Bài giảng thực hành Vi sinh công nghệ thực phẩm

Thôngthường phòng thực hành vi sinh vật cần phân chia các khu vực như sau: - Lưu trữ mẫu - Rửa dụng cụ, khử trùng, làm khô - Bảo quản hóa chất - Pha chế môi trường - Thao tác nuôi cấy vi

NHỮNG QUI ĐỊNH TRONG PHÒNG THỰC HÀNH

VI SINH VẬT

B Nội dung

1 Những yêu cầu cơ bản đảm bảo an toàn

1.1 Những yêu cầu cơ bản về phòng thực hành vi sinh vật – ký sinh trùng

Phải có diện tích làm việc và bố trí phù hợp Khoảng cách làm việc hợp lýnhằm hạn chế tối đa sự di chuyển trong phòng, tránh nguy cơ lây nhiễm Thôngthường phòng thực hành vi sinh vật cần phân chia các khu vực như sau:

- Lưu trữ mẫu

- Rửa dụng cụ, khử trùng, làm khô

- Bảo quản hóa chất

- Pha chế môi trường

- Thao tác nuôi cấy vi sinh vật có lợi

- Thao tác nuôi cấy vi sinh vật gây bệnh

Phòng thực hành phải đảm bảo đủ sáng, thoáng khí nhưng không bụi Khu thaotác nuôi cấy cần lắp đặt đèn UV để tiệt trùng không khí và không gian làm việc, hạnchế tối đa việc sử dụng quạt để tránh lây nhiễm Hóa chất cần bảo quản nơi khô, mát,tránh ánh sáng chiếu trực tiếp và an toàn cháy nổ

1.2 Sổ lưu ký thí nghiệm

* Nhật ký thiết bị

Các dụng cụ, thiết bị phải có sổ ghi chép, người sử dụng cần ghi hoặc đăng kýthời gian bắt đầu và kết thúc sử dụng dụng cụ, thiết bị, tình trạng trước và sau khi sửdụng

A Mục tiêu:

1 Thực hiện được những yêu cầu đảm bảo an toàn trong phòng thực hành

2 Thực hiện đúng những qui định đề phòng nhiễm trùng

3 Trình bày được các biện pháp phòng ngừa và xử trí một số rủi ro có thể xảy ra trong thực hành vi sinh

* Nhật ký thí nghiệm

Mỗi sinh viên làm thực hành cần phải có sổ ghi chép các công việc đã làm, cáckết quả thu được một cách cẩn thận, rõ ràng và làm bài phúc trình kết quả thực hiệntrên giấy A4 (Ví dụ: Họ Tên, Lớp, nhóm, ngày tháng năm, tên bài thực hành, phươngpháp tiến hành, diễn biến và kết quả…)

- Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật

- Cẩn thận thao tác với đèn cồn, dùng nấp đậy một cách dứt khoát, không thỏiđèn bằng miệng, không dùng đèn để mồi lửa, không để đèn cháy mà khikhông làm việc

- Không dùng mũi ngửi hóa chất, môi trường, vi sinh vật

- Không dùng miệng hút hóa chất mà phải chọn lựa dụng cụ phù hợp để sửdụng

- Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, phải đeo găng tay để thu gom hết các mảnh

vỡ cho vào túi riêng

- Các dụng cụ, thiết bị cần phải nắm rõ cách sử dụng, không sử dụng tùy tiện

- Tất cả chất thải rắn, môi trường có chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần khửtrùng trước khi bỏ vào bãi rác Các dụng cụ nhiễm vi sinh vật cần ngâm

nước tẩy (nước javel hoặc những dung dịch sát khuẩn khác) trước khi rửa vàtái sử dụng.

- Sát trùng và rửa tay trước khi rời phòng thí nghiệm

2 Một số nguyên tắc làm việc với vi sinh vật

Khi làm việc với vi sinh vật cần hạn chế đến mức tối đa sự lây nhiễm và nhầmlẫn các giống với nhau, cần thực hiện các bước cơ bản sau:

+ Khử trùng: Phòng thí nghiệm phải được vệ sinh sạch sẽ, bàn làm việc được laubằng chất sát khuẩn thích hợp (dung dịch javen, cồn 70o, cloramin 1%, ), chiếu tia cựctím (UV) trước khi tiến hành thí nghiệm

+ Không có luồng gió lưu thông khi làm thí nghiệm, đóng kín cửa và không sửdụng quạt

