Nghiên cứu thu nhận sản phẩm thủy phân protein từ bã đậu nành của công nghiệp sản xuất sữa bằng chế phẩm enzyme thương mại

45 3.3.4.Nghiên cứu lựa chọn nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân protein47 3.3.5.Nghiên cứu sự kết hợp 2 loại enzyme Neutrase và Flavourzyme trong thủy phân protein Bã đậu nành thu nh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

CAO THỊ KIM CHI

NGHIÊN CỨU THU NHẬN SẢN PHẨM THỦY PHÂN PROTEIN

TỪ BÃ ĐẬU NÀNH CỦA CÔNG NGHIỆP SẢN XUẤT SỮA BÀNG CÁC CHẾ PHẨM ENZYME THƯƠNG MẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

CAO THỊ KIM CHI

NGHIÊN CỨU THU NHẬN SẢN PHẨM THỦY PHÂN PROTEIN

TỪ BÃ ĐẬU NÀNH CỦA CÔNG NGHIỆP SẢN XUẤT SỮA BÀNG CÁC CHẾ PHẨM ENZYME THƯƠNG MẠI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS QUẢN LÊ HÀ

Hà Nội - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Học viên: Cao Thị Kim Chi

Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Người hướng dẫn : PGS.TS Quản Lê Hà

Tên luận văn: “Nghiên cứu thu nhận sản phẩm thủy phân protein từ Bã đậu

nành của công nghiệp sản xuất sữa bằng các chế phẩm enzyme thương mại”

Nội dung cam đoan: Em xin cam đoan, trong suốt quá trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, dưới sự hướng dẫn chỉ bảo tận tình của giáo viên hướng dẫn, em đã tiến hành nghiên cứu luận văn một cách trung thực, toàn bộ nội dung trong báo cáo luận văn được em trực tiếp thực hiện Tất cả các kết quả nghiên cứu không sao chép từ các báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách của bất cứ tác giả nào

Học viên

Cao Thị Kim Chi

LỜI CẢM ƠN

Đối với mỗi học viên cao học, luận văn tốt nghiệp là một công trình khoa học nhỏ nhưng mang ý nghĩa lớn, đánh dấu bước trưởng thành đầu tiên của mỗi cá nhân trên con đường ứng dụng những kiến thức đã được học vào thực tiễn

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Quản Lê Hà, Viện trưởng – Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, PGS.TS Phạm Thu Thủy – giảng viên bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức quý báu để giúp em hoàn thành luận văn này

Trong thời gian thực tập và làm việc tại phòng Thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học- Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, em đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ, sự chỉ bảo tận tình về chuyên môn, kĩ thuật cùng sự động viên chân thành của thầy cô và tập thể học viên, sinh viên thực tập tại phòng

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Em xin được gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên khuyến khích em trong suốt quá trình học tập để đạt được kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, tháng năm 2018

Học viên

Cao Thị Kim Chi

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

[a.a]: Hàm lượng axit amin

BĐ: Bã đậu

CK: Chất khô

ĐPL: Độ pha loãng

HSTH: Hiệu suất thu hồi

HSTP: Hiệu suất thủy phân

KL: Khối lượng

KLTB: Khối lượng trung bình

OD: Optical density (mật độ quang)

[Pr]: Hàm lượng protein

TLPT: Tỉ lệ phối trộn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 10

ậu nành 10

1.1.1.Sản xuất sữa đậu nành 10

1.1.2.Bã đậu nành 11

1.1.3.Thành phần Bã đậu nành: 13

1.1.4.Protein Bã đậu nành 14

1.1.5.Phương pháp xử lí protein 15

1.2.Hệ enzyme protease 18

1.2.1.Định nghĩa 18

1.2.2.Phân loại protease 19

1.2.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của protease 20

1.3.Protein thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa của protein thủy phân 22

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Vật liệu nghiên cứu: 26

2.1.1.Bã đậu nành 26

2.1.2.Các chế phẩn enzyme thương mại 26

2.2.Hóa chất 26

2.3.Thiết bị 26

2.4.Phương pháp xác định hoạt độ protease của các chế phẩm 27

2.5.Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu 29

2.6.Phương pháp xác định protein hòa tan bằng phương pháp Lowry 30

2.7.Phương pháp xác định axit amin bằng Ninhydrin 32

2.8.Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH: 34

2.9.Sơ đồ nghiên cứu thủy phân Bã đậu nành bằng các chế phẩm protease 36

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

3.1.Phân tích thành phần ban đầu của Bã đậu nành 40

3.2.Xác định hoạt độ của các chế phẩm enzyme thương mại 40

3.3.Nghiên cứu thu hồi protein trong bã đậu ướt bằng các chế phẩm protease thương mại 40

3.3.1.Nghiên cứu thủy phân protein trong bã đậu ướt bằng chế phẩm protease 40

3.3.2.Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ phối trộn bã đậu ướt và nước đến khả năng thuỷ phân protein 42

3.3.3.Nghiên cứu lựa chọn chế độ khuấy đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân 45

3.3.4.Nghiên cứu lựa chọn nồng độ enzyme đến khả năng thủy phân protein47 3.3.5.Nghiên cứu sự kết hợp 2 loại enzyme Neutrase và Flavourzyme trong thủy phân protein Bã đậu nành thu nhận sản phẩm có hoạt tính chống oxy hóa cao 49

