BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH VẬT ỨNG DỤNG

Nội dung:Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong một mẫu thực phẩm Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của VSVBài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật

Trang 1

THỰC HÀNH

VI SINH VẬT ỨNG DỤNG

Trang 2

NỘI DUNG

Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật trong một mẫu thực phẩm

Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của VSV

Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng sinh tổng hợp

enzym của vi sinh vật

Trang 3

Bài 1: Xác định số lượng vi sinh vật

Các phương pháp xác định:

+ Phương pháp xác định trực tiếp

+ Phương pháp xác định gián tiếp

Trang 4

Trang 5

CẤU TẠO CỦA BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU

Đây là phiến kính dày, phần giữa phiến kính có khắc 1 lưới các ô vuông

Trang 6

CẤU TẠO CỦA BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU

- Lưới khắc chia thành 25 ô vuông lớn 

diện tích 1 ô vuông lớn là 1/25 mm 2

- Mỗi ô vuông lớn lại chia thành 16 ô

vuông nhỏ  Số ô vuông nhỏ trên lưới khắc là 400 ô  diện tích 1 ô vuông nhỏ

là 1/400 mm 2

- Chiều sâu của mỗi ô là 1/10 mm

Trang 7

Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật

2 Cách tiến hành

- Xác định số lượng tế bào nấm men của men bánh mì khô

- Pha loãng mẫu đến nồng độ 10 -4

- Nhỏ một giọt dịch huyền phù có vi sinh vật vào giữa khung đếm và đậy kín bằng

lá kính, di chuyển nhẹ khung đếm làm dịch chiếm đầy các khoang

- Đặt khung đếm vào bàn kẹp tiêu bản của kính hiển vi, chọn vật kính 10x hoặc

40x rồi từ từ dùng ốc chỉnh thô đưa bàn kẹp tiêu bản lên trên để buồng đếm gần chạm vào vật kính

- Dùng ốc vi chỉnh từ từ đưa tiêu bản xuống dưới để tìm ảnh và lấy nét Tiến

hành đếm số tế bào trong 5 ô vuông lớn hoặc 20 ô vuông nhỏ.

Trang 8

Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật

3 Tính kết quả:

- N = a 10 n 10 3 /h.s

- Trong đó N: số tế bào trong 1 gram men bánh mì; a là số tế bào trung bình

trong 1 hình vuông của lưới ở nồng độ pha loãng 10 -n , h là chiều sâu của

khung đếm; n là độ pha loãng dịch huyền phù; s là diện tích một hình vuông của lưới

- Lưu ý: số tế bào trong 1 ô lớn không vượt quá 20, số tế bào trong 1 ô nhỏ

không vượt quá 10.

Trang 9

trong mẫu thực phẩm

III Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật thông qua phương

pháp đếm khuẩn lạc

1 Nguyên tắc:

Mẫu được đồng nhất và được pha loãng đến nồng độ thích hợp rồi cấy trên

môi trường thạch chọn lọc cho từng nhóm, loài VSV Xác định số lượng khuẩn lạc trên bề mặt thạch sau thời gian nuôi trong tủ ấm.

Cách đếm: lấy bút chì kẻ 2 đường vuông góc ở đáy hộp petri Đếm số khuẩn

lạc trong từng góc theo thứ tự từ trái qua phải, từ trên xuống dưới

Trang 10

Phương pháp xác định gián tiếp số lượng vi sinh vật

2 Cách tiến hành:

- Yêu cầu xác định số lượng tế bào nấm men của men bánh mì khô

- Chuẩn bị môi trường Hansen:

+ Thành phần môi trường:

Đường saccarose: 30g/l; Pepton 10 g/l; K2HPO4: 3g/l; MgSO4.7H2O: 2 g/l;

Agar: 20g/l; Nước: 1000ml

+ Chuẩn bị 200ml môi trường, khử trùng ở 121 0 C/15 phút Sau đó để nguội,

đổ vào 9 đĩa petri đã khử trùng.

Trang 11

2 Cách tiến hành:

- Chuẩn bị dãy pha loãng mẫu đến nồng độ 10 -6 – 10 -8

- Cấy dịch mẫu vào các đĩa thạch có chứa môi trường nuôi Hansen, mỗi

độ pha loãng cấy vào 3 đĩa, nhỏ 0,1ml dịch vào chính giữa đĩa thạch, trang đều, ủ ở 28 – 30 0 C

- Đếm số khuẩn lạc sau 48h nuôi.

Trang 12

3 Tính kết quả:

 C

N =

(n 1 x f 1 + n 2 x f 2 ) x v

N: Tổng số vi khuẩn hiếu khí (CFU/g hoặc CFU/ml)

C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

n i : Số lượng đĩa cấy tại nồng độ i

f i : Độ pha loãng đĩa i

Trang 13

IV Đặt thí nghiệm cho bài 2

1 Thí nghiệm lên men rượu:

Chuẩn bị 100ml dung dịch đường saccharose 10% cho vào bình tam giác

250ml, thêm 0,1g nấm men Sac cerevisiae hòa tan Lên men ở nhiệt độ

phòng trong 48 h.

