Nghiên cứu thu nhận sản phẩm thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng các chế phẩm protease thương mại

Tôi là Đồng Thị Liên, tôi xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề tài “Nghiên cứu thu nhận sản phẩm thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng các chế phẩm protease thương mại” là cô

Tôi là Đồng Thị Liên, tôi xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề tài

“Nghiên cứu thu nhận sản phẩm thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng các chế phẩm protease thương mại” là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện dưới sự

hướng dẫn của PGS.TS Phạm Thu Thủy Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn

là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời trân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập

Đặc biệt, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS.Phạm Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, định hướng và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình Nghiên

cứu và hoàn thành Luận văn

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ các thầy cô quản lý phòng thí nghiệm 101-C10 Công nghệ sinh học - trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới các bạn đồng môn lớp 14A.CNSH những người thân trong gia đình và toàn thể bạn bè đã luôn là điểm tựa tinh thần vững chắc, chăm lo, động viên tôi, giúp tôi hoàn thành tốt Luận văn

Hà Nội, ngày … tháng 03 năm 2016

Đồng Thị Liên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tôm và phế liệu tôm 2

1.1.1 Nguồn và phân loại tôm 2

1.1.2 Cấu tạo và thành phần hóa học của tôm 2

1.1.3 Tình hình sử dụng tôm ở Việt Nam [3] 3

1.1.4 Cấu tạo và thành phần hóa học của phế liệu tôm 5

1.1.4.1 Cấu tạo vỏ tôm [3] 5

1.1.4.2 Thành phần hóa học của phế liệu tôm 6

1.2 Tổng quan về tình hình nghiên cứu và sử dụng phế liệu tôm 8

1.2.1 Các phương pháp thu hồi protein trong phế liệu tôm 8

1.2.1.1 Phương pháp lên men lactic 9

1.2.1.2 Phương pháp thủy phân bằng Protease 10

1.3 Tổng quan về enzyme protease [5] 13

1.3.1 Giới thiệu chung 13

1.3.2 Phân loại Protease 14

1.3.3 Các yêu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme [6, 7] 15

1.3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 15

1.3.4 Một số chế phẩm thương mại protease dùng trong nghiên cứu 18

1.3.4.1 Alcalase 18

1.3.4.2 Protamex 19

1.3.4.3 Flavourzyme 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu 20

2.1.1 Phế liệu tôm 20

2.1.2 Chế phẩm enzyme Alcalase, Protamex, Flavozym 21

2.2 Hóa chất 21

2.3 Thiết bị 21

2.4 Phương pháp phân tích các chỉ số 22

2.4.1 Phương pháp xác định hàm ẩm 22

2.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro 22

2.4.3 Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp kjeldahl 23

2.4.4 Phương pháp định lượng protein trong mẫu bằng phương pháp Biuret 25

2.4.5 Phương pháp định lượng axit amin trong dịch sau thủy phân bằng Ninhydrin 26

2.4.6 Phương pháp xác định hoạt độ của các chế phẩm protease 27

2.5 Phương pháp nghiên cứu 30

2.5.1 Nghiên cứu thủy phân PLT bằng các chế phẩm protease thương mại 30

2.5.2 Xác định hiệu suất thu hồi 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Phân tích thành phần ban đầu của phế liệu tôm 33

3.2 Khảo sát khả năng thu hồi protein trong phế liệu tôm của các chế phẩm protease thương mại 33

3.2.1 Xác định hoạt độ của các chế phẩm enzym thương mại 33

3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn PLT và nước tới sự thủy phân

protein 36

3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng chế phẩm enzym tới sự thủy phân protein 37