3.4 Nghiên cứu khảo sát tỉ lệ phối trộn bã đậu khô và nước tới khả năng thu hồi protein 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng trên 100g bã đậu nành ướt 13

Bảng 1.2 Bảng so sánh thành phần axit amin trong protein Bã đậu nành ướt và hạt đậu nành 15

Bảng 3.1 Thành phần Bã đậu nành 40

Bảng 3.2 Hoạt độ các chế phẩm enzyme 40

Bảng 3.3 Nghiên cứu kết hợp 2 chế phẩm enzyme Neutrase và Flavourzyme trong thủy phân protein Bã đậu nành 50

Bảng 3.4 Nghiên cứu khảo sát tỉ lệ phối trộn bã đậu khô và nước tới khả năng thu hồi protein 51

Bảng 1.1’: Bảng xác định độ ẩm nguyên liệu 58

Bảng 1.2’: Bảng xác định protein hòa tan trong Bã đậu nành 59

Bảng 2.1’ : Xác định lượng protein của dịch trong 60

Bảng 2.2’: Xác định lượng axit amin của dịch trong 61

Bảng 3.1’ Bảng xác định lượng protein của dịch trong 64

Bảng 3.2’ Bảng xác định lượng axit amin của dịch trong 65

Bảng 3.3’ : Kết quả phân tích dịch trong khi khảo sát tỷ lệ phối trộn bã đậu và nước 67

Bảng 3.4’ : Kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch trong khi khảo sát tỷ lệ phối trộn bã đậu và nước 68

Bảng 4.1’ Bảng xác định lượng protein của dịch trong 69

Bảng 4.2’ Bảng xác định lượng axit amin của dịch trong 70

Bảng 4.3’ : Kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch trong khi khảo sát chế độ khuẩy 71

Bảng 5.1’ Bảng xác định lượng protein của dịch trong 72

Bảng 5.2’ Bảng xác định lượng axit amin của dịch trong 74

Bảng 5.3’: Kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch trong khi khảo sát nồng độ enzyme 75

Bảng 5.4’: Kết quả phân tích hoạt tính chống oxy hóa của dịch trong khi khảo sát tỉ lệ phối trộn bã đậu khô và nước 76

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein 19

Hình 1.2 Hỗn hợp protein thủy phân 23

Hình 2.1 Đường chuẩn Tyrosine 28

Hình 2.2 Đường chuẩn albumin 31

Hình 2.3 Đồ thị đường chuẩn glutamic 33

36

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình thu hồi protein sử dụng enzyme 36

Hình 3.1 (a) Lượng axit amin trong dịch thủy phân bã đậu ướt bằng 2 chế phẩm Flavourzyme và Neutrase 41

Hình 3.1 (b) Khả năng thủy phân protein trong BĐ ướt của chế phẩm enzyme 41

Hình 3.2 (a) Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn BĐ và nước tới lượng axit amin 42

Hình 3.2 (b) Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn BĐ và nước tới hiệu suất thủy phân của enzyme 43

Hình 3.2 (c) Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn BĐ và nước tới hiệu suất thu hồi protein 43

Hình 3.2 (d) Ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn BĐ và nước tới hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein 44

Hình 3.3 (a) Ảnh hưởng của chế độ khuấy tới lượng axit amin trong dịch sau thủy phân 45

Hình 3.3 (b) Ảnh hưởng của chế độ khuấy tới hiệu suất thủy phân protein 46

Hình 3.3 (c) Ảnh hưởng của chế độ khuấy tới hiệu suất thu hồi protein 46

Hình 3.3 (d) Ảnh hưởng của chế độ khuấy tới hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein 46

Hình 3.4 (a) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hàm lượng axit amin trong dịch thủy phân 47

Hình 3.4 (b) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hiệu suất thủy phân protein 48

Hình 3.4 (c) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hiệu suất thu hồi protein 49 Hình 3.4 (d) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein 49

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, ngành sản xuất sữa đậu nành phát triển một cách vượt bậc Theo số liệu thống kê của hãng thống kê thị trường Neilsen, năm 2014 Việt Nam tiêu thụ khoảng 613 triệu lít sữa đậu nành, có nghĩa khoảng 1,5 triệu lít / ngày Việt Nam là nước tiêu thụ sữa đậu nành nhiều thứ 3 trên thế giới [34] Với thị trường tiềm năng này, các doanh nghiệp cũng mạnh tay đầu tư cơ sở, công nghệ để sản xuất mặt hàng này, nổi bật như nhà máy Vinasoy (Bắc Ninh và Quảng Ngãi), nhà máy Vinamilk …Nhưng đi đôi với việc đẩy mạnh chế biến đậu nành thì việc một lượng lớn bã đậu được thải ra Theo một số thống kê cho biết, riêng nhà máy Vinasoy với công suất thiết kế 180 triệu lít/năm, mỗi năm nhà máy thải ra 20000 tấn

