCR 19

Hình 4.1: Viêm kết mạc mắt (heo dương tính E2) 32

Hình 4.2: Xuất huyết da (vùng tai) 32

Hình 4.3: Lách nhồi huyết 37

Hình 4.4: Thận xuất huyết (vùng vỏ và vùng tuỷ) 37

Hình 4.5: Hạch màng treo ruột xuất huyết 38

Hình 4.6: Nốt loét ở van hồi manh tràng, ruột loét hình cúc áo 38

Hình 4.7: Thận xuất huyết với nhiều hồng cầu trong tiểu thể Malpighi 40

Hình 4.8: Lách nhồi huyết, hồng cầu tụ thành đám lớn dưới vỏ bao lách 41

Hình 4.9: Hạch xuất huyết ở rìa, nốt bạch huyết suy giảm 42

Hình 4.10: Cây di truyền vùng biến động (190 nt) của gien E2 45

Sơ đồ 3.1: Trình tự nội dung khảo sát và phân tích mẫu 23

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các kỹ thuật thường sử dụng để chẩn đoán bệnh DTH 15

Bảng 2.2: So sánh các đặc tính của các kỹ thuật chẩn đoán dùng để phát hiện vi-rút và các thành phần của vi-rút DTH 19

Bảng 2.3: Các loại vắc-xin DTH được phép lưu hành ở Việt Nam 21

Bảng 3.1: Phân bố mẫu thu thập 22

Bảng 3.2: Các chủng vi-rút DTH tham chiếu từ Việt Nam 26

Bảng 3.3: Các chủng vi-rút DTH tham khảo trên thế giới 27

Bảng 4.1: Tần suất các biểu hiện lâm sàng trên heo nghi bệnh DTH 29

Bảng 4.2: Tần suất các biểu hiện lâm sàng ở heo dương tính E2 31

Bảng 4.3: Phân bố của biểu hiện lâm sàng ghép trên heo dương tính E2 34

Bảng 4.4: Tần suất ghép 2 biểu hiện lâm sàng của heo dương tính E2 34

Bảng 4.5: Tỷ lệ của các bệnh tích đại thể ở các cơ quan nội tạng trên heo dương tính E2 35

Bảng 4.6: Tỷ lệ các dạng bệnh tích vi thể trên thận 39

Bảng 4.7: Tỷ lệ các dạng bệnh tích vi thể trên lách 41

Bảng 4.8: Tỷ lệ các dạng bệnh tích vi thể trên hạch màng treo ruột 42

Bảng 4.9: Các chủng vi-rút trong bệnh phẩm được giải trình tự vùng gien E2 42

vì thế, chẩn đoán dựa vào dịch tễ và lâm sàng bệnh DTH chỉ có giá trị khi kèm theo kết quả cận lâm sàng Ngoài ra, sự phù hợp giữa kết quả cận lâm sàng và dấu hiệu lâm sàng cần được đánh giá lại sau một thời gian diễn biến thay đổi của bệnh

Bên cạnh đó, việc xác định chủng vi-rút gây bệnh DTH có vai trò quyết định trong chương trình kiểm soát bởi lẽ chủng vi-rút của vắc-xin và chủng vi-rút gây bệnh thực địa không phù hợp thì chiến lược tiêm phòng sẽ thất bại Một số tác giả (Kim Văn Phúc và ctv, 2004; Hồ Thu Hương và ctv, 2004; Bùi Nghĩa Vượng và ctv, 2006; Nguyễn Thế Vinh và ctv, 2007) đã khảo sát về chủng vi-rút DTH trên các mẫu từ Hà Tây, Nghệ An, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, TP Cần Thơ, TP Hải Phòng và TP Hồ Chí Minh Tuy nhiên, cho đến nay ở Tiền Giang vẫn chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này

Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang, dưới sự hướng dẫn của PSG.TS Trần Thị Dân và TS Hồ Thị Kim Hoa, chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát biểu hiện lâm sàng và bệnh tích trên heo giết mổ dương

tính dịch tả heo, xác định nhóm di truyền của vi-rút dịch tả heo tại Tiền Giang” 1.2 Mục tiêu

- Xác định tần suất của triệu chứng và bệnh tích trên heo có kết quả ELISA dương tính với vi-rút DTH để định hướng cho việc chẩn đoán lâm sàng

- Xác định sự phân bố của các chủng vi-rút DTH thực địa tại một số địa bàn tỉnh Tiền Giang

1.3 Yêu cầu

- Ghi nhận triệu chứng và bệnh tích đại thể trên heo nghi ngờ bệnh DTH

- Xét nghiệm kháng nguyên E2 bằng kỹ thuật ELISA từ mẫu lách của heo nghi ngờ bệnh dịch tả

- Đánh giá bệnh tích vi thể trên lách, hạch màng treo ruột và thận của những heo có mẫu lách dương tính với kháng nguyên E2

- Thực hiện RT- PCR trên các mẫu lách dương tính với kháng nguyên E2

nhằm xác định trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gien E2, từ đó định nhóm di

truyền của vi-rút DTH dựa trên GenBank

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Đặc điểm sinh học của vi-rút DTH

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Ở Hoa kỳ, năm 1810 có một bệnh giống như bệnh DTH được mô tả tại bang Tennesee Đến năm 1833, bệnh DTH mới được báo cáo chính thức tại bang Ohio Năm 1885, Salmon và Smith xác định căn bệnh này là do vi trùng Mãi đến năm

1903, Dorset và Schweinitz đã khẳng định bệnh DTH là do vi-rút với chứng minh huyễn dịch bệnh phẩm không có vi trùng nhưng vẫn gây bệnh DTH Từ năm 1822 –

1862, có nhiều quốc gia ở Châu Âu xuất hiện bệnh DTH như Pháp (1822), Đức (1833), Anh (1862) Ngoài ra, bệnh DTH cũng được báo cáo ở Nam Mỹ (1899) và Nam Phi (1900) (dẫn liệu van Oirschot, 1999)

