Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme để sản xuất đường chức năng xylose từ lõi ngô dùng trong công nghiệp thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---    --- TRẦN THỊ LÝ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME ðỂ SẢN XUẤT ðƯỜNG CHỨC NĂNG XYLOSE TỪ LÕI NGÔ DÙNG TRONG CÔNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


   -

TRẦN THỊ LÝ

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYME ðỂ SẢN XUẤT ðƯỜNG CHỨC NĂNG XYLOSE TỪ LÕI NGÔ

DÙNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Công nghệ Sau thu hoạch

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Nguyễn Duy Lâm

Viện Cơ ñiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

2 ThS Nguyễn Tất Thắng

Viện Cơ ñiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

HÀ NỘI – 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng trong bất kỳ một nghiên cứu nào

Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ

rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 30 tháng 7 năm 2012

Tác giả

Trần Thị Lý

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ ii

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành ựề tài tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân tôi ựã nhận ựược rất nhiều sự quan tâm giúp ựỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân

Trước tiên, tôi xin ựược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Duy Lâm - Giám ựốc Trung tâm Nghiên cứu và Kiểm tra chất lượng nông sản thực phẩm - Viện Cơ ựiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch ựã tận tình hướng dẫn, giúp ựỡ tôi trong quá trình thực hiện ựề tài và hoàn thành bản luận văn này

đồng thời, tôi xin ựược cảm ơn Th.S Nguyễn Tất Thắng - Viện Cơ ựiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch ựã nhiệt tình giúp ựỡ và tạo mọi ựiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình làm ựề tài

Tôi xin ựược gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ thực phẩm, Viện đào tạo Sau ựại học - Trường đại học Nông nghiệp

Hà Nội

Bên cạnh ựó tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn bè và ựồng nghiệp, những người luôn bên cạnh ựộng viên giúp ựỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện bản luận văn này

Hà Nội, ngày 30 tháng 7 năm 2012

Tác giả

Trần Thị Lý

MỤC LỤC

PHẦN I MỞ ðẦU 1

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 2

1.2.1 Mục ñích của ñề tài 3

1.2.2 Yêu cầu của ñề tài 3

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về ñường xylose 4

2.1.1 ðặc ñiểm của ñường xylose 4

2.1.2 Các phương pháp sản xuất ñường xylose ……… 6

2.1.3 Ứng dụng của ñường xylose ……… 10

2.2 Enzyme xylanase 12

2.2.1 Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme xylanase ……… 12

2.2.2 Nguồn enzyme xylanase ……… 14

2.2.3 Ứng dụng thực tiễn của xylanase ……… 16

2.3 Lõi ngô - nguồn xylan ……… 19

2.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose trên thế giới và ở Việt Nam ……… 22

2.4.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose trên thế giới…… 22

2.4.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose ở Việt Nam 24

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 ðối tượng và vật liệu nghiên cứu……… 26

3.1.1 ðối tượng và vật liệu ……… 26

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ……… 26

3.2 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu ……… 27

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… iv

3.3 Nội dung nghiên cứu ……….……… 27

3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm……… 28

3.4.1 Sơ ñồ qui trình xuất ñường xylose từ lõi ngô……… 28

3.4.2 Bố trí các thí nghiệm xác ñịnh các thông số công nghệ trong xử lý nguyên liệu lõi ngô……… 30

3.4.3 Bố trí thí nghiệm xác ñịnh các thông số quá trình thủy phân dịch chứa xylan thành ñường xylose bằng enzyme xylanase…… 31

3.4.4 Bố trí thí nghiệm xác ñịnh một số thông số công nghệ của quá trình tách chiết, làm sạch và thu hồi ñường xylose quy mô phòng thí nghiệm

32 3.5 Phương pháp phân tích ……… 33

3.5.1 Các phương pháp vật lý ……… 33

3.5.2 Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa học ……… 34

3.5.3 Phương pháp ñánh giá cảm quan……… 36

3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu……… 36

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……… 37

4.1 Xác ñịnh các thông số công nghệ trong xử lý nguyên liệu lõi ngô … 37

4.1.1 Lựa chọn dung môi xử lý ……… 37

4.1.2 Xác ñịnh tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp trong xử lý lõi ngô 38

4.1.3 Xác ñịnh nhiệt ñộ thủy phân axit thích hợp trong xử lý lõi ngô…… 40

4.1.4 Xác ñịnh thời gian thủy phân axit thích hợp trong xử lý lõi ngô… 42

4.2 Xác ñịnh các thông số của quá trình thủy phân dịch xylan thành ñường xylose bằng enzyme xylanase ……… 43

4.2.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme xylanase ñến hiệu quả thủy phân xylan ……… 43

4.2.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất ñến hiệu quả thủy phân xylan … 45

4.2.3 Ảnh hưởng của thời gian thuỷ phân ñến hiệu quả thủy phân xylan 47

4.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hiệu quả thủy phân xylan ……… 49

4.2.5 Ảnh hưởng của pH ñến hiệu quả thủy phân xylan ……… 51

4.3 Nghiên cứu công nghệ tách chiết, làm sạch và thu hồi ựường xylose

quy mô thắ nghiệm ẦẦẦ 52

4.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ than hoạt tắnh ựến hiệu quả tinh sạch dịch ựường sau thủy phân ẦẦẦ 52

4.3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ tinh thể ựường xylose bổ sung ựể làm mồi ựến quá trình kết tinh thu hồi ựường xylose ẦẦẦ 54

4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ựộ tới quá trình sấy khô ựường Ầ 56 4.4 đánh giá chất lượng của ựường xylose thành phẩm và ựưa ra quy trình sản xuất xylose từ lõi ngô ẦẦẦ 57

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ ẦẦẦ 60

5.1 Kết luận ẦẦẦ.ẦẦẦ 60

5.2 đề nghị ẦẦẦ.ẦẦẦ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ẦẦẦ.ẦẦẦ 61

PHỤ LỤC ẦẦẦ.ẦẦẦ 66

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… vi

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.6 Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm nông nghiệp của một số chủng Aspergillus 16

Bảng 2.7 Tình hình sản xuất ngô Việt Nam ……… 20

Bảng 2.8 Thành phần các hợp chất của lõi ngô 22

Bảng 2.9 Thành phần hemicellulose trong sinh khối thực vật 20

Bảng 2.10 Lượng sản xuất và giá cả các loại ñường trên thế giới 23

Bảng 4.1 Hiệu quả thủy phân nguyên liệu lõi ngô bằng axit 37

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu trên dung môi tới hiệu quả xử lý lõi ngô 39

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ thủy phân axit tới hiệu quả xử lý

lõi ngô 41

Bảng 4.4 Ảnh hưởng thời gian thủy phân axit tới hiệu quả xử lý lõi ngô 42 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme xylanase ñến hiệu quả thủy phân dịch xylan lõi ngô 44

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất ñến hiệu quả thủy phân dịch xylan lõi ngô 46

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hiệu quả thủy phân dịch xylan lõi ngô 48

Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hiệu quả thủy phân xylan …… 50

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của pH ñến hiệu quả thủy phân xylan ……… 52 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ than hoạt tính ñến hiệu quả tinh sạch 53

dịch ñường sau thủy phân

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ mầm tinh thể ñường xylose bổ sung ñể làm mồi ñến hiệu suất kết tinh 55 Bảng 4.12 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ tới quá trình sấy khô ñường 56 Bảng 4.13 Thành phần của ñường xylose sản xuất 57

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… viii

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Công thức cấu tạo của ñường xylose 4

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của Xylan 5

Hình 2.3 Công thức cấu tạo hóa học của một số loại xylan 6

Hình 2.4 Ứng dụng chính của ñường Xylose 11

Hình 2.5 Tác ñộng của các loại enzyme xylanase lên mạch xylan …… 14

DANH MỤC CÁC SƠ ðỒ Sơ ñồ 3.1 Quy trình dự kiến sản xuất ñường xylose bằng enzyme xylanase ……… 29

Sơ ñồ 4.14 Quy trình công nghệ sản xuất ñường xylose từ lõi ngô…… 58

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết thường

Công nghiệp thực phẩm

gam lit mililit miligam Xylose Fructooligosaccharide Xylooligosaccharide Dinitro Salicylic