bã đậu [34] Phần lớn lượng bã này được sấy khô bán cho nhà máy chế biến thức ăn gia súc Với phương pháp tận thu này tiêu tốn năng lượng và không đem lại lợi nhuận cao Còn một phần bã đậu được bán tươi, tuy nhiên bã đậu chứa nhiều chất dinh dưỡng cũng như độ ẩm cao nên rất dễ hư hỏng cần sử dụng Để khắc phục những nhược điểm trên, cũng đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng bã đậu như lên men thu hồi axit xitric hay dùng enzyme cellulase và pectinase thủy phân bã đậu thu hồi sản phẩm kích thước nhỏ bổ sung một phần vào bột làm bánh mì….bởi phần bã đậu sau quá trình sản xuất sữa đậu nành vẫn chứa nhiều thành phần dinh dưỡng như protein (20-30%), gluxit, chất béo và chất xơ Nhận thấy nguồn protein trong bã đậu

có khả năng thu hồi và việc thu hồi protein trong bã đậu sẽ giúp tiết kiệm năng lượng cũng như tăng giá trị thương mại của bã đậu Xu hướng mở ra hiện nay là phối hợp các chế phẩm enzyme thương mại để thủy phân bã đậu tạo ra các peptide, các axit amin có hoạt tính chống oxy hóa được sử dụng để bổ sung vào thực phẩm chức năng hay ứng dụng trong dược phẩm

Xuất phát từ những mục đích thăm dò khả năng thu hồi protein trên bã đậu khô bằng chế phẩm Neutrase và Flavourzyme nhằm đưa ra một hướng mới giúp tận dụng tốt đa nguồn bã đậu thải ra hàng năm và mang lại giá trị kinh tế cao, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận sản phẩm thủy phân protein

từ Bã đậu nành của công nghiệp sản xuất sữa bằng các chế phẩm enzyme thương mại”

bã đậu ướt và bã đậu khô chế phẩm Flavourzyme và Neutrase (tỉ lệ phối trộn, chế độ khuấy và nồng độ enzyme hiệu suất thu hồi protein cao nhất và tạo ra các peptide có hoạt tính chống oxy hóa

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1.1 Sản xuất sữa đậu nành

Sữa đậu nành được chế biến từ hạt đậu nành thu mua từ nhiều nguồn khác nhau Trước khi đưa vào dây chuyền sản xuất, chúng được làm sạch và phân loại để đảm bảo loại hết tạp chất và độ đồng đều chất lượng Sau đó, những hạt đậu này được nghiền với nước nóng và ly tâm thu dịch Để loại những enzyme có hại cho sản phẩm như enzyme Lipoxygenase và Anti-tripsin, người ta dùng biện pháp gia nhiệt và bài khí Sau đó, dịch đậu nành sẽ được phối trộn với nguyên liệu khác (nước, đường, phụ gia, hương và một số thành phần phụ khác) nhằm tạo ra hương

vị cho sản phẩm Tuy nhiên, những thành phần này có thể bị lắng xuống nên cần đồng hóa dịch Dưới áp suất cao thì các phần tử trong dịch được phân tán đều tạo dung dịch đồng nhất Một công đoạn không thể thiếu trong dây chuyền sản xuất là tiệt trùng với nhiệt độ cao và áp suất cao thì những vi sinh vật bị tiêu diệt mà không làm thay đổi tính chất sản phẩm ban đầu Cuối cùng dịch được trữ lạnh, đóng gói và bảo quản [34] Bã đậu nành thu được từ quá trình này được ứng dụng vào đề tài của tôi

Sơ đồ quy trình sản xuất sữa đậu nành tại công ty Vinasoy Việt Nam

1.1.2 Bã đậu nành

Bã đậu nành hay còn gọi tắt là bã đậu: là phần rắn còn lại sau khi lọc trong

quá trình sản xuất đậu phụ, sữa đậu nành và các sản phẩm từ đậu nành khác

Trên thế giới, từ ngữ thông dụng để chỉ bã đậu nành là “okara”, thuật ngữ này

xuất phát từ Nhật Bản (phát âm theo tiếng Nhật là “oh-KAR-uh”)

Okara là bã màu trắng hoặc trắng ngà bao gồm các phần không hòa tan của hạt đậu nành còn lại, khi hạt đậu nành xay nhuyễn được lọc trong sản xuất sữa đậu nành và đậu phụ Khi sấy khô, bã đậu nành có màu vàng

Okara là một sản phẩm phụ từ ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành và đậu phụ Nó chứa protein, chất xơ có giá trị và có thể được sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm để đáp ứng nhu cầu của thị trường Tuy nhiên, chúng ta phải xử lý một cách nhanh chóng để duy trì được các tính chất của nó Bã đậu nành chứa hầu hết cacbohydrate, một phần protein và một lượng nhỏ phần dầu của hạt đậu nành

Bã ướt giống như mùn cưa ẩm, nó được cho là giống với cơm dừa về kết cấu và hình thức, thường được sử dụng như một thành phần thực phẩm trong món súp Nhật Bản, salad và các món ăn được chế biến từ thực vật

Tình hình nghiên cứu okara ở nước ngoài:

- Ma và cộng sự (1997) đã tách các protein từ okara và nghiên cứu tính chất hóa lý, chức năng của chúng để so sánh với protein thương mại tách chiết từ đậu nành Chan và Ma (1999) cũng đã thủy phân protein bã đậu bằng trypsin Kết quả cho thấy protein tách chiết từ okara có lượng axit amin phong phú so với tiêu chuẩn của FAO/WHO và so với protein đậu nành thương mại; dễ tiêu hóa, có thể bổ sung vào thực phẩm [10,11,21]

