Kỹ thuật nhân giống vô tính invitro

II/ Tính cấp thiết của kỹ thuật in vitro ƯU ĐiỂM Có hệ số nhân rất cao Cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền Có thể nhân giống ở quy mô công nghiệp, đối với cả các đố

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KĨ THUẬT NHÂN

GiỐNG VÔ TÍNH IN VITRO

Gvhd: Nguyễn Thị Lý Anh

Khái niệm

II/ Tính cấp thiết của kỹ thuật in vitro

ƯU ĐiỂM

Có hệ số nhân rất cao

Cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền

Có thể nhân giống ở quy mô công nghiệp, đối với cả các đối tượng khó nhân

Chủ động được giống trong sản xuất

Tạo ra các giống cây trồng sạch bệnh

Các cây sau nhân in vitro có xu hướng được trẻ hóa nên nâng cao hiệu quả nhân bằng các phương pháp thông thường sau đó

 Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành.

 Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân,

lá, hoa, quả, bao phấn,

noãn chưa thụ tinh.

 Nuôi cấy mô sẹo

(callus).

 Nuôi cấy tế bào đơn

(huyền phù tế bào).

 Nuôi cấy Protoplast:

nuôi cấy phần bên trong của tế bào thực vật sau khi tách vỏ, còn gọi là nuôi cấy tế bào trần

IV/ Các bước tiến hành nhân giống vô tính in vitro

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ:

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

 Bước 3: Nhân nhanh

Bước 4: tạo cây in vitro hoàn chỉnh

 Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

V/ Các phương thức nhân giống vô tính in vitro

1. Nuôi cấy đỉnh phân sinh

 Sơ đồ 1 Mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (thông qua

 phương thức tăng khả năng phát sinh chồi nách)

 Đỉnh sinh trưởng là phần chóp của búp lá hoặc thân

cây nơi có thể sinh ra những phần mới từ đó, đỉnh

sinh trưởng thường mềm yếu rất mẫn cảm với ánh

sáng, nó chứa rất nhiều Auxin, nơi diễn ra trao đổi

chất rất mạnh.

 Ở mỗi nách lá đều có chồi nách Chồi nách thực chất không khác đỉnh sinh

trưởng Do hiện tượng ưu thế ngọn nên các chồi nách không phát triển nhưng khi được đánh thức và bắt đầu sinh trưởng chúng có cấu tạo đầy đủ như thân chính.

 Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo một hay

nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển thành một cây hoàn chỉnh Xét

về nguồn gốc của các cây đó có ba khả năng:

 - Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn).

 - Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ.

 - Cây phát triển từ chồi mới phát sinh

 Các phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi

cấy như sau:

 Phát triển trực tiêp:

 Đỉnh sinh trưởng Chồi nách Cây

 Phát triển thông qua giai đoạn protocorm

 Đỉnh sinh trưởng Protocorm Cây

 2 Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác nhau của cây

 Sơ đồ 2 Mẫu mô phát sinh callus, callus tạo chồi và phát triển cây hoàn chỉnh (thông qua phương thức phát sinh chồi bất định)

2 Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác

2.1 Nuôi cấy chồi bất định

 Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật.

 - Đoạn thân: thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải…

 - Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao…

 - Các bộ phận của hoa: súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá…

 - Nhánh củ: họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên…

 Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô

nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển Các thể phân sinh này rõ ràng có nguồn gốc từ các tế bào đơn Tuy nhiên, chiều hướng phản ứng của thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ phytohormone

2.2 Nhân giống thông qua giai đoạn callus

Tế bào callus khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di

truyền Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại callus vừa phát sinh, tức là callus sơ cấp để tái sinh cây thì hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất

 3 Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính

 Năm 1958, Street và Reinert là hai tác giả đầu tiên mô tả sự hình

thành phôi vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt (Daucus carota).

 Năm 1977, Murashige cho rằng phôi vô tính có thể trở thành một

biện pháp nhân giống in vitro

 Phôi vô tính là các cá thể nhân giống có cực tính bắt nguồn từ các

tế bào soma

 Ở rất nhiều cây, người ta nhận thấy các tế bào đang phân chia vô tổ chức đã tạo nên callus

khi nuôi cấy Có thể thay đổi hướng phát triển của chúng để tạo ra các phôi vô tính với các bước phát sinh hình thái rất giống với trường hợp phôi hữu tính

 Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều kiện vật lý, hóa học

thuận lợi cho sự tạo phôi, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các giống, dòng trong cùng một loài

VI/Hạn chế của vi nhân giống

 Hạn chế về chủng loại sản phẩm

 Chi phí sản xuất

 Hiện tượng sản phẩm có thể bị biến đổi kiểu hình

VII/ QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY BA KÍCH (Morinda officenalis How)

 1 Vật liệu nghiên cứu

Đoạn thân cây ba kích 1 năm tuổi có nguồn

gốc từ huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Khử trùng mẫu cấy

 Đoạn thân ba kích chứa mắt ngủ có kích thước khoảng 1,5 cm sau khi cắt từ cây mẹ được ngâm trong nước sạch Sau đó được rửa bằng nước xà phòng loãng và rửa lại dưới vòi nước chảy Tiếp theo, mẫu cấy được khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, khử trùng lần 1

bằng Ca(HClO)2 10% trong 15 phút, lần 2 bằng HgCl20,1% trong 5 phút, rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3-4 lần

2.2 Tái sinh chồi từ mẫu cấy

 Mẫu cấy sau khi khử trùng được cấy vào môi trường nền MS

(Murashige và Skoog, 1962) bổ sung 0,25 mg/l kinetin kết hợp với BA với nồng độ 1 mg/l để tái sinh chồi, cụm chồi

2.3 Nhân nhanh

 Chồi tái sinh từ mẫu cấy có chiều cao 2-2,5 cm và 2-3 cặp lá được

chuyển sang môi trường nhân nhanh là môi trường MS, bổ sung 3mg/l BA

 Các chồi được cấy chuyển sang môi trường mới 45 ngày 1 lần.

2.4 Tạo rễ cho chồi in vitro

 Các chồi có chiều cao 3-3,5cm, sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0.2mg/l IBA, 0,4mg/l than hoạt tính để kích thích tạo rễ

 Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C trong 20 phút

 Điều kiện nuôi cấy in vitro: 14h sáng, cường độ ánh sáng 2000 -2500 lux, nhiệt độ

25 ± 20C

2.5 Thích nghi cây ngoài vườn ươm

Cây in vitro hoàn chỉnh được chuyển ravườn ươm, sử dụng giá thể đất (đất cát pha và đất tầng B - lớp đất thứ 2 từ trên mặt xuống, sau lớp tầng đất mặt hay tầng lớp canh tác (đất tầng A), tích tụ các chất rửa trôi từ tầng A xuống) hoặc giá thể hữu cơ gồm 50% bột dừa và 50% phế liệu sản xuất nấm ăn

Cảm ơn sự chú ý lắng nghe của

cô và các bạn