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 1

PHẦN I MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề

Thực phẩm chức năng là loại thực phẩm ñược chế biến từ các nguyên liệu tự nhiên như các nguồn thực vật và ñộng vật giàu hoạt chất sinh học Thực phẩm chức năng giúp cho con người duy trì và tăng cường sức khỏe, kéo dài tuổi thọ, phòng và chữa ñược nhiều bệnh hiểm nghèo Trong các nhóm thực phẩm chức năng thì ñường chức năng là một bộ phận quan trọng, ñược tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần ñây do có các ñặc tính sinh học có lợi cho sức khỏe như phòng chống bệnh tiểu ñường, không gây béo phì, có khả năng kích thích hoạt ñộng của hệ tiêu hóa… Các loại ñường chức năng phổ biến hiện có là ñường xylooligosaccharide, panatinose, maltitol, fructooligosaccharide, xylose, lactitol, galactooligosaccharide Trong

số ñó, ñường xylose ñang có xu hướng gia tăng ở nhiều quốc gia trên thế giới với các ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm như làm chất phụ gia thực phẩm, bổ sung vào các loại ñồ uống dinh dưỡng, làm nguyên liệu ñầu của thuốc tổng hợp ñiều trị bệnh ung thư, phòng chống một

số bệnh (tiểu ñường, mất ngủ, ñường ruột,…)

Xylose là một ñường năm cacbon có công thức phân tử C5H1005 còn ñược gọi là “ñường gỗ” vì có mặt trong nhiều loại gỗ Xylose là thành phần chủ yếu của ñường pentose - một trong hai nhóm ñường chính thu ñược khi thủy phân hemicellulose trong nguyên liệu gỗ và các chất thải xơ nông nghiệp như rơm lúa mỳ, lúa nước, thân và lõi ngô Khi thuỷ phân rơm rạ thu ñược khoảng 18% pentose và 26,8% hexose [4] Chính vì vậy, hiện nay trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất ñường xylose bằng cách lên men các nguyên liệu giàu xylan như các chất thải nông nghiệp Với phương pháp này, xylose ñược sản xuất từ các nguyên liệu giàu xylan Các nguyên liệu này trước hết ñược thủy phân axit ñể tạo thành dịch chứa xylan Sau ñó, dùng các vi sinh vật sử dụng xylan làm nguồn cacbon ñể lên men tạo dịch

thủy phân enzyme chứa xylose [16] ðường xylose ñược thu hồi trong một số

ần công ñoạn tiếp theo rồi thường ñược sấy phun Sản xuất xylose theo phương pháp thủy phân enzyme nhờ vi sinh vật có nhiều ưu ñiểm so với phương pháp sản xuất hóa học

Việc nghiên cứu sản xuất ñường xylose ở Việt Nam còn rất mới mẻ và chưa có nhiều kết quả ñược công bố Trong khi nước ta là một nước nông nghiệp rất phong phú nguồn tài nguyên chất thải xơ, trong ñó có lõi ngô Hầu hết các chất thải nông nghiệp ñều chưa ñược khai thác hoặc khai thác chưa hợp lý dẫn tới lãng phí tài nguyên và gây ô nhiễm môi trường Nếu sử dụng lõi ngô làm nguyên liệu ñể sản xuất ñược ñường xylose thì sẽ mang lại tác ñộng kép vì không những tạo ra sản phẩm mới có giá trị mà còn hỗ trợ giảm thiểu ô nhiễm môi trường do phải thải hoặc ñốt

Theo hướng này, năm 2009 nhóm nghiên cứu Nguyễn Tất Thắng và cộng sự tại Viện Cơ ñiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch ñã tiến hành nghiên cứu thăm dò với trọng tâm là tuyển chọn chủng giống vi sinh vật

có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao [4] Kết quả của nhóm ñã tuyển chọn

ñược chủng Aspergillus niger DL1 cho hiệu suất chuyển hóa xylan thành

ñường xylose ñạt 70,38% [4] Từ năm 2011, nhóm tác giả của Viện ñang có những nghiên cứu sâu rộng trong khuôn khổ thực hiện ñề tài cấp Nhà nước với mục tiêu xây dựng ñược qui trình công nghệ sản xuất ñường xylose từ lõi ngô bằng phương pháp của công nghệ sinh học

ðược sự ñồng ý của Viện Cơ ñiện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch cho tham gia thực hiện một phần ñề tài nêu trên, chúng tôi ñã tiến hành

nghiên cứu với chủ ñề “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme ñể sản

xuất ñường chức năng xylose từ lõi ngô dùng trong công nghiệp thực phẩm”

1.2 Mục ñích và yêu cầu của nghiên cứu

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 3

1.2.1 Mục ựắch của nghiên cứu

Xác ựịnh ựược các thông số cơ bản của các công ựoạn chắnh trong quy trình sản xuất ựường xylose từ lõi ngô bằng phương pháp thủy phân enzyme dùng trong công nghiệp thực phẩm

1.2.2 Yêu cầu của nghiên cứu

- Xác ựịnh các ựiều kiện xử lý nguyên liệu tạo dịch xylan;

- Xác ựịnh các ựiều kiện thủy phân dịch xylan bằng enzyme xylanase;

- Xác ựịnh một số thông số công nghệ của quá trình thu hồi và làm sạch ựường xylose quy mô phòng thắ nghiệm;

- đánh giá chất lượng của ựường xylose thành phẩm và ựưa ra quy trình sản xuất xylose từ lõi ngô

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về ñường xylose

2.1.1 ðặc ñiểm của ñường xylose

Xylose là một ñường 5 cacbon, có công thức phân tử là C5H10O5 Xylose còn có tên gọi là “ñường gỗ”, là ñường có mặt trong nhiều loại gỗ Khi thủy phân hemicellulose trong thân lúa mì người ta thu ñược 31% xylose, 59% glucose và khoảng vài phần trăm các ñường khác (arabinose, galactose, mannose…) Khi thuỷ phân rơm rạ thu ñược khoảng 18% pentose và 26,8% hexose [1] Công thức cấu tạo của ñường xylose ñược thể hiện ở hình 2.1

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của ñường xylose

Xylose là thành phần chủ yếu thuộc ñường pentose, cùng với glucose là hai nhóm ñường chính thu ñược khi thủy phân hemicellulose trong nguyên liệu

gỗ và chất thải nông nghiệp Khi thủy phân hemicellulose bằng axit có thể giải phóng ra nhiều loại ñường khác nhau ngoài ñường xylose như D - galactose, D - glucose, D - mannose và L - arabinose Kèm theo ñó còn là các sản phẩm thủy phân khác như fucfural, 5 - hydroxymethyl fucfural, axit acetic, axit syringic [32]

Khi một chuỗi các nhóm xylose liên kết với nhau qua liên kết β - (1 - 4) glycoside và phân nhánh bởi các chuỗi carbonhydrate ngắn như axit D - glucuronic hoặc ñồng phân của nó 4 - O - methylether, α - arabinose hoặc các

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 5

Oligosaccharide tạo thành từ D - xylose, L - arabinose, D - hay L - galactose

và D - glucose sẽ tạo thành xylan

Cấu tạo của xylan ñược thể hiện qua hình 2.2

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của xylan

Thành tế bào thực vật là một vật liệu phức tạp trong ñó cellulose chiếm 35-50%, hemicellulose chiếm 20-30% Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose Xylan ñược tìm thấy chủ yếu trong cấu trúc thứ cấp của thành

tế bào thực vật và tạo thành pha giữa giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác [28]

Xylan gồm nhiều loại khác nhau, có thể ñược chia thành homoxylan và heteroxylan bao gồm: glucuronoxylan, (arabino) glucuronoxylan, (glucurono) arabinoxylan, arabinoxylan và tổ hợp heteroxylan Homoxylan có cấu tạo bao gồm các xylopyranose ñược liên kết với nhau bởi liên kết β - (1 - 3) glycoside hoặc hỗn hợp β - (1 - 3, 1 - 4) glycoside Cấu tạo kiểu homoxylan ñược tìm

thấy trong tảo biển Palmariales và Nemaliales Heteroxylan có cấu tạo là các

mạng lưới β - (1 - 4) - D xylopyranose gắn với chuỗi mono và oligoglycosy Heteroxylan có mặt ở trong các loại ngũ cốc, hạt cây, mủ và nhựa cây