Năm 1921, sau khi phát hiện bệnh DTH Châu Phi do một loại vi-rút khác gây ra, các nhà khoa học đã sử dụng thuật ngữ “dịch tả heo cổ điển” (classical swine fever - CSF) cho bệnh DTH của thế kỷ XIX nhằm phân biệt với DTH Châu Phi, cho đến nay thuật ngữ này vẫn còn được sử dụng (Lê Hồng Phong, 1999)

2.1.2 Phân loại

Vi-rút DTH (Classical swine fever virus – CSFV) thuộc giống Pestivirus, họ Flaviviridae Họ Flaviviridae có 3 giống (Flavivirus, Hepacivirus và Pestivirus) Ngoài CSFV, giống Pestivirus có 2 loài khác là vi-rút gây bệnh tiêu chảy bò (Bovine viral diarrhoea virus, BVDV type 1 và type 2) và vi-rút gây bệnh Border ở

cừu (Border disease virus – BDV) (Wengler và ctv, 1995; Becher và ctv, 2003) (Hình 2.1)

4

2.1.3 Đặc điểm cấu tạo và phân bố nhóm vi-rút DTH

2.1.3.1 Đặc điểm hình thái

Vi-rút DTH có hệ gien RNA chuỗi đơn, mạch dương, dài khoảng 12,3 kb; có

vỏ bọc bên ngoài, đường kính 40-50 nm, dạng hình cầu, đối xứng khối 20 mặt, có

một nucleocapside đường kính 29 nm Khối lượng phân tử khoảng 60 x 106 Da

(Trần Đình Từ, 1999)

2.1.3.2 Cấu tạo và chức năng các protein của vi-rút DTH

Cấu tạo

Phân tử RNA của vi-rút DTH gồm vùng 5’ không mã hoá (5’ non-translated

region, 5’-NTR), một khung đọc mở (open reading frame – ORF) và vùng 3’ không

mã hóa (3’-NTR) ORF mã hóa 1 polyprotein chứa khoảng 3.900 a-xít a-min gồm 4

protein cấu trúc (C, protein của nucleocapsid; Erns (E0), E1 và E2, các glycoprotein

vỏ) và 8 protein không cấu trúc (Npro, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)

Các protein của vi-rút DTH

Erns, E1, E2 (vùng A1,2,3, B, C và D) là các glycoprotein của vỏ vi-rút, mục tiêu của kháng thể trung hòa Erns hay E0 (trước đây được gọi là gp44/48) và E2 (trước đây được gọi là gp55) phân bố ở bề mặt ngoài virion tham gia vào việc kết dính và xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm E0 có hoạt tính ribonuclease đối với uridine và có thể bị ức chế bởi ion kẽm (Dong và Cheng, 2007) Glycoprotein màng (transmembrane glycoprotein) E1 (gp33) tạo phức hợp với E2 (E1–E2 heterodimer) bằng cầu nối disulfide Các nhánh kỵ nước của E1 vươn ra, đóng vai trò truyền các tín hiệu khởi đầu hay ngừng lại (stop/begin-transfer signals) cho quá trình di chuyển E0, E1, E2 trong hệ thống võng nội chất (endoplasmic reticulum- ER) của tế bào (Dong và Cheng, 2007) Glycoprotein E2 có thể được dùng phân biệt dịch tả heo và BVDV với BDV (van Oirschot, 1999)

Npro (N-ternimal protease) (còn gọi là p23) là một autoprotease duy nhất, chỉ

có trong giống Pestivirus Npro nhanh chóng tự cắt khỏi nucleocapsid protein C (p14) Protein p7 có kích thước nhỏ hiện diện ở hai dạng E2-p7 và p7, được tìm thấy trong tế bào nhiễm vi-rút, nhưng không thấy ở virion trưởng thành (Dong và Cheng, 2007) NS3 (p80) có 3 hoạt tính: serine proteinase (đầu N-), RNA helicase

và nucleoside triphosphatase (RNA-stimulated NTPase) (đầu C-) (Brown và ctv, 2002; Zhang và ctv, 2003) NS4A là một phosphoprotein, đồng yếu tố (cofactor) của serine proteinase NS3, cần cho sự phân tách NS4B/5A và NS5A/5B để phóng thích NS4A, NS4B, NS5A và NS5B Cả hai, NS4B và NS5A, được cho rằng là những thành viên của nhóm replicase và protein NS5B là một RNA polymerase (RNA-dependent RNA polymerase) (Dong và Cheng, 2007)

Trong số các protein vi-rút, E0 và E2 là hai kháng nguyên chủ yếu được dùng để sản xuất vắc-xin (Dong và Cheng, 2007) Nghiên cứu của Konig và ctv (1995) cho thấy sau khi nhiễm vi-rút, kháng thể kháng vi-rút DTH được hình thành chống lại 2 protein cấu trúc Erns, E2 và protein không cấu trúc P80 (NS3) E2 có tính sinh miễn dịch cao nhất trong số các protein của CSFV Hầu hết các kháng thể

trung hòa được sinh ra trong cơ thể vật chủ nhằm vào glycoprotein này E2 còn là một yếu tố xác định độc lực (virulence determinant) của vi-rút Glycoprotein Erns (E0) là mục tiêu kế tiếp của các kháng thể trung hòa Các nghiên cứu cho thấy Erns cũng góp phần xác định độc lực vi-rút (Dong và Cheng, 2007)

Uttenthal và ctv (2001) đã chứng minh, heo sau khi tiêm chủng vắc-xin E2 hoặc Erns có thể được bảo hộ sau khi công cường độc vi-rút DTH Điều này không xảy ra ở vắc-xin E1 Tác giả còn cho biết, kháng thể kháng Erns chỉ được phát hiện khi dùng kháng nguyên Erns tái tổ hợp Do vậy, kỹ thuật ELISA được thiết kế không thể phát hiện kháng thể ở heo được tiêm chủng vắc-xin Erns mà chỉ phát hiện kháng thể của heo nhiễm DTH tự nhiên hoặc heo đã chủng vắc-xin thông dụng

