công nghệ ENZYME, DNA polymerase

Một đơn vị enzyme Klenow được định nghĩa là hoạt động của enzyme kết hợp 10 nmol nucleotide tạo thành axit kết tủa trong 30 phút ở 370C [1685].. Một đơn vị T4 DNA polymerase được định ng

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

- -TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ ENZYME

BÀI DỊCH

6.5.2 DNA polymerase

Bảng 47 liệt kê các thuộc tính của polymerase DNA quan trọng trong A.

6.5.2.1 Escherichia coli DNA polymerase I

Enzym E coli polymerase I, còn được gọi là deoxynucleoside triphosphate:

deoxynucleotidyltransferase DNA (DNA-trực tiếp) (EC 2.7.7.7) [9012-90-2],

được lấy từ Escherichia coli.

Tính chất Escherichia coli DNA poylmerase I bao gồm một polypeptide duy

nhất với một khối lượng phân tử là 109× 103 dalton [1679] và chứa một ion Zn 2 + trên một phân tử [1678] Enzyme bao gồm hai vùng tham gia của một proteasenhạy cảm liên kết peptide [1680], [1681], mặc dù các protein hoàn chỉnh có

dạng hình cầu với đường kính 6500 pm [1682], [1683] Escherichia coli

DNApolymerase I có một nhóm mercapto tự do duy nhất có thể để tạo thànhmột phức hợp phân ly với Hg2 + Protein có thể carboxymethylated mà không

mất hoạt tính [1684] Một đơn vị của E coli DNA polymerase I được định nghĩa

là hoạt động enzyme kết hợp với 10 nmol nucleotide để tạo thành axit kết tủatrong 30 phút ở 370C [1685]

Sử dụng Escherichia coli DNApolymerase I được sử dụng chủ yếu trong ống

nghiệm cho đánh dấu DNA dịch chuyển từ điểm cắt [1476] Một số thủ tục công

bố tất cả theo một nguyên tắc chung (Hình 100) Hàm lượng của DNase I (xemPhần 6.5.4.1) đưa điểm cắtvào DNA không đánh dấu, do đó phơi bày nhóm 3’-

hydroxyl bên trong Những hoạt động tiếp theo của E coli DNApolymerase I là

di chuyển về phía điểmcuối 3’ Đầu tiên, các enzyme loại bỏ các nucleotide trênđầu 5’ của điểm cắt Trong phản ứng kết hợp sau đó, các nucleotide cắt đượcthay thế bằng một nucleotide có đánh dấu tại điểm cuối 3’ của điểm cắt Hoạt

động lặp đi lặp lại của E coli polymerase I thay thế tất cả các nucleotide với

nucleotide có đánh dấu phía cuối từ điểm cắt Dưới 220C, phản ứng sẽ khôngtiếp tục được tồn tại một trao đổi đầy đủ của các sợi DNA không đánh dấu đốivới việc có đánh dấu một mình, như thể hiện trong hình 100

Hình 100 Sử dụng DNA và enzyme RNA-sửa đổi trong tổng hợp DNA tái tổ

hợp Cho viết tắt, xem văn bản

Theo đúng tỷ lệ của DNA, DNase I, và E coli DNA polymerase I, khoảng

20-40% các nucleotide có đánh dấu được đưa vào các sản phẩm, với năng suất mật

độ đánh dấu 108-109 dpm i microgram DNA Có 20-30% đánh dấu kết hợp nàythường được tìm thấy trong DNA foldback [1686] Số lượng DNA foldbackthường là cao hơn nếu các đoạn DNA không đánh dấu là tương đối nhỏ (<1000nucleotide) [1687] Trong trường hợp này, có lẽ đầu 3’sẽ được sử dụng để tổnghợp DNA bên trong điểm cuối 3’ tại điểm cắt

6.5.2.2 Klenow Enzyme

Enzyme Klenow là mảnh lớn nhất thu được bằng cách phân giải protein của vi

khuẩn Escherichia coli DNA polymerase I với subtilisin, nó còn được gọi là

deoxynucleoside triphosphate: deoxynucleotidyltransferase DNA (DNA-trựctiếp) (EC 2.7.7.7) [9012-90-2]