2 Thí nghiệm lên men lactic:

Chuẩn bị 100ml sữa tươi vào bình tam giác 250ml Thêm vào 5g sữa chua Lên

men ở 40độ C trong 6h.

3 Đặt thí nghiệm lên men axetic:

Chuẩn bị 100ml bia + 1ml cồn 96 0 + 15ml dấm ăn vào bình tam giác 250ml Lên

Trang 14

V Đặt thí nghiệm cho bài 3

1 Thí nghiệm thủy phân protein

Chuẩn bị 5g thịt vụn + 150ml nước vào bình tam giác 250ml.

Đun sôi cách thủy trong 10 phút.

Để nguội, kiểm tra pH bằng giấy thử pH.

Kẹp 1 miếng giấy thử pH ở miệng bình tam giác để kiểm tra sự bay hơi của

khí NH 3

Ủ ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày.

Trang 15

V Đặt thí nghiệm cho bài 3

2.Thí nghiệm thử khả năng sinh tổng hợp enzyme amilase

- Chuẩn bị môi trường:

+ Thành phần môi trường: NaNO3: 3g/l; K2HPO4: 1g/l; KCl: 0,5g/l;

MgSO4.7H20: 0,5g/l; FeSO4: 0,1g/l; Tinh bột tan: 15g/l; Agar: 20g/l; Nước: 1000ml (Chú ý: Tinh bột tan hòa trong nước ấm cho tan thành dạng hồ rồi mới đổ vào môi trường).

+ Chuẩn bị 200ml môi trường, khử trùng ở 121 0 C/15 phút Sau đó để nguội,

đổ vào 8 đĩa petri đã khử trùng.

- Cấy chấm điểm nấm mốc Aspergillus và Penecillium vào giữa các đĩa: mỗi

Trang 16

Bài 2: Xác định khả năng chuyển hóa hydratcacbon của vi

sinh vật

1 Quá trình lên men rượu:

- Quan sát trạng thái của bình lên men:

- Quan sát tế bào nấm men: Làm 1 tiêu bản tươi không nhuộm, quan sát ở vật

kính 40X, xác định hình dạng, cách sắp xếp tế bào nấm men

- Xác định tỷ lệ nấm men nảy chồi: Làm 1 tiêu bản tươi không nhuộm, quan

sát ở vật kính 40X, đếm tổng số tế bào nấm men và số tế bào nấm men nảy chồi ở 5 trường kính để tính

Cách làm tiêu bản tươi không nhuộm: Nhỏ 1 giọt dung dịch chứa VSV vào

giữa phiến kính, dùng lam kính đậy lại

Trang 17

PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC

Bài 1:

Tổ 1: Chuẩn bị dãy pha loãng đến nồng độ 10-8; cấy 3 nồng độ (10-6 đến 10-8 )

trong 5 ô lớn, tính kết quả

Tổ 2: Chuẩn bị 200 ml môi trường Hansen; đổ môi trường Hansen vào 9 đĩa;

Tổ 3: Chuẩn bị 200 ml môi trường thử khả năng STH enzym amilase; đổ môi

trường thử khả năng STH enzym amilase vào 8 đĩa; đếm số tế bào nấm

Tổ 4: Đặt 3 TN của bài 2 và 1 TN thủy phân protein của bài 3; cấy 2 chủng

Trang 18

sinh vật

1 Quá trình lên men rượu:

- Xác định tỷ lệ nấm men sống: Làm 1 tiêu bản tươi nhuộm đơn bằng

safranin, quan sát ở vật kính 40X, đếm tổng số tế bào nấm men và số tế bào nấm men sống ở 5 trường kính để tính

Cách làm tiêu bản tươi nhuộm đơn: Nhỏ 1 giọt dung dịch chứa VSV vào

giữa phiến kính, nhỏ tiếp 1 giọt thuốc nhuộm safarnin, trộn đều, dùng lam kính đậy lại, đếm trong vòng 3 phút

Lưu ý: Tế bào nấm men sống không bắt màu, tế bào nấm men chết bắt màu

của thuốc nhuộm

Trang 19

sinh vật

2 Quá trình lên men lactic :

- Quan sát trạng thái của bình lên men:

- Xác định lượng axit lactic tạo thành: Cân 10g sữa chua vào bình tam

giác 250ml, thêm 20ml nước, thêm 1-2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N

1ml NaOH 0.1N = 0,009g lactic

- Quan sát vi khuẩn lactic: làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram để

quan sát: hình dạng, cách sắp xếp, loại Gram của các chủng vi khuẩn lactic trong sữa chua

