TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỊT TƯƠI VÀ THỊT ĐÔNG LẠNH

iii TÓM TẮT Đề tài “Tìm hiểu quy trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong thịt tươi và thịt đông lạnh” được tiến hành tại Trung tâm Chuẩn Đoán - Xét Nghiệm Bệnh động vật trực thuộc Cơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH

TRONG THỊT TƯƠI VÀ THỊT ĐÔNG LẠNH

Họ và tên sinh viên: VÕ THỊ HIỀN

Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN VÀ VI SINH THỰC PHẨM Niên khóa: 2007 - 2011

Tháng 08/2011

i

TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH

TRONG THỊT TƯƠI VÀ THỊT ĐÔNG LẠNH

Sinh viên thực hiện

VÕ THỊ HIỀN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành

Bảo quản và Chế biến Nông sản Thực phẩm và Vi Sinh Thực Phẩm

Giáo viên hướng dẫn:

TS Vũ Thị Lâm An

Tháng 8 năm 2011

ii

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm khoa Công nghệ thực phẩm cùng tất cả quý thầy cô đã tận tâm truyền đạt cho chúng tôi những kiến thức tổng quan cho đến kiến thức chuyên ngành trong suốt thời gian học tập tại trường

Đồng thời, tôi cũng gửi lời cảm ơn Ban Giám Đốc – Cơ Quan Thú Y Vùng VI, Ban Giám Đốc Trung Tâm Chuẩn Đoán Xét Nghiệm Bệnh Động Vật, cô Vũ Thị Lâm

An đã tạo điều kiên cho tôi được thực tập tại cơ quan, tôi đã được tiếp xúc thực tế với đầy đủ trang thiết bị hiện đại, chuyên dùng

Tôi xin chân thành cảm ơn anh Võ Minh Châu và các anh chị đang làm việc tại Trung Tâm đã tận tình chỉ dẫn cho tôi những kiến thức, kỹ năng thực tế, nó rất hữu ích cho tôi trong công việc sau này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng 8 năm 2011

Võ Thị Hiền

iii

TÓM TẮT

Đề tài “Tìm hiểu quy trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong thịt tươi và thịt đông lạnh” được tiến hành tại Trung tâm Chuẩn Đoán - Xét Nghiệm Bệnh động vật trực thuộc Cơ Quan Thú Y Vùng VI, thời gian từ ngày 7/3/2011 đến ngày 30/6/2011 với mục tiêu tìm hiểu quy trình kiểm nghiệm vi sinh đối với sản phẩm thịt tươi và thịt đông lạnh, đồng thời làm quen với điều kiện làm việc thực tế, cách giao tiếp ứng xử trong điều kiện làm việc nhóm

Trong quá trình thực tập tôi đã hiểu được các tiêu chuẩn và qui định được áp dụng tại Trung tâm CĐ - XN Bệnh động vật trong quy trình kiểm nghiệm vi sinh đối với các

sản phẩm có nguồn gốc động vật nói chung và sản phẩm thịt tươi và thịt đông lạnh nói riêng

Tham gia vào quy trình kiểm nghiệm các chỉ tiêu vi sinh trong sản phẩm thịt và các sản phẩm có nguồn gốc động vật, tôi đã nắm rõ được quy trình kiểm nghiệm vi sinh

vật tại trung tâm từ khâu chuẩn bị môi trường đến khâu tiến hành và trả kết quả phân tích Ngoài ra tôi còn nắm được những điểm cần lưu ý trong công tác kiểm nghiệm

iv

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Lời cảm ơn ii

Tóm tắt iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt v

Danh sách các bảng và danh sách các hình vi

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Nội dung của đề tài 2

1.4 Phương pháp của đề tài 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu về Cơ Quan Thú Y Vùng VI 3

2.2 Tổng quan về kiểm nghiệm vi sinh 6

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12

3.1 Tìm hiểu các quy định được áp dụng tại trung tâm 12

3.2 Quy trình kiểm nghiệm 15

3.2.1 Chuẩn bị môi trường kiểm nghiệm 15

3.2.2 Trích mẫu 15

3.2.3 Phương pháp kiểm nghiệm các chỉ tiêu vi sinh 16

3.3 Kết quả ghi nhận 29

3.3.1 Kết quả 29

3.3.2 Nhận xét 30

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

4.1 Kết luận 31

4.2 Đề nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC

v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BGBL: Brilliant Green Bile Broth