3.3 Nghiên cứu sử dụng phối hợp chế phẩm Alcalase và Flavourzyme 37

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi protein 38

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi protein 38

3.3.3 Khảo sát phối hợp chế phẩm Alcalase và Flavourzyme 39

3.4 Khảo sát khả năng thu hồi protein từ PLT khô bằng các chế phẩm protease 40

KẾT LUẬN 42

KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 49

KÝ HIỆU TÊN ĐẦY ĐỦ

Bảng 1.1: Thành phần trọng lượng của tôm (%) 4

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của phế liệu tôm 6

Bảng 1.3: Tỷ lệ đầu và vỏ thân của phụ phẩm một số loài tôm [16] 7

Bảng 2 1: Bảng pha dung dịch đệm 28

Bảng 2.2: Dựng đường chuẩn tyrosin 29

Bảng 3 1:Thành phần phế liệu tôm 33

Bảng 3 2: Xác định hoạt độ của các chế phẩm enzym thương mại 34

Bảng 3 3: Khảo sát khả năng thu hồi protein trong PLT 34

Bảng 3.4: Khảo sát phối hợp chế phẩm Alcalase và Flavourzyme 40

Bảng 3 5: Khảo sát khả năng thu hồi protein trong PLT khô 41

Bảng PL 1: Kết quả dựng đường chuẩn tyrosine 49

Bảng PL 2: Kết quả dựng đường chuẩn BSA 49

Bảng PL 3: Kết quả dựng đường chuẩn axit amin 50

Bảng PL 4: Khảo sát quá trình thủy phân protein 51

Bảng PL 5: Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn PLT và nước tới sự thủy phân protein 51

Bảng PL 6: Ảnh hưởng của liều lượng chế phẩm enzym tới sự thủy phân protein 52

Bảng PL 7: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi protein 52

Bảng PL 8: Ảnh hưởng của nhiệt đến hiệu suất thu hồi protein 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Xử lý làm sạch đầu vỏ tôm trong hồ chứa axit, sau đó được phơi khô 8

Hình 1.2: Sơ đồ thu hồi protein bằng lên men lactic 10

Hình 1 3: Sơ đồ thu nhận dịch thủy phân protein và chitin bằng phương pháp enzyme 11

Hình 1 4: Sơ đồ quy trình thu hồi protein, chitin và astaxanthin 12

Hình 1.5: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein 13

Hình 1.6: Sơ đồ phân loại protease 14

Hình 1.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng enzyme 16

Hình 1.8 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme 17

Hình 1.9: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất 18

Hình 2 1: Ảnh PLT dùng làm mẫu thí nghiệm 20

Hình 2 2: Ảnh PLT dùng làm mẫu thí nghiệm được nghiền nhỏ 20

Hình 2 3: Sơ đồ qui trình thu hồi protein sử dụng enzyme 31

Hình 3 1: Khảo sát quá trình thủy phân protein 35

Hình 3 2: Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn PLT và nước tới sự thủy phân protein 36

Hình 3.3: Ảnh hưởng của liều lượng chế phẩm enzym tới sự thủy phân protein 37

Hình 3 4: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi protein 38

Hình 3 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu hồi protein 39

Hình PL 1: Biểu đồ đường chuẩn tyrosin 49

Hình PL 2: Biểu đồ đường chuẩn BSA 50

Hình PL 3 : Biểu đồ đường chuẩn axit amin 50

MỞ ĐẦU

Những năm gần đây nghề nuôi tôm phát triển mạnh và trở thành ngành kinh tế quan trọng mang lại thu nhập cho người dân và nguồn thu ngoại tệ cho đất nước Theo Hội nghị tổng kết xuất khẩu thủy sản năm 2015, xuất khẩu thủy sản của cả nước năm

2015 ước đạt 6,7 tỷ USD, trong đó xuất khẩu tôm tiếp tục giữ vị trí số một, ước đạt 3 tỷ USD, chiếm 44% tỷ trọng giá trị xuất khẩu Tính đến ngày 31/10/2015 diện tích nuôi tôm nước lợ cả nước khoảng 654.600 ha với sản lượng ước đạt 407.000 tấn, trong đó tôm sú chiếm 577.300 ha với sản lượng 189.000 tấn, tôm thẻ chân trắng chiếm 76.300

ha với sản lượng 218.000 tấn Ngành công nghiệp tôm đang tiến lên theo hướng bền vững và đáp ứng các chỉ tiêu kế hoạch là 630.000 ha và 700.000 tấn vào năm 2020

Công nghệ chế biến tôm tạo ra lượng lớn phế thải rắn bao gồm đầu tôm, vỏ tôm

và chiếm khoảng 50 – 70% [9] nguyên liệu ban đầu Phế liệu tôm (PLT) chứa từ 25 – 50% protein, lượng protein này bị thải ra môi trường trong quá trình xử lý phế liệu tôm thu chitin-chitosan gây lãng phí nguồn protein và làm ô nhiễm môi trường Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm tận dụng nguồn protein từ phế liệu tôm để sản xuất thức