Tính chất Enzyme Klenow có khối lượng phân tử của 75×103 dalton Nó có thểthu được bằng cách xử lý subtilisin, tiêu hóa được protease nhạy cảm peptideliên kết giữa hai vùng của enzyme tự nhiên [1688] Đoạn lớn mang đoạn 5’-3’của polymerase và 3’-5’ exonuclease hoạt động của DNA polymerase I nguyênvẹn, nhưng lại thiếu các hoạt động 5’-3’exonuclease nằm trên mảnh nhỏ của36×103 dalton Enzyme Klenow xúc tác bổ sung deoxynucleotides đến điểmcuối 3’-hydroxyl của mồi được ủ với DNA mẫu

Một đơn vị enzyme Klenow được định nghĩa là hoạt động của enzyme kết hợp

10 nmol nucleotide tạo thành axit kết tủa trong 30 phút ở 370C [1685]

Sử dụng Enzyme Klenow được sử dụng trong một loạt các kỹ thuật, chẳng hạn

3 Tổng hợp thứ hai sợi cDNA [1690];

4 Đánh dấu đồng nhất của các đoạn ADN với oligodeoxynucleotides ngẫunhiên như mồi (oligolabeling) [1692];

5 Trình tự DNA bởi dideoxy phương pháp chấm dứt chuỗi [1691] (Hình101);

6 Kéo dài sự hình thành của oligonucleotide trung gian không phù hợp chocác đột biến trực tiếp[1693]

Thuộc tính DNA polymerase enzym T4 bao gồm một polypeptide đơn có khối

lượng phân tử của 114×103 dalton [1694] Polymerase này sẽ hiển thị một pH tối

ưu tương đối rộng khác nhau từ 8-9, tại giá trị pH 7.5 và 9.7, ca 50% hoạt độngtối ưu được quan sát thấy Hoạt động polymerase tối đa yêu cầu 6 mmol / L của

Mg2 +, hoạt động này được giảm xuống còn một phần tư nếu Mg2 + được thaythế bằng Mn2 + ở nồng độ tối ưu của nó là 0,1 mmol / L

Một đơn vị T4 DNA polymerase được định nghĩa là hoạt động của enzyme kếthợp 10 nmol của 3H-dTTP thành các sản phẩm DNA axit ngưng kết trong 30phút ở 370C [1694] Polymerase T4 DNA xúc tác bổ sung mononucleotides vàođiểm cuối 3’-hydroxyl của mồi ủ đến một vùng duy nhất bị mắc kẹt trong mộtmẫu DNA Bởi vì DNA đôi hoàn toàn không thể dùng làm một mồi mẫu, DNAtrước tiên phải được thực hiện một phần sợi đơn bằng cách tiêu hóa điểm cuối 3’của E coli exonuclease III (xem Phần 6.5.4.2) [1685]

Sợi đơn ADN cũng có thể dùng làm một mồi mẫu cho T4 DNA polymerase.Polymerase này không thể sử dụng một DNA đôi có chứa một điểm cắt như mẫumồi Tuy nhiên, bổ sung các T4 gene 32 protein tạo điều kiện cho chuyển sợi,trong đó cho phép T4 DNA polymerase tái tạo ngay cả DNA đôi bị cắt trong cơthể và trong ống nghiệm [1695], [1696] Mặc dù T4 DNA polymerase thiếu hoạtđộng exonuclease 5’-3’, nó có chứa một hoạt động exonuclease 3’-5’ cho thấymột đặc trưng mạnh cho DNA chuỗi đơn Số doanh thu của nó lớn khoảng 250lần so với exonuclease 3’-5’ kết hợp với vi khuẩn E coli DNA polymerase I vàlớn hơn số doanh thu của hoạt động polymerase 5’-3’ riêng của mình khoảng 3lần [1697]

Sử dụng Enzym T4 DNA polymerase có thể hoạt động như hoặc là một

polymerase 5’-3’ hoặc exonuclease 3’-5’ Trùng hợp xảy ra khi cả ba chất sauđây có sẵn cho các enzyme: một mẫu polynucleotide, một mồi 3’-hydroxyl ítnhất một dư lượng ngắn hơn so với các mẫu, và các dNTP thích hợp hoặc bổsung NTPs cho mẫu Trong trường hợp không có bất kỳ một trong ba thành phầnnày, các enzyme hoạt động như một exonuclease 3’-5’