BP: Baird Parker Agar

BPW: Buffered Pepton Water

BYT: Bộ Y Tế

CĐ – XN: chuẩn đoán – xét nghiệm

CFU : Colony Formin Unit

ctv : cộng tác viên

E coli: Escherichia coli

FDA: Food anh Drug Administation

ISO: Internation Organization for Standardizion

LDC: Lysine Decarboxylation Medium

LT: Lauryl sufate broth

MR: Methyl red

MRD: Maxinum Recovery Diluent

NA: Nutrient Agar

PCA: Plate Count Agar

PTN: Phòng thí nghiệm

QĐ - BNN: Quyết định - Bộ Nông Nghiệp

QĐ: quyết định

S aureus: Staphylococcus aureus

SEM: Rappaport Vassiliadis

TCVN: tiêu chuẩn Việt Nam

TSC: Tryptose Sulfite Cycloserine agar

TSVKHK: Tổng số vi khuẩn hiếu khí

VP: Voges Proskauer

XLD: Xylose Lysine Desoxycholate Agar

vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Giới hạn cho phép vi sinh vật trong thịt 11

Bảng 3.2: Kết quả của nhóm thịt tươi và thịt đông lạnh 29

Bảng 3.3: Tỉ lệ nhiễm vi sinh vật của nhóm thịt tươi và thịt đông lạnh 29

DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Quy trình định lượng một số vi sinh vật 6

Hình 2.2: Quy trình định tính một số vi sinh vật 7

Hình 2.3: Khuẩn lạc Escherichia coli 9

Hình 2.4: Vi khuẩn Staphylococcus aureus 10

Hình 2.5: Vi khuẩn Salmonella 10

Hình 3.1: Quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí 19

Hình 3.2: Quy trình định lượng tổng số coliform và E coli 20

Hình 3.3: Khuẩn lạc của coliform và E coli trên môi trường 21

Chromocult Coliform Agar Hình 3.4: Quy trình định lượng coliform 22

Hình 3.5: Quy trình định lượng E coli 23

Hình 3.6: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD 25

Hình 3.7: Quy trình kiểm tra định tính Salmonella 26

Hình 3.8: Quy trình kiểm tra định lượng Clostridium perfringens 28

cơ này là các thành phần tích hợp của protein và không thể tổng hợp được trong cơ thể người - tạo nên khả năng cân bằng các thành phần và các hàm lượng Thịt và các sản phẩm thịt cũng là nguồn tuyệt hảo chứa các vitamin và chất khoáng cần thiết cho cơ thể

Tuy nhiên, thực tế hiện nay cho thấy để thực phẩm thực sự “chất lượng” và “an toàn” thì việc tuân thủ các biện pháp “an toàn vệ sinh thực phẩm” là một vấn đề đang rất cần được quan tâm, đặc biệt là trong tình hình ngộ độc thực phẩm ngày càng gia tăng trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng Một trong những nguyên nhân chủ yếu là do thực phẩm có chứa vi khuẩn gây bệnh, chúng xâm nhập vào cơ thể bằng đường tiêu hóa và tác động tới cơ thể do sự hiện diện của nó và chất độc do nó tạo ra

Do đó để đạt được những sản phẩm chất lượng và an toàn cho người tiêu dùng thì yêu cầu về kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm là cần thiết và là nhu cầu thiết yếu trong xã hội Trong đó, một trong những thực phẩm được kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh một cách nghiêm ngặt là thịt tươi và thịt đông lạnh nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm và đảm bảo cuộc sống con người Đồng thời ngăn chặn các mối nguy gây mất an toàn vệ sinh thực phẩm

2

Từ những nhận thức trên cùng với sự cho phép của khoa Công nghệ thực phẩm và

Cơ Quan Thú Y Vùng VI, tôi đã thực hiện khóa thực tập tại Trung tâm Chuẩn Đoán -

Xét Nghiệm Bệnh động vật với đề tài “Tìm hiểu quy trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong thịt tươi và thịt đông lạnh”

1.3 Nội dung của đề tài

Tìm hiểu các quy định và tiêu chuẩn kiểm nghiệm được áp dụng tại trung tâm Phân tích các chỉ tiêu vi sinh đối với các sản phẩm có nguồn gốc động vật, đặc biệt phân tích chỉ tiêu vi sinh trong thịt tươi và thịt đông lạnh

1.4 Phương pháp

Tham khảo tài liệu để hiểu về các quy định và tiêu chuẩn được áp dung tại trung tâm

Học hỏi kinh nghiệm của cán bộ nhân viên có chuyên môn kỹ thuật

Trực tiếp tham gia vào các công đoạn của quy trình kiểm nghiệm: chuẩn bị môi trường, quy trình phân tích

3

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu cơ quan thú y vùng VI

Căn cứ theo quyết định số 80/2006/QĐ - BNN ngày 18/09/2006, Cơ Quan Thú Y Vùng VI trực thuộc Cục Thú Y được thành lập trên cơ sở hợp nhất và tổ chức lại

Trung Tâm Thú Y vùng thành phố Hồ Chí Minh và Bộ phận thường trực của Cục Thú

Y tại thành phố Hồ Chí Minh

Cơ Quan Thú Y Vùng VI trụ sở tại 124 Phạm Thế Hiển, phường 2, Quận 8, thành phố Hồ Chí Minh

2.1.1 Chức năng và nhiệm vụ của cơ quan

Cơ Quan Thú Y Vùng VI thực hiện các chức năng và nhiệm vụ sau:

Cơ Quan Thú Y Vùng VI thực hiện chức năng quản lý nhà nước về thú y và chẩn đoán, xét nghiệm bệnh động vật, sản phẩm động vật tại vùng được phân công

Cơ Quan Thú Y Vùng VI có tư cách pháp nhân, có con dấu riêng, được hưởng kinh phí từ ngân sách Nhà nước, được mở tài khoản theo quy định của pháp luật Trụ sở của

Cơ Quan Thú Y Vùng VI đặt tại thành phố Hồ Chí Minh

Phạm vi hoạt động của Cơ Quan Thú Y Vùng VI gồm các tỉnh, thành phố trực thuộc Trung Ương: thành phố Hồ Chí Minh, Bà Rịa Vũng Tàu, Đồng Nai, Ninh Thuận, Bình Thuận, Bình Dương, Bến Tre, Bình Phước, Tây Ninh, Long An, Tiền Giang

Hướng dẫn, đôn đốc, kiểm tra việc thực hiện các văn bản quy phạm pháp luật, chương trình, dự án, tiêu chuẩn, quy trình kỹ thuật về thú y đối với các Chi Cục Thú Y cấp tỉnh

Cơ Quan Thú Y Vùng VI có nhiệm vụ và quyền hạn về việc phòng chống dịch bệnh động vật, kiểm dịch động vật, kiểm soát giết mổ và kiểm tra vệ sinh thú y Ngoài

ra còn tham gia tuyên truyền, phổ biến kiến thức, giáo dục pháp luật, thanh tra chuyên

2.1.2 Tổ chức bộ máy

Bao gồm Ban lãnh đạo Cơ Quan Thú Y Vùng VI, bộ máy quản lý và các trạm kiểm dịch, Trung Tâm Chuẩn Đoán - Xét Nghiệm trực thuộc Sơ đồ về tổ chức bộ máy ở Cơ Quan được thể hiện ở phụ lục 1

Mỗi bộ phận thực hiện các chức năng và nhiệm vụ riêng nhưng vẫn thống nhất trong việc thực hiện chức năng chung ở Cơ Quan Đặc biệt các trạm kiểm dịch thực hiện công tác lấy mẫu cần phân tích và vận chuyển về trung tâm chuẩn đoán để tiến hành phân tích các chỉ tiêu vi sinh

2.1.3 Chức năng và nhiệm vụ trung tâm chuẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật

Trung tâm Chuẩn Đoán – Xét nghiệm Bệnh động vật trực thuộc ở Cơ Quan Thú Y Vùng VI thực hiện các chức năng và nhiệm vụ sau:

Kiểm tra điều kiện vệ sinh thú y nơi cách ly kiểm dịch động vật, theo dõi cách ly kiểm dịch động vật, sản phẩm động vật xuất khẩu, nhập khẩu theo hướng dẫn của Cục Thú Y

Kiểm tra điều kiện vệ sinh thú y đối với các cơ sở giết mổ, bảo quản, sơ chế động vật, sản phẩm động vật xuất khẩu, nhập khẩu và các cơ sở chăn nuôi theo sự phân công của Cục trưởng Cục Thú Y

Kiểm tra vệ sinh thú y động vật, sản phẩm động vật xuất khẩu, nhập khẩu, chuyển cửa khẩu, tạm nhập tái xuất, tạm xuất tái nhập, quá cảnh, mượn đường Việt Nam Tham gia tuyên truyền, phổ biến kiến thức, giáo dục pháp luật, thanh tra chuyên ngành thú y Tham gia thực hiện khuyến nông và vệ sinh an toàn thực phẩm trong lĩnh vực thú y tại các tỉnh trong vùng

Tham gia nghiên cứu, ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật và hợp tác quốc tế theo chương trình, kế hoạch của Cục Thú Y Phối hợp với Chi Cục Thú Y các tỉnh trong vùng tổ chức đào tạo, bồi dưỡng kỹ thuật, nghiệp vụ về thú y

5

Qua sơ đồ tổ chức bộ máy ở cơ quan, Trung tâm CĐ - XN Bệnh động vật gồm các

tổ chuyên môn: mỗi tổ thực hiện nhiệm vụ riêng nhưng vẫn thống nhất và đảm bảo về công tác vệ sinh thú y Trong đó tổ vi sinh là tổ trực tiếp thực hiện chức năng chính về

vệ sinh thú y (Trung tâm CĐ – XN Bệnh động vật, 2011)

Chức năng tổ vi sinh

Thực hiện chuẩn đoán, xét nghiệm xác định bệnh động vật, các chỉ tiêu vệ sinh thú

y đối với sản phẩm có nguồn gốc động vật thuộc lãnh vực vi sinh, xét nghiệm mẫu phục vụ công tác chuẩn đoán bệnh động vật, kiểm dịch động vật và sản phẩm động vật xuất nhập khẩu Chịu trách nhiệm trên kết quả chuẩn đoán và xét nghiệm đã thực hiện Tiếp nhận, phân loại mẫu là sản phẩm có nguồn gốc động vật, phối hợp với các tổ, phòng chuyên môn khác để tổ chức thực hiện xét nghiệm các chỉ tiêu vệ sinh thú y Quản lý hồ sơ chuyên môn kỹ thuật, kết quả xét nghiệm phục vụ kiểm dịch xuất nhập khẩu Tổng hợp, nhận định và báo cáo kết quả xét nghiệm phục vụ kiểm dịch xuất nhập khẩu theo quy định