ăn chăn nuôi, sản xuất nước mắm … trong đó nghiên cứu thủy phân phế liệu tôm bằng enzym đang được các nhà khoa học quan tâm bởi phương pháp thu được lượng protein cao và sản phẩm thủy phân chứa nhiều peptit và axit amin dễ tiêu hóa Tuy nhiên, có nhiều loại chế phẩm protesa khác nhau cho hiệu suất thu hồi protein khác nhau nên

chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận sản phẩm thủy phân protein từ phế liệu tôm bằng các chế phẩm protease thương mại” để khảo sát, lựa

chọn phương án tối ưu thu hồi protein từ phế liệu tôm

Đề tài bao gồm các nội dung chính sau:

 Khảo sát khả năng thu hồi protein trong phế liệu tôm của các chế phẩm protease thương mại;

 Nghiên cứu sử dụng phối hợp chế phẩm Alcalase và Flavourzyme;

 Ảnh hưởng trạng thái PLT đến quá trình thu hồi protein;

 Khảo sát khả năng thu hồi protein từ PLT khô bằng các chế phẩm protease

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tôm và phế liệu tôm

1.1.1 Nguồn và phân loại tôm

Tôm là sinh vật đáy thuộc hệ thống phân loại:

Ngành: Arthropoda;

Ngành phụ: Brabachista;

Lớp: Crustacea;

Bộ: Decapoda Việt Nam là một quốc gia ven biển ở Đông Nam Á có nguồn lợi thủy hải sản vô cùng phong phú, cùng với điều kiện tự nhiên thuận lợi cho việc đẩy mạnh khai thác và nuôi trồng thủy hải sản Do vậy, tôm là đối tượng rất quan trọng của ngành thủy sản nước ta hiện nay, chiếm tỷ lệ 70÷80% tổng kim ngạch xuất khẩu của ngành [1 8] Ngành chế biến tôm, đặc biệt là tôm đông lạnh đang được phát triển để đáp ứng cho nhu cầu ngày càng cao của thị trường trong nước và quốc tế, các mặt hàng chủ yếu hầu hết các loài có giá trị như: tôm Sú, tôm Bạc, tôm Thẻ, tôm Chì … Theo Tổng cục Thủy sản, tính đến ngày 31 tháng 10 năm 2014, tôm nước lợ được nuôi trong khoảng 676.000 ha, tăng 3,6% so với cùng kỳ năm ngoái Theo số liệu của Tổng cục Thống kê, sản lượng thủy sản 9 tháng đầu năm 2014 tôm đạt 0,57 triệu tấn Số liệu này cho thấy nhu cầu về tôm rất cao và ngành nuôi tôm đang rất phát triển [36]

Đến năm 2013, cả nước có khoảng 200 doanh nghiệp tham gia chế biến, xuất khẩu tôm, tập trung chủ yếu ở Miền Trung, Nam Trung Bộ (Khánh Hòa, Phú Yên, Ninh Thuận, Bà Rịa – Vũng Tàu…), Đồng Bằng Sông Cửu Long (Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà Mau, Kiên Giang), với tổng công suất chế biến đạt gần 1 triệu tấn sản phẩm/năm Các loại tôm khác nhau có đặc điểm sinh lý, sinh thái khác nhau nên mùa vụ thu hoạch tôm cũng khác nhau trong năm [4, 8]

1.1.2 Cấu tạo và thành phần hóa học của tôm

Tôm gồm hai phần là phần đầu và phần thân.Hầu hết các cơ quan nằm ở phần đầu ngực, phần thân chỉ có ruột và động mạch chủ, thịt tôm nằm gần như hoàn toàn ở thân.Phần đầu thường chiếm khoảng 35÷45% trọng lượng [8], phần vỏ chiếm 10÷15% trọng lượng [8, 25] Tỷ lệ giữa các phần đầu, thân, vỏ thay đổi phụ thuộc vào giống loài.Thịt tôm có giá trị dinh dưỡng cao, cơ thịt rắn chắc, có mùi vị thơm ngon đặc trưng [5-7, 9, 21]

Tôm là một trong những loại thực phẩm có chứa đầy đủ các loại axit amin không thay thế, vì vậy tôm có giá trị cao về mặt dinh dưỡng Thành phần hóa học của tôm dao động tùy thuộc vào giống loài và điều kiện sinh sống, mùa vụ, nguồn thức ăn, thời tiết khí hậu [31] Trong thành phần tôm có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng cần thiết cho dinh dưỡng cơ thể con người như giàu vitamin, protein, khoáng dễ tiêu hóa