- Quitain và cộng sự (2005) đã tách chiết dầu từ okara sử dụng cacbon dioxit siêu tới hạn Lượng dầu thu được là 3,09g trên 100g bã đậu khô Ngoài ra isoflavone, genistein và daidzen cũng được tách chiết cùng dầu làm tăng giá trị dinh dưỡng của dầu với sức khỏe con người (hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư…)[28]

- Sourel (2005) đã nghiên cứu quá trình sấy okara và chỉ ra rằng quá trình sấy làm biến đổi cấu trúc sợi và làm giảm khả năng giữ nước Tuy nhiên, hàm lượng isoflavones trong okara không thay đổi nhiều trước và sau khi xử lý nhiệt [31] Tình sử dụng và nghiên cứu bột okara trong nước:

- Đỗ Bích Thủy, Lê Thị Kim Anh (2017) đã thủy phân, lên men bã đậu nành bởi các

chế phẩm Bacillus amiloliquefaciens N1 và Lactobacillus fermentum DC4t2 Giá trị

dinh dưỡng của sản phẩm sau xử lý được đánh giá thông qua hoạt độ enzyme ngoại bào protease, amlylase, hàm lượng axit amin tự do [2]

- Lê Chiến Phương và các cộng tác viên (2004) xử lý okara bằng nấm mốc Mucor

và vi khuẩn lactic [3]

Tính đến thời điểm hiện tại, chưa có sản phẩm nào trong số các sản phẩm nêu trên được triển khai sản xuất thử ở quy mô công nghiệp Điều này cho thấy ở Việt Nam loại phụ phế liệu đậu nành này vẫn chưa được tận dụng có hiệu quả vào các mục đích khác ngoài thức ăn chăn nuôi

1.1.3 Thành phần Bã đậu nành:

Bã đậu nành chứa nhiều thành phần dinh dưỡng, theo Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ (Cẩm nang “Dinh dưỡng người, thông tin dịch vụ Nông Nghiệp số 16/8”) công bố thành phần bã đậu như sau:

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng trên 100g bã đậu nành ướt

Theo công bố của Li Bo và cộng sự (2012) thì thành phần hóa học của okara

sẽ phụ thuộc vào số lượng giai đoạn nước chiết xuất từ đậu nành và lượng nước tiếp tục được bổ sung để trích xuất các thành phần chiết dư Nó cũng phụ thuộc vào các giống đậu nành và các phương pháp sản xuất, gồm: 46,3% chất xơ, 17,8% protein, 5,9% lipid, tro 3,9%, 2,6% đường khử, 0,22% flavone và 6,7% ẩm Một số thành phần của đậu nành khác cũng có khả năng hiện diện trong Bã đậu nành, bao gồm: isoflavones, lignans, phytosterol, counestans, saponin và phytates

Bên cạnh đó, sự tác động bởi cơ học và nhiệt độ làm tăng tương tác protein- protein và thúc đẩy hình thành lớp màng không khí và nước nên tăng khả năng tạo

và giữ bọt của protein Bã đậu nành

Khi chiết tách protein trong Bã đậu nành bằng NaOH 2N thì hiệu suất thu hồi protein của bã ướt sẽ cao hơn bã khô (12,9g/100g BĐ và 12,3g/100g BĐ) Còn các tính chất khác (ổn định hệ nhũ tương, khả năng tạo và giữ bọt) gần như giống nhau đối với protein bã đậu khô và bã đậu ướt

Nghiên cứu trên cũng đã phân tích thành phần axit amin có trong protein Bã đậu nành ướt như sau:

Bảng 1.2 Bảng so sánh thành phần axit amin trong protein Bã đậu nành ướt và hạt đậu nành [32]

Nhận thấy tỷ lệ axit amin trong bã đậu hầu như thấp hơn có với axit amin trong hạt đậu nành ngoại trừ một số axit amin như : Cystein, Threonine, Glycine

1.1.5 Phương pháp xử lí protein

Thủy phân protein là sự phân cắt các liên kết peptide khi có mặt của nước Do liên kết peptide là liên kết bền nên cần có những tác nhân xúc tác có thể hóa học hoặc sinh học

Phương pháp hóa học

a Thủy phân protein bằng axit

Đây là phương pháp thủy phân khắc nghiệt, dùng axit HCl nồng độ cao và thủy phân ở nhiệt độ 100-120oC trong thời gian 24-48 giờ Sản phẩm thu được chủ yếu là các axit amin tự do dưới dạng hydrogenclorate Một số axit amin như serine, threonin bị phá hủy một phần, tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và asparagine phân ly thành axit glutamic và axit asparic và NH4+

Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện

Nhược điểm: cần thiết bị chịu được nồng độ axit cao, xử lí chất thải sau quá trình thủy phân tốn kém, phản ứng không có tính đặc hiệu và quá trình thủy phân làm phá hủy một số axit amin

b.Thủy phân bằng NaOH

Phương pháp sử dụng NaOH nồng độ 4-8N, thủy phân trong thời gian dài

24-48 giờ và nhiệt độ > 100oC

Ưu điểm: Đơn giản, dễ thực hiện

Nhược điểm: cần thiết bị chịu được nồng độ kiềm cao, xử lí chất thải sau quá trình thủy phân tốn kém và nguy hại tới môi trường, gây hiện tượng racemic hóa giảm giá trị dinh dưỡng và quá trình thủy phân làm phá hủy một số axit amin như cystein, serine, treonine