Thực hiện công tác phối hợp với phòng dịch tễ, phòng kiểm dịch của Cơ Quan Thú

Y Vùng VI và các Chi Cục Thú Y trong việc chuẩn đoán xác định bệnh, phòng chống dịch bệnh động vật theo phân công của Giám Đốc Cơ Quan Thú Y Vùng VI

Tham gia kiểm tra, đánh giá tình trạng vệ sinh thú y kho chứa hàng hóa sản phẩm động vật theo phân công của Giám Đốc Cơ Quan Thú Y Vùng VI

Tổ chức lưu trữ các mẫu sản phẩm có nguồn gốc động vật sau khi xét nghiệm theo quy định (Quan Tuyết Anh, 2010)

Từng bước xây dựng và áp dụng hệ thống quản lý chất lượng theo tiêu chuẩn ISO 17025 để đảm bảo chất lượng của các kết quả xét nghiệm

Trung tâm tiếp nhận mẫu từ các trạm kiểm dịch sau đó tiến hành kiểm nghiệm các chỉ tiêu vi sinh Trung tâm chủ yếu kiểm nghiệm các mẫu sản phẩm có nguồn gốc từ động vật: thịt và các sản phẩm từ thịt, sữa và các sản phẩm từ sữa, cá và các sản phẩm

từ cá, thủy sản, thức ăn gia súc…

Các chỉ tiêu vi sinh được kiểm nghiệm chủ yếu đối với các sản phẩm có nguồn gốc

động vật: Salmonella, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus

aureus , tổng số vi khuẩn hiếu khí, coliforms, Escherichia coli, Clostridium

perfringens, Vibrio parahaemolyticus

6

Đối với thịt tươi và thịt đông lạnh kiểm tra các chỉ tiêu: tổng số vi khuẩn hiếu khí,

coliforms, E coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium perfringens

Các mẫu thịt ngoài kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh còn kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan

và lý hóa

• Trạng thái cảm quan: hình dạng, cấu trúc, màu sắc và mùi vị bình thường

• Chỉ tiêu lý hóa: pH, phản ứng H2S, phản ứng amoniac, phản ứng với giấy quỳ…

• Chỉ tiêu côn trùng sống đối với các sản phẩm lông vũ, bột vỏ cua,…

2.2 Tổng quan về kiểm nghiệm vi sinh

2.2.1 Quy trình kiểm tra chung đối với sản phẩm thực phẩm

Theo các tiêu chuẩn quy định về mật độ cho phép của các vi sinh vật trong thực phẩm thay đổi tùy theo nhóm vi sinh vật cần phân tích, đối tượng thực phẩm, tiêu chuẩn về vệ sinh an toàn thực phẩm của từng nước Thông thường, tiêu chuẩn quy định mật độ vi sinh vật cho phép hiện diện trong một khối lượng thực phẩm xác định, trong trường hợp này cần tiến hành định lượng mật độ vi sinh vật hiện diện trong mẫu kiểm.Quy trình định lượng môt số vi sinh vật được thể hiện ở Hình 2.1

Mẫu

Tiền tăng sinh

Pha loãng mẫu

Cấy trên môi trường định lượng

Ủ (điều kiện thích hợp)

Xác định tổng số

Hình 2.1: Quy trình định lượng một số vi sinh vật

Phương pháp định lượng vi sinh vật cho phép xác định số lượng vi sinh vật trong mẫu Đầu tiên mẫu được tiền tăng sinh bằng các môi trường tăng sinh như

7

Peptone đệm (Buffered Peptone Water) nhằm phục hồi và tăng sinh số lượng vi sinh vật ban đầu có trong mẫu kiểm nghiệm Sau đó mẫu có thể được pha loãng theo các nồng độ khác nhau như 10-1

, 10-2, 10-3,… tùy theo mức độ nhiễm dự kiến ban đầu của mẫu kiểm nghiệm sử dụng pipet vô trùng để pha loãng Sau khi pha loãng mẫu sẽ được cấy trên môi trường định lượng chọn lọc cho từng loại vi sinh, có thể sử dụng phương pháp đổ đĩa hoặc cấy trang Sau đó tiến hành ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp Quan sát và đọc kết quả phân tích vi sinh có thể sử dụng các dụng cụ đếm để có kết quả chính xác

Đối với vi sinh vật gây bệnh, mức độ nguy hiểm cao, tiêu chuẩn thường quy dịnh không cho phép có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh trong một đơn vị khối lượng thực phẩm nhất định Trong trường hợp này cần định tính sự hiện diện của vi sinh vật Quy trình định tính một số vi sinh vật được thể hiện ở Hình 2.2