T4 DNA polymerase có thể được sử dụng để đánh dấu cùn hoặc điểm cuối 3’lõm của DNA hoạt động polymerase 5’-3’của nó Trong trường hợp đầu cùn,hoạt động exonuclease 3’-5’ của enzyme chịu trách nhiệm về tiêu hóa của DNAđôi để sản xuất các phân tử với điểm cuối 3’ lõm Tiếp theo về việc bổ sung củadNTP đánh dấu, phân tử DNA tiêu hóa một phần dùng làm mồi-mẫu được táitạo bởi polymerase thành nguyên vẹn, DNA sợi kép Các phân tử được đánh dấu

cụ thể để hoạt động cao bằng kỹ thuật này có thể được sử dụng nhưhybridizationprobes.Chúng có hai ưu điểm so với các đầu dò chuẩn bị dịchchuyển điểm cắt Đầu tiên, chúng thiếu các cấu trúc hairpin artifactual có thểđược sản xuất trong dịch chuyển điểm cắt Thứ hai, họ có thể được chuyển đổi

dễ dàng vào sợi đầu dò cụ thể của sự phân cắt với enzyme hạn chế thích hợptrong khu vực trung tâm không có đánh dấu của phân tử DNA [1698] Kết hợpvới T4 gene 32 protein, T4 DNApolymerase được sử dụng cho khoảng cách điềnvào các thí nghiệm đột biến trang web hướng trong đó oligonucleotide ngắnđược sử dụng cho sự hình thành không phù hợp [1699]

6.5.2.4 Reverse Transcriptase

Enzyme AMV sao chép ngược, còn được gọi là deoxynucleoside triphosphate:Deoxynucleotidyltransferase DNA (DNA-trực tiếp) (EC 2.7.7.49), thu được từ

vi rút cúm gia cầm myeloblastosis

Đặc tính Enzyme AMV sao chép ngược là một trong những sản phẩm gen của

RNA bộ gen của vi rút cúm gia cầm myeloblastosis tồn tại trong hai bản sao bêntrong lõi cấu trúc của các hạt retrovirus Retrovirus có khả năng sao chép màkhông có virus trợ giúp có ít nhất ba gen được sắp xếp theo thứ tự sau:

1 gag (encoding structural proteins of the inner coat and core),

2 pol (mã hóa các sao chép ngược và endonuclease DNA),

3 env (mã hóa các glycoprotein của vỏ).

Một gag-pol tiền chất protein, p180 gag-pol, là một trong những sản phẩm proteinchính, đó là xử lý thành một loại protein nhỏ hơn, p130gag-pol [1700], [1701] Sựphân giải protein tiếp tục giải phóng hai polypeptide được xem như là α và β,sau này được phosphoryl hóa [1702] Các hình thức hoạt động của enzym saochép ngược tồn tại như α, ββ, và αβ Khối lượng phân tử của tiểu đơn vị α là68×103 dalton và của tiểu đơn vị β là 92×103 dalton Một đơn vị sao chép ngượcđược định nghĩa là hoạt tính enzym kết hợp của 1 nmol 3H-dTMP thành các sảnphẩm acid kết tủa trong 10 phút ở 370C với poly(dA).p(T)15 như mồi mẫu[1703]

Bởi vì trình tự amino acid của α là tập hợp của tiểu đơn vị β, hình thức trưởngthành αβ được coi là hình thành bởi sự phân giải protein của dimer ββ vào αβ vàp32, có chứa hoạt tính endonuclease DNA Hoạt động enzyme liên quan đến αβlà(1) RNA phụ thuộc vào DNA polymerase, DNA phụ thuộc vào DNApolymerase, (3) RNase H, và (4) một hoạt động giãn xoắn thường do sợi đơnprotein ràng buộc Một tiểu đơn vị chứa cả polymerase và Rnase Hactivity