+ Cấy vi sinh vật cần thực hiện trong tủ an toàn sinh học (tủ cấy vô trùng)

+ Dụng cụ dùng để nuôi, cấy vi khuẩn phải được vô trùng

+ Các thao tác đều được thực hiện bên ngọn lửa đèn cồn

+ Que cấy phải được hơ nóng trước khi lấy mẫu và sau khi sử dụng

+ Cầm ống nghiệm luôn ở trạng thái nghiên 1 góc nhỏ hơn 450 so với mặt phẳngngang để hạn chế bụi rơi vào Hơn nóng miệng ống nghiệm sau khi mở nắp và trướckhi đóng nắp

+ Đối với đĩa Petri, để đĩa nằm ngang, nắp nằm phía trên, đáy nằm phía dưới hé mởtạo một góc khoảng 30o, làm như thế nắp vẫn còn che phía trên của đáy đĩa hạn chế bụirơi vào

+ Khi để trong tủ ấm hay tủ lạnh để đáy phía trên, nắp phía dưới hạn chế bay hơinước làm khô môi trường

- Thận trọng không để bắn các giọt nhỏ có vi sinh vật ra ngoài không khí, khilắc hay ly tâm dung dịch có vi sinh phải đậy nắp.

- Khử trùng thường xuyên bàn làm việc, sàn nhà bằng chất sát khuẩn

- Các thiết bị nhiễm vi sinh (tủ ấm, máy ly tâm, ) phải được khử trùng bằngchất sát khuẩn

hoặc acid

Bôi vaselin oxycyanat

Tổn thương do các vật nhọn đâm hay

mảnh thủy tinh vỡ

Bóp cho máu chảy, rửa nước sạch, bôicồn (iod hoặc betadin)

phút, sau đó bôi thuốc chống bỏng

chất sát khuẩn

BÀI 1: DỤNG CỤ, THIẾT BỊ TRONG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

VÀ PHƯƠNG PHÁP LÀM MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG (5 tiết)

- Ống nghiệm: Dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn, pha loãng hay lưu trữ vi khuẩn

- Lọ thủy tinh/ bình tam giác: dùng để chứa hóa chất, môi trường nuôi cấy

- Cốc thủy tinh/cốc nhựa: dùng để pha môi trường, pha hóa chất

- Đèn cồn: có tác dụng vô trùng khi làm việc với vi khuẩn

- Phiến kính/lam: sử dụng làm tiêu bản khi quan sát hình thái, sinh hóa, di độngcủa vi khuẩn,…

- Lá kính/lamel: Dùng để đậy lên vết bôi của vi khuẩn trên phiến kính

- Phiến kính có khung đếm/buồng đếm: Dùng để kiểm tra số lượng vi khuẩn

1.2 Dụng cụ thiết bị khác

- Que cấy: Được chế tạo bằng kim loại chóng nóng và chóng nguội, dùng để lấy

và chuyển vi khuẩn, có 4 loại que cấy:

+ Que cấy vòng: được làm bằng kim loại, có đầu uốn cong thành vòng tròn,được sử dụng lấy vi khuẩn từ môi trường lỏng hoặc đặc chuyển sang môitrường khác, sử dụng cấy vạch (cấy ria) để tách ròng

+ Que cấy thẳng: được làm bằng kim loại, đầu thẳng dùng để cấy trích sâutrong môi trường đặc.

+ Que cấy móc: làm bằng kim loại, đầu uốn hơi cong giống như có móc dùng

để cấy nấm và xạ khuẩn

+ Que cấy gạt: thường làm bằng thủy tinh, đầu có hình tam giác hoặc hìnhchữ L dùng để phân bố dịch chứa vi khuẩn trên mặt môi trường đặc

- Cân: cân môi trường, hóa chất,…

- Máy đo pH: dùng để phá hóa chất và môi trường

- Tủ lạnh/tủ âm: lưu trữ, vi sinh vật, hóa chất, môi trường

- Tủ cấy vô trùng (tủ an toàn sinh học): Có hệ thống quạt, đèn UV, khử trùng tạokhoảng không gian vô trùng để cấy vi sinh vật

- Tủ ấm: Dùng để ủ vi sinh vật, có chế độ điều chỉnh nhiệt độ phù hợp giúp cho

vi sinh vật phát triển

- Tủ sấy: dùng để sấy khô các dụng cụ

- Nồi hấp khử trùng nhiệt ướt (autoclave): hấp khử trùng môi trường, một sốnguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm bằng hơi nước ở áp suất cao