8

phần chỉ thị giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối tượng vi sinh vật mục tiêu Tiếp đến mẫu sẽ được khẳng định bằng các môi trường sinh hóa Dựa trên kết quả sinh hóa sẽ kết luận phát hiện hoặc không phát hiện vi sinh vật trong mẫu thử nghiệm

2.2.2 Các chỉ tiêu vi sinh cần kiểm nghiệm đối với sản phẩm thịt tươi và thịt

đông lạnh

2.2.2.1 Tổng vi khuẩn hiếu khí

Tổng vi khuẩn hiếu khí là tất cả các vi khuẩn có thể tồn tại và phát triển được trên môi trường dinh dưỡng, ở nhiệt độ 30 oC sau một thời gian nuôi cấy nhất định trong điều kiện hiếu khí

Xác định tổng số vi sinh vật có trong sản phẩm thực phẩm để đánh giá mức độ tạp nhiễm của nguyên liệu và sản phẩm, từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm

2.2.2.2 Vi sinh vật chỉ thị an toàn vệ sinh thực phẩm

Coliforms Theo nghĩa rộng coliforms là một nhóm vi sinh vật bao gồm các giống như

Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella Coliforms là những vi khuẩn hình que, hiếu khí hay kị khí tùy ý, Gram (-), không tạo bào tử, lên men đường lactose và sinh hơi ở 37 o

C trong môi trường nuôi cấy lỏng (Trần Linh Thước, 2008)

Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm coliforms được chia thành hai nhóm nhỏ là

coliform và coliforms phân Coliforms được coi là vi sinh vật chỉ thị vệ sinh vì nếu chúng có mặt trong mẫu thực phẩm với số lượng nhất định thì mẫu thực phẩm đó có khả năng bị nhiễm nước nhiễm phân và có khả năng chứa các vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong phân Coliforms phân là những coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 h khi được ủ ở 37 oC trong môi trường canh BGBL (Nguyễn Tiến Dũng, 2007)

Coliforms phân có nguồn gốc từ ruột người và động vật máu nóng, coliform nhiễm

từ nước có nhiễm phân hoặc thực phẩm nhiễm phân Các triêu chứng chủ yếu là: đau bụng dữ dội, nôn mửa, đi phân lỏng, thân nhiệt bình thường hoặc sốt nhẹ, Chân co quắp (Lương Đức Phẩm, 2000)

9

Escherichia coli (E coli)

E coli thuộc họ vi sinh vật đường ruột Enterobacteriaceae Đặc điểm hình thái: E

coli có hình que, Gram (-), hai đầu tròn, không tạo bào tử, có hay không có giáp mô Một số chủng có lông bám, kích thước dài ngắn khác nhau, từ 0,5 μm×1-3 μm Kết

quả nhuộm Gram khuẩn lạc Escherichia coli được thể hiện ở Hình 2.3

Hình 2.3: Khuẩn lạc Escherichia coli

E coli sống trong ruột già của người và động vật và chỉ trở nên gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ theo phân người, gia súc ra thiên nhiên và nhiễm vào thực phẩm (Nguyễn Minh Hiền, 2009) Các triệu chứng như: tiểu lắt nhắt, tiểu đau, tiểu ra máu,

tiểu ra mủ, gây nhiễm khuẩn máu E coli có khả năng gây bệnh viêm màng não

(khoảng 40% trường hợp viêm màng não ở trẻ sơ sinh) và gây bệnh tiêu chảy (Lương Đức Phẩm, 2000)

2.2.2.3 Vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm

Staphylococcus aureus ( thuộc họ Micrococcaceae)

Đặc điểm hình thái: là tụ cầu khuẩn Gram (+), hiếu khí hay kị khí tùy ý, không di động, không sinh bào tử, có hay không có giáp mô Kích thước 0,8 - 1,2 μm Tế bào của chúng thường sắp xếp thành dạng chùm nho (Nguyễn Minh Hiền, 2009)

10

Kết quả nhuộm Gram khuẩn lạc Staphylococcus aureus được thể hiện ở Hình 2.4

Hình 2.4: Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus sản sinh một số độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt,

không bị phân hủy ở 100 o

C trong 30 phút Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4 - 6 giờ người ngộ độc có triệu chứng tiêu chảy nôn mửa kéo dài từ 6 - 7 giờ

(Trần Linh Thước, 2008)

Salmonella ( thuộc họ Enterobacteriaceae)

Đặc điểm hình thái: là các trực khuẩn Gram (-), kích thước 1 - 2 μm, có khả năng

di động, không có khả năng hình thành giáp mô và bào tử Kết quả nhuộm Gram

khuẩn lạc Salmonella được nhuộm Gram ở Hình 2.5

Hình 2.5: Vi khuẩn Salmonella

Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa: là loài hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp 37 oC, pH thích hợp 7,2 - 7,6 Lên men sinh hơi đường glucose, mannitol, sorbitol , không lên men lactose, salicin, raffinose Phản ứng dương tính: MR, citrate,