trong đó có khả năng duy nhất là làm suy giảm RNA trong DNA _ RNA lai bằngexonucleolytic [1706], [1707] Hoạt động exonucleolytic này của RNase H cóthể tiến hành hoặc điểm cuối 5’ hoặc 3’ Tuy nhiên, nó không thể hoạt động trêncác mối liên kết RNA trong vòng tròn khép kín hai liên kết hóa trị Sao chépngược đã thể hiện bằng việc tổng hợp sản phẩm phiên mã poly ( dT) trong ốngnghiệm một cách tiến bộ với poly ( rA ) 1100_ Oligo ( dT) 12-18 như mẫu vàmồi [ 1703 ] Ngoài ra, hiệu suất của các sao chép ngược sử dụng poly (RC) _oligo (dG) 12 như chất nền là một tính năng hữu ích cho việc phân biệt giữa cáchoạt động polymerase của virus và host DNApolymerases khác nhau [1708],[1709] Ngoài ra, hiệu suất của các sao chép ngược sử dụng poly (RC) _ oligo(dG) 12 như chất nền là một tính năng hữu ích cho sự phân biệt giữa các hoạtđộng polymerase của virus và hostDNApolymerases khác nhau [1708], [1709].Mồi đặc hiệu được quan sát thấy nếu mồi là hơn tám nucleotide [1710] EnzymeAMV phiên mã dự trữ được sử dụng rộng rãi để tổng hợp sản phẩm phiên mãcDNA của chuỗi RNA cụ thể trong ống nghiệm (Hình 102) Tổng hợp sợi DNAchính được xúc tác bởi RNA - phụ thuộc vào hoạt động DNA polymerase DNAphụ thuộc vào hoạt động DNA polymerase có trách nhiệm tổng hợp thứ hai sợitrong việc hình thành cDNA khi sao chép ngược được sử dụng như tác nhânpolymer hóa DNA phụ thuộc vào hoạt động DNA polymerase có thể bị ức chếbằng cách bổ sung actinomycin D [1711] Sản phẩm phiên mã của cDNA được

sử dụng để phân tích cấu trúc, tổ chức, và biểu hiện của gen sinh vật nhân thực

So sánh giữa trình tự cDNA và DNA việc sắp xếp lại gen làm sáng tỏ sự tồn tạicủa việc can thiệp trình tự, và chi tiết của các sự kiện nối [1712], [1713], [1714]nhân điển hình Tổng hợp cDNA cũng là một công cụ mạnh mẽ cho sự cô lậpcác trình tự DNA chức năng và các thế hệ thăm dò lai tương ứng Gần đây, nhânbản cDNA bản sao của gen RNAvirus đã mở ra một hướng nghiên cứu khác chitiết về cấu trúc di truyền của họ [1715], [1716], [1717] Một số hình thức đểtổng hợp cDNA đã được mô tả [1718], và qui trình điển hình đã được xem xétgần đây [1719], [1721], [1722] Ngoài ra, phương pháp mới đã được phát triển

để nâng cao hiệu quả nhân bản độ dài đầy đủ cDNA và trình tự RNA [1723]bằng cách sử dụng AMV sao chép ngược [1724]

6.5.2.5 Điểm cuối Transferase

Điểm cuối transferase, còn được gọi là triphosphate nucleosidedeoxynucleotidylexo DNA transferase (EC 2.7.7.31) [9027-67-2], được lấy từtuyến ức bê

Đặc tính Điểm cuối transferase từ tuyến ức bê xúc tác bổ sung

deoxynucleotides đến điểm cuối 3’-hydroxyl của mồi DNA [1725]

Một đơn vị điểm cuối transferase được định nghĩa là hoạt động của enzyme kếthợp 1 nmol ẩm vào các sản phẩm không tan trong axit trong 60 phút ở 370C vớid(pT) 6 như mồi [1726] Điểm cuối transferase từ tuyến ức bê có khối lượngphân tử của 32×103 dalton Trong điều kiện biến tính, hai tiểu đơn vị cấu trúcnonidentical được quan sát khối lượng phân tử của 26,5× 103 và 8×103 dalton.Điểm đẳng điện là ở pH 8.6, và pH tối ưu 7,2 Ở 350C, điểm cuối transferase cómột điều kiện tuyệt đối cho một mồi oligodeoxynucleotide là có chứa ít nhất badeoxynucleotides và 30-hydroxyl tự do cuối cùng Tuy nhiên, phản ứng khôngphải là phụ thuộc vào mẫu Tuy nhiên, phản ứng không phải là mẫu phụ thuộcvào Bất kỳ dNTP, bao gồm cả deoxynucleotides thay thế, có thể được polymebởi enzyme [1727] Tỷ lệ trùng hợp cao nhất cho triphosphate purinedeoxyribonucleoside thu được khi đệm cacodylate và Mg2 + được sử dụng, trongkhi đó việc sử dụng Co2 + thay vì Mg2 + tăng sự trùng hợp của pyrimidin base[1728]