Vỏ tôm thường được tạo thành từ nhiều lớp protein, khoáng, lipit bao phủ khung chitin Vì thế, vỏ tôm chính là nguồn thu nhận protein, chitin và AX [27] Toàn bộ lớp

vỏ này không sinh trưởng vì vậy tôm phải lột xác theo từng thời kỳ sinh trưởng của bản thân [3] Dưới lớp vỏ là lớp biểu bì có vai trò quan trọng trong việc lột xác bỏ lớp vỏ

cũ và hình thành lớp vỏ mới của tôm.Kề trong lớp biểu bì là lớp trung bì có chứa sắc tố chủ yếu là Astaxanthin Chính nhờ sự biến đổi của sắc tố này mà ta có thể phân biệt được chất lượng tôm

1.1.3 Tình hình sử dụng tôm ở Việt Nam [ 3 ]

Hiện nay ở nước ta, kỹ thuật khai thác và nuôi tôm rất phát triển và ngày càng cung cấp nhiều nguyên liệu cho các nhà máy chế biến thủy sản và xuất khẩu nhiều mặt hàng như:

 Tôm tươi còn vỏ, đầu (nguyên con) cấp đông IQF hoặc Block

 Tôm vỏ bỏ đầu cấp đông IQF hoặc Block

 Tôm bóc vỏ, bỏ chỉ lưng cấp đông IQF

 Tôm bóc vỏ còn đốt đuôi cấp đông IQF

 Tôm dạng sản phẩm định hình, làm chín

 Tôm bóc vỏ, đóng hộp

Bên cạnh nguồn lợi kinh tế lớn từ sản phẩm tôm mang lại cho đất nước, một lượng lớn phế liệu chủ yếu là vỏ và đầu tôm từ công nghiệp chế biến tôm đông lạnh cũng tăng [8] Trong công nghiệp chế biến tôm xuất khẩu của Việt Nam lượng lớn phế thải rắn (phế liệu tôm bao gồm đầu tôm và vỏ tôm) thường chiếm 50-70% nguyên liệu ban đầu tùy theo giống loài [1, 8] Ví dụ tôm càng xanh phế liệu vỏ đầu có thể lên đến 60% khối lượng tôm, với tôm sú chiếm khoảng 40%, tôm thẻ thì khoảng 37%, Đối với sản phẩm tôm bóc nõn và rút ruột thì mất mát theo vỏ tôm và đuôi khoảng 25% [8] Nhìn chung, trong phế liệu tôm thì trọng lượng phần đầu thường gấp 3-4 lần so với phần vỏ và đuôi Theo giáo trình “Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản” của PGS.TS Trần Thị Luyến (chủ biên), trường Đại học Nha Trang ta

có các bảng sau:

Bảng 1.1: Thành phần trọng lượng của tôm (%)

Càng 40.22 31.61 51.95 8.56

1.1.4 Cấu tạo và thành phần hóa học của phế liệu tôm

1.1.4.1 Cấu tạo vỏ tôm[ 3 ]

Vỏ tôm chia làm bốn lớp chính: lớp biểu bì (epicucle); lớp màu; lớp canxi hóa; lớp không bị canxi hóa Trong đó, lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hóa có cấu trúc cứng

do sự lắng đọng của canxi.Các lớp đều chứa nhiều chitin, trừ lớp biểu bì

Lớp màu: tính chất của lớp này là do sự có mặt của những thể hình hạt của vật chất mang màu giống dạng melanin Chúng gồm những túi khử hoặc những không bào Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng khó phân nhánh, là con đường cho canxi thẩm thấu vào

Lớp biểu bì (epculicle): những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ bởi fucxin, có điểm pH = 5,1 không chứa chitin Nó khác với lớp vỏ còn lại, bắt màu với anilin xanh.Lớp epicuticle có lipit vì thế nó cản trở tác động của axit ở nhiệt độ thường trong công đoạn khử khoáng bằng axit hơn là các lớp bên trong.Màu của lớp này thường vàng rất nhạt có chứa polyphenoloxidase và bị hóa cứng bởi puinone-tanin Lớp epicuticle liên kết với một số màng mỏng bên ngoài cản trở hòa tan ngay cả trong môi trường axit đậm đặc do nó có chứa các mắt xích paratin mạch thẳng

Lớp canxi hóa: lớp này chiếm phần lớn vỏ, thường có màu xanh trải đều khắp, chitin ở trạng thái tạo phức với canxi

Lớp không bị canxi hóa: vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo thành bởi một phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin-protein bền vững không có canxi và quinine