Xylan ña dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử Trong tự nhiên, chúng ñược thay thế một phần bằng acetyl 4 - 0 - methyl - d - glucuronosyl và arabinofuranosyl tạo thành cấu trúc polymer không ñồng nhất Việc tách chiết xylan từ các nguyên liệu trong tự nhiên không thể tránh khỏi những biến ñổi

về cầu trúc vì vậy tác ñộng của xylan về mặt cấu trúc vẫn chưa ñược xác ñịnh

rõ ràng [6]

Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân hủy xylan, ñặc biệt là vi sinh vật tiết ra enzyme xylanase [16]

a) Heteroxylan

b) (4 - O - Methyl - α - D - glucurono) - D - Xylan Hình 2.3 Công thức cấu tạo hóa học của một số loại xylan

2.1.2 Các phương pháp sản xuất ñường xylose

Có hai phương pháp chủ yếu ñể sản xuất ñường xylose là phương pháp hóa học và phương pháp lên men nhờ vi sinh vật [1,4]

2.1.2.1 Sản xuất xylose bằng phương pháp hoá học

Sản xuất xylose bằng phương pháp hoá học dựa trên quá trình hydro hóa dịch thủy phân hemicellulose (chứa thành phần chủ yếu là xylan) thành xylose Trong quá trình hydro hoá có khoảng 60% lượng xylan ban ñầu

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 7

chuyển thành xylose Sau phản ứng dịch hydro hóa ñược kết tinh ñể thu hồi ñường xylose Phương pháp này có ưu ñiểm là hiệu suất thuỷ phân cao, ít yêu cầu về công nghệ nhưng có nhược ñiểm là gây hao mòn thiết bị, tạo sản phẩm

có ñộ tinh khiết thấp và không an toàn cho người sử dụng nếu chưa xử lý hết lượng acid dùng ñể thuỷ phân, gây ô nhiễm môi trường bởi lượng acid thải ra

Các nghiên cứu trước ñây ñưa ra quy trình sản xuất ñường xylose từ nguyên liệu lignocellulose có chứa hemicellulose, quy trình bao gồm các bước như sau:

- Thủy phân lignocellulose với nước ñể tạo ra phần hoà tan và phần không hoà tan Phần hoà tan có chứa ñường xylose, phần không hoà tan có chứa lignin và cellulose

- Tách phần không tan từ dịch thuỷ phân

- Xử lý phần hoà tan có chứa ñường xylose ñể dịch chuyển các chất hữu cơ và các ion ra ngoài

- Tập trung phần có chứa ñường xylose thành dạng sirô có chứa 20% - 40% nước

- Trộn sirô với ethanol ñể tạo thành dạng ethanolic hòa tan và kết tinh ñường xylose từ dạng ethanolic hòa tan

Trong sản xuất xylose từ nguyên liệu lignocellulose quy mô thương mại, vấn ñề quan trọng là phải giảm thiểu tối ña lượng xylose bị mất ñi khi tách xylose ra khỏi sản phẩm sau thủy phân Quy trình sản xuất ñường xylose

từ nguyên liệu lignocellulose quy mô thương mại gồm các bước như sau:

Bước 1: Thủy phân nguyên liệu bằng dung dịch axit ñể tạo ra hai phần Phần hoà tan chứa xylose và phần không hòa tan chứa lignin và cellulose Dung dịch axit nên ñược sử dụng ở nồng ñộ 0,5 - 5% Có thể sử dụng axit vô

cơ (như axit H2SO4, HCl hoặc H3PO4) hoặc axit hữu cơ (như acetic hoặc trifluoracetic) Trong quá trình thủy phân hỗn hợp phản ứng ñược duy trì ở nhiệt ñộ từ 70 - 270oC Thời gian thủy phân từ 2 phút ñến 2 giờ Quá trình

thủy phân ñược tiến hành trong sự kết hợp của cả 3 yếu tố: nhiệt ñộ, nồng ñộ axit và thời gian

Bước 2: Tách phần không hòa tan

Bước 3: Xử lý phần dung dịch xylose ñể loại bỏ những hợp chất hữu cơ (gồm protein, lipit và chất màu) Các hợp chất này ñược loại bỏ bằng phương pháp xử lý với thuốc thử (như than hoạt tính hoặc chất hấp phụ polymer) Những tạp chất ion chủ yếu là axit sử dụng ở bước 1 ñược loại bỏ bằng thiết

bị ñiện phân, sau ñó ñược cho qua thiết bị có chứa nhựa trao ñổi ion

Bước 4: Dung dịch xylose ñược cô ñặc thành dạng siro có hàm lượng nước dao ñộng từ 20 - 40 % về khối lượng Cô ñặc xylose ở hàm lượng vừa

ñủ ñể xylose có thể kết tinh khi nó ñược trộn với ethanol ở bước 5 ðiều kiện

cô ñặc thích hợp nhất là sử dụng quá trình bay hơi bằng thiết bị bay hơi có màng hay quay Siro thu ñược sau bước 4 này ñem bảo quản và sử dụng cho bước 5

Bước 5: Trộn siro với ethanol ñể tạo dung dịch hòa tan và kết tinh ñường xylose từ dạng ethanolic hòa tan Tiến hành kết tinh ở ñiều kiện nhiệt

ñộ thường Bổ sung ethanol ở nồng ñộ không quá 2 lần ethanol so với lượng dịch (nên chọn lượng ethanol bằng lượng dịch siro) Hỗn hợp ethanol và siro ñược giữ trong thời gian 10 - 18 giờ, thỉnh thoảng lắc ñể xylose kết tinh

Phản ứng thủy phân ở bước 1 có thể ñược tiến hành ở dạng liên tục hoặc gián ñoạn Sự có mặt của những oligosaccharide có thể ảnh hưởng ñến quá trình kết tinh của xylose Chính vì vậy, dịch thuỷ phân cần phải loại bỏ hoặc khử bớt lượng oligosaccharide có trong dịch bằng cách gia nhiệt dịch xylose ñến nhiệt ñộ 50 - 150oC duy trì trong khoảng 2 phút ñến 2 giờ có bổ dung axit ở nồng ñộ 0,5 - 5% Tinh thể xylose ñược sản xuất ra từ bước 5 ñược rửa sạch bằng dung dịch ethanol có nồng ñộ 90% ñể nâng cao ñộ tinh sạch và ñáp ứng tiêu chuẩn chế biến tốt hơn

2.1.2.2 Sản xuất ñường xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh vật

a) Sản xuất xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 9

Với phương pháp sản xuất xylose bằng phương pháp lên men nhờ vi sinh vật xylose ñược sản xuất từ các nguyên liệu giàu xylan Nguyên liệu trước hết ñược thủy phân ñể tạo thành dung dịch chứa xylan Sau ñó các vi sinh vật sử dụng xylan làm nguồn cacbon ñể lên men dịch thủy phân [32] ðường xylose ñược thu hồi bằng phương pháp cô quay chân không và sấy phun Sản xuất xylose theo phương pháp lên men xylan nhờ vi sinh vật có nhiều ưu ñiểm hơn

so với phương pháp hóa học như tạo ra sản phẩm an toàn hơn, không gây ô nhiễm môi trường hay làm hao mòn thiết bị Phương pháp này có nhược ñiểm

là công nghệ yêu cầu cao hơn, hiệu suất thuỷ phân thấp hơn so với phương pháp hoá học Việc thu nhận và tinh sạch ñường xylose gặp nhiều khó khăn

do dịch lên men ngoài ñường xylose còn lẫn rất nhiều tạp chất như ñạm, muối

vô cơ, acid amin ðường xylose lại dễ tạo phản ứng Maillard với axit amin tạo sản phẩm có màu sẫm