Phương pháp sinh học

a.Phương pháp vi sinh

Phương pháp này thủy phân protein nhờ enzyme từ vi sinh vật Các enzyme này có thể được tạo ra từ việc nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường riêng sau đó được đưa vào môi trường giàu đạm (cơ chất) Dung dịch sau thủy phân thu được gồm protein, peptide, axit amin

Ưu điểm: Phương pháp có tính đặc hiệu cao, phản ứng xảy ra trong điều kiện

ôn hòa, thiết bị đơn giản

Nhược điểm: hiệu suất thủy phân thấp và thời gian thủy phân kéo dài

Nhược điểm: Chi phí cao hơn so với phương pháp hóa học

Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến ngày này, những chế phẩm enzyme thương mại được bổ sung vào các quá trình thu hồi protein từ phụ phẩm

trong quá trình sản xuất

Phương pháp sấy

Bã đậu nành tươi có độ ẩm lớn cùng với hàm lượng chất dinh dưỡng trong đó rất phù hợp cho vi khuẩn gây thối phát triển Do đó, vấn đề bảo quản bã đậu nành là vấn đề được quan tâm Nhiều tác giả ở nước ngoài (Chung và cộng sự, 1978; Fujigami và cộng sự, 1980; Hirotsuka và cộng sự , 1987) đã nghiên cứu chế độ sấy

để kéo dài thời gian bảo quản bã đậu nành

Bã đậu nành được thải ra từ quá trình sản xuất sữa đậu nành ở dạng ướt, độ ẩm cao 70-85% ẩm được chuyển vào thiết bị sấy phù hợp với công suất từng nhà máy

Bã đậu này, thường được sấy bằng thiết bị sấy băng tải ở nhiệt độ 70-90oC trong thời gian dài đưa ẩm về 10-12% Sau đó bã khô được bán cho các nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi để phối trộn với các thành phần khác tạo hỗn hợp thức ăn gia súc Phương pháp được sử dụng từ lâu đời và được ứng dụng rộng rãi do tính chất đơn giản cuaa phương pháp Tuy nhiên, phương pháp này tiêu tốn nguồn năng lượng vô cùng lớn mà sản phẩm sau quá trình lại đem lại lợi nhuận không cao Chính vì vậy, hiện nay người ta đang nghiên cứu tìm kiếm những giải pháp đem lại hiệu quả cao hơn

Phương pháp lên men

Để tận dụng lượng lớn xenluloza còn sót trong Bã đậu nành, người ta đã tiến hành nghiên cứu lên men Bã đậu nành bằng nấm mốc Nhờ đó, lượng gluxit trong

bã đậu bị phân giải tạo axit pyruvic và CH3CHO, từ đó tổng hợp tạo axit xitric Axit xitric là loại axit có độ chua nhẹ, tan trong nước Axit xitric được ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm như bánh kẹo, nước giải khát…Ngoài ra, axit xitric còn được sử dụng trong các ngành công nghiệp khác như mỹ phẩm, y học, dược phẩm, phim ảnh và trong sản xuất chất tẩy rửa

Phương pháp lên men đậu nành cũng được ứng dụng trong sản xuất tương Bã

đậu nành được lên men bởi nấm mốc bổ sung vào như: Aspergillus, Mucor, Rhizopus có hoạt tính amylase và protease cao nên thường được bổ sung trong quá

trình sản xuất

Các chế độ (nhiệt độ, pH, thời gian ) được điều chỉnh phù hợp với loại nấm mốc sử dụng Việc tận dụng Bã đậu nành trong sản xuất tương đã đem lại nguồn lợi lớn cho doanh nghiệp

Phương này tận dụng được nguồn dinh dưỡng trong bã đậu và năng lượng cần thiết rất thấp Bên cạnh những ưu điểm đó, thì việc sử vi sinh vật lên men bã đậu cần nhiều thời gian cũng như có những rủi ro (nhiễm các loại vi sinh vật khác không mong muốn), khó kiểm soát quá trình

Phương pháp thủy phân

Để tận thu nguồn protein trong bã đậu thì người ta còn sử dụng các enzyme, các chế phẩm enzyme thương mại để thủy phân protein trong các điều kiện tương ứng tạo peptide và axit amin Xu hướng nghiên cứu phối hợp các loại chế phẩm khác nhau hoặc khảo sát điều kiện để thu hồi protein nhiều nhất đang mở ra một hướng đi mới trong vấn đề xử lí Bã đậu nành

1.2.1 Định nghĩa

Protease là nhóm enzyme xúc tác thủy phân liên kết peptide, là loại liên kết chủ yếu trong phân tử protein và polypeptide

Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptide (-CO-NH- )n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài

ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Hình 1.1 Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên proteasevi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

1.2.2 Phân loại protease

Dựa vào vị trí phân cắt các liên kết peptide của protease, người ta chia protease thành 2 loại:

Exo peptidase: là nhóm protease xúc tác phân cắt các liên kết ở đầu mạch polypeptide, có thể là đầu cuối C hoặc đầu cuối N, sản phẩm tạo ra là phân tử nhỏ như axit amin, dipeptide

Endo peptidase: là nhóm protease xúc tác phân cắt các liên kết peptid nội mạch, sản phẩm tạo ra là các phân tử lượng vừa và lớn

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của protease

Ảnh hưởng nhiệt độ tới thủy phân

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn tới khả năng xúc tác của protease Nhiệt độ ứng với hoạt độ enzym cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu của enzym và tùy thuộc vào loại, cũng như nguồn enzyme Ngoài ra nó còn có thể thay đổi tuỳ thuộc cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng,…

Nhiệt độ mà enzym bị mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn Ở nhiệt độ tới hạn enzym bị biến tính, ít có khả năng phục hồi, thường nhiệt độ tới hạn khoảng 90-950C Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 00

C hoạt độ enzyme tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi nâng nhiệt độ lên

Đối với chế phẩm Neutrase khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp 40-60oC, khi nhiệt độ nằm ngoài khoảng này thì hoạt tính enzyme giảm xuống

Ảnh hưởng của pH

pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym, do ảnh hưởng đến mức độ ion hoá trung tâm hoạt động của enzym, cơ chất Giá trị pH môi trường tương ứng với hoạt độ enzym cao nhất gọi là pH tối ưu của enzym và thay đổi tùy thuộc nguồn enzym Một số enzym có pH tối ưu rất thấp (pepsin, proteinase axit

của vi sinh vật, ) hoặc khá cao (substilizin có pH tối ưu >10) Ngoài ra pH tối ưu

của một enzym còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ,…

Nghiên cứu của Siriporn.D và Kongpob.R cho thấy hiệu suất thu hồi protein cao nhất với chế phẩm Neutrase tại pH 7 [12]

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì tốc độ phản ứng xúc tác bởi enzym phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym Tuy nhiên, khi nồng độ enzym quá lớn thì hiệu quả xúc tác lại giảm

Theo kết quả nghiên cứu của Dey và Dora [13] khi tối ưu các điều điện để thủy phân protein trong phế liệu tôm bằng protease cho thấy khi tăng nồng độ

enzyme từ 1% đến 1,5% thì hiệu suất thủy phân tăng, nhưng khi tiếp tục tăng nồng

độ lên nữa thì hiệu suất thủy phân hầu như không thay đổi

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Trong phản ứng thủy phân dưới xúc tác của enzym, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất theo phương trình hypecpol Ở nồng độ cơ chất thấp, khi tăng nồng độ cơ chất tốc độ phản ứng tăng, nhưng tăng đến một mức nào đó thì vận tốc phản ứng sẽ không tăng nữa

Ngoài ra nồng độ cơ chất tối đa còn phụ thuộc vào trạng thái hòa tan của cơ chất

Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa và kìm hãm

Tính hoạt động của một số enzym protease còn phụ thuộc vào sự có mặt của các ion kim loại và một số hợp chất khác Một số trong những chất đó có tác dụng làm tăng tính hoạt động của enzym, còn một số khác lại có tác dụng kìm hãm hoạt động của các enzyme

Protease của Aspergillus awamori 78 – 2 bị kìm hãm bởi các ion Co2+, Fe2+, Cu2+,

Hg2+, Ca2+, Mg2+,Mn2+, Zn2+, Ni2+ và EDTA (etylen diamin tetraaxetic)

Protease I, II,III của Aspergillus oryzae không bị kìm hãm bởi các ion Ba2+, Ca2+,

Mn2+, Mg2+, Zn2+, nhưng bị kìm hãm bởi các ion kim loại khác như

Cu2+,Co2+,Cd2+,Fe3+ Protease của Bacillus subtilis bị mất hoạt tính bởi hợp chất tạo

phức và khi nồng độ urê cao, ngoài ra nó bị kìm hãm bởi EDTA Conovalov và Dorokhow nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần nước quả đến hoạt độ của enzym protease nhận thấy ion Na+ và Ca2+ là chất hoạt hoá enzym protease Đường có tác dụng kích thích enzym protease, ngược lại axit có tác dụng ức chế enzym protease Chất chát có nồng độ 0.02 % có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzym protease

1.2.4 Một số chế phẩm protease thương mại:

Flavourzyme là một phức hợp enzyme thủy phân protein đượ ừ

phân cắt nộ ạ ử peptide (endoprotease và exopeptidase)

để chuyển hóa protein đến tận đơn vị cuối cùng là acid amin

Nhiệt độ tối ưu cho Flavourzyme hoạt động là khoảng 50OC – 55OC, pH tối ưu

là từ 5.0 – 7.0 và có khả năng chịu mặ bất hoạt ở 75 ºC trong 10 phút

ế phẩm: dạng bột (Flavourzyme 500MG) và dạng lỏng (Flavourzyme 500L)

Hoạt tính của Flavourzyme ghi trên nhãn là 500 LAPU/g (Leucine Amino Peptidase Units/g)