1.1.4.2 Thành phần hóa học của phế liệu tôm

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của phế liệu tôm

Chitin (%,trọng lượng chất khô, đã loại protein) 40.40 0.48

(Nguồn: Sách Seafoods: Chemistry, Processing Technology and Quality – by Fereidoon Shahidi (Author), J.R Botta (Author) tr.322)

Protein: Trong phế liệu tôm thường tồn tại ở dạng tự do và dạng liên kết [13]

 Dạng tự do: dạng này là tồn tại ở phần thịt tôm từ một số tôm bị biến đổi và vứt

đi lẫn vào phế liệu hoặc phần đầu và thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của tôm Nếu công nhân vặt đầu không đúng kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu này khó xử lý hơn

 Dạng liên kết: ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chitin, canxicacbonat, với lipit tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo protein carotenoit … như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm [34] Phức hợp carotenoid (cụ thể là AX) với protein còn được gọi là carotenoprotein vừa có giá trị dinh dưỡng lớn vừa có những đặc tính sinh học tuyệt vời của AX [14, 32, 34]

Chitin: tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các protein dưới dạng phức hợp chitin-protein, liên kết với các hợp chất khoáng và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng

Canxi: trong vỏ, đầu tôm, … có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là muối CaCO3 hàm lượng Ca(PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá trình khử

khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây khó khăn cho quá trình khử khoáng

Sắc tố hay còn gọi là chất màu: Chất màu trong thủy sản được chia làm bốn nhóm chất màu chính:

 Carotenoids: đây là chất màu chính tạo màu sắc nâu lục cho thủy sản sống và màu vàng tới đỏ cho thủy sản được đun nóng Trong tôm, cua thì loại màu carotenoids

ở dạng carotenoprotein và crustacyanin (hydroxy – beta – caroten)

 Pteridines: có vai trò nhỏ so với carotenoids

 Melanin: tạo màu đen của thủy sản

 Purines: tạo màu bạc của vảy cá

Trong vỏ tôm thường chứa hợp chất màu carotenoids và thành phần chủ yếu là Astaxanthin tạo thành màu đỏ cho tôm khi gia nhiệt

Bảng 1.3: Tỷ lệ đầu và vỏ thân của phụ phẩm một số loài tôm [ 16 ]

Tôm chì (Metapenaeus affinis) 63,32 30,71

Tôm sắt (Parapenaeopsis

Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần khác như nước, lipit, phospho, enzyme (theo tạp chí thủy sản [8] hoạt độ enzym protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/gam tươi Các enzym chủ yếu là enzym của nội tạng trong đầu tôm và của vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu

Như vậy, phế phụ phẩm từ chế biến tôm thải ra một lượng rất lớn, nếu như không được tận dụng và khai thác triệt để sẽ rất lãng phí, hơn nữa việc thải loại bừa bãi

sẽ ảnh hưởng tới môi trường sống xung quanh, dưới đây là một số hình ảnh xử lý phế thải tôm gây nguy hại tới môi trường Hiện nay tại các cơ sở chế biến tôm chỉ xử lý hết sức đơn sơ Ví dụ: Nhà máy Chế biến đầu vỏ tôm Hưng Nguyên (xã Hàm Rồng, huyện

Năm Căn), quá trình xử lý làm sạch đầu vỏ tôm bằng các hồ dung dịch axít Sau khi xử

lý bằng axít, đầu vỏ tôm được vớt ra phơi khô và cuối cùng thải nước bẩn ra sông (nguồn: pda.vietbao.vn)

Hình 1.1: Xử lý làm sạch đầu vỏ tôm trong hồ chứa axit, sau đó được phơi khô

1.2 Tổng quan về tình hình nghiên cứu và sử dụng phế liệu tôm

1.2.1 Các phương pháp thu hồi protein trong phế liệu tôm

Trong đầu vỏ tôm có chứa lượng lớn protein với thành phần các axit amin tương đương với protein của cá [32], tận thu nguồn dinh dưỡng này làm thức ăn cho gia súc

là một hướng đi đúng đăn Tuy nhiên do trong đầu tôm còn chứa nhiều khoáng và chitin gây khó tiêu cho gia súc nên cần phải có bước loại bỏ khoáng và chitin Nấu đầu tôm để tách protein ra vừa tốn nhiên liệu vừa gây phân hủy chất béo, vitamin, sắc tố [19], Phơi nắng và xay mịn thành thức ăn cho gia súc vừa không loại được khoáng và chitin vừa không đảm bảo vệ sinh Dùng axit vô cơ có thể làm tăng giá trị dinh dưỡng