Haltrich cùng các cộng sự ñã chỉ ra một số vi sinh vật có thể sử dụng ñể

lên men xylan bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc như Aspergillus,

Trichoderma, Bacillus, Cryptococcus, Penicillium, Aureobasidium, rium, Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor, Humicola, Talaromyces

Fusa-[32] Các loại vi sinh vật này có khả năng sinh enzyme xylanase vào môi trường lên men có chứa nhiều xylan Hiện nay ñã có khá nhiều nghiên cứu về các chủng vi sinh vật trên trong ñó các nghiên cứu tập chung chủ yếu vào sử

dụng nấm mốc Aspergillus nige ñể lên men xylan [29] Pang Pei Kheng và

cộng sự ñã sử dụng phần mềm của thực vật ngọt làm chất nền ñể phân lập và

tuyển chọn ñược chủng nấm mốc Aspergillus niger USA AI 1 Sau ñó sử

dụng chủng nấm mốc này ñể lên men xylan Theo Pang Pei Kheng, sử dụng

Aspergillus niger ñể lên men không những nâng cao ñược năng suất, hiệu quả

lên men mà còn tận dụng ñược các phế phụ phẩm của ngành nông nghiệp như lõi ngô, bã mía, rơm rạ [34]

b) Sản xuất xylose bằng phương pháp enzyme

Phương pháp sản xuất ñường xylose bằng enzyme tách riêng hai quá trình là tổng hợp và thu nhận enzyme qua lên men Sau ñó dùng enzyme ñể thuỷ phân dịch xylan thành ñường xylose Với phương pháp này ta có thể khắc phục ñược nhược ñiểm của phương pháp sản xuất ñường xylose nhờ vi sinh vật

Xylanase là enzyme thủy phân xylan nó có thể ñược tách chiết, thu hồi

từ vi khuẩn (Clostridium, Cellulomonas, Bacillus và Thermonospora…) hoặc nấm (Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum và Penicillium…) Tuy nhiên,

do phát triển trong ñiều kiện yếm khí nên enzyme xylanase do vi khuẩn sinh

ra thường có hàm lượng và hoạt tính thấp hơn enzyme xylanase sinh ra bởi nấm mốc Hiện nay người ta thường sử dụng enzyme xylanase sinh ra từ các chủng mấm mốc ñể sản xuất ñường xylose [28]

Năm 1986 Allenza và cộng sự ñã nghiên cứu sản xuất xylose bằng

enzyme xylanase sinh ra từ chủng Aureobasidium plll/ulam Y-2JII·1 trên hai

dạng enzyme xylanase cố ñịnh và tự do ở nhiệt ñộ 40oC, pH =4,5 - 4,75 [30] Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng thủy phân xylan thành xylose ở cả hai dạng là gần như nhau (0,16% khối lượng ñối với xylanase ở dạng tự do và 0,21% khối lượng ñối với xylanase ở dạng cố ñịnh) Hoạt tính enzyme ở dạng

tự do sau 16 giờ còn 54% trong khi hoạt tính của xylanase dạng cố ñịnh chỉ

còn 47% sau 16 giờ

Năm 2009 Goldman nghiên cứu quá trình thủy phân xylan thành ñường xylose bằng enzyme xylanase [29] Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme xylanase từ các chủng nấm mốc khác nhau ảnh hưởng khác nhau ñến khả

năng thuỷ phân xylan Enzyme xylanase sinh ra bởi chủng Aspergillus niger

AN-1.15, sau 5 giờ có 70% saccharide chuyển thành xylan Enzyme xylanase

sinh ra bởi chủng Thermobifida fusca sau 30 phút ở 70oC chuyển hóa ñược

10% xylan Enzyme xylanase sinh ra bởi chủng Trichoderma sp K930 chỉ có

1,4% saccharide chuyển thành xylan [29]

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 11

2.1.3 Ứng dụng của ñường xylose

Xylose là một loại ñường tự nhiên có nhiều ứng dụng trong thực tế Hiện nay, xylose ñã và ñang ñược sử dụng rộng rãi trong nhiều loại sản phẩm khác nhau ở nhiều quốc gia trên thế giới Phạm vi ứng dụng của xylose chủ yếu thuộc về hai lĩnh vực chính là công nghiệp thực phẩm và dược phẩm [13]

Những ứng dụng chính của ñường xylose ñược thể hiện ở hình 2.4

Hình 2.4 Ứng dụng chính của ñường Xylose

2.1.3.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Xylose ñược sử dụng ñể sản xuất bánh kẹo, dùng làm chất phụ gia thực phẩm và là sản phẩm ñược bổ sung vào các loại ñồ uống Nhờ xylose có ñộ ngọt tương ñương với ñường sucrose (Vị ngọt của ñường xylose tương ứng khoảng 67% so với ñường sucrose) và do ñặc ñiểm mất nhiệt khi hoà tan nên tạo cảm giác mát lạnh trong miệng ðặc tính này làm cho xylose rất hấp dẫn trong một số sản phẩm thực phẩm, ñặc biệt là ñồ uống Xylose còn ñược sử dụng làm tăng hương vị trong chế biến một số sản phẩm cao cấp như: trong

- Nguyên liệu cho sản xuất ñường xylitol: dùng cho người mắc bệnh tiểu ñường, viêm loét dạ dày,…

chế biến thịt quay, bánh mì… Vì xylose là một nguồn saccharide lý tưởng cho các phản ứng Maillard ñể sản xuất các chất tăng cường hương vị với thời gian phản ứng ngắn hơn so với các ñường 6 cacbon khác [11]

2.1.3.2 Trong lĩnh vực y dược

Không giống như ñường glucose và fructose, ñường xylose là nguồn năng lượng lý tưởng ñể sản xuất nước uống giàu năng lượng không gây cao ñường huyết Xylose bị hấp thu rất ít ở ruột non, ñến ruột già xylose bị hấp thu vào tế bào của vi sinh vật ñường ruột Tại ruột già xảy ra phản ứng lên men lên sinh ra axit hữu cơ khiến pH hạ thấp ức chế nhóm vi khuẩn có hại,

kích thích vi khuẩn có lợi Bifidobacteria phát triển giúp cải thiện hệ tiêu hoá

của con người, giảm huyết áp, lipid và cholesterol trong máu [11]

2.2 Enzyme xylanase

2.2.1 Cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzyme xylanase

2.2.1.1 Cấu tạo của enzyme xylanase

Các xylanase có cấu tạo gồm nhiều chuỗi polypeptide xoắn lại với nhau tạo cấu trúc bậc 2 và tiếp tục cuộn xoắn trong không gian ñể tạo thành cấu trúc bậc 3 Các chuỗi có cấu trúc bậc 3 kết hợp với nhau tạo cấu trúc bậc 4 [31] Ở mức phân tử protein, xylanase gồm vùng chức năng, vùng không chức năng và vùng nối Vùng nối thường có nhiều amino axit, hydroxyl ñược glycosyl hóa ở vị trí O Sự glycosyl hóa này giúp chúng không bị enzyme protease phân cắt Vùng chức năng ñược chia thành vùng xúc tác và vùng bám cơ chất, hai vùng này có thể tách biệt nhau về cấu trúc hoặc không Tính chất của xylanase có mối tương quan rất lớn ñến các gốc hydro liên kết với các xylanase Nếu xylanase có tính bazơ thì amino axit là asparagines, xylanase có tính axit thì amino axit là aspartic [28]

2.2.1.2 Cơ chế xúc tác của enzyme xylanase

Cơ chế hoạt ñộng của xylanase bao gồm các bước sau [6, 29]:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 13

Bước 1: Enzyme xylanase nhận mặt xylan và liên kết với nó bằng cách thay ñổi cấu hình ở phần cánh trái cuộn xoắn lại 3 lần

Bước 2: Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác, liên kết glycoside bị kéo căng và bị bẻ gãy và tạo thành dạng trung gian ñồng hóa trị enzyme-cơ chất

Bước 3: Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt ñộng Phân tử nước này tách thành ion H+ và OH- Ion H+ gắn vào gốc glycosyl vừa ñược tách ra trong khi ion OH- gắn vào ñầu khử của mạch xylan vừa tạo ra theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ ñó sản phẩm ñược giải phóng, ñồng thời enzyme tiếp tục xúc tác cho phản ứng khác