2.1.3.3 Phân bố

Paton và ctv (2000a) đã vẽ các cây di truyền (phylogenetic tree) dựa trên phân tích các đoạn nucleotide của các gien mã hóa E2 (190 nt), NS5B (490 nt) và 5’- NTR (150 nt) từ nhiều chủng vi-rút DTH Kết quả cho thấy sự phân bố các chủng vi-rút này trên cả 3 cây di truyền tương tự nhau Cây di truyền được vẽ dựa vào phân tích đoạn nucleotide của gien mã hóa E2 (190 nt) từ 100 chủng vi-rút DTH phân lập khắp nơi trên thế giới cho thấy các chủng vi-rút này phân bố thành 3 nhóm chính, mỗi nhóm có 3 - 4 nhóm phụ (Hình 2.3)

Các chủng vi-rút phân lập từ Châu Âu vào những thập niên 1920-1970 thuộc nhóm 1, chủ yếu là nhóm phụ 1.1 Trong khi đó, các chủng ở Châu Âu phân lập trong những thập niên 1980-1990 thuộc nhóm 2 Tất cả những chủng vắc-xin phân tích (Thái Lan, Hàn Quốc, Đức) đều thuốc nhóm phụ 1.1

Vi-rút phân lập ở các quốc gia châu Á phân bố vào các nhóm khác nhau, tùy theo thời gian phân lập Ví dụ, các chủng phân lập ở Thái Lan vào thập niên 1980 phân bố chủ yếu vào nhóm phụ 1.2, trong khi các chủng phân lập vào thập niên

1990 phân bố vào nhóm phụ 2.2 và 3.3 Tương tự, các chủng ở Maylaysia phân lập vào thập niên 1960 thuộc nhóm phụ 1.2, và phần lớn các chủng phân lập vào thập

niên 1980-1990 thuộc nhóm phụ 2.1 Nhóm 3 chủ yếu gồm các chủng vi-rút phân lập ở Châu Á (Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật và Đài Loan)

Hình 2.3: Cây di truyền thể hiện mối quan hệ giữa 3 nhóm chính của vi-rút

DTH và các nhóm phụ của chúng dựa trên gien E2 (Paton và ctv, 2000a)

Hình 2.4: Cây di truyền của một số chủng vi-rút DTH ở Việt Nam và khu vực khi

phân tích đoạn gien E2 của chúng (Nguyễn Thế Vinh và ctv, 2007)

Kiểu gien

Kết quả phân tích của Nguyễn Thế Vinh và ctv (2007) cho thấy các chủng rút DHT phân lập ở Việt Nam, từ những heo có triệu chứng bệnh tích của bệnh thuộc nhóm phụ 2.1 và 2.2 Trong khi đó, phần lớn các chủng phân lập từ Thái Lan

vi-sử dụng trong nghiên cứu này thuộc nhóm 1 và 3 Đặc biệt, vi-rút vắc-xin chủng C

và chủng GPE phân bố trong nhóm phụ 1.1

2.1.4 Độc lực của vi-rút DTH

Nguyễn Tiến Dũng (2002) cho biết đến nay vi-rút DTH chỉ có một loại kháng nguyên mặc dù các nhà nghiên cứu đã tìm ra sự khác biệt của một số chủng vi-rút

và phân chia chúng thành các nhóm khác nhau với độc lực khác nhau

Dựa vào độc lực của vi-rút DTH, Szent-Ivanyi (1984) đã chia các chủng vi-rút DTH thành hai nhóm Nhóm 1 là các chủng cường độc như chủng Alfort, chủng Rovac, chủng ALD, chủng C Nhóm 2 là các chủng độc lực thấp, chủ yếu gây rối loạn sinh sản như chủng 331 và nhiều chủng khác phân lập được từ những heo bị bệnh mãn tính Sự khác nhau về độc lực của hai nhóm là yếu tố chính gây ra những dấu hiệu lâm sàng khác nhau trên các ca bệnh (Cheville và Mengeling, 1989; dẫn liệu của Too và Seneque, 2002) Bằng kỹ thuật huỳnh quang trực tiếp với một cặp kháng thể đơn dòng, có thể phân biệt được kháng nguyên vi-rút DTH tự nhiên và vi-rút DTH trong vắc-xin ở heo sau 2 tuần tiêm phòng vắc-xin DTH chủng C nhược độc (van Oirschot, 1999)

Tốc độ lây lan của bệnh DTH sẽ thay đổi theo độc lực của vi-rút Tuy nhiên, vấn đề này còn chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như giống, tuổi, sự cạnh tranh miễn dịch và điều kiện dinh dưỡng (van Oirschot, 1999)

2.2 Đường xâm nhập và cơ chế sinh bệnh của vi-rút DTH trong cơ thể vật chủ

Vi-rút DTH vào cơ thể chủ yếu qua đường tiêu hóa Ngoài ra, vi-rút còn có thể xâm nhập qua đường hô hấp, niêm mạc mắt, đường sinh dục Các vết thương ở da cũng là đường xâm nhập của vi-rút Hạch amiđan là một trong những vị trí đầu tiên nơi vi-rút nhân lên sau khi xâm nhập vào vật chủ

Trong điều kiện tự nhiên, 7 giờ sau khi xâm nhập vào cơ thể heo, vi-rút vào hạch amiđan, hạch vùng hầu họng (đây là vị trí nhân lên đầu tiên) Mười sáu giờ

sau, vi-rút vào hệ thống lâm ba rồi vào máu (trong các đại thực bào) gây ra hiện tượng máu nhiễm vi-rút lần thứ nhất (dẫn liệu Trần Đình Từ, 1999)

Theo hệ tuần hoàn, vi-rút đến định vị, sinh sản và phá hủy những tế bào nội mạc mao mạch, những mảnh vỡ sẽ tụ lại thành vật tắc mạch, dẫn đến nhồi huyết ở lách, xuất huyết và hoại tử ở ruột Năm đến sáu ngày sau khi nhiễm, máu nhiễm vi-rút lần thứ hai xảy ra, lúc này xuất hiện những triệu chứng, số lượng vi-rút trong máu sẽ đạt tối đa vào ngày thứ 7 Đa số heo bệnh cấp tính thường bị chết do rối loạn tuần hoàn nghiêm trọng Sự suy giảm miễn dịch đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự phụ nhiễm vi sinh vật khác (Trần Thanh Phong, 1996) Như vậy, vi-rút DTH có độc lực sẽ có mặt ở khắp các tổ chức, biểu mô sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ

5 - 6 ngày (van Oirschot, 1999)

Ngoài ra, vi-rút còn có thể tồn tại trong bạch cầu và đại thực bào gây ra sự lưu nhiễm dai dẳng Trường hợp nhiễm trùng qua phôi thai trong tử cung, có thể không dẫn đến chết phôi nhưng dẫn đến hiện tượng dung nạp miễn dịch (Trần Thanh Phong, 1996)

Một số chủng vi-rút có độc lực yếu không gây bệnh lâm sàng cho heo trưởng thành mà chỉ gây bệnh cho bào thai heo, gây ra rối loạn sinh sản như hấp thụ phôi (phải phối lại), chết thai (thai gỗ, thai chết lưu), hoặc chết yểu, dạng này còn được gọi là DTH bẩm sinh (congential CSF) hay DTH phát muộn (late onset CSF) (Nguyễn Tiến Dũng, 2002)

2.3 Dấu hiệu lâm sàng bệnh DTH

Tùy thuộc vào độc lực của vi-rút và phản ứng của cơ thể heo mà bệnh DTH có các thể bệnh khác nhau

2.3.1 Nhiễm sau khi sinh

(1) Thể quá cấp

Xuất hiện đột ngột không có triệu chứng ban đầu, heo đột nhiên sốt cao

41-42oC, phần da mỏng ửng đỏ, chết nhanh trong 24 đến 48 giờ (Trần Thanh Phong, 1996)

(2) Thể cấp tính

Thường bắt đầu với vài heo có biểu hiện lờ đờ và kém ăn Heo sốt 41-42oC, táo bón, bỏ ăn, mệt mỏi, ủ rũ, ít vận động, nằm chồng chất lên nhau, số lượng bạch cầu giảm mạnh (<9000/mm3 máu), viêm kết mạc (nhiều ghèn dính mí mắt, sưng mí mắt) Khi thân nhiệt giảm, heo thường tiêu chảy phân vàng, vàng nâu hoặc đỏ nâu, đôi khi nôn mữa Sau đó, heo bị táo bón, phân đóng viên, heo có thể ói mửa, heo lạnh và chúng thường nằm tụ lại thành đống trong chuồng (Trần Thanh Phong, 1996) Theo Đào Trọng Đạt và Trần Thị Tố Liên (1989), trong bệnh DTH có một số trường hợp không thấy biểu hiện tiêu chảy nên dễ nhầm lẫn với bệnh khác

Xuất hiện dấu hiệu thần kinh như đi lảo đảo, run và co chân sau, heo trở nên quay vòng, đi xiêu vẹo, mất điều hòa vận động xảy ra trong giai đoạn đầu của bệnh, một số khác có biểu hiện run và co giật trước khi chết (Trần Thanh Phong, 1996) Trên da có vết xuất huyết ở vành tai, đuôi, vùng bụng, xung quanh mắt, mặt trong của chân vào tuần thứ hai và thứ ba sau khi nhiễm cho đến chết (Laevens và ctv, 1999) Vết xuất huyết có màu đỏ xám với nhiều kích cỡ khác nhau và lan rộng ra xung quanh có thể thấy ở hầu hết các heo chết ở giai đoạn này

(3) Thể mãn tính

Những heo bệnh DTH có thời gian biểu hiện triệu chứng lâm sàng kéo dài trên một tháng mà vẫn còn sống sót được xem là bệnh mãn tính (Mengeling và Packer, 1969) Các triệu chứng thường thấy là biếng ăn, ốm yếu, chậm lớn, tiêu chảy, viêm

da, sốt cách khoảng với thân nhiệt thường dưới 41oC Khi mổ khám trên heo con bệnh thấy bệnh tích teo tuyến ức và sưng các khớp của xương sườn (van Oirschot

và Terpstra, 1997)

2.3.2 Nhiễm trước khi sinh và phát bệnh muộn

Heo con bị nhiễm trước khi sinh thường biểu hiện bệnh ở thể không điển hình Theo nhận định của Quin (1950), “trong bệnh DTH, điều điển hình hơn cả là bệnh thường tiến triển một cách không điển hình” (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996) Thể bệnh này do vi-rút độc lực yếu, thời gian ủ bệnh dài và thường gặp nhất trên heo con (Trần Thanh Phong, 1996) Vi-rút không gây bệnh lâm sàng cho heo

trưởng thành mà chỉ gây bệnh cho bào thai, gây ra rối loạn sinh sản hoặc bệnh lý sinh sản (sảy thai, chết thai, thai gỗ, dị dạng, run bẩm sinh, rối loạn vận động, chết yểu), heo con chậm lớn Vi-rút DTH có khả năng đi qua hàng rào bảo vệ của nhau thai để lây nhiễm cho bào thai Chỉ có những heo con bị nhiễm vi-rút trong giai đoạn đầu của quá trình phát triển bào thai mới phát triển thành thể phát bệnh muộn (Nguyễn Tiến Dũng và ctv, 2002) Sự nhiễm trùng bẩm sinh này dẫn đến hai hậu quả: (i) heo con dung nạp miễn dịch, loại heo này không có kháng thể và khi tiêm phòng cũng không tạo ra được miễn dịch chống lại bệnh; (ii) heo con mang trùng khi sinh ra khỏe mạnh và trông bên ngoài dáng vẻ bình thường và không có gì khác

so với các loại heo khác (Nguyễn Tiến Dũng và ctv, 2002) Đây là nguồn bệnh âm ỉ

và nguy cơ làm lây lan bệnh DTH cho các heo khác trong đàn

Ở thể bệnh này, heo vẫn phát triển bình thường trong vài tuần đến vài tháng trước khi ghi nhận các triệu chứng bệnh như kém ăn, ủ rũ, viêm kết mạc, viêm da, tiêu chảy cách khoảng và rối loạn vận động Heo con thường phát bệnh sau khi cai sữa (lúc 1 đến 2 tháng tuổi) (Nguyễn Tiến Dũng và ctv, 2002) Thân nhiệt bình thường hoặc tăng ít, bạch cầu tăng vào giai đoạn cuối khi heo gần chết (van Oischot