do axit phân hủy protein thành các peptid và acid amin nhưng giá thành tương đối cao,

có thể gây phân hủy một phần các chất dinh dưỡng, và cần trung hòa axit vô cơ trước khi chế biến thành thức ăn cho gia súc [32] Các axit đã dung để thủy phân là HCl [18], axit fomic [32], Hiện nay có hai hướng dung phương pháp sinh học để chuyển nguồn phế liệu tôm thành nguồn dinh dưỡng có giá trị cao hơn là phương pháp lên men lactic

và phương pháp thủy phân bằng protease

1.2.1.1 Phương pháp lên men lactic

Theo phương pháp này, đầu tôm được lên men nhờ hệ vi sinh vật tự nhiên hay cấy thêm vi khuẩn lactic [32] Do trong đầu tôm còn thiếu nguồn cacbon nên thường phải bổ sung thêm mật rỉ Sản phẩm thu được cò thể dung trực tiếp hay thu dưới dạng bột và được chứng minh có thể dung làm thức ăn cho cá rất rất hiệu quả [27, 31, 32] Phương pháp lên men lactic là phương pháp rẻ tiền có thể ổn định và giữ lại giá trị dinh dưỡng của phế liệu [11] Theo Cremades, protein thu được sau quá trình lên men lactic

phế liệu tôm dung chủng Lactobacillus paracasei A3 có chứa đến 47% các axit amin

không thay thế trong tổng số acid amin thu được Bueno – Solano đã đề xuất quy trình thi hồi dịch thủy phân như hình 1.2 [12]

Hình 1.2: Sơ đồ thu hồi protein bằng lên men lactic

Dịch thủy phân đem sấy phun có hàm lượng protein đạt 47% còn đem cô đặc có hàm lượng protein 28% [12] Thành phần axit amin trong 2 loại sản phẩm cũng có khác nhau, trong đó trong dịch cô đặc chứa nhiều các axit amin không thay thế so với 47% trong bột thủy phân sấy phun Ngoài sản phẩm là bột thủy phân protein, phương pháp lên men lactic cho phép thu hồi chitin, một polimer tự nhiên có giá trị sử dụng cao Do vậy rất nhiều nghiên cứu phương pháp lên men lactic nhằm mục đích loại khoáng và protein trong phế liệu tôm thu chitin [22-24, 28, 35] Phương pháp lên men lactic thường lâu (đến 2 tuần), và protein bị tiêu thụ một phần cho sinh trưởng của vi khuẩn

1.2.1.2 Phương pháp thủy phân bằng Protease

Những nghiên cứu đầu tiên tập trung vào việc sản xuất bột PLT bằng phương pháp sử dụng enzyme protease [17, 26, 33].Trên hình 1.3 là sơ đồ quá trình thủy phân PLT bằng protease.Quá trình thủy phân PLT bằng phương pháp enzyme cho kết quả khả quan Thủy phân PLT bằng chế phẩm Alcalase thu được dịch thủy phân có nhiều các axit amin không thay thế rất thích hợp cho thức ăn gia súc [26], tăng khả năng thu hồi protein trong dịch thủy phân và có thể dùng làm thức ăn cho cá [20, 26] Dịch thủy phân thu được bằng phương pháp sinh học có chứa các peptit có hoạt tính sinh học có thể dùng trong dược phẩm hay chất kích thích sinh trưởng cho động vật [20] Ngoài ra một số nghiên cứu đã chứng minh dịch thủy phân phế liệu tôm bằng enzyme có chứa các chất chống oxi hóa [29], peptit ức chế enzyme chuyển hóa ACE chữa các bệnh tim mạch [15]

Hình 1 3: Sơ đồ thu nhận dịch thủy phân protein và chitin bằng phương pháp

Bốc hơi

chân không

Lọc phần nước trong

Sấy 60 độ C, 16h)

Chitin

Trypsin và Pepsin Ưu điểm của phương pháp enzyme là ngoài dịch protein có thể thu hồi đồng thời carotenoid và chitin Carotenoit có thể được sử dụng làm thức ăn cho cá hồi do tạo sắc tố cho thịt cá So với phương pháp hóa học dùng kiềm để loại protein trong chitin, lượng protein thu hồi bằng phương pháp enzyme tăng lên rất nhiều 68,5%

so với 12,8% Tương tự như trong lên men lactic, dịch thủy phân protein thu được chứa hàm lượng cao các axit amin không thay thế [20] Alcalase tỏ ra hữu hiệu hơn Pancreatin trong việc thu hồi protein 64,6% so với 57,5%