Sơ ñồ tóm tắt của quá trình như sau:

Xylanase + xylan xylan-xylanase xylanase + sản phẩm ðầu tiên cơ chất xylan xoắn ốc ñược ñặt vào vị trí ñối diện với khe giữ Tyr 65 và Tyr 69 Axit glutamic 172 là chất xúc tác axit/bazơ và axit Glutamic 78 là chất cho ñiện tử (nucleophile) Cơ chất bám vào vị trí Glutamic 78 tạo thành dạng sản phẩm trung gian và ñược giữ vững trong suốt quá trình phản ứng chuyển glycosylate Một phân tử nước thay thế vị trí của chất cho ñiện tử (nucleophile) Có sự phân tách và phân tán các ñường (xylobiose) cho phép enzyme di chuyển ñến một vị trí mới trên cơ chất [2]

2.2.1.3 Enzyme xylanase và sự thuỷ phân xylan

Thủy phân xylan bằng enzyme là quá trình ñể phá vỡ chuỗi xylan thu ñược từ quá trình tiền xử lý lõi ngô thành các phân tử ñường xylose bằng tác dụng của các enzyme thủy phân Quá trình này còn ñược gọi là quá trình ñường hóa Xylan có cấu tạo phức tạp và nguồn xylan phong phú nên các enzyme xylanase có cấu tạo cũng rất phức tạp Mỗi loại vi sinh vật khác nhau

sẽ thu ñược sẽ khác nhau Hầu hết enzyme xylanase từ các chủng vi sinh vật ñều chứa trên một hoạt tính ðể phân giải xylan thành xylose cần tác dụng ñồng thời của 2 loại enzyme chính bao gồm: endoxylanase (còn ñược gọi là β-

1,4-xylanase, β-D-xylanase hay Endo-1,4-β-D-xylanase) và β-xylosidase Endo-xylanase thường cắt mạch chính của xylan ở những ñiểm bất kỳ tại giữa mạch và giải phóng olygoxylose Sau ñó, β-xylosidase cắt các ñoạn olygoxylose ñể giải phóng ñường ñơn xylose Ngoài ra còn cần thêm các loại enzyme ñể phân cắt ñường chuỗi bên như α-L-arabinofuranosidase, α-glucuronidase…[28] Nguyên tắc các enzyme thuỷ phân mạch xylan ñược mô

tả trong hình 2.5

Hình 2.5 Tác ñộng của các loại enzyme xylanase lên mạch xylan

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 15

2.2.2 Nguồn enzyme xylanase

Trong thời gian gần ñây việc nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase ñã thu hút ñược sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, trong ñó các công trình nghiên cứu sản xuất enzyme xylanase chủ yếu từ vi sinh vật như nấm và vi khuẩn [6]

Enzyme xylanase từ vi khuẩn: Là một trong số rất nhiều enzyme

xylanase ñược nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp Trong số ñó, chi

Bacillus và Streptomyces là hai chi sản sinh enzyme xylanase khá phổ biến ñã

ñược công bố và sử dụng rộng rãi Xylanase của các họ vi khuẩn thường hoạt ñộng tối ưu ở pH từ 5,0 - 8,0, ở nhiệt ñộ 50 - 80oC Nakamura và cộng sự khi

nghiên cứu enzyme xylanase của Bacillus sp 41-1 cho thấy chúng hoạt ñộng

tốt ở nhiệt ñộ 50oC [28]

Enzyme xylanase từ nấm: Enzyme xylanase ñược sản xuất từ nấm ñặc

biệt là các loại nấm sợi ñược ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp Khả năng sinh enzyme xylanase của nấm sợi cao hơn nhiều so với khả năng sinh enzyme xylanase của vi khuẩn và nấm men Ngoài ra, nấm sợi thường sản sinh một hệ enzyme phân giải xylan bao gồm endoxylanase, β-xylosidase và các enzyme phân cắt nhóm thế khác Các enzyme xylanase của nấm sợi thường là các enzyme ngoại bào Với những ưu thế về khả năng sinh enzyme xylanase như vậy nên hiện nay trên thị trường các chế phẩm enzyme xylanase chủ yếu sản xuất từ nấm sợi ðặc tính chung của ña số các xylanase từ nấm là hoạt ñộng hiệu quả nhất ở nhiệt ñộ 35 - 50oC, pH 3,0 - 5,5 và bền ở dải pH từ 4,0 - 8,0 [40]

Trong số các chi nấm sợi thì các chi Aspergillus và Trichoderma là hai chi sinh enzyme xylanase ñược nghiên cứu nhiều nhất ðặc biệt Aspergillus là

một chi nấm sợi có ý nghĩa công nghiệp cao do có khả năng sinh nhiều loại enzyme thủy phân ngoại bào Chính vì khả năng sinh ñồng thời nhiều loại enzyme thủy phân ngoại bào nên ña số các loài của các chi nấm này ñều có khả năng sinh ra nhiều enzyme xylanase trên các cơ chất tự nhiên, phế phụ

phẩm nông nghiệp chứa lignocellulose như bã dầu cọ, lõi ngô, vỏ lúa mì… Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm nông nghiệp của một số

chủng Aspergillus ñược thể hiện ở bảng 2.6 [29]

Christov và cộng sự khi cấy các chủng A foetidus, A oryzae, A niger

và A phoenicis trên môi trường chứa lõi ngô ñã thu ñược hàm lượng xylanase

tương ứng là 82,3 IU/g; 547,4 IU/g; 99,9 IU/g và 225,6 IU/g [31] Khả năng sinh enzyme xylanase từ nấm cao hơn rất nhiều so với khả năng sinh enzyme xylanase từ vi khuẩn ðể sản xuất enzyme xylanase từ nấm người ta có thể sử dụng các phương pháp truyền thống ñể nâng cao hoạt tính của enzyme như chọn lọc chủng ñầu dòng, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, gây ñột biến bằng tác nhân vật lý, hóa học ñể có thể thu ñược chủng mong muốn

Bảng 2.6 Khả năng sinh enzyme xylanase trên phế phụ phẩm nông

nghiệp của một số chủng Aspergillus

Chủng

Vi sinh vật

Cơ chất

Khối lượng (%)

ðiều kiện nuôi cấy ( o C/h)

IU/g khối lượng khô

50 30/48 283

Cám mỳ/xylan (Tỷ lệ 25/1)

60 28/336 724

A Ochraceus

Thân mỳ 60 28/336 448

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 17

2.2.3 Ứng dụng thực tiễn của enzyme xylanase

2.2.3.1 Tình hình sản xuất và thương mại enzyme xylanase

Những thành tựu nổi bật trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng xylanase ựược sản xuất và ngày càng ựược sử dụng phổ biến Trên thế giới có khoảng 10 công ty sản xuất lớn và hàng loạt các công ty nhỏ sản xuất enzyme công nghiệp, nhưng công ty của Novo- Nordisk của đan Mạch là công ty sản xuất enzyme lớn nhất trên thế giới Chỉ tắnh ựến năm 1994 họ ựã sản xuất ựến 32% enzyme tẩy rửa, chế biến các sản phẩm từ sữa 14%, dệt 10%, thuỷ phân tinh bột 15% và các enzyme khác khoảng 29% Nhưng thành tựu nổi bật nhất trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng xylanase chắnh là các chế phẩm xylanase phục vụ cho công nghiệp giấy, dược phẩm ựã ựược sản xuất và ngày càng ựược sử dụng rộng rãi Hiện nay ựã có một số sản phẩm ựang lưu hành

trên thị trường như: enzyme xylanase X2753-50G từ Thermomyces

lanuginosus của hãng Sigma, enzyme xylanase X400 OL từ Trichoderma longibrachiatum của hãng Gramma Chemie GMbH (đức), Novoenzyme 431

từ Trichoderma longibrachiatum của hãng Novo Nordisk và Grydazym GP

5000 (đan Mạch) [29, 40]