H2S, LDC Phản ứng âm tính: Indol, VP, ure

11

Salmonella gây bệnh cho người: bệnh Salmonellosis (sốt thương hàn do chúng nhiễm vào đường máu) và bệnh viêm dạ dày ruột cấp tính do ngộ độc thực phẩm (Nguyễn Minh Hiền, 2009) Nguồn lây nhiễm thường là phân người hay phân động vật, được nhiễm gián tiếp hoặc trực tiếp

Clostridium perfringens (Thuộc họ Clostridiaceae)

Đặc điểm hình thái: trực khuẩn hai đầu vuông, gram (+), yếm khí tuyệt đối, kích thước 1×3×9 μm, không có tiêm mao nên không di động, có khả năng hình thành bào

tử trong môi trường trung tính hoặc hơi kiềm

Tính chất nuôi cấy và sinh hóa: là loài yếm khí tuyệt đối, phát triển ở pH 6,0 - 7,5 Nhiệt độ phát triển là 12 - 50 oC, phát triển mạnh ở 43 - 47 oC Môi trường Tryptose Sulfite Cyclserine: khử sulfite thành sulfur tạo khuẩn lạc màu đen Môi trường đường: lên men sinh hơi glucose, fructose, galactose, lactose, raffinose, maltose, saccharose Không lên men salicin, mannitol, glycerin Phản ứng dương tính: H2S, nitrate (Trần Thị Ngọc Quỳnh, 2010)

Clostridium perfringens gây ngộ độc thực phẩm, bào tử của chúng sống sót qua quá trình nấu chín và các bào tử sống sót này khi gặp điều kiện thích hợp (độ ẩm và nhiệt độ) sẽ nảy mầm, tăng trưởng Các triệu chứng ngộ độc do độc tố là đau thắt vùng

bụng, tiêu chảy thời gian ủ bệnh 12 - 24 giờ Phần lớn các vụ ngộ độc thực phẩm do

Clostridium perfringens gây nên là do ăn các thực phẩm nấu xong để nguội, trong các bữa cổ tiệc như thịt sấy hun, thịt viên,… (Nguyễn Phùng Tiến và ctv, 2003)

12

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tìm hiểu các quy định được áp dụng tại trung tâm

Qua quá trình thực tập ở Trung Tâm tôi đã tìm hiểu một số tiêu chuẩn được áp dụng ở Trung Tâm về giới hạn vi sinh vật cho phép trong mẫu thịt, các quy định về lấy mẫu, tiếp nhận, bảo quản… như sau:

3.1.1 Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong thịt theo Bộ Y tế số

46/2007/QĐ-BYT

Chỉ tiêu vi sinh vật có trong thịt tươi, thịt đông lạnh theo quyết định số 46/2007/QĐ - BYT được trình bày cụ thể ở Bảng 3.1

Bảng 3.1: Giới hạn cho phép vi sinh vật trong thịt

13

3.1.2 Lấy mẫu

Cán bộ kiểm dịch là bộ phận tiến hành lấy mẫu, mẫu phải là lượng sản phẩm được trích từ lô hàng đồng nhất với số lượng nhỏ có tính ngẫu nhiên, phân bố nhiều vị trí trong lô hàng đồng nhất và mang tính đại diện cho lô hàng

Sau khi lấy mẫu, mẫu sẽ được vận chuyển về phòng thí nghiệm Việc vận chuyển mẫu tới phòng thí nghiệm phải đảm bảo giữ được mẫu không bị biến đổi do sự có mặt các vi sinh vật Vận chuyển mẫu tới phòng thí nghiệm bằng phương pháp nhanh nhất trong vòng 24 h Mẫu phải được bảo quản đúng nhiệt độ trong quá trình vận chuyển

• Đối với sản phẩm tươi và sản phẩm được giữ lạnh nhiệt độ: 0 oC đến +4

Chú ý: Các thực phẩm dễ bị ôi hỏng (thí dụ như nội tạng và cá tươi) phải bảo quản

ở nhiệt độ 0 oC đến +2 oC Các mẫu “ổn định” đã hỏng phải được vận chuyển trong bao bì kín để tránh rò rỉ

Các trạm kiểm dịch sử dụng các phương tiện khác nhau tùy từng loại sản phẩm để vận chuyển mẫu về Trung tâm CĐ-XN Bệnh động vật đồng thời gởi các phiếu yêu cầu xét nghiệm cho nhân viên phòng thí nghiệm

3.1.3 Tiếp nhận và bảo quản

Nhân viên phòng thí nghiệm tiếp nhận phiếu yêu cầu xét nghiệm và mẫu thử nghiệm Phải tiến hành kiểm tra trạng thái của mẫu khi tiếp nhận Nếu trạng thái không đảm bảo hoặc nếu mẫu không đủ, thông thường phòng thí nghiệm không được tiếp nhận mẫu đó Trong trường hợp đặc biệt, nhân viên phòng thử nghiệm có thể phân tích chúng nhưng phải lưu giữ báo cáo về tính chất hợp lệ của kết quả

