Giáo trình kỹ thuật nhân giống invitro

Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro o 0 o Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi



Giáo trình công nghệ

sinh học

Kỹ thuật nhân giống in

vitro

Chuyên đề 3 Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro

o 0 o

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng

Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Bao gồm:

+ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành + Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh + Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành

+ Nuôi cấy mô sẹo (callus) + Nuôi cấy tế bào đơn + Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi

đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần

Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm

(in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm (in vivo)

Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm Đây là hướng đang được ứng dụng rộng rãi Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp

*Cơ sở khoa học

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân hoá

- Tính toàn năng của tế bào:

Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một

cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều

có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào Qua đó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản phân hoá

- Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào

+ Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu,

mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã trải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt

+ Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá thành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào

Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân…thì giai đoạn tạo

mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân… trước đó

Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên hoá được biểu diễn theo sơ đồ sau:

Phân hoá tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá

Phản phân hoá tế bào

Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và một số gen khác bị ức chế Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen để hình thành một các thể mới Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

*Các ứng dụng

Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn thực sự Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn Mô nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối

tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền

Ứng dụng:

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống

- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các loại cây trống khác nhau

+ Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt + Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa các loại cây trồng khác

+ Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus + Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trong điều kiện tự nhiên, hoặccác cây dễ bị giao phấn

Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền, cúc…), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà phê…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa sợi…) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất

*Các bước trong nhân giống in vitro

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm

tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro

Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu

Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt

Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá

Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro

Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975)

Khoai tây: mầm (Morel, 1952)

Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976)

Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)

Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978)

Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng

để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được

tốc độ sinh trưởng nhanh Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br… Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:

Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962)

Chất hữu cơ: đường sarcaroza

Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit

Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3)

Bước 3: nhân nhanh

Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính

Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi

Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoá chồi (Weiss và Jaffe, 1969) Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối…

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưng chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ Vì vậy, cần chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển

từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây…)

- Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều kiênj tự nhiên, mở nắp bình nuôi…

Chuyển gen mã hoá vỏ protein của virus: Virus có cấu tạo 2 phần, gồm lõi acidnucleic (ADN hoặc ARN) và vỏ protein Khi có mặt gen mã hoá protein vỏ sẵn trong tế bào sẽ gây hiệu ứng ngăn chặn sự lột vỏ của virus khi xâm nhập tế bào chủ, kìm hãm sự nhân lên của virus Dựa trên cơ chế này, người ta đã chuyển gen mã hoá

vỏ protein của nhiều lại virus vào các đối tượng cây trồng khác nhau tạo nên các giống kháng virus như: đu đủ kháng bệnh đốm vòng PRSV, cây chống chịu virus khảm alfalfa (AMV), virus khảm dưa chuột (CMV), khoai tây kháng virus X, xoăn

lá khoai tây, chuối kháng virus gây bệnh bó đọt

Chiến lược tạo giống kháng virus thứ hai là sử dụng gen mã hoá replicase của virus Replicase là một enzyme giúp virus tổng hợp acid nucleic trong tế bào vật chủ Cây được chuyển gen chứa một đầu nhất định của gen replicase sẽ tổng hợp phân tử ARN nhỏ chứa một điểm nhận biết để liên kết với replicase Do đó phân tử này cạnh tranh với ARN của virus trong quá trình liên kết với enzyme replicase Nếu

tế bào thực vật sao mã đủ loại ARN này thì có khả năng ức chế quá trình nhân của virus

Khả năng thứ ba là sử dụng các gen có trình tự ngược chiều (anti sense) với các gen nhất định của virus Gen có trình tự ngược sao mã mARN có trình tự bổ sung với ARN của virus ARN ngược chiều can thiệp trực tiếp vào sự biểu hiện gen của virus bằng cách kết hợp với ARN của virus tạo thành phân tử kép, ngăn cản quá trình dịch mã hay sự vận chuyển ARN từ nhân ra tế bào chất

b) Ví dụ:

Những cây trồng chuyển gen kháng virus trồng diện tích lớn trên thế giới gồm thuốc lá, cà chua, bí đỏ và đu đủ (James và Krattiger, 1996; James, 1997)

Một số thành tựu khác trong chuyển gen kháng virus:

Cây

trồng

Gen ngoại Phương pháp chuyển gen Tính trạng biểu hiện

Cà chua CP-TMV Thông qua Agrobacterium Kháng virus khảm thuốc

lá Lúa CP-stripe Xung điện protoplast Kháng lại virus sọc

2 Chuyển gen kháng nấm:

3 Chuyển gen kháng vi khuẩn:

III/ Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ:

Trong nền nông nghiệp hiện nay, việc sử dụng thuốc trừ cỏ đang trở nên phổ biến, thay thế cho các phương pháp làm cỏ truyền thống khác Tuy nhiên chúng ta cũng phải đặt ra câu hỏi: “thuốc trừ cỏ tiêu diệt cỏ dại thì có tiêu diệt cả cây trồng hay không?” Để việc sử dụng thuốc trừ cỏ không làm ảnh hưởng đến cây trồng, chúng ta phải tạo ra các loại cây trồng có tính kháng thuốc trừ cỏ Công nghệ chuyển

gen đã có thể làm được điều này Chúng ta sẽ đưa các gen kháng được thuốc trừ cỏ vào bộ gen của cây trồng