- Kính hiển vi quang học: dùng để quan sát hình thái, sự di động hay khảo sát trựctiếp số lượng vi khuẩn

1.3 Một số điểm cần lưu ý khi sử dụng thiết bị, dụng cụ

- Tủ lạnh, tủ ấm: khi bảo quản môi trường nuôi cấy vi khuẩn, hóa chất haygiống vi sinh vật cần phải ghi thời gian và làm dấu tên người làm thínghiệm, sắp xếp gọn gàng, ngăn nắp tránh nhầm lẫn hay đổ vỡ

- Đối với tủ cấy vô trùng: trước khi cấy phải bậc đèn UV 30 phút, trước vàsau khi cấy phải dùng cồn 700 lau tủ Sử dụng chổi và giẻ riêng để quét, lau

tủ, bậc quạt trong khi cấy

- Que cấy: trước và sau khi cấy phải hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi đầu

và thân que cấy cháy đỏ

- Đèn cồn: Không được dùng miệng thổi đèn, không mồi lửa từ đèn này sangđèn khác, không rót cồn quá đầy Khi không sử dụng đèn thì dùng nắp đậy

để tắt đèn

- Hấp khử trùng: Cần thận để tránh bị bỏng, phải nắm rõ yêu cầu và mục đíchkhử trùng, điều kiện khử trùng, cách sử dụng nổi khử trùng Các dụng cụchứa hóa chất, môi trường khử trùng không được chứa nhiều hơn 1/3 thểtích

- Kính hiển vi quang học: Cần quan sát mẫu ở vật kính có độ phóng đại nhỏ(10X) thật rõ trước khi chuyển sang vật kính dầu (100X) Ở vật kính 40Xthấy rõ, nhỏ 1 giọt dầu vào giữa tiêu bản tại điểm sáng rồi chuyển vật kính100X vào Không sử dụng ốc thứ cấp điều chỉnh khi quan sát mẫu ở vậtkính 40X và 100X Đối với vật kính dầu, sau khi sử dụng xong phải dùnggiấy hoặc khăn lau dành riêng tẩm cylon hoặc xăng tốt lau thật sạch

Kính hiển vi quang học

2 Thực hành làm môi trường dinh dưỡng

Làm môi trường dinh dưỡng dùng để phân lập, nhân và giữ giống vi sinh vật,đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu những đặc điểm sinh học của chúng

- Hòa tan các chất vào nước

- Làm trong môi trường bằng cách lọc môi trường bằng bông hoặc giấy lọc

- Kiểm tra thể tích, pH nếu có

- Phân phối môi trường vào dụng cụ như ống nghiệm, bình tam giác Đối vớiống nghiệm, trước khi rót phải đun cho hóa chất hòa tan đều rồi mới rót vàoống nghiệm Môi trường được phân phối vào dụng cụ khoản ¼ đến 1/3 thểtích của dụng cụ

- Khử trùng, tùy từng loại môi trường và yêu cầu sử dụng chọn các phươngpháp khử khác nhau, thông thường khử trùng bằng nhiệt ướt ở nhiệt độ

121oC, áp suất 1 atm, thời gian 15 phút

+ Đổ thạch (môi trường dinh dưỡng thạch)

Thao tác đổ hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn Mặt thạchphải phẳn, nhẵn, có độ dày khoản 2mm Môi trường sau khi đổ cho vào tủ ấm 1 – 2ngày kiểm tra xem có nhiễm khuẩn hay không rồi mới sử dụng

 Làm thạch đĩa:

- Việc phân phối môi trường vào đĩa petri phải được thực hiện trong vô trùng

- Đĩa petri phải được vô khuẩn (khử trùng cùng lúc với môi trường)

- Đặt đĩa trong tủ cấy vô trùng, nắp nằm phía trên, đáy phía dưới

- Hé nắp một phần đĩa và rót môi trường vào (tùy theo mục đích của thí nghiệm

mà lượng môi trường được phân phối vào đĩa có thể dày hay mỏng)

- Đậy nắp lại, xoay đĩa theo đường tròn tới, lui vài lần tránh làm môi trườngdính vào thành đĩa

- Hé mở nắp một phần đĩa, bậc đèn UV của tủ và để yên khoảng 15 phút

- Tắc đèn UV, đậy nắp đĩa lật úp mặt đáy lên và cho vào hộp đựng đĩa hoặcbọc kiến để vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 – 48 giờ kiểm tra sự nhiễmkhuẩn Bảo quản lạnh 0 – 5oC, sử dụng không quá 1 tuần

- Môi trường sau khi pha rót vào ống nghiệm không quá ¼ thể tích ống

- Vặn nút ống nghiệm không quá chặt làm hơi không thoát ra

- Khử trùng

- Sau khi khử trùng các ống nghiệm chứa môi trường được đặt nghiên một gócsao cho môi trường trong ống tạo thành một mặt phẳng nghiên, sâu đạt yêucầu

- Để nguội, vặn nắp ống nghiệm chặt lại và luôn giữ ống đứng, bảo quản điềukiện lạnh

BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI KHUẨN (5 tiết)

- Dùng bút long chia bên ngoài đáy đĩa ra 4 phần và đánh số từ 1 – 4

- Đốt nóng que cấy, để nguội lấy một ít mẫu hoặc vi khuẩn từ hỗ dịch

- Hé nắp đĩa petri, cho đầu que cấy có dính mẫu chạm nhẹ vào mặt thạch tại ô

số 1, trượt nhẹ que cấy theo đường zizac liên tục Tránh đè mạnh que cấy làm

bể mặt môi trường

- Đốt nóng que cấy, để nguội, chạm đầu que cấy vào đường cấy ở ô 1 kéo nhẹsang ô số 2, trượt que cấy theo đường zizac liên tục trong ô này, đường cấykhông trùng nhau

- Đối với các ô còn lại cũng làm tương tự Sau mỗi lần cấy, que phải được đốtnóng Lần cấy cuối cùng sau khi đốt nóng phải nhúng que vào cồn 700

A Mục tiêu:

- Nắm được nguyên tắc phân lập

- Thực hiện được các phương pháp cấy để phân lập vi khuẩn tạo dòng thuần

- Biết cách đọc kết quả sau khi phân lập

- Cấy xong, đậy nắp lại, hơ xung quanh miệng đĩa trên ngọn lửa đèn cồn, đặcngược hộp thạch đáy lên trên, nắp ở dưới, cho vào tủ ủ ấm 37oC Hôm sau đọckết quả

* Phương pháp cấy ria liên tục

- Lấy một ít mẫu hay hỗn dịch vi khuẩn, trượt đều đầu que cấy trên ½ mặt thạchtheo đường zizac liên tục

- Không đốt nóng que cấy và không đưa que ra khỏi đĩa, không quay bề mặt đầuque cấy mà xoay đĩa thạch một gốc 90o và tiếp tục tạo đường zizac liên tục như trêntrên vùng thạch còn lại

- Chuẩn bị đĩa cấy ria đối chứng để kiểm tra sự vô khuẩn Các bước thực hiện nhưtrên nhưng que cấy không lấy mẫu hay hỗ dịch vi khuẩn mà cấy không

5 Đọc kết quả

Sau thời gian ủ ấm nhất định, tế bào vi khuẩn phát triển thành một bộ lạc(khúm) vi khuẩn được gọi là khuẩn lạc Mỗi một loại vi khuẩn khi tăng trưởng sẽ tạonên khuẩn lạc khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc, độ trong, đục,… Tiếnhành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về kíchthước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độtrong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không)

-Hình dạng khuẩn lạc

+ Đường kính+ Đường viền + Bề mặt ( lồi hay lõm, khô hay ướt, trơn hay sần sùi…) + Hình dạng tổng thể (tròn đều, không đều, …)

-Màu sắc của khuẩn lạc

-Độ đục trong của khuẩn lạc

Mỗi một sự khác nhau về chi tiết của hình dạng, màu sắc, độ đục trong của khuẩnlạc có thể tượng trưng cho một loại vi khuẩn khác nhau

Sau khi quan sát hộp thạch để tìm sự khác biệt của các loài khuẩn lạc Có thể kếtluận: có bao nhiêu khuẩn lạc khác nhau là có bấy nhiêu loại vi khuẩn hiện diện trênhộp thạch

BÀI 3: NHUỘM GRAM VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI KHUẨN (5 Tiết)

B Nội dung

1 Nguyên tắc

Dựa trên khả năng bắt màu của màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh(Crystal violet) mà chia thành hai nhóm:

+ Nhóm thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm Crystal violet sau khi

cố định bởi dung dịch lugol không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn Vi khuẩn thuộcnhóm này gọi là vi khuẩn Gram dương

+ Nhóm thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm Crystal violet khi

xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm Safranin bổ sung Vi khuẩn nhóm nàyđược gọi là vi khuẩn Gram âm

2 Dụng cụ và hóa chất

- Lam, kính hiển vi quang học, que cấy, đèn cồn

- Hóa chất: Dung dịch tím kết tinh (Crystal violet = tím gentian), Dung dịch lugol,Etanol 95%, dung dịch Safranin

3 Cách tiến hành

* Chuẩn bị vết bôi

- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ môi trường đặc(sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính hoặc 1 vòng cấy vikhuẩn từ huyền phù vi khuẩn, để khô tự nhiên trong không khí

- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần

- Nhỏ dung dịch tím gentian trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhỏ dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhỏ cồn 95o giữ khoảng 30 giây hoặc cho cồn chảy qua vết bôi vi khuẩn liêntục đến khi nước cồn chảy không còn màu, rửa nước, thấm khô

A Mục tiêu:

- Thực hiện được qui trình nhuộm Gram

- Đọc kết quả nhuộm, phân biệt nhóm vi khuẩn Gram âm, Gram

dương, hình dạng tế bào và kiểu sắp xếp

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 1 phút, rửa nước, để khô trongkhông khí

- Soi kính: dùng vật kính dầu 100X để quan sát

4 Đọc kết quả

- Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ

- Hình dạng tế bào vi khuẩn (que, cầu, phẩy, xoắn,…)

- Cách sắp xếp (đơn, đôi, chùm, chuỗi, đám,…)

BÀI 4: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ Ở 37 O C BẰNG PHƯƠNG

PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC TRÊN ĐĨA THẠCH (5 tiết)

Lấy một lượng mẫu xác định trãi đều trên môi trường thạch dinh dưỡng, ủ ở nhiệt độ

37oC trong điều iện hiếu khí, sau 24 giờ đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa

- Các đĩa sau khi đông đặc được ủ ở nhiệt độ 37oC, trong đều kiện hiếu khí

- Đọc kết quả sau 24 giờ

5 Đọc kết quả

- Chọn 2 nồng độ liên tiếp để đếm, số khuẩn lạc ở mỗi nồng độ từ 30-300 khuẩn lạc

A Mục tiêu:

- Nắm được phương pháp đếm sống vi khuẩn trên môi trường đặc

- Đánh giá được mức độ nhiễm vi khuẩn hiếu khí trong thực phẩm

- Cách tính kết quả:

Gọi N là số khuẩn lạc có trong 1g mẫu Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong mẫu đượctính theo công thức sau:

C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri được chọn

d: hệ số pha loãng mẫu

n1, n2 số đĩa petri chọn đếm khuẩn

VD: Ở độ pha loãng 10-2 số khuẩn lạc đếm trên 2 đĩa là 151 và 143 Ở độ pha loãng 10

-3, số khuẩn lạc đếm được là 91 và 67 Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong 1g mẫu là

BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E.COLI (10 tiết)

B Nội dung

1 Khái niệm

Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵkhí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ.Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trongthực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện

của các loại vi sinh vật gây bệnh khác Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: E coli,

Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này đượcthể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) vàCitrate (iC) thường được gọi là IMViC

Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơitrong khoảng 24h khi ủ ở 44oC trong môi trường lỏng EC

Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinhindole khi ủ khoảng 24h ở 44oC trong môi trường lỏng trypton E coli là Coliforms

phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer-, Citrate –

2 Nguyên tắc

Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E coli chứa trong

mẫu nước, thực phẩm với mật độ thấp có thể xác định bằng phương pháp MPN (MostProbable Number) Phương pháp MPN là phương pháp định lượng vi khuẩn dựa trênkết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khácnhau, mỗi độ pha loãng cách nhau 10 lần Thông thường, việc định lượng này đượcthực hiện lặp lại 3 hoặc 5 lần ở 3 độ pha loãng liên tiếp Các ống nghiệm mẫu đều cóđặt ống bẫy khí Durham để theo dõi sự sinh hơi Các ống nghiệm sau khi ủ thấy có đổimàu và sinh hơi được ghi nhận là dương tính Số lượng ống nghiệm dương tính ở từngnồng độ được ghi nhận và tra bảng Mac Crady để suy ra số lượng vi khuẩn hiện diệntrong 1g (1ml) mẫu ban đầu