Trung Quốc ựã sản xuất một số enzyme thương mại trong ựó có

xylanase như: DKN xylanase 10000 dry của hãng Qingdao Continent Industry Co., sản phẩm có hoạt tắnh xylanase không dưới 10000 IU/g; xylanase XCB

của hãng Hunan New Century BioChemical Co., sản phẩm có hoạt tắnh xylanase 5000 IU/g; Green enzyme có tổ hợp enzyme gồm: β-glucanase (50000 U/g); protease (1000 U/g), xylanase (60000 U/g); pectinase (6000 U/g); cellulase (12000 U/g) [29]

Các nước đông Nam Á như Singapore cũng có hàng loạt các sản phẩm enzyme xylanase như: Kemzyme dry KM-24-10/99 ựược sản xuất bởi công ty Kemin Industries (Asia) Pte Limited; Rovabio Excel AP AA-54-2/01 ựược sản xuất bởi công ty Adisseo[6]

Ở Việt Nam ñã có một số công trình nghiên cứu về xylanase từ vi sinh vật Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức ñộ tìm hiểu hoạt tính enzyme xylanase của các chủng vi sinh vật ñược sản xuất trong nước Chúng ta chưa tự sản xuất ñược enzyme xylanase ñể phục vụ cho nhu cầu nghiên cứu và sản xuất trong nước Các enzyme hầu hết ñều ñược nhập khẩu về nước ở dạng thành phẩm và bán thành phẩm [6]

2.2.3.2 Ứng dụng trong chuyển hóa các chất lignocenlulose

Xylan còn là cơ chất dùng ñể sản xuất các loại ñường charide Xylo-oligosaccharide là một trong số các oligo-saccharide chức năng (prebiotic) có cấu tạo từ 2 ñến 7 phân tử ñường β-xylose liên kết với nhau bằng liên kết 1,4- β-xyloside Prebiotic có nhiều lợi ích về mặt dược phẩm cũng như có ảnh hưởng tốt ñến sức khỏe Khi ñược bổ sung vào cơ thể người, prebiotic có nhiều tác ñộng sinh lý quan trọng như ngăn cản quá trình gây bệnh của vi khuẩn và các tác nhân gây tiêu chảy, tăng khả năng miễn dịch của

xylo-oligosac-cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, cản trở sự phát triển của các vi sinh vật trong khoang miệng Các sản phẩm phụ nông nghiệp như lõi ngô, cám gạo, vỏ trấu

là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất xylo-oligosaccharide Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình này là các enzyme từ nấm mốc Hiện nay nhu cầu

về oligosaccharide trên thế giới là rất lớn Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về oligosaccharide vào khoảng 1000 - 2000 tấn/năm [16]

2.2.3.3 Ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Việc sử dụng enzyme xylanase cho thức ăn của ñộng vật ñã thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học Bổ sung enzyme xylanase vào thức ăn của gà con làm giảm ñộ nhớt trong ruột gà, tăng hiệu quả hấp thu thức ăn của

gà con và kết quả là cải thiện ñáng kể trọng lượng của chúng Theo Feoli và cộng sự thì việc bổ xung enzyme xylanase vào bột mì và bột ñậu tương trong thức ăn gia súc với một tỷ lệ nhất ñịnh cải thiện ñược năng suất và khả năng tiêu thụ thức ăn của lợn [16] Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng việc bổ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 19

sung enzyme xylanase vào thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ thực vật (cỏ linh lăng, ngũ cốc ) ñã làm tăng hiệu quả tiêu thụ chất dinh dưỡng và năng suất trong chăn nuôi [29]

2.2.3.4 Ứng dụng trong sản xuất bánh

Các enzyme xylanase có khả năng cải thiện chất lượng của bánh mì bởi

vì nó làm tăng thể tích của bánh Chất lượng của bánh ñược cải thiện tốt hơn khi sử dụng enzyme xylanase kết hợp với enzyme amylase Enzyme xylanase

có tính axit từ nấm Aspergillus oryzae ñược sử dụng ñể sản xuất các sản phẩm

thương mại truyền thống của Nhật như sake và shoyu koji Hiện nay một số enzyme xylanase ñược thương mại hoá và sử dụng trong công nghệ làm bánh với các tên như Multifect và Enzeko Novozyme ñưa ra một số các enzyme xylanase mới, có thể là kết hợp với các enzym khác, ñể cải thiện tính chất của bột nhào, ñặc biệt là trong các nhà máy bánh mỳ [29]

2.2.3.5 Các ứng dụng khác

Enzyme xylanase còn ñược ứng dụng rộng rãi trong việc làm mềm rau quả, gạn lọc chất xơ trong công nghiệp nước hoa quả và rượu vang, tách chiết hương liệu và chất màu, dầu thực vật và tinh bột Trong quy trình sản xuất giấy cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy Lignin nằm trong tổ hợp lignocellulose bao gồm lignin, cellulose và hemicellulose ðể tách ñược lignin từ tổ hợp này, phương pháp xử lý truyền thống thường dùng là bổ sung nước clo Tuy nhiên phương pháp này tốn kém và thường gây ô nhiễm môi trường do thành phần clo trong nước thải Ngày nay người ta ñã thay thế dùng enzyme xylanase ñể

xử lý bột giấy Xử lý bột giấy bằng chế phẩm enzyme xylanase sẽ tạo ra loại bột giấy có chất lượng tốt hơn, ñặc biệt không gây ô nhiễm môi trường [6]

2.3 Lõi ngô - nguồn xylan

Cây ngô (Zea Mays L.) với vai trò là cây lương thực cho con người

Ngô góp phần nuôi sống gần 1/3 dân số thế giới và là nguồn lương thực

không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày ñối với một số nước như Peru, Kenia, Mexico… Ngô chiếm 17% tổng sản lượng lương thực, là nguồn thức ăn chăn nuôi (66,8%), nguyên liệu cho ngành công nghiệp (5%), và phục vụ cho xuất khẩu (hơn 10%) Cây ngô hiện nay ñã trở thành cây trồng góp phần ñảm bảo

an ninh lương thực, góp phần chuyển ñổi cơ cấu nông nghiệp từ trồng trọt sang chăn nuôi, cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp và sản phẩm hàng hóa xuất khẩu ở nhiều nước trên thế giới

Trong những năm qua, cây ngô ở nước ta ñã có những bước tiến dài cả

về diện tích, năng suất và sản lượng nhờ ứng dụng khoa học kỹ thuật tiên tiến trong sản xuất, chuyển ñổi cơ cấu giống, thâm canh Tình hình sản xuất ngô của nước ta trong những năm gần ñây ñược thể hiện qua bảng 2.7 [25]

Bảng 2.7 Tình hình sản xuất ngô tại Việt Nam (2007 - 2011)

Năm Diện tích

(1000 ha)

Sản lượng (1000 Tấn)

Năng suất (Tạ/ ha)

(Nguồn: Niên giám thống kê năm 2011)

Số liệu bảng 2.7 cho thấy diện tích và năng suất và sản lượng ngô của nước ta từ năm 2007 ñến năm 2010 liên tục tăng Diện tích ngô năm 2011 giảm so với năm 2010 là 44,2 nghìn ha (giảm 3,9%), giảm chủ yếu ở vụ ñông

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 21

Miền Bắc, nhưng năng suất ngô vẫn ñạt 43,0 tạ/ha Sản lượng ngô năm 2011 vẫn tăng nhẹ so với năm trước Cùng với sản lượng ngô liên tục tăng ñó là những phế thải mà quá trình sản xuất ngô tạo ra như thân ngô, lá ngô, lõi ngô Trong ñó lõi ngô chiếm tỷ lệ khá lớn Hiện nay các giống ngô thường có tỷ lệ lõi/hạt chiếm từ 30 - 40% Như vậy với sản lượng ngô khoảng 4,5 triệu tấn mỗi năm thì lượng lõi ngô thải ra tương ñương mỗi năm khoảng 1,35 - 1,8 triệu tấn, ñây là một con số rất lớn Thành phần các hợp chất trong lõi ngô ñược thể hiện qua bảng 2.8 [9]

Bảng 2.8 Thành phần các hợp chất của lõi ngô STT Thành phần các hợp chất Hàm lượng chất khô %