ới hoạt độ tối ưu

khoảng pH 5,5-7,5 và 45-55° C Hoạt tính của Neutrase ® được ghi trên nhãn là 1,5 AU/g (Anson unit/g) Nó là một protease kim loạ –

kẽm trong trung tâm hoạt độ

một nhiệt độ nhất định bị ảnh hưởng bởi loại và nồng độ củ

quản ở nhiệt độ 3-5 ° C, Neutrase ® sẽ có hoạt tính ít nhất là một năm sau khi bảo

C trong 5 giây

1.3 Protein thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa của protein thủy phân

Protein thủy phân là hỗn hợp sản phẩm thủy phân protein, bao gồm các axit amin tự do, các polypeptide, các peptide với chiều dài mạch khác nhau và cả các protein chưa bị thủy phân [7]

Hình 1.2 Hỗn hợp protein thủy phân

Không chỉ có peptide và các axit amin thu được từ quá trình thủy phân protein

có hoạt tính chống oxy hóa mà bản thân protein cũng có hoạt tính chống oxy hóa [7] Trong phân tử protein đã chứa sẵn những đoạn peptide có hoạt tính sinh học Tuy nhiên, khi nằm trong mạch protein (hay polypeptide) các hoạt tính này tồn tại dưới dạng tiềm ẩn, không được thể hiện Khi được giải phóng ra khỏi mạch bằng cách thủy phân với enzyme đặc hiệu, các đoạn peptide và các axit amin tự do này sẽ thể hiện được hoạt tính của chúng [26, 30]

Các axit amin tự do thường thể hiện hoạt tính chống oxy hóa không cao trong thực phẩm và các hệ thống sinh học; sự phân giải triệt để protein tạo thành các axit amin tự do thường làm giảm hoạt tính chống oxy hóa [14, 19]

Hoạt tính chống oxy hóa của các peptide thường cao hơn so với các axit amin

tự do, khả năng đó có liên quan tới tính chất đặc biệt được hình thành từ thành phần cấu tạo, tính chất vật lý và sự ổn định của các peptide [25] Liu và Chiang (2008) nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa, đặc điểm, tính chất của sản phẩm thủy phân từ hạt vừng tách béo Kết quả thu được sản phẩm là các peptide ngắn mạch, có khối lượng phân tử khoảng 4 - 6 kDa, có hoạt tính chống oxy hóa cao và có tác dụng làm giảm huyết áp Bên cạnh đó nghiên cứu còn cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm thủy phân phụ thuộc vào loại enzyme thủy phân và các thông số của quá trình thủy phân như nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) và thời gian thủy phân [19]

- Phần lớn các peptide chống oxy hóa có nguồn gốc thực phẩm có khối lượng khoảng 500 - 800 Da, một số peptide có khối lượng phân tử 8 - 15 kDal Trong

thành phần cấu tạo của các peptide này có chứa các axit amin kị nước như valine, leucine tại đầu nitơ tận cùng và proline, histidine, tyrosine, tryptophan, methionine trong thành phần chuỗi [29]

- Các axit amin kị nước như valine và leucine có thể làm tăng sự tương tác giữa peptide và axit béo để loại gốc tự do [15]

- Hoạt tính chống oxy hóa của histidine trong chuỗi peptide được xác định là

do khả năng cho hydro, giữ gốc peroxy lipid, hoặc khả năng tạo phức kim loại của vòng imidazol [17]

Thành phần axit amin và vị trí sắp xếp của các axit amin trong chuỗi peptide

sẽ quyết định khả năng chống oxy hóa của các peptide Vì vậy, khi thay đổi vị trí sắp xếp và thành phần các axit amin sẽ làm thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của các peptide [19, 29]

- Trong chuỗi peptide, axit amin histidine và proline đóng vai trò quan trọng trong hoạt động chống oxy hóa và peptide có cấu trúc proline - histidine - histidine

có khả năng chống oxy hóa cao hơn Hơn thế nữa peptide này có sự tương tác với các chất chống oxy hóa tan trong lipid như - tocopherol, BHA và làm tăng hoạt tính chống oxy hóa của chúng [14]

- Tripeptide chứa 2 axit amin tyrosine có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với tripeptide chứa 2 axit amin histidine trong hệ thống peroxy hóa của linolic [18]

- Nếu loại gốc histidine của đầu carbon tận cùng của chuỗi peptide thì hoạt tính chống oxy hóa sẽ giảm trong khi loại gốc leucine ở đầu nitơ tận cùng thì không ảnh hưởng tới hoạt tính chống oxy hóa [29]

Gần đây, trong một số thí nghiệm đã cho thấy okara là một nguồn tiềm năng của các thành phần chống oxy hóa (Amin & Mukhrizah, 2006), thấy rằng một số sản phẩm thủy phân protease từ okara có khả năng hoạt động chống oxy hóa (Yokomizo, Takenaka, và Takenaka, 2002) Kết quả nghiên cứu của Préstamo và cộng sự (2007) đã kiểm tra được tác động của okara ở chuột đã kết luận rằng: okara

có thể có ích như một thành phần phụ bổ sung vào khẩu phần ăn và có thể bảo vệ

môi trường ruột về khả năng chống oxy hóa và probiotic (Jimeınez- Escrig, Tenorio, Espinosa-Martos, & Rupérez, 2008) Trong mô phỏng các điều kiện sinh

lý, okara có thể giải phóng các peptide có hoạt tính sinh học tiềm năng Escrig và cộng sự, 2010) Đặc biệt, protein được cô đặc từ okara và thu được kết tủa, tiếp theo cho enzyme thủy phân để giải phóng peptide có hoạt tính sinh học tiềm năng [22]