Bệnh tích đặc trưng là nhiễm trùng huyết với những mảng xuất huyết có kích

cỡ khác nhau Xuất huyết xảy ra do sự thoái hóa, phù nề và hoại tử các tế bào biểu

bì mầm ở hệ thống mạch Ngoài ra, viêm cata và xuất huyết ở đường tiêu hóa, đường hô hấp, đường niệu sinh dục Những biến đổi thường thấy là niêm mạc miệng, lợi hoặc cuống lưỡi viêm xuất huyết, sụn tiểu thiệt xuất huyết Phổi viêm tụ máu hoặc xuất huyết có thể có vùng gan hóa, hoại tử Hạch lâm ba sưng to, phù nề

sau đó xuất huyết Hạch bị xuất huyết ngoại biên hoặc lan tràn do lympho bị hư hại Những biến đổi này thường sớm từ ngày 4 – 5 khi heo nhiễm bệnh; đầu tiên xảy ra, hạch ở ruột, hạch lâm ba dưới hàm, hạch vùng cổ, dạ dày, thận và màng treo ruột

Sự thoái hóa, phù nề các tế bào nội bì và tích tụ hồng cầu làm tắc nghẽn mạch máu gây nhồi huyết ở lách Lách nhồi huyết, xuất huyết ở rìa lách, nốt xuất huyết có màu tím bầm Túi mật tích dịch đặc, niêm mạc xuất huyết Thận xuất huyết lấm tấm bằng đầu đinh ghim, xuất huyết cả phần vỏ, tủy thận và phần kẽ thận Niêm mạc bàng quang có chấm xuất huyết đỏ Niêm mạc ruột nhất là van hồi manh tràng, trực tràng xuất huyết, có nốt loét hình cúc áo Hầu hết heo bệnh đều bị tổn thương não (Nguyễn Văn Cảm, 2002)

- Thể mãn tính

Ruột viêm có nhiều mụn loét tròn, bề đứng phủ casein, nhất là ở vùng van hồi manh tràng Phổi có bệnh tích viêm dính vào lồng ngực bằng tổ chức liên kết chứa những cục hoại tử (Trần Thanh Phong, 1996)

Trên heo nái bệnh, thai chết lưu, chết sau khi sinh, dị tật, thai chết trong bụng

mẹ, dưới da thai bị phù thủng, tràn dịch màng phổi Trường hợp thai bị nhiễm vi-rút thì xuất huyết lấm tấm trên da và các cơ quan nội tạng (Trần Đình Từ, 2005)

2.4.2 Bệnh tích vi thể

Bệnh tích vi thể đặc trưng nhất là ở hệ lưới nội bì của thành mạch quản Các tế bào nội bì sưng do thoái hóa thủy thủng, các mạch quản ngoại biên ngoài bị dãn rộng, một số bị tắc mạch dẫn đến các bệnh tích đại thể đặc trưng của DTH như sung huyết, xuất huyết, nhồi huyết, hoại tử Viêm não không mủ, đặc trưng bởi sưng và thoái hóa các tế bào nội bì, nghẽn mạch, thấm nhiễm các tế bào lympho quanh mạch thường thấy ở 70 – 90% các trường hợp heo chết (van Oirschot,1998)

2.5 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh DTH trong phòng thí nghiệm

Elbers và ctv (2004) nghiên cứu khả năng chẩn đoán DTH dựa vào dấu hiệu lâm sàng và bệnh tích Những tiêu chuẩn để chẩn đoán bệnh là xuất huyết điểm vùng bụng, thờ thẩn, gầy yếu và kém ăn, sốt, không thể điều trị được Tác giả cho biết bệnh tích thay đổi tùy thuộc vào tình trạng thú trước khi giết mổ, không phải

lúc nào cũng phát hiện được bệnh tích thể cấp tính Vì vậy bệnh tích được thu thập

để đánh giá chỉ có 50% trường hợp đúng DTH và 50% không có ý nghĩa về mặt thống kê trong phân tích

Hiện nay, có nhiều phương pháp phi lâm sàng được dùng để phát hiện tình trạng nhiễm vi-rút DTH Việc lựa chọn phương pháp dùng chẩn đoán bệnh do vi-rút DTH phụ thuộc điều kiện phòng thí nghiệm Các phương pháp có thể dùng để phát hiện kháng nguyên hay kháng thể (Bảng 2.1)

Bảng 2.1: Các kỹ thuật thường sử dụng để chẩn đoán bệnh DTH

Phát hiện sự hiện diện của Kỹ thuật thường sử dụng

Kháng nguyên

Kháng thể huỳnh quang ELISA

PCR

Trung hòa vi-rút

2.5.1 Phân lập vi-rút DTH trên tế bào nuôi cấy

Vi-rút DTH có thể được phân lập bằng cách cấy vào môi trường tế bào PK15A với nguồn vi-rút từ lách hay hạch của heo có dấu hiệu nghi ngờ bệnh DTH

Vì vi-rút DTH không gây bệnh tích trên tế bào nhiễm, sự hiện diện của chúng trong

tế bào nuôi cấy phải được phát hiện tiếp tục bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Trần Thanh Phong, 1996)

Phương pháp phân lập vi-rút là phương pháp chuẩn, rất nhạy và có thể phát hiện sự nhiễm mầm bệnh sớm hơn so với kỹ thuật ELISA Tuy nhiên, thời gian phân lập kéo dài (72 giờ hoặc hơn) vì một số dòng vi-rút DTH có tính gây nhiễm kém và sự phát triển giới hạn trong tế bào nuôi cấy, đồng thời yêu cầu cao về trang thiết bị và người thực hiện

2.5.2 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang (Flourescent antibody test – FAT)

Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang được ứng dụng với mẫu cắt lạnh để phát hiện nhanh và xác định những mẫu đã nhiễm vi-rút DTH Tuy nhiên kỹ thuật này có hạn chế là độ nhạy thấp, đặc biệt là trong những trường hợp cần phát hiện heo cảm nhiễm trong giai đoạn ủ bệnh hoặc đang trong tình trạng mãn tính của bệnh, khi mà vi-rút trong máu thấp hoặc có không liên tục (CEC, 2003)

2.5.3 Kỹ thuật miễn dịch peroxidase (Imunoperoxidase)

Kỹ thuật này được dùng để phát hiện kháng nguyên vi-rút DTH trong mẫu mô bệnh phẩm và trong tế bào nuôi cấy Nguyên lý các bước của kỹ thuật này tương tự như kỹ thuật kháng thể huỳnh quang, chỉ khác là kháng thể được dùng làm conjugate sẽ gắn với một enzyme, enzyme này chỉ hoạt động và cho thấy màu của phản ứng khi kết hợp với cơ chất gồm H2O2 và chất phát màu

Kỹ thuật này thuận lợi hơn kỹ thuật kháng thể huỳnh quang do không yêu cầu kính hiển vi huỳnh quang Đặc biệt, phương pháp có ưu điểm trong việc xác định vị trí kháng nguyên vi-rút trong bệnh tích vi thể (Wise và ctv, 2005)

2.5.4 Kỹ thuật ELISA (Enzyme linked imunosorbent assay)

2.5.4.1 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên

Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên vi-rút DTH trong các mẫu máu và

mô thích hợp để chẩn đoán nhanh những đàn bị nhiễm Một số bộ kít thương mại có thể phát hiện kháng nguyên glycoprotein E2bằng việc dùng kháng thể đơn dòng (Mab) gắn trực tiếp tại những điểm quyết định kháng nguyên (epitope) của glycoprotein E2 (http://www.idexx.com/production/swine/6209101m.pdf) Một số

bộ kít thương mại khác dùng kháng thể đơn dòng gắn trực tiếp với những protein phi cấu trúc của vi-rút (được sản sinh chỉ khi có sự tái sản vi-rút), như là kháng nguyên P125 Sự phát hiện các kháng nguyên như thế cũng có tầm hữu ích thực tiễn

để nhận biết những thú mang trùng Tuy nhiên, phương pháp này không nhạy như phương pháp phân lập vi-rút và có thể cho kết quả dương tính giả

2.5.4.2 Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể

Có nhiều kỹ thuật ELISA được ứng dụng để phát hiện kháng thể sản sinh do vi-rút DTH Kỹ thuật này rất hữu ích vì đơn giản và nhanh, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn, nhằm xác định những đàn cảm nhiễm, nhất là ở những quốc gia không có bệnh DTH Đồng thời kỹ thuật này được dùng để phân biệt kháng thể sinh

ra ở heo là do vi-rút DTH hay do vi-rút gây tiêu chảy ở bò thông qua sự gắn kết giữa hai kháng thể đơn dòng và những epitope khác nhau trên glycoprotein E2 (Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương, 2003) Tuy vậy, kỹ thuật này không thể

áp dụng trong những đàn heo đã được chủng ngừa vắc-xin vi-rút sống nhược độc vì không thể phân biệt được kháng thể kháng E2 hiện diện là do vi-rút xâm nhiễm hay

do đáp ứng vắc-xin Kỹ thuật này cũng có hạn chế là cho kết quả dương tính giả

Hình 2.5: ELISA “kẹp chả”

(www.activemotif.com/ /products/nr_sandwich.jpg)

2.5.5 Kỹ thuật trung hòa vi-rút (Virus neutralization test)

Trên môi trường nuôi cấy (phôi gà, động vật cảm thụ, môi trường tế bào) rút sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho các đối tượng trên Khi vi-rút gặp kháng thể

vi-kháng thể phát hiện

Cơ chất

kháng thể bắt giữ

Protein mục tiêu

kháng thể gắn kết HRP

đặc hiệu tương ứng, chúng sẽ bị trung hòa, không nhân lên được và không gây bệnh tích cho các tế bào trong môi trường nuôi cấy

Kỹ thuật trung hòa theo phương pháp vi-rút cố định và huyết thanh pha loãng hiện đang là phương pháp chuẩn cho việc phát hiện sự hiện diện của kháng thể kháng vi-rút DTH trong mẫu máu (CEC, 2003)

2.5.6 Kỹ thuật RT- PCR

Kỹ thuật này được sử dụng để nhận biết sự hiện diện của vi-rút DTH, thông qua sự khuếch đại và nhận biết những đoạn RNA đặc hiệu Kỹ thuật RT-PCR là công cụ chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Độ nhạy của kỹ thuật này có thể phát hiện được vi-rút DTH tại 100 TCID50 (Kim Văn Phúc và ctv, 2004)

Kỹ thuật RT-PCR đặc biệt phù hợp để kiểm tra sàng lọc những mẫu máu hoặc

mô, hoặc dùng như là một công cụ trong quá trình so sánh trình tự nucleotide ở những vùng khác nhau của bộ gien vi-rút DTH (CEC, 2003) Mục đích của việc so sánh trình tự này là để đánh giá sự tiến hóa, sự đa dạng và phân bố các dòng vi-rút DTH trên toàn cầu Đồng thời, giúp cho việc tìm lại nguồn gốc xuất phát của vi-rút DTH, nếu có bệnh DTH xảy ra trong tương lai (Paton và ctv, 2000a)

Wirz và ctv (1993) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR vào việc phát hiện và phân

biệt vi-rút DTH từ các Pestivirus khác Nhiều tác giả nước ngoài dùng kỹ thuật PCR để nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh dựa vào gien E2 (Harding, 1994; Ruggli