1 Cơ chế chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ:

Trước hết, chúng ta phải hiểu cơ chế tác động của thuốc trừ cỏ Thuốc trừ cỏ

có thể kìm hãm sinh tổng hợp thực vật, kìm hãm sinh hô hấp, kìm hãm sự chuyển hoá acidnucleic, gây rối loạn phân chia tế bào, kìm hãm sinh tổng hợp lipid, kìm hãm sinh tổng hợp amino acid

Cơ chế chung của việc chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ đó là chuyển vào cây trồng những gen có khả năng sản xuất dư thừa loại protein (enzyme) mẫn cảm với thuốc trừ cỏ, bảo đảm đủ lượng cần thiết cho các chức năng của tế bào khi có mặt của thuốc; hoặc làm giảm khă năng liên kết của protein mẫn cảm với thuốc bằng cách thay đổi cấu trúc protein; hoặc trang bị cho cây khả năng làm mất hoạt tính chuyển hoá của thuốc trừ cỏ

Sản xuất dư thừa protein (enzyme) mẫn cảm với thuốc trừ cỏ đã được áp dụng với nhiều cây trồng để tăng tính kháng thuốc trừ cỏ, Ví dụ Phosphinothricin (tên thương phẩm là Basta) và bialaphos Phosphinothricin ức chế enzyme tổng hợp glutamin (glutamin synthaza – GS) Ức chế GS gây ra sự tích luỹ amonia nhanh chóng trong cây làm cho cây chết Tăng sự tổng hợp GS trong cây lên nhiều lần có thể khắc phục được tác động của thuốc trừ cỏ De Block (1987) đề xuất một chiến lược liên quan tới một enzyme có khả năng khử độc của thuốc trừ cỏ Basta Gen Bar phân lập từ Steptomyces hygroscopicus tham gia vào quá trình sinh tổng hợp bialaphos và mã hoá enzyme phosphinothricin axetyltranferase (PAT) Enzyme này axetyl hoá nhóm NH2 tự do của phosphinothricin và làm cho cây không bị ngộ độc

Đột biến của gen protein mục tiêu làm mất khả năng liên kết của thuốc trừ cỏ cũng tăng khả năng kháng hay chịu thuốc trừ cỏ, chẳng hạn như thuốc trừ cỏ glyphosate, atrazine và sulphonylurea

2 Ví dụ:

Một số cây trồng chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ được trồng trên quy mô lớn: đậu tương, ngô, bông, cải dầu, thuốc lá

Một số thành tựu trong chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ:

Cây

trồng

Gen ngoại Phương pháp chuyển gen Tính trạng biểu hiện

Lúa Bar Chuyển qua protoplast

trong môi trường đệm PEG

Kháng thuốc trừ cỏ Basta (phosphinothrricin)

Lúa Bar Bắn gen vào tế bào nuôi

cấy dạng huyền phù

Kháng thuốc trừ cỏ Basta (phosphinothrricin)

Lúa mỳ Bar Bắn gen vào callus đang

hình thành phôi

Kháng thuốc trừ cỏ Basta (phosphinothrricin)

Ví dụ về chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ Glyphosate và Glufosinate:

Glyphosate và Glufosinate là những loại thuốc diệt cỏ kiểm soát hầu hết các loại cây xanh khác Hai loại thuốc diệt cỏ này rất hữu hiệu trong việc kiểm soát có dại và ít ảnh hưởng trực tiếp lên vật nuôi cũng như không tồn tại lâu trong đất Chúng có hiệu quả cao nhất và an toàn nhất trong số những hoá chất dùng trong nông nghiệp Tuy nhiên chúng vẫn ảnh hưởng xấu tới cây trồng Những loại thuốc diệt cỏ này nhắm vào một số enzyme chủ yếu trong quá trình trao đổi chất của cây trồng, phá vỡ quá trình sản xuất ra thức ăn cho cây và cuối cùng là tiêu diệt nó

Cây trồng kháng thuốc diệt cỏ Glyphosate:

Cơ chế hại của thuốc là kìm hãm hoạt động của một enzyme enol pyruvat sikimat phosphat synthetase (EPSPS), biến đổi sản phẩm quang hợp thành acid mạch vòng sikimic Khi acid này không hình thành sẽ gây rối loạn toàn bộ quá trình trao đổi chất ở thực vật, dẫn đến cây chết Người ta tìm ra gen mã hoá EPSPS từ vi sinh vật hoặc từ một số thực vật có hoạt tính rất cao, sau đó cải biến chúng và chuyển nạp cho cây trồng Kết quả tạo ra cây có hàm lượng hoạt tính của enzyme EPSPS cao hơn gấp 4 lần so với cây bình thường và hoàn toàn chống chịu được với thuốc Glyphosate Ngoài ra, người ta còn có thể đưa vào cây trồng một gen của vi sinh vật khác tạo ra enzyme làm suy biến Glyphosate

Cây trồng kháng thuốc Glufosinate:

Thuốc diệt cỏ Glufosinate chứa thành phần kích hoạt phosphinothrcin tiêu diệt thực vật bằng cách phong toả enzyme chịu trách nhiệm trong quá trình chuyển hoá nitơ và giải phóng chất độc amoniac, một dẫn xuất của quá trình chuyển hoá của thực vật Cây trồng biến đổi gen chịu được Glufosinate có chứa một gen của vi khuẩn tạo ra loại enzyme giải phóng chất phosphinothrcin và ngăn chặn chúng không bị phá huỷ