Mẫu được nhận vào phòng thí nghiệm được ghi chép đầy đủ sao cho có thể kiểm soát được suốt quá trình đến khi trả kết quả kiểm nghiệm Các mẫu sau khi tiếp nhận

sẽ được ghi nhận các thông tin như: ngày nhận mẫu, tên và địa chỉ của bên yêu cầu xét nghiệm, đặc trưng của mẫu…

14

Đối với các mẫu chờ kiểm nghiệm phải bảo quản ở các điều kiện không làm thay đổi số lượng vi sinh có trong mẫu Đặc biệt chú ý đến nhiệt độ bảo quản và việc kiểm tra hạn cuối của sản phẩm

3.1.4 L ưu mẫu và hủy mẫu thí nghiệm

Thời gian lưu mẫu là 30 ngày tính từ ngày Trung Tâm thông báo kết quả cho khách hàng Hết thời gian nói trên Trung Tâm sẽ thanh lý các mẫu lưu, khách hàng không có quyền khiếu nại về chất lượng lô hàng đã kiểm nghiệm Mẫu phải được bao gói trong vật đựng vô trùng như túi chất dẻo

Nhiệt độ lưu mẫu của từng loại sản phẩm dựa trên khuyến cáo về nhiệt độ bảo quản ghi trên bao bì của cơ sở sản xuất Sản phẩm lạnh đông lưu -18 o

C (ở trung tâm thường lưu ở -24 oC) Sản phẩm trữ lạnh 0 - 4 o

Thời gian khách hàng nhận mẫu lại tối đa là 7 ngày kể từ ngày Trung Tâm thông báo kết quả Nếu quá thời hạn khách hàng phải đóng tiền lưu kho và bảo quản Nếu quá 30 ngày thì trung tâm lập biên bản thanh lý số hàng trên

Đối với lô hàng có đơn vị bao gói ≤ 3 kg lấy nguyên đơn vị bao gói để chuyển về trung tâm trích mẫu xét nghiệm Trong trường hợp này trung tâm không trả mẫu cho khách hàng (Nguyễn Văn Ý, 2009)

15

3.2 Quy trình kiểm nghiệm

3.2.1 Chuẩn bị môi trường

Theo mặt bằng tổng thể ở cơ quan phòng chuẩn bị môi trường nằm tách biệt với phòng vi sinh nhằm tránh tạp nhiễm trong quá trình chuẩn bị môi trường

Các cán bộ nhân viên theo dõi môi trường còn lại sau quá trình phân tích mỗi ngày

để chuẩn bị môi trường mới phục vụ cho công tác phân tích mẫu mới Đồng thời kiểm tra chất lượng môi trường nhằm loại bỏ các môi trường có hiện tượng bị tạp nhiễm để

có biện pháp xử lý kịp thời ngăn chặn sự gián đoạn trong công tác kiểm nghiệm

Đối với những môi trường phải hấp tiệt trùng autoclave phải theo dõi quá trình hấp nhằm tránh những trường hợp xảy ra ngoài ý muốn như: mất điện đột ngột Cán bộ nhân viên phải khởi động lại máy tránh hư hỏng môi trường Các môi trường sau khi hấp autoclave sẽ được nhân viên chuyên môn đưa đến các vị trí theo quy định Những môi trường khác nhau sẽ được bảo quản theo quy định của các nhà sản xuất Những môi trường thạch không cần hấp autoclave sau khi tiến hành đỗ đĩa đến khi thạch đông phải bảo quản môi trường ở nhiệt độ 0 - 4 o

Do không đủ điều kiện nên các môi trường vẫn được bảo quản chung với các mẫu

để phân tích trong tủ mát có thể dẫn đến ảnh hưởng đến chất lượng môi trường

3.2.2 Trích mẫu

Việc trích mẫu, ghép mẫu được thực hiện trong phòng trích mẫu nhằm tránh tạp nhiễm giữa môi trường và phần mẫu thử Phòng trích mẫu, dụng cụ trích mẫu phải được đảm bảo khử trùng theo quy trình kỹ thuật Sau khi trích mẫu xong phòng trích mẫu và dụng cụ trích mẫu sẽ được vệ sinh và khử trùng và bật tia UV khoảng 30 phút

16

Các mẫu sẽ được mã hóa theo số của trung tâm nhằm thu được kết quả khách quan Nhân viên trích mẫu tại trung tâm phải đánh dấu cẩn thận số ký hiệu đã mã hóa của mẫu thử lên dụng cụ chứa mẫu như bao PE, phải ghi rõ ngày trích mẫu để kiểm soát mẫu trong quá trình lưu Đối với đồ hộp dạng lỏng (thịt hộp, cá hộp…) thì sau khi ghép các hộp, nhóm sản phẩm với nhau chuyển sang bộ phận vi sinh để tiến hành thử nghiệm Trung tâm trích mẫu theo nguyên tắc từ các loại mẫu ít vấy nhiễm trước sang các loại mẫu vấy nhiễm nhiều hơn nhằm tránh lây nhiễm chéo trong quá trình trích mẫu (Trần Thị Ngọc Quỳnh, 2010)