Đề tài nghiên cứu của Trang Sĩ Trung thuộc trường đại học thủy sản Nha Trang ứng dụng Flavourzyme, một chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Đan mạch

để thủy phân PLT thu hồi đồng thời protein và chitin (Hình 1.4) [10] Hàm lượng protein thu hồi đạt 49,2%

Phế liệu tôm

Tách protein bằng Flavourzyme

Hình 1 4: Sơ đồ quy trình thu hồi protein, chitin và astaxanthin

1.3 Tổng quan về enzyme protease [5]

1.3.1 Giới thiệu chung

Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Hình 1.5: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê )

So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme

rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

1.3.2 Phân loại Protease

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

Hình 1.6: Sơ đồ phân loại protease

Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

Peptidase (Protease) (E.C.3.4)

Exopeptidase

(E.C 3.4.11-17)

Endopeptidase (E.C 3.4.21-99)

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng.Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

- Protease acid: pH 2-4

- Protease trung tính: pH 7-8

- Protease kiềm: pH 9-11

1.3.3 Các yêu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme [6, 7]

1.3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme.Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng.Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định.Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm đến mức triệt tiêu Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu.Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 50oC.Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau là hoàn toàn khác nhau Một số enzyme khác có nhiệt độ tối ưu ở 60oC, một số khác lại có nhiệt độ tối ưu

ở 70oC, thậm chí có một số enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis lại hoạt động mạnh ở

90oC Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm.Khi

đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.Ngược lại, ở nhiệt độ 0oC enzyme

bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào

sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ Người ta thường sử dụng nhiệt độ

để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm

Hình 1.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng enzyme 1.3.3.2 Ảnh hưởng của pH

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến

phản ứng của enzyme.Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính.Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu.Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid VD: một số protease hoạt động ở pH kiềm (protease kiềm), một số lại hoạt động ở pH acid (protease acid) và một số protease lại hoạt động ở pH trung tính (protease trung tính) Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến lương thực, thực phẩm, trong tuyển chọn giống vi sinh vật

Hình 1.8 Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme 1.3.3.3 Tốc độ phản ứng enzym

Năm 1913, Michealis và Menten đã đề ra giả thuyết về vai trò của nồng độ cơ chất trong việc hình thành phức hợp enzyme – Cơ chất ES

Sự liên quan nói chung giữa enzyme, cơ chất và sản phẩm phản ứng được thể hiện bằng phương trình sau: E + S  ES  E +P

Giả thuyết của Michealis và Menten về sự liên quan giữa tốc độ phản ứng và nồng độ cơ chất được tính toán theo phương trình Michealis Menten:

Hình 1.9: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng có dạng hyperpol.Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, tất cả các phân tử enzym có trong phản ứng đều tham gia trong phức ES, tốc độ phản ứng sẽ đạt cực đại (Vmax)

Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ enzym Tuy nhiên, trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt hóa thì vận tốc phản ứng do enzym xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] nữa

1.3.4 Một số chế phẩm thương mại protease dùng trong nghiên cứu

1.3.4.1 Alcalase

Chế phẩm enzyme Alcalase 2.4L là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan Mạchdạng lỏng, màu nâu được sản xuất bằng cách lên men chìm chủng vi khuẩn Bacilus licheniformi, là enzyme endo-protease, thuộc loại serine protease, xúc tác đặc hiệu ở vị trí axit amin thơm hoặc amino-acid kỵ nước, vì vậy có tác dụng khử đắng trong dịch thủy phân Hoạt động ở nhiệt độ cao thường có mặt trong thành phần của các chất tảy rửa để loại bỏ vết bẩn.Đặc trưng là khả năng hoạt động bề mặt rất rộng, nó có thể thủy phân hầu hết các liên kết peptit có trong phân tử protein Chế phẩm có hoạt độ protease 2,4 AU (Anson Units)/g Hoạt động tối ưu ở PH: 6,8-8,5, nhiệt độ 45-65ºC

1.4.4.2 Protamex

Chế phẩm enzyme Protamex dùng cho sự thủy phân protein được cung cấp bởi công ty Novozyme của Đan Mạch Đó là enzyme protease có nguồn gốc từ vi sinh vật Bacillus Chế phẩm Protamex có hoạt độ protease 1,5 AU (Anson Units)/g, điều kiện thích hợp cho enzyme này hoạt động là pH = 5,5 - 7,5 và nhiệt độ 35 - 600C Bảo quản