RT-và ctv, 1996;Paton và ctv, 2000b; Risatti và ctv, 2003; Blacksell và ctv, 2004; Deng

và ctv, 2005; Pereda, 2005; Liu và ctv, 2007; Chen và ctv, 2008) Dewulf và ctv (2004) gây nhiễm 128 thú bệnh (heo cai sữa, heo vỗ béo, heo nái), tỷ lệ dương tính của phương pháp RT-PCR là 98,90% trong khi phương pháp ELISA là 74,7% Tác giả cho rằng phương pháp RT-PCR là phương pháp tốt nhất để phát hiện vi-rút

Hình 2.6 : Qui trình RT- PCR

(http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif)

Bảng 2.2: So sánh các đặc tính của các kỹ thuật chẩn đoán dùng để phát hiện vi-rút

và các thành phần của vi-rút DTH (CEC, 2003)

FAT ELISA Phân lập vi-rút RT-PCR

Thời gian đạt kết quả 3 - 4 giờ 6 - 20 giờ > 72 giờ 8 giờ

Bước 1: biến tính

Bước 2: bắt cặp

Bước 3: kéo dài

Một số phương pháp chẩn đoán phân biệt giữa các loài thuộc giống

Pestivirus

Phản ứng trung hòa có thể dùng để phân biệt vi-rút DTH và BVDV nhưng không thể phân biệt BVDV và BDV Khi nuôi cấy tế bào, vi-rút DTH không gây bệnh tích tế bào (CPE); trong khi đó, BDV có 1 nhóm gây CPE và nhóm còn lại không gây CPE BDV thuộc nhóm CPE có cả protein P80 và P125, còn vi-rút không gây CPE chỉ có P125(Thiel và ctv, 1991) Để phân biệt trường hợp nhiễm vi-rút DTH và BVDV trong máu, có thể dùng kỹ thuật ELISA cạnh tranh với kháng thể đơn dòng (Moennig, 1990)

Chẩn đoán phát hiện bệnh do vi-rút DTH ở Việt Nam

Bùi Quang Anh và ctv (2000) thăm dò phát hiện kháng nguyên vi-rút DTH trong đàn heo giết mổ và chăn nuôi tại một số tỉnh vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IF), phản ứng ELISA và phản ứng trung hòa trên thỏ Kết quả dương tính đối với IF là 35% và ELISA là 33,5%, trung hòa trên thỏ 28% Trần Thị Dân và ctv (2003) sử dụng xét nghiệm ELISA và ghi nhận heo

âm tính P125 có dấu hiệu lâm sàng và bệnh tích gần giống heo dương tính P125 Lê Văn Hùng và ctv (2003) ứng dụng RT-PCR để chẩn đoán DTH tại năm tỉnh thành phố ở phía Nam; kết quả cho thấy, nếu lấy mẫu trên những heo còn sống nghi DTH thì khi xét nghiệm chỉ có 3/61 mẫu dương tính chiếm 4,9%, trong khi mẫu được lấy

từ những heo chết nghi DTH thì dương tính khá cao (5/7 mẫu dương tính chiếm 71,4%) Từ năm 2002-2003, Kamakawa và ctv đã tiến hành khảo sát bệnh DTH ở các đàn heo và các trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại đoạn gien 5’NTR Kết quả cho thấy bệnh DTH hiện diện ở tất cả các trại khảo sát Phạm Hồng Sơn (2004) sử dụng phản ứng ngăn trở hồng cầu gián tiếp trong việc phát hiện kháng nguyên dịch tả heo

Hồ Thu Hương và ctv (2004) so sánh 4 phương pháp chẩn đoán vi-rút DTH (phân lập vi-rút, phản ứng huỳnh quang kháng thể, phản ứng ELISA và RT-PCR) từ mẫu được bảo quản ở các điều kiện khác nhau Theo các tác giả, việc lựa chọn phương pháp chẩn đoán phải dựa vào chất lượng mẫu Bùi Nghĩa Vượng và ctv

(2006) chẩn đoán bệnh DTH bằng phương pháp RT-PCR với mẫu máu lấy bằng giấy thấm, tác giả chứng tỏ rằng có thể phát hiện được vi-rút DTH từ các mẫu giấy thấm máu khô giữ ở 370C trong 10 tháng

Nguyễn Thế Vinh và ctv (2007) nghiên cứu phân tích di truyền vi-rút DTH phân lập ở Việt Nam bằng cách phân tích đoạn gien E2 của 20 mẫu vi-rút DTH và

so sánh chúng với một số chủng đã được giới thiệu trên thế giới Kết quả đưa ra là các chủng vi-rút DTH thuộc nhóm 2 đang là tác nhân chính gây bệnh DTH ở Việt Nam

2.6 Vắc-xin phòng chống bệnh DTH

Thông tin được ghi nhận từ thú y cơ sở cập nhật trong thời gian gần đây (2006 – 2007) cho thấy ở Tiền Giang vắc-xin DTH được sử dụng phổ biến là vắc-xin chủng C của Công ty Navetco (72,5%), kế đến là vắc-xin của Công ty Merial, Pháp (17,5%), Công ty Fort Dodge Animal Health của Brazil (7,5%) Các loại vắc-xin khác chỉ chiếm tỷ lệ 2,5% Theo khảo sát của Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE, 2003), vi-rút DTH chủng C được sử dụng làm vắc-xin nhiều nhất Chủng này không phát hiện trong cơ thể heo sau khi tiêm vắc-xin 2 – 3 tuần

Bảng 2.3: Các loại vắc-xin DTH được phép lưu hành ở Việt Nam

1 Dịch tả lợn C Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương

3 Dịch tả heo C Công ty thuốc thú y Trung ương II

4 Porcillis Pesti C Công ty Intervet - Hà Lan

5 Porcillis CSF live GPE Công ty Intervet - Ấn Độ

6 HC Vac (Hog cholera vaccin) C Công ty Korea Microbiological Lab.- Hàn Quốc

7 Pest – Vac C Công ty Fort Dodge Animal Health – Brazil

8 Cholera Vac® C Công ty Pfizer – Croatia

9 Live Hog Cholera Vaccine C Công ty Katasato Institute - Nhật

11 Coglapest Thiverval Công ty Cevasante Animale – Pháp

12 Suigen Swine Fever C Công ty Virbac – Pháp

Singapore

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian khảo sát từ tháng 3/2007 đến 2/2008

