phân tích hàm lýợng melanine trong sữa

Xác định melanine trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC...7 a.. Gần đây việc tìm thấy Melamine, một chất có hại cho sức khoẻ có trong sữa và các sản phẩm sữa như bánh, kẹo…

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BÀI BÁO CÁO

Đề tài: PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MELANINE TRONG SỮA

MÔN HÓA PHÂN TÍCH DỤNG CỤ

Giáo viên hướng dẫn: Phùng Võ Cẩm Hồng

MỤC LỤC

I Mở đầu 1

II Tổng quan về melanine 1

1 Melanine là gì 1

2 Sự ra đời và phương pháp tổng hợp melanine 3

3 Tại sao melanine lại được cho vào sữa trẻ em 3

4 Ảnh hưởng của melanine đến sức khỏe 4

a Nhiễm độc cấp tính 4

b Nhiễm độc mãn tính 4

c Trẻ em nhiễm melanine tạo sỏi thận do uống sữa có những dấu hiệu sau 4

5 Triệu chứng nhiễm độc melanine 5

6 Liều lượng dung nạp melanine an toàn cho một người 5

7 Nồng độ an toàn cho sữa và thực phẩm 5

III Phương pháp xác định melanine trong sữa 6

1 Các phương pháp xác định melanine trong sữa 6

a Định tính 6

b Đinh lượng 6

2 Xác định melanine trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC 7

a Hóa chất và thuốc thử để nhận biết melanine 7

b Hệ thống sắc kí - derector 7

c Pha dung dịch 7

d Chuẩn bị mẫu 8

e Thiết lập các hệ thống số cho HPLC 8

3 Quá trình tiến hành 9

IV Các biện pháp khắc phục khi sữa bị nhiễm melanine 10

I Mở đầu:

Sữa chứa rất nhiều thành phần khác nhau, bao gồm protein, lipid, đường lactose, các chất khoáng, các men và các hoạt chất sinh học khác

Nếu tính theo khối lượng thì 1 lít sữa bò với thành phần đặc trưng như sau:

- Nước: 900-910g

- Vật chất khô, bao gồm:

 Các chất béo (37-38g) bao gồm

99% là các lipid đơn (glycerit) và từ

0,5 đến 1% là các lipid phức

 Gluxit đặc thù của sữa là đường đôi

lactose (33-48g)

 Vật chất chứa nitơ (33-38g) bao

gồm: 80% cazein, 18% protein

trong nước sữa (lactoserum) và 2%

nitơ phi protein

Hình 1: Sữa tươi

 Sữa chứa nhiều khoáng và vitamin

 Ngoài ra, sữa còn chứa các nguyên tố vi lượng như: nhôm, brom, đồng, sắt, flo, iốt, mangan, molipden, silic, kẽm Nói chung, sữa là nguồn thực phẩm thiết yếu cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho con người

Gần đây việc tìm thấy Melamine, một chất có hại cho sức khoẻ có trong sữa và các sản phẩm sữa như bánh, kẹo… đã gây nhiều lo lắng cho người dân và cả các nhà quản

lý về an toàn vệ sinh thực phẩm, vì đây là loại thực phẩm rất phổ biến được nhiều người sử dụng, nhất là trẻ em Kiểm soát hàm lượng Melamine trong sữa và các sản phẩm từ sữa hiện nay là việc cần thiết để bảo vệ sức khoẻ người dân

II Tổng quan về Melanine:

1 Melanine là gì?

Melamine là một chất hữu cơ, màu trắng pha lê, và khó hòa tan trong nước Tên khoa học của melamine là 1,3,5-triazine-2,4,6-triamine, có khi còn gọi là cyanuramide hay cyanurotriamine, với cấu trúc hóa học gồm 3 nguyên tử carbone, 6 nguyên tử hydrogen và 6 nguyên tử nitrogen Trọng lượng phân tử của melamine chỉ 126; trong

đó, 66% là nitrogen

Hình 2: Cấu trúc phân tử của melanine

Công thức tổng quát: C3H6N6

Ứng dụng của melanine trong công nghiệp và trong nông nghiệp:

o Trong nông nghiệp, melanine được dùng để chế tạo phân bón, thươc trừ sâu cyromazine; melanine cũng có mặt trong thuốc có gốc asrenic được dùng trong điều trị xoắn trùng châu Phi (trypanosomiasis)

- Melanine được dùng như một nguồn nitơ phi protein cho bò từ năm

1958, tuy nhiên đến 1078 thì không được dùng nữa vì sự thủy phân của

nó khá chậm và không hoàn toàn

o Trong công nghiệp, melanine được dùng để

sản xuất:

- Nhựa melanine (kết hợp với formaldehyde),

rất bền với nhiệt

- Bọt melanine, một chất trùng hợp dùng để tẩy rửa, làm sạch

- Chất chống cháy

- Là thành phần chính của sắt chất vàng 150, một chất màu trong mực in và trong chất dẻo

- Sử dụng trong sản xuát bêtông nhằm làm giảm hàm lượng nước, tăng khả năng chịu lực

2 Sự ra đời và phương pháp tổng hợp melanine:

Melamin được Liebig tổng hợp lần đầu tiên vào

năm 1834 Đầu tiên canxi cyanamid được chuyển

thành dicyandiamid sau đó đun nóng đến trên nhiệt

độ nóng chảy để tạo thành melamin Tuy nhiên, hiện

nay các quy trình sản xuất melamin trong công

nghiệp đều dùng urê theo phương trình phản ứng

sau: 6(NH2)2CO → C3H6N6 + 6 NH3 + 3 CO2

- Đầu tiên urê phân hủy tạo thành axit cyanic và ammoni, đây là phản ứng thu nhiệt: 6 (NH2)2CO → 6 HCNO + 6 NH3

- Sau đó axit cyanic polyme hóa tạo thành melamin và khí carbon dioxit: 6HCNO → C3H6N6 + 3 CO2

Phản ứng sau là tỏa nhiệt, nhưng xét toàn bộ quá trình là phản ứng thu nhiệt

Hình 3: Nhựa melanine

Hình 4: Liebig

3 Tại sao melanine lại được cho vào sữa trẻ em?

Việc thêm Melamin vào sữa tại Trung

Quốc trong thời gian gần đây với mục đích

tăng “đạm” đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng

đến sức khỏe người tiêu dùng Theo thông tấn

xã Pháp (AFP) tại Beijing, cho đến nay gần

13.000 trẻ em đã nhập viện tại Trung Quốc sau

khi uống sữa có chứa Melamine, trong đó 104

trẻ bệnh rất nặng và có ít nhất 4 trẻ bị tử vong

Melamine đã được phát hiện trong sữa hộp trẻ

em, sau đó phát hiện trong cả sữa lỏng đóng

hộp, yoghurt và kem tại Trung Quốc Hàm

lượng nhiễm Melamine trong khoảng từ 0.09

mg/kg đến 2.560 mg/kg

Gần đây, việc nhập khẩu một lượng sữa và nguyên liệu sữa từ Trung Quốc và các nước khác vào tiêu thụ tại thị trường Việt Nam gây nhiều bất an cho người dân và cả cho các

cơ quan chức năng về an toàn vệ sinh thực phẩm Melamine có tìm thấy trong các loại sữa và sản phẩm sữa đang tiêu thụ tại nước ta không? Đây là vấn đề thật sự cần được quan tâm Vì thế việc kiểm tra, giám sát Melamine nhiễm trong sữa và sản phẩm sữa là điều cần thiết phải thực hiện nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng

Hình 5: Sữa bị nhiễm milanine

4 Ảnh hưởng của melanine đến sức khỏe:

a) Nhiễm độc cấp tính:

- Số liệu từ thí nghệm trên chuột cho thấy liều gây chết 50% chuột thí nghiệm (LD50) là 3.000mg/kg khối lượng cơ thể nếu melamine được đưa vào theo đường miệng LD50 của thỏ khi làm thí nghiệm kích thích trên da lớn hơn 1000mg/kg Melamine cũng gây kích thích cho da và mắt Một nhóm nhà khoa học Liên Xô cũ cho rằng muối tạo thành từ melamine và axit cyanuric (muối sử dụng trong chống cháy) có độc tính mạnh hơn cả hai chất riêng rẽ này Nếu đưa muối melamine trực tiếp vào dạ dày của chuột, LD50 là 4,1g/kg còn khi cho chuột hít, LD50 là 3,5g/kg Các số liệu tương ứng đối với chuột nhắt là 7,7 g/kg và 3,4 g/kg

- Mèo ăn thức ăn chứa melamine có các biểu hiện của hư thận

b) Nhiễm độc mãn tính:

- Nếu ăn thực phẩm chứa melamine có thể dẫn đến các tổn thương đường tiêu hóa, sỏi bàng quang, sỏi thận và có thể ung thư bàng quang Melamine cũng được tìm thấy trong mô thận của mèo và chó ít được cho ăn thức ăn chứa melamine Sự lắng đọng các tinh thể muối melamine có khả năng gây bệnh tích tại thận của lợn và cá tương tự như axit uric gây sỏi thận ở người

- Thí nghiệm trên chó ăn thức ăn chứa 3% melamine trong một năm dẫn đến giảm tỷ lệ các thành phần quyết định tăng trưởng, tăng bài tiết nước tiểu, hình thành tinh thể melamine trong nước tiểu, đi tiểu ra máu

- Tinh thể melamine rất khó tan, di chuyển rất chậm trong đường tiết niệu (từ thận xuống niệu đạo) nên có khả năng gây các triệu chứng độc cấp tính c) Trẻ em nhiễm melamine tạo sỏi thận do uống sữa có những dấu hiệu sau:

- Dấu hiệu sớm là bé thường khóc nhiều, đặc biệt là khóc khi đi tiểu và kèm theo là bị buồn nôn

- Những dấu hiệu tiếp theo là trẻ đi tiểu ra máu Tình trạng ra máu ít hay nhiều phụ thuộc vào viên sỏi gây tổn thương như thế nào ở đường tiết niệu

- Em bé cũng có thể có biểu hiện niệu (tức là đi tiểu ít hơn bình thường) hoặc

là vô niệu (tức là không đi tiểu)

- Kèm theo đó là triệu chứng đau đớn ở vùng thận nếu chẳng may người lớn chạm vào, sờ vào vùng thận của bé

- Ngoài ra, có nhiều bé bị tăng huyết áp do bị sỏi thận, sạn thận Thậm chí, có những trường hợp đi tiểu ra cả viên sạn

- Lưu ý: khi thấy trẻ có những biểu hiện trên thì đưa trẻ ngay đến bệnh viện để được chuẩn đoán và điều trị kịp thời

Hình 6: Một cặp song sinh bị sỏi thận do uống sữa Tam Lộc tại tỉnh Cam Túc,

Trung Quốc.

5 Triệu chứng nhiễm độc melamine

- Bị kích thích ở da, mắt, hô hấp, tiểu ra máu, tiểu ít, tiểu khó hoặc không tiểu được, có dấu hiệu nhiễm trùng tiểu (sốt, đau lưng, tiểu gắt) huyết áp tăng là các dấu hiệu cần cảnh giác sau khi sử dụng sản phẩm

6 Liều lượng dung nạp melamine an toàn cho một người

- Các chuyên gia về an toàn thực phẩm trên thế giới nhất trí rằng nồng độ melamine dung nạp hằng ngày có thể chấp nhận được (TDI) là 0,5 mg/kg cân nặng Ở Mỹ, Cục Quản lý thực phẩm và dược phẩm (FDA) đề nghị TDI 0,63 mg/kg cân nặng Xin nói thêm rằng ngưỡng an toàn 0,5 mg/kg cân nặng được xem là “bảo thủ”, tức rất nghiêm ngặt Vì vậy, cứ mỗi kg cân nặng, một người có thể hấp thu 0,5 mg melamine mỗi ngày Chẳng hạn một em bé cân nặng 20 kg thì liều lượng melamine an toàn là 10 mg/ngày; hay một người lớn nặng 60 kg có thể dùng 30 mg/ngày mà không gây tác hại đến sức khỏe

7 Nồng độ an toàn cho sữa và thực phẩm

- Theo tiêu chuẩn mới về an toàn thực phẩm, hàm lượng an toàn melamine tối

đa là 0,15 mg/kg với sữa nước dành cho trẻ em, 1mg/kg với sữa bột dành cho trẻ em và 2,5 mg/kg với thức ăn cho động vật và các thực phẩm khác

- Đó là tiêu chuẩn mới do Ủy ban luật quốc tế về chất lượng và an toàn thực phẩm của LHQ (CAC) công bố ngày 5/7/2012

Hình 7: Nhân viên kiểm định sữa

III Phương pháp xác định Melamine trong sữa.

1) Các phương pháp xác định Melamine trong

sữa

a Định tính

Ban đầu họ cho một ít acid hydrochloric

vào trong sữa để đạm sữa kết tủa nhằm

phòng ngừa nó sẽ gây ảnh hưởng đến quá

trình giám định melamine Sau đó, thêm

những hạt nano vàng vào dung dịch sữa

Khi khoảng cách giữa các hạt nano vàng

này trong dung dịch sữa tương đối xa,

dung dịch sẽ có màu vàng và chuyển thành

màu xanh da trời khi các hạt nano vàng

đến gần nhau

Do melamine có thể thay đổi khoảng cách của các hạt nano, tức là sẽ khiến màu sắc của dung dịch sữa thay đổi từ vàng sang xanh và ngược lại Bởi vậy ta chỉ cần nhìn xem sữa có đổi màu hay không để phán đoán xem nó có chứa chất độc hại này không Bước cuối, cùng có thể thêm acid cyanuric vào dung dịch sữa để phản ứng hóa học xảy ra và tạo nên chất kết tủa mà mắt thường có thể thấy của melamine Với phương pháp này, chỉ mất 15 phút là hoàn toàn có thể kiểm định melamine trong sữa

b Định lượng

- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

- Phương pháp xác định melamine trong sữa bằng hệ LC-MSD lon trap

- Phương pháp Kjedahl

- Phương pháp DUMAS

- Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ

- Trong các phương pháp trên thì phương pháp sắc ký

2) Xác định Melamine trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC

a Hóa chất và thuốc thử để nhận biết Melamine

+ Chất chuẩn: Melamine (99,0% )

+ Dung môi: Methanol

Hình 8: Công thức của melanine kết hợp với acid nucleotic

Nước sử dụng cho việc chuẩn bị pha động và pha loãng được lọc bằng hệ thống Q-pod Millipore

b Hệ thống sắc kí- derector

Đầu dò UV, cột C18 ( 150mm x 3.2mm ID, kích thước 5 µm)

Hình 9: Máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

c Pha dung dịch

+ Dung môi: dung môi 50% methanol (về thể tích) được chuẩn bị bằng cách pha thể tích bằng nhau của methanol và nước

+ Dung dịch chuẩn Melamine: cân chính xác 100mg melamine vào bình định mức 100mL, hòa tan với methanol 50% bằng cách rung trong bể rung siêu âm 30 phút Lên thể tích 100mL thu được dung dịch có nông độ melamine 1000µgmL-1

Pha loãng 5mL melamine trên (1000 µgmL-1)bằng 50 ml 50% methanol để được nồng độ melamine 100 µgmL-1

Pha loãng tiếp 5mL melamine 100 µgmL-1 bằng 50 ml methanol 50% để được nồng

độ melamine 10 µgmL-1

d Chuẩn bị mẫu

Cho 10 ml (mẫu dạng lỏng) hoặc 1,0 g (mẫu khô) vào bình định mức 100 ml Mẫu được pha với 10 ml dung dịch melamine của 1000 µgmL-1, được pha loãng với 50

ml dung dịch methanol 50% và rung siêu âm 30 phút Sau khi làm lạnh về nhiệt độ phòng, lên thể tích 100 ml bằng dung dịch methanol 50% và thu được dung dịch hỗn hợp với nồng độ melamine là 100 µgmL-1

Cho dung dịch mẫu thu được vào ống li tâm và ly tâm ( ≥ 3200 rpm) rồi lấy phần dung dịch phía trên ống (5 ml) chuyển sang bình định mức 50ml, và lên thể tích 50

7ml) Như vậy, 3ml ban đầu của dịch lọc bị loại bỏ phần lọc còn lại được bổ sung vào một lọ HPLC để phân tích

e Thiết lập các thông số cho HPLC

Nồng độ có thể pháp hiện: theo các báo cáo phương háp này pháp hiện Melamine với nồng độ khoảng vài chục ppb (parts per billion -1 phần tỉ)

Các tham số khi dùng HPLC (Theo tiêu chuẩn của FDA):

+ Cột hấp phụ: VenusilASBC8 kích thước: 4,6 x250mm

+ Pha động: buffer: acetonitrile (ACN )= 85:15; 10mM citric acid; `10mM sodium octane, pH=3

+ Tốc độ chảy: 1.0 ml/min

+ Bước sóng tia UV: 240nm

+ Nhiệt độ: 40oC

+ Detector: DAD

Hình 10: Sơ đồ hệ thống HPLC

1: Bình chứa pha động

2: Bộ phận khử khí

3: Bơm cao áp

4: Bộ phận tiêm mẫu

5: Cộ sắc ký (pha tĩnh)

6: Đầu dò

7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển

hệ thống

3 Quá trình tiến hành

Nguyên tắc hoạt động: pha động sau khi bài khí được bơm đưa vào hệ thống sắc kí,

hệ thống sẽ tự động bơm mẫu vào cột Pha động khi đi ngang qua sẽ cuốn theo mẫu cần phân tích đi theo Khi vào trong cột sắc kí, chất nào có ái lực mạnh với pha động sẽ theo pha động đi ra trước, chất nào có ái lực yếu hơn sẽ đi ra sau Đầu

dò Detector phát hiện các cấu tử đi ra khỏi cột chuyển tín hiệu cho máy ghi kết quả

Hình 11: Sơ đồ lí thuyết quá trình tiến hành

Trong quá trình này ta cần lưu ý một số điểm sau:

+Đưa mẫu vào: Bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào khá cao

+ Thời gian lưu mẫu: là khoảng thời gian đưa mẫu vào đến khi đỉnh (peak) hiển thị

rõ nét Bị chi phối bởi các yếu tố:

- Áp suất đầu vào

-Tính chất của pha tĩnh

-Thành phần dung môi

-Nhiệt độ cột

- Máy dò (decteector):các hợp chất thường hấp thụ tia UV, mỗi chất hấp thụ mạnh

Từ đó có thể tính được nồng độ các chất Nên nhơ dung môi cũng hấp thụ tia UV nên lựa chọn các bước sóng thích hợp

Dịch kết quả từ máy dò: Kết quả thường gồm một dãy peak, mỗi peak đại diện cho một hợp chất trong hỗn hợp đi qua cột hấp phụ và hấp thụ tia UV Ta có thể điều khiển điều kiện của cột hấp phụ và thời gian lưu để xác định sự có mặt của các hợp chất

IV CÁC BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC KHI SỮA BỊ NHIỄM MELAMINE

Tại Việt Nam hiện nay, việc xử lý sữa nhiễm

melamine thực hiện bằng phương pháp đốt

Ngoài ra sữa nhiễm melamine có thể xử lý được

thành phân bón hữu cơ bằng giải pháp công nghệ

sinh học Quy trình thực hiện tương tự như sản

xuất phân vi sinh, tuy nhiên điểm khác biệt duy

nhất (khác với vi sinh thông thường) là phải bôt

sung them một số chủng vi sinh chọn lọc-chủng

vi sinh có enzim (do CTY Mai Việt sản xuất) có

khả năng phân hủy sữa hoàn toàn trong vòng 30

ngày

MỘT SỐ GIẢI PHÁP HẠN CHẾ SỰ NHIỄM MELAMINE VÀO CƠ THỂ

Bạn hãy chọn những nhãn sữa có nhãn mác ghi đầy đủ các thông tin như tên sản phẩm, tác dụng, hạn sử dụng, nhà sản xuất hày nhà nhập khẩu có địa chỉ rõ ràng, thành phần của sữa, có số chứng nhận công bố chất lượng của cục Vệ sinh An toàn thực thẩm và

đã được bộ Y Tế công bố là sữa không có nhiễm chất melamine

Thường xuyên theo dõi báo đài để có kiến thức tiêu dùng và sang suốt khi chọn lựa một sản phẩm nào đó

Các nhà sản xuất phải công bố rõ ràng thành phần các chất dinh dưỡng vitamin và các chất khác trên bao bì và nhãn mác

Hình 12: Sữa bị thiêu hủy