2 Các chất hoà tan trong rượu 0,27

Các chất hoà tan trong nước ở 50oC 2,41

3

Các chất hoà tan trong nước ở 90oC 0,97

4 Các polysaccharide dễ thuỷ phân 38,13

5 Các polysaccharide khó thuỷ phân 34,03

lõi ngô không ñược xử lý (nhất là ñối với các vùng trồng ngô tập trung có diện tích lớn)

Hiện nay có một số nghiên cứu tận dụng lõi ngô làm giá thể ñể trồng nấm, nhưng kết quả rất hạn chế và hầu như không ñược ứng dụng trong sản xuất thực tiễn Sản lượng ngô ngày càng lớn thì lượng lõi ngô thải ra ngày càng cao Việc nghiên cứu và áp dụng sản xuất ñường xylose từ lõi ngô không chỉ giúp tận dụng tốt hơn nguồn phế thải này mà còn góp phần cải thiện kinh

tế cho người trồng ngô, phát triển ngành công nghiệp thực phẩm trong nước, ñồng thời làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường [9]

Theo các nghiên cứu thì lõi ngô chính là nguồn xylan phong phú Lõi ngô có hàm lượng xylan khá lớn (khoảng 19 - 23% khối lượng chất khô) Hàm lượng xylan trong một số loại thực vật ñược thể hiện qua bảng 2.9 [4,9]

Bảng 2.9 Thành phần hemicellulose trong sinh khối thực vật

Thành phần hemicellulose (% khối lượng khô) Loại thực vật Galactan Xylan Arabino Mannan

Thân ngô, lõi ngô khô 1,0 - 1,2 19,0 - 23,0 1,8 - 3,4 0,3 - 0,7

Cỏ Switchgass khô 1,0 - 1,1 23,0 - 25,0 3,0 - 3,4 0,1 - 0,8 Cây gỗ ngắn ngày 0,7 - 1,2 13,0 – 17,0 0,4 - 1,1 0,9 - 1,3

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh Hạnh khi tiến hành lựa chọn nguyên liệu trong quá trình thực hiện ñề tài cấp Bộ “Nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại ñường chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm” ñã xác ñịnh ñược lượng ñường xylose sau khi

xử lý bằng axit trên các nguyên liệu khác nhau và ñã chỉ ra lõi ngô là loại nguyên liệu cho hàm lượng xylan cao nhất ñạt 3,75% [3] Như vậy, lõi ngô không chỉ là nguồn nguyên liệu chứa nhiều xylan mà ñây còn là nguồn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 23

nguyên liệu tương ñối sẵn có, dễ thu gom và rẻ tiền rất phù hợp cho sản xuất ñường xylose

2.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose trên thế giới và ở Việt Nam

2.4.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới ñã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu phương pháp sản xuất ñường xylose bằng cách lên men các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật giàu xylan (như thân, lõi ngô, bã mía,…) nhờ vi sinh vật

và bằng phương pháp hóa học Theo thống kê năm 2005 của Frieder W Lichtenthaler, lượng xylose ñược sản xuất hàng năm trên thế giới là 25.000 tấn Con số này so với ñường mía (130.000.000 tấn/ năm) còn rất thấp Xét về mặt hiệu quả kinh tế thì sản xuất ñường xylose mang lại hiệu quả cao hơn rất nhiều so với ñường sucrose (giá ñường xylose cao gấp 15 lần ñường sucrose) ðến năm 2012 ñường xylose ñược bán trên thị trường với giá khoảng 6,2 (Euro/kg), trong khi ñó ñường sucrose có giá khoảng 0,8 (Euro/kg) Lượng sản xuất và giá cả của các loại ñường trên thế giới năm 2005 ñược thể hiện ở bảng 2.10 [4]

Bảng 2.10 Lượng sản xuất và giá cả các loại ñường trên thế giới

(tấn/ năm)

Giá thành (Euro/ kg)

Sucrose 130.000.000 0,30 D- glucose 5.000.000 0,60 Lactose 295.000 0,60 D- fructose 60.000 1,00 Maltose 3.000 3,00 D- xylose 25.000 4,50 ðường

L- sorbose 60.000 7,50

D- sorbitol 650.000 1,80 Erythritol 30.000 2,25 ðường rượu

D- xylitol 30.000 5,00 Axit citric 1.500.000 1,00 ðường có nguồn

gốc từ axit D-Axit gluconic 60.000 1,40

(Theo số liệu thống kê năm 2005)

Sản xuất xylose có thể dùng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền như phế thải nông nghiệp (kể cả phế thải của ngành công nghiệp mía ñường) trong khi giá thành của xylose trên thị trường cao hơn tới 15 lần so với ñường mía Vì vậy

mà trong những năm gần ñây xu hướng sản xuất xylose có chiều hướng tăng

ở nhiều quốc gia trên thế giới

2.4.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ñường xylose ở Việt Nam

Hiện nay ở trong nước ñã có một số công trình nghiên cứu sản xuất các loại ñường chức năng như fructooligosaccharides, xylooligosaccharide Việc nghiên cứu và sản xuất ñường xylose vẫn còn là vấn ñề rất mới

Trong quá trình nghiên cứu thăm dò công nghệ sản xuất oligogalac- turonide từ thịt quả cà phê bằng phương pháp enzyme Năm 2007 Nguyễn Trung Dũng và cộng sự tiến hành xác ñịnh các ñiều kiện cho quá trình thủy phân pectin bằng chế phẩm enzyme pectinex ULTRA SP-L ñể sản xuất oligogalacturonide Kết quả ñã xác ñịnh ñược ñiều kiện thuỷ phân phù hợp: tỷ

lệ enzyme pectinex 0,1%, nhiệt ñộ = 40-45oC; pH = 4,5-5; thời gian thủy phân là 45 phút Tác giả ñưa ra quy trình sản xuất và tạo ra chế phẩm oligogalacturonide theo phương pháp cô ñặc và sấy khô [2]

Nguyễn Thị Minh Hạnh và cộng sự năm 2008 tiến hành nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất các loại ñường chức năng dùng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm Kết quả của ñề tài tuyển chọn ñược 47 chủng nấm men có khả năng chuyển hóa xyloze thành xylitol từ 23 mẫu ñất

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 25

và hoa quả Trong ñó có 9 chủng nấm men có hiệu suất chuyển hóa lớn hơn 45%, hiệu suất cao nhất ñạt ñược là 70,1% ðề tài ñã tìm ra nguyên liệu thích hợp cho quá trình sản xuất xylitol từ phế thải nông nghiệp là lõi ngô Tác giả ñưa ra quy trình sản xuất ñường xylitol với ñộ tinh khiết lớn hơn 98% sau ñó ứng dụng chế phẩm xylitol vào sản xuất kẹo cao su, kẹo cứng, bánh gato và thuốc ñánh răng [1]

Bùi Kim Thúy và cộng sự năm 2008 tiến hành nghiên cứu xây dựng công nghệ sản xuất Fructo-oligosaccharides (FOS) làm thực phẩm chức năng Tác giả ñã tìm ra ñiều kiện tốt nhất ñể xử lý nguyên liệu với tỉ lệ nguyên liệu/ nước là 1/2, nhiệt ñộ 80oC trong thời gian 1giờ ðiều kiện tốt nhất ñể thuỷ phân ñường sacaroza thành ñường FOS nhờ sử dụng enzyme fructosyltranferaza có nồng ñộ 0,3%; pH=5, thời gian thuỷ phân là 12h ở nhiệt ñộ 50oC Tác giả xây dựng quy trình công nghệ sản xuất ñường FOS từ chuối tiêu và tạo ra sản phẩm ñường FOS với ñộ tinh khiết 55,12% [3]