Sử dụng Vì điểm cuối transferase đòi hỏi DNA sợi đơn như mồi, hiệu quả kết

hợp là cao nhất cho dsDNA với 3’-protruding kết thúc Tuy nhiên, đầu bằng và30-đầu lặn cũng có đuôi do sao chép ngược, làm giảm hiệu quả [1729], [1717].Điểm cuối transferase được sử dụng chủ yếu để thêm đuôi homopolymer chođoạn DNA để xây dựng DNA tái tổ hợp Bằng cách sử dụng phương pháp tailingnày, bất cứ đoạn DNA sợi đôi nào cũng có thể được tham gia như một phươngtiện nhân bản Độ dài tối ưu cho đuôi G-C khoảng 20-25 nucleotide, cho đuôi A-

T dài khoảng 100 nucleotide [1476] Ngoài các phản ứng tailing, điểm cuốitransferase được sử dụng cho 30 đầu đánh dấu đoạn DNA với dNTP đánh dấu32P hoặc ddNTPs [1730], [1731] và việc bổ sung một nucleotide đơn để độtbiến đầu 30 DNA trong vitro thí nghiệm in vitro [1729]

Hình 102 Trình tự hoạt động của DNase I và Escherichia coli DNA polymerase

Đặc tính Enzym SP6 RNA polymerase bao gồm một chuỗi polypetide đơn có

96×103dalton [ 1732 ]

Một đơn vị SP6 RNA polymerase được định nghĩa là hoạt động của enzyme xúctác kết hợp với 1 nmol GTP để tạo thành axit kết tủa các sản phẩm RNA trong

60 phút ở 370C [ 1732 ]

Các SP6 RNA polymerase cần một mẫu DNA và Mg2 + như một đồng yếu tố choRNA tổng hợp, và được kích thích mạnh bởi albumin hoặc spermidine tronghuyết thanh bò [ 1732 ] Các enzyme này không bị ức chế bởi các kháng sinhrifampicin Chất ức chế này ảnh hưởng đến RNA polymerase của vi khuẩnnhưng không được mã hóa như SP6 RNA polymerase [1732 ], [ 1733 ] SP6RNA polymerase sở hữu một promoter rất nghiêm ngặt đặc biệt là từ mà cácenzyme tương tự gây ra bởi thể thực khuẩn T7 , T3 , GH1 , hoặc T7- như thểthực khuẩn khác [ 1734 ], [ 1735 ], [ 1736 ] Do đó SP6 RNA polymerase cóthể ghi lại duy nhất SP6 khuẩn DNA [ 1737 ] hoặc DNA nhân bản vô tính cuốicùng từ SP6 promoter ví dụ như trong các plasmid pSP64 hoặc pSP65 [ 1738 ]

Sử dụng Enzyme SP6 RNA polymerase được sử dụng để tổng hợp riêng các sản

phẩm phiên mã của RNA trong ống nghiệm thu được từ chuỗi DNA riêng biệt

để nhân bản vào nhiều trang web nhân bản của các vectơ pSP64 hoặc pSP65[ 1738 ] Trong các vectơ, các promoter SP6 nằm ở phía trước của nhiều trangweb nhân bản trực tiếp bắt đầu phản ứng phiên mã cụ thể Enzyme cắt giới hạncủa một vector tại một điểm hạn chế duy nhất phía cuối các chuỗi trình tự DNAđưa vào để mang điểm riêng biệt cho các sản phẩm phiên mã của RNA Chiềudài duy nhất của các sản phẩm phiên mã RNA có thể được tạo ra có nghĩa hoặckhông có nghĩa, còn tùy thuộc vào sự định hướng của DNA tích hợp (Hình 103)

Phân tích cắt nối Khi hệ thống vector này được áp dụng, SP6 RNA

polymerase có thể được sử dụng để tổng hợp một lượng lớn tiền chất RNA trongnghiên cứu in vitro và in vivo của phản ứng nối [ 1739 ], [ 1740 ], [ 1738 ]

Mẫu dò RNA Enzyme SP6 RNA polymerase cũng rất hữu ích cho các thế hệ

đồng nhất , cụ thể là mẫu dò sợi đơn RNA được đánh dấu phóng xạ cao nhất.Các thiết bị thăm dò có thể được áp dụng tại phía Bắc và phía Nam trong kỹthuật lai blot [ 1741 ]