Nhân viên trích mẫu phải khử trùng tay bằng cồn trước khi tiến hành trích mẫu Dùng kẹp vô trùng, lấy một khối lượng mẫu nhất định (200 g – 1000 g) cho vào túi PE

vô trùng, các dụng cụ dùng để mở bao gói cũng được vô trùng Chú ý không để mẫu chạm vào miệng túi

Quy định ghép mẫu phân tích:

+ Trộn đều các mẫu ban đầu và gộp thành mẫu chung bằng cách lấy một khối lượng mẫu bằng nhau ở mỗi mẫu ban đầu ghép lại thành mẫu chung Trộn đều mẫu chung và từ mẫu chung lấy ra: Mẫu trung bình thử nghiệm, mẫu lưu cho PTN bảo quản chiếm gấp đôi mẫu trung bình thử nghiệm

+ Khối lượng mẫu trung bình thử nghiệm tối thiểu 100 g

+ Việc ghép các mẫu lại với nhau trong lô hàng không đồng nhất phải được thể hiện trên phiếu trả lời kết quả xét nghiệm

Mẫu sau khi được trích chuyển sang phòng vi sinh để tiến hành chuẩn bị mẫu Trong quá trình trích mẫu thường xảy ra các trường hợp: trường hợp có mẫu nhưng không có hồ sơ (phiếu yêu cầu xét nghiệm) các nhân viên phòng thí nghiệm phải làm việc với các cán bộ trích mẫu để nhận được đầy đủ thông tin về mẫu Các mẫu có hồ sơ nhưng không có mẫu sẽ được đánh dấu ghi chú để có thể kiểm tra sau (Trung tâm Thú Y vùng TPHCM, 2009)

3.2.3 Phương pháp kiểm nghiệm các chỉ tiêu vi sinh

Chuẩn bị mẫu: cân 25 g hoặc 10 g mẫu thịt (tùy theo chỉ tiêu vi sinh phân tích)

cho vào bao PE vô trùng, thêm 225 ml nước peptone đệm (Buffered Pepton Water), dập mẫu thịt trong 30 giây Ta được dịch mẫu có độ pha loãng 10-1 Sử dụng cân điện

tử với độ chính xác cao và thao tác cân phải có độ chính xác, tránh tạp nhiễm Sử dụng

17

kéo, kẹp, muỗng vô trùng trong quá trình cân Trước khi tiến hành bàn chuẩn bị mẫu phải được khử trùng bằng cồn 75o và đèn gas được bật trong suốt quá trình nhằm tạo ra

và duy trì một vùng bảo vệ quanh điểm nóng

Pha loãng mẫu theo tiêu chuẩn ISO 6887/1999 tùy theo mức độ nhiễm dự kiến ban đầu của mẫu thử, tiếp tục pha loãng mẫu để được các lũy thừa tiếp theo bằng cách dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch mẫu có độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước muối vô trùng MRD (Maxinum Recovery Diluent) sẽ có được dịch mẫu ở nồng độ pha loãng 10-2

, 10-3… Pha loãng mẫu được tiến hành trên bàn phân tích mẫu, bàn phân tích mẫu đã được khử trùng và cũng bật đèn gas

3.2.3.1 Định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí

Phương pháp: ISO 4833 : 2003(E)

Nguyên tắc: Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một

lượng mẫu xác định trên cơ sở coi mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào vi sinh

vật duy nhất Môi trường nuôi cấy: Nutrient agar hoặc Plate Count Agar

Tiến hành

Cấy mẫu: với mẫu thịt nuôi cấy ít nhất 2 nồng độ pha loãng liên tiếp tùy mức nhiễm dự kiến ban đầu của mẫu (đa số các mẫu thịt trâu và thịt bò ở trung tâm tiến hành nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-3

, 10-4các mẫu thịt còn lại đều được nuôi cấy ở nồng độ 10-2

), mỗi nồng độ 2 đĩa Thời gian từ khi pha loãng mẫu tới khi cấy không quá 20 phút

Dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-2 cho vào giữa đĩa petri đã được ghi nhãn (số mã hóa) Sử dụng pipet riêng cho mỗi độ pha loãng, rót vào mỗi đĩa khoảng 15 ml thạch Nutrient Agar hoặc Plate Count Agar đã được chuẩn

bị ở phòng môi trường và được giữ ở bể ổn nhiệt có nhiệt độ 48,3 oC Lắc tròn đĩa xuôi

và ngược theo chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 lần Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên Khi môi trường đã đông, lật úp đĩa và đặt vào tủ ấm 30 o

C/24 h