Khảo sát được thực hiện tại 4 cơ sở giết mổ heo (lò mổ) thuộc địa bàn thành

phố Mỹ Tho và huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang Việc phân tích mẫu được thực

hiện tại Phòng Xét nghiệm của Chi cục Thú y tỉnh Tiền Giang, Viện Công nghệ

Sinh học và Môi trường và Bệnh xá Thú y, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí

Minh Các mẫu cần được giải trình tự nucleotide được gửi đến Công ty Nam Khoa,

TP Hồ Chí Minh

3.2 Nội dung và phương pháp thực hiện

3.2.1 Đối tượng khảo sát và trình tự nội dung thực hiện

Tất cả những heo được đưa đến lò mổ để hạ thịt, tập trung khảo sát heo có một

trong các biểu hiện lâm sàng nghi ngờ bệnh dịch tả Heo nghi ngờ bệnh DTH (heo

bệnh) có một trong các biểu hiện lâm sàng: da xuất huyết, viêm kết mạc mắt, gầy

ốm, đi đứng xiêu vẹo Một số heo nghi ngờ bệnh tại các lò mổ được lấy mẫu (lách,

hạch màng treo ruột và thận) Phân bố mẫu thu thập được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1: Phân bố mẫu thu thập

Sơ đồ 3.1: Trình tự nội dung khảo sát và phân tích mẫu

Ghi chú: (*): chỉ xét nghiệm vi thể các mẫu hạch ruột, thận khi mẫu lách dương tính với ELISA

Khảo sát thực hiện tập trung ở heo có trọng lượng bình quân từ 10 – 50kg

Heo có biểu hiện nghi ngờ bệnh

Mẫu hạch ruột, thận

(*)

Heo bệnh được quan sát kỹ lưỡng và ghi nhận vào phiếu điều tra (phụ lục kèm theo) tất cả các biểu hiện lâm sàng trước khi giết mổ Bệnh tích trên các cơ quan: thanh quản, phổi, gan, lách, thận, hạch màng treo ruột, túi mật, bàng quang, van hồi manh tràng được ghi nhận

Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu

Mỗi heo bệnh được lấy một bộ mẫu (lách, hạch màng treo ruột và thận) tại vùng có bệnh tích sau khi giết mổ Mỗi loại lấy khoảng 5gram cho vào túi ny-lon vô trùng Bảo quản trong thùng bảo ôn có đá vận chuyển về phòng thí nghiệm

Mẫu lách được chia ra làm 2 phần, một phần mẫu lách bảo quản ở -20oC, một phần mẫu lách cùng với mẫu thận, hạch màng treo ruột được cố định trong dung dịch formol 10%

3.2.3.2 Xét nghiệm kháng nguyên E2 bằng kỹ thuật ELISA từ mẫu lách của heo nghi ngờ bệnh dịch tả

Mẫu lách heo nghi bệnh được xét nghiệm bằng kỹ thuật ELISA để phát hiện heo dương tính với kháng nguyên E2 tại Phòng Xét nghiệm Chi cục Thú y Tiền Giang Các mẫu có kết quả dương tính được gọi là “heo dương tính E2” trong luận văn

Bộ kit CSFV Antigen Test của hãng IDEXX theo phương pháp ELISA được dùng để phát hiện kháng nguyên E2 của vi-rút DTH Đây là phản ứng ELISA kẹp chả, phát hiện nhanh và đặc hiệu tình trạng nhiễm DTH bởi kháng thể đơn dòng kháng lại những epitope của E2

Xử lý mẫu: Một phần mẫu lách được cắt ra từng mãnh nhỏ, nghiền nhuyễn,

cho dung dịch PBS vào để thu huyền dịch tế bào (tỷ lệ mẫu so với dịch PBS là 20%), ly tâm 5.000 vòng/10 phút, thu dịch tế bào, bỏ cặn

Phản ứng ELISA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Đọc kết quả bằng máy ELISA với chương trình Xchek Điều kiện để kết quả được chấp nhận:

ODPC (giá trị OD đối chứng dương) > 0,3

ODNC (giá trị OD đối chứng âm) < 70% ODPC

Cách đọc kết quả:

OD thực = OD mẫu (hoặc OD đối chứng dương ) - OD đối chứng âm

Nếu ODthực ≥ 0,3 → mẫu dương

Nếu ODthực < 0,2 → mẫu âm

Nếu 0,2 < ODthực ≤ 0,3 → mẫu nghi ngờ

3.2.3.3 Đánh giá bệnh tích vi thể trên lách, hạch màng treo ruột và thận của những heo có mẫu lách dương tính với E2

Thận, lách, hạch màng treo ruột từ heo dương tính kháng nguyên E2 của rút DTH được gửi làm tiêu bản để đánh giá bệnh tích vi thể (40 mẫu cho mỗi loại cơ quan; Bệnh xá Thú y, Trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh) Quan sát mẫu tiêu bản dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100 và 400 lần

vi-3.2.3.4 Thực hiện RT- PCR trên các mẫu lách dương tính với E2 nhằm xác định trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gien E2 để định chủng vi-rút DTH

Lách từ heo dương tính với kháng nguyên E2 bằng kỹ thuật ELISA được ly

trích RNA và thực hiện phản ứng RT-PCR khuếch đại gien E2 tại Viện Công nghệ

Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh

Việc thực hiện phản ứng RT-PCR khuếch đại gien E2 nhằm sử dụng sản

phẩm PCR để giải trình tự nucleotide của đoạn được nhân lên

Quy trình RT-PCR khuếch đại 671 nucleotide của gien E2 dựa theo tài liệu

của Paton và ctv (2000) được điều chỉnh cho phù hợp với các hóa chất sẵn có ở Việt Nam

Trình tự cặp mồi phản ứng (Paton và ctv, 2000):

Mồi xuôi: 5′- AGR CCA GAC TGG TGG CCN TAY GA-3′

Mồi ngược: 5′-TTY ACC ACT TCT GTT CTC A -3′