(Jiménez-CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu:

2.1.1 Bã đậu nành

Bã đậu nành được lấy từ nhà máy sữa đậu nành Vinasoy – Bắc Ninh Bã đậu sau khi lấy từ nhà máy thì được bảo quản lạnh Trước khi tiến hành thí nghiệm cần làm rã đông bã đậu ở nhiệt độ phòng Bã đậu sau rã đông chia thành 2 phần Một phần trực tiếp đem thủy phân Một phần đem sấy ở nhiệt độ 125oC – 135oC trong 1 giờ trước khi đem thủy phân

2.1.2 Các chế phẩn enzyme thương mại

Các chế phẩm enzyme protease được sản xuất từ công ty Novozym, Đan Mạch: Chế phẩm Flavourzyme và Chế phẩm Neutrase

2.2 Hóa chất

- huyết thanh bò ABS

- Dung dịch TCA 3% - thuốc thử Folin

- K2HPO4 và KH2PO4 - HCl đậm đặc

- dung dịch Nyhidrin - dung dịch Pyridine 20%

- Na2CO3; NaOH; CuSO4

2.3 Thiết bị

Máy đo quang phổ

Nhiệt kế

2.4 Phương pháp xác định hoạt độ protease của các chế phẩm[7, 20]

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất protein (casein)

bởi enzym Sau đó diệt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng axit tricloaxetic Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, kết quả phân tích dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine

Hoạt độ protease được xác định ở những pH tối ưu của protease trong chế phẩm Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzym xúc tác chuyển hóa được một lượng casein tương đương với 1µmol tyrosine (0,181mg tyrosine) trong 1 phút ở 30o

C

 Chuẩn bị dung dịch đệm phosphate có pH 7:

● Dung dịch A là dung dịch mono orthophosphat 0,2M: hòa tan 36,14g NaH2PO4.2H2O bằng nước cất và định mức đến 1000ml

● Dung dịch B là dung dịch dinatri hydrophosphat 0,2M: hòa tan 71,7g

Na2HPO4.12H2O bằng nước cất và định mức tới 1000 ml

 Chuẩn bị dung dịch enzyme 1g/lít: Cân 0,1g chế phẩm Flavourzyme hoặc Neutrase hòa tan vào dung dịch đệm pH 7 và định mức tới 100 ml

Dựng đường chuẩn tyrosin:

Dung dịch gốc tyrosin 0,001M: cân 0,0181g tyrosine hòa tan trong dung dịch HCl 0,2N và định mức tới 100ml Các dung dịch khác được pha loãng từ dung dịch gốc được sử dụng để dựng đường chuẩn tyrosine

Hút 1ml mỗi dung dịch tyrosin nồng độ trên cho vào ống nghiệm, bổ sung 5ml dung dịch Na2CO3 0,5M và 1ml dung dịch Folin (pha loãng 4 lần) lắc đều giữ ở

nhiệt độ phòng trong 30 phút, sau đó đo màu trên máy ở bước sóng 750nm Với ống đối chứng thay 1ml tyrosine bằng 1ml nước cất

Dựng đường chuẩn tyrosine

Tyrosine 0,001M (ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,5 HCl 0,2N (ml) 4,9 4,8 4,6 4,4 4,2 4 3,5 Tyrosine (µmol/ml) 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,30

Kết quả đo OD hiển thị trong bảng sau:

Tyrosine

(µmol/ml) 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,30

OD 0,108 0,142 0,212 0,234 0,403 0,468 0,712

Hình 2.1 Đường chuẩn Tyrosine

Phương trình đường chuẩn tyrosin y = 2,1603x +0,0509; R2 = 0,9966

y là giá trị OD đo tại bước sóng λ= 750 nm

x là nồng độ tyrosine tính theo [µmol /ml]

 Thủy phân bằng chế phẩm enzyme

Ống thí nghiệm: cho 2ml dung dịch casein vào mỗi ống nghiệm đặt vào bể

ổn nhiệt 50oC trong 10 phút Sau đó, bổ sung 0,5ml dung dịch Neutrase 1g/l (hoặc Flavourzyme 1g/l) vào mỗi ống nghiệm và giữ ở 50oC trong 10 phút Cuối cùng dừng phản ứng bằng cách cho 4,5ml dung dịch axit tricloaxetic 5% lắc đều giữ ở 50oC trong 30phút Ly tâm hỗn hợp phản ứng với tốc độ 6000 v/phút trong 10 phút, định lượng thể tích dịch trong

nhận được và nồng độ protein hòa tan thông qua đường chuẩn tyrosin

Ống đối chứng: tiến hành như trên, nhưng thay thế 0,5ml dung dịch enzyme Neutrase (Flavourzyme) bằng dung dịch enzym đã vô hoạt

Thiết lập công thức tính hoạt độ enzyme (HđP):

HđP = (đv/g)

Trong đó:

X: nồng độ tương ứng giá trị OD theo đường chuẩn tyrosin [µmol /ml