Trang 20

sinh vật

2 Quá trình lên men axetic :

- Quan sát trạng thái của bình lên men

- Xác định lượng axit axetic tạo thành: Hút 10ml dịch lên men axetic

vào bình tam giác 250ml, thêm 20ml nước, thêm 1-2 giọt

phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N

1ml NaOH 0.1N = 0,006g axetic

- Quan sát vi khuẩn axetic: làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram để

quan sát: hình dạng, cách sắp xếp, loại Gram của các chủng vi khuẩn axetic trong dịch lên men

Trang 21

Các bước nhuộm gram

Trang 22

Các bước nhuộm Gram

cấy tròn sinh khối vi sinh vật hòa đều vào giọt nước cất (hoặc lấy 1 giọt dung dịch chứa vi sinh vật đặt lên giữa phiến kính), dàn mỏng, hong khô

khuẩn lấy từ canh lỏng để 2 phút, lấy từ thạch dinh dưỡng để 1 phút ) Rửa nước (trong 5 giây), hong khô

trong 1 phút, đổ dung dịch lugol đi

- Tẩy cồn 96: 15 – 30 giây (vi khuẩn lấy từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ thạch dinh dưỡng tẩy 30 giây ) Rửa nước, thấm (hong) khô Tẩy cồn bằng cách

để nghiêng tiêu bản, cho cồn chảy từ từ ở mép trên phiến kính Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt cồn vừa mất màu tím

Trang 23

Các bước nhuộm Gram

- Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi, nhuộm lần 2 bằng cách nhỏ dung dịch safranin kiềm loãng (màu hồng) để 1 phút Rửa nước, thấm (hong) khô tiêu bản

Vi khuẩn G (+) bắt màu tím Crystal violet, vi khuẩn G (–)bắt màu hồng

lọc phủ lên vết bôi Sau mỗi lần nhuộm đều phải rửa nước và thấm (hong) khô tiêu bản

Trang 24

Bài 3: Xác định khả năng thủy phân protein và khả năng

sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật

1 Xác định khả năng thủy phân protein của VSV

- Quan sát hiện tượng

- Xác định định tính :

So sánh giá trị pH ở thời điểm đặt thí nghiệm và thời điểm đọc kết quả

- Quan sát vi khuẩn gây thối rữa protein:

Làm 01 tiêu bản cố định nhuộm Gram từ dịch thủy phân để xác định: Hình dạng của các loài vi khuẩn, so sánh tỷ lệ vi khuẩn G(+) và G(-) trong tiêu bản

Trang 25

2 Xác định khả năng sinh tổng hợp emzym amilaza

- Thuốc thử: Dùng dung dịch Lugol (I2 và KI) đổ vào đĩa thạch có chứa

tinh bột tan đã nuôi nấm mốc

- Xác định định tính khả năng sinh enzym amilase của VSV:

Xác định đường kính khuẩn lạc: d (mm)

Xác định đường kính vòng môi trường đã bị thủy phân: D (mm)

Hiệu số D – d là đại lượng định tính để xác định khả năng sinh enzym của vi sinh vật

So sánh khả năng sinh enzym amilase của 2 loài nấm mốc đã sử dụng

Trang 26

2 Xác định khả năng sinh tổng hợp emzym amilaza

- Quan sát nấm mốc:

+ Làm 01 tiêu bản tươi không nhuộm: để quan sát hình dạng hệ sợi nấm

(có vách ngăn hay không, có phân nhánh hay không?), màu của bào tử+ Làm 01 tiêu bản tươi nhuộm đơn bằng safranin: để quan sát bộ phận sinh bào tử của nấm mốc (bào tử trần hay bào tử nang, bào tử trần dạng bàn tay xòe hay dạng hoa hướng dương )

Trang 27

Bài 2 + 3:

Tổ 1: Đếm số khuẩn lạc nấm men của bài 1, tính kết quả; làm 1 tiêu bản tươi

không nhuộm nấm men; 1 tiêu bản cố định nhuộm Gram vi khuẩn lactic trong sữa chua; 1 tiêu bản cố định nhuộm Gram vi khuẩn axetic

Tổ 2: Xác định lượng axit lactic tạo thành trong sữa chua; ; làm 1 tiêu bản tươi

nhuộm đơn nấm men; 1 tiêu bản cố định nhuộm Gram vi khuẩn lactic trong nước dưa chua; 1 tiêu bản cố định nhuộm Gram vi khuẩn axetic

Tổ 3: Xác định lượng axit axetic tạo thành; ; làm 1 tiêu bản tươi không nhuộm

nấm mốc Aspergillus; 1 tiêu bản cố định nhuộm Gram vi khuẩn lactic trong

sữa chua; 1 tiêu bản cố định nhuộm Gram vi khuẩn thủy phân protein

Tổ 4: Xác định hiệu số D – d của hai chủng nấm mốc; Xác định lượng axit axetic

tạo thành; làm 1 tiêu bản tươi nhuộm đơn nấm mốc Aspergillus; 1 tiêu bản cố

định nhuộm Gram vi khuẩn lactic trong nước dưa chua; 1 tiêu bản cố định

Trang 28