Năm 2008 khi tiến hành nghiên cứu ñề tài “Ứng dụng công nghệ enzyme trong sản xuất ñường chức năng XOS - xylooligosaccharide” tác giả Nguyễn Thị Hồng Nhung xác ñịnh ñược nguyên liệu phù hợp nhất ñể sản xuất ñường XOS là lõi ngô Phương pháp xử lý lõi ngô thích hợp nhất là hấp lõi ngô ở 120oC/30 phút, sau khi xay hấp tiếp ở 120oC/25 phút ðiều kiện tối thích cho Viscoenzyme thuỷ phân xylan trong lõi ngô thành ñường XOS là: Nồng ñộ enzyme/cơ chất là 60µl/100ml, nhiệt ñộ 60oC, thời gian 120 phút,

pH = 6 Tác giả ñã ñề xuất quy trình sản xuất XOS từ lõi ngô [8]

ðến năm 2009 Nguyễn Tất Thắng và cộng sự bước ñầu tiến hành nghiên cứu công nghệ sản xuất ñường xylose từ lõi ngô Kết quả ñã phân lập,

tuyển chọn ñược 27 chủng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng chuyển hóa xylan thành ñường xylose Trong ñó chủng Aspergillus niger DL1 có khả

năng thuỷ phân xylan tốt nhất Khi ứng dụng chủng nấm này ñể thuỷ phân xylan thành ñường xylose cho hiệu suất thuỷ phân thấp (ñạt 70,38%) [4]

PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 3.1 ðối tượng và vật liệu nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng và vật liệu

- ðối tượng: ðường xylose

- Vật liệu: Lõi ngô thu mua tại các hộ gia ñình ở Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc và Mê Linh, Hà Nội Lõi ngô ñược thu gom, loại bỏ những phần lõi bị hỏng, mốc và ñem phơi khô ñến ñộ ẩm < 5% Sử dụng máy nghiền, nghiền nhỏ lõi ngô khô ñến kích thước khoảng 0,1-0,5mm) Lõi ngô ñược bảo quản trong các bao ni lông ñể chuẩn bị cho các nghiên cứu

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

3.1.2.1 Thiết bị

Máy ño pH (MP200R, Thụy Sỹ)

Cân phân tích (Precisa XT 320M, Thụy Sỹ)

Máy ño OD (Labomed, Mỹ)

Tủ lạnh (Tosiba, Nhật)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 27

Nồi hấp (Tomy, nhật)

Tủ sấy, tủ ấm (Binder, ðức)

Máy li tâm (Sorwall, Mỹ)

Máy lắc Orbital (Gallenkamp, Anh)

Máy cô chân không (SpeedVac, Thermo Fisher Scientific, Mỹ)

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao năng HPLC (Shimadzu, Nhật)

3.1.2.2 Dụng cụ

Nhiệt kế, bếp ñiện, giấy lọc, dụng cụ thủy tinh các loại (ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống ñong, bình ñịnh mức, phễu thủy tinh, pipet, buret, ), micropipet (Gilson, Pháp)

3.1.2.3 Hóa chất

- Ca(OH)2 tinh khiết của Trung Quốc

- ðường xylose chuẩn của ðan Mạch (dạng bột)

- H2SO4 , HCl của Trung Quốc

- Giấy thử pH, phenolphtalein, glycerin của Trung Quốc

- Thuốc thử DNS: 3,5 axit dinitro salicylic, NaOH, Muối K-Na tactrat kép, phenol (nóng chảy ở 68oC), natri metabi sunfit (Na2S2O5) của Trung Quốc

- Than hoạt tính, ethanol của Việt Nam

- Enzyme xylanase: ðược sản xuất từ Trichoderma Longibrathia-pum

của hãng Novo - Công ty Novo Nordisk - ðan Mạch Enzyme ñược sản xuất

có các hoạt tính phù hợp cho quá trình thuỷ phân xylan ñể thu ñược ñường xylose với hàm lượng cao Enzyme có hoạt tính cellulanase, hemicellulanase, ñặc biệt quan trọng là endoxylanase và β-xylosidase (có hoạt tính là 1ml= 820,1U)

3.2 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu

3.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác ựịnh các thông số công nghệ trong xử lý nguyên liệu lõi ngô Nội dung 2: Xác ựịnh các thông số của quá trình thủy phân dịch xylan thành ựường xylose bằng enzyme xylanase

Nội dung 3: Xác ựịnh một số thông số công nghệ của quá trình tách chiết, làm sạch và thu hồi ựường xylose quy mô phòng thắ nghiệm

Nội dung 4: đánh giá chất lượng ựường xylose thành phẩm và ựưa ra quy trình sản xuất xylose từ lõi ngô

3.4 Phương pháp bố trắ thắ nghiệm

3.4.1 Sơ ựồ quy trình sản xuất ựường xylose từ lõi ngô

Quy trình sản xuất ựường xylose bằng enzyme xylanase ựược thể hiện ở

sơ ựồ hình 3.1 Quy trình này ựược xây dựng dựa trên quy trình sản xuất ựường FOS của Bùi Kim Thúy [3] và các quy trình sản xuất các loại ựường chức năng của Nguyễn Thị Minh Hạnh và cộng sự [1] Quy trình dự kiến sản xuất ựường xylose bằng enzyme xylanasegồm các bước chắnh: Xử lý sơ bộ lõi ngô, xử lý lõi ngô tạo dịch xylan, thủy phân dịch chứa xylan bằng enzyme xylanase, làm sạch và thu nhận ựường xylose thành phẩm

- Xử lý nguyên liệu sơ bộ: Lõi ngô ựược làm sạch, phơi khô, nghiền nhỏ tới kắch thước thắch hợp (0,1-0,5mm) cho quá trình thuỷ phân

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 29

- Xử lý nguyên liệu tạo dịch xylan: Thủy phân nguyên liệu trong các khoảng nhiệt ñộ và thời gian khác nhau ñể thu nhận dịch chứa xylan

- Xử lý dịch sau thủy phân: Tiến hành lọc lấy phần dịch xylan và chỉnh

về pH = 4 - 5, cô ñặc dịch bằng máy cô chân không, bảo quản lạnh

- Thủy phân dịch chứa xylan bằng enzyme xylanase: Dịch xylan trước khi thủy phân bằng enzyme xylanase ñược chỉnh về pH thích hợp Sau ñó dùng enzyme xylanase thủy phân dịch chứa xylan ñể tạo ra ñường xylose với ñiều kiện nhiệt ñộ, thời gian, pH, tỷ lệ dịch thuỷ phân thích hợp

- Thu hồi dịch thủy phân: Dịch sau thủy phân ñược ly tâm loại bỏ một

số tạp chất và màu ở tốc ñộ 200 vòng/phút; lọc lấy phần dịch lỏng có chứa xylose, bảo quản ở 3 - 4oC cho ñến khi tách chiết

- Làm sạch dịch thủy phân: Dịch sau khi thủy phân, dùng than hoạt tính với nồng ñộ 2,5 - 3,0% ñể làm sạch, loại bỏ màu trong thời gian 30 phút, sau

ñó ñem lọc bằng thiết bị lọc chân không Dịch ñược cô ñặc về nồng ñộ ≥ 40% ñường xylose bằng máy cô chân không

- Thu hồi ñường xylose: Dịch thủy phân sau khi ñã ñược cô ñặc về nồng ñộ ≥ 40% ñường xylose thì ñem kết tinh thu hồi xylose Một số tinh thể ñường xylose ñược bổ xung ñể làm mồi cho quá trình kết tinh Tinh thể ñường xylose xuất hiện với số lượng lớn sau 18 giờ kết tinh Sau khi kết tinh, tinh thể ñường xylose ñược thu hồi bằng ly tâm, rửa sạch, sấy khô

Sơ ñồ 3.1 Quy trình dự kiến sản xuất ñường xylose bằng enzyme xylanase 3.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xác ñịnh các thông số công nghệ trong xử lý nguyên liệu lõi ngô Nội dung 2: Xác ñịnh các thông số của quá trình thủy phân dịch xylan thành ñường xylose bằng enzyme xylanase

Xử lý sơ bộ lõi ngô (phân loại, làm sạch, nghiền nhỏ)

Xử lý lõi ngô (ñược dịch chứa xylan)

Làm sạch dịch thủy phân (lọc, ly tâm, sử dụng than

hoạt tính)

Thu hồi và làm sạch sản phẩm (cô ñặc dịch rửa, Kết tinh,

rửa, sấy) Lõi ngô

Sản phẩm ñường xylose