ở nhiệt độ 3-5ºC

1.4.4.3 Flavourzyme

Chế phẩm enzym Flavourzyme là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan mạch dạng bột màu trắng nâu được sản xuất bằng cách lên men chìm chủng Aspergillus oryzae, là một phức hợp bao gồm endo-protease, amino_peptidase, cacboxyl_peptidasecó thể thuỷ phân trên 70% mối liên kết peptide, sản phẩm thuỷ phân bởiFlavourzyme thơm ngon, không có vị đắng khi thuỷ phân ở mức độ vừa phải Sản phẩm không có các chất độc hại, hàm lượng muối thấp Hoạt động ở pH 5-7, nhiệt độ tối ưu 40-65ºC Bất hoạt ở 85ºC trong 5 phút, 120ºC trong 5s

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Phế liệu tôm

Phế liệu tôm thẻ chân trắng được thu mua tại Công ty chế biến Thủy sản xuất khẩu Hải Phòng Tôm được xử lý nhiệt trước khi bóc vỏ, sau khi bóc vỏ PLT được thu gom vào thùng xốp và bảo quản lạnh để làm mẫu cho các thí nghiệm

Hình 2 1: Ảnh PLT dùng làm mẫu thí nghiệm

Trước khi thủy phân PLT được lấy ra khỏi tủ bảo quản lạnh và rã đông ở nhiệt

độ phòng.PLT sau đó được nghiền nhỏ và tiến hành thủy phân

2.1.2 Chế phẩm enzyme Alcalase, Protamex, Flavozym

Chế phẩm enzym Alcalase 2.4L là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan Mạch, được sản xuất từ chủng vi khuẩn Bacillius lichenformis

Chế phẩm enzym Protamex: là chế phẩm được cung cấp bởi công ty Novozyme của Đan Mạch Enzym Protamex có nguồn gốc từ vi sinh vật Bacillus có hoạt độ protease 1,5 AU (Anson Units)/g

Chế phẩm enzym Flavourzyme: là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan Mạch được sản xuất bằng cách lên men chìm chủng Aspergillus Oryzae

- Dung dịch CuSO4 (Trung Quốc)

- Ninhydrin (Trung Quốc)

- Pyrydine (Trung Quốc)

- KNaC4H4O6 (Trung Quốc)

- Cơ chất Cazein (Trung Quốc)

- Tinh thể Albumin huyết thanh bò BS

- Đệm phosphat (Trung Quốc)

- Axit H2SO4 đậm đặc (Trung Quốc)

- Hỗn hợp xúc tác CuSO4 :K2SO4 với

tỷ lệ 1:3

- Chỉ thị Taxiro (Trung Quốc)

- Dung dịch acid boric 3%

- Dung dịch axit H2SO4 (Trung Quốc)

- Máy khuấy từ (Trung Quốc)

- Máy đo quang (Mỹ)

- Máy đo pH (Ấn Độ)

- Buret chuẩn độ

- Máy voltex (Đức)

- Cối nghiền (Trung Quốc)

Các loại dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm : micropipette, ống nghiệm, ống

eppendorf, bình tam giác 250 ml, ống đong, giấy lọc…

2.4 Phương pháp phân tích các chỉ số

2.4.1 Phương pháp xác định hàm ẩm

Nguyên tắc: sấy nguyên liệu ở 110oC đến khối lượng không đổi

Cách tiến hành:

Cân 3g mẫu PLT đã được nghiền nhỏ cho vào hộp sấy và sấy ở 105oC.Sau 2 giờ

lấy hộp ra cho vào bình hút ẩm để nguội rồi đem cân.Tiếp tục sấy hộp 30 phút và đem

cân lại, tiếp tục tiến hành cho đến khi khối lượng hộp sấy không thay đổi

Tính kết quả:

Độ ẩm của mẫu được tính bằng phần trăm (%) theo công thức:

Trong đó: G1: Trọng lượng hộp nhôm và mẫu trước khi sấy (g)

G2: Trọng lượng hộp và mẫu sau khi sấy (g)

G: Trọng lượng hộp sấy

2.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro

Nguyên tắc: Dùng sức nóng 550-600oC đốt cháy hoàn toàn các phần hữu cơ

Phần còn lại đem đi cân và tính ra phần trăm tro toàn phần theo công thức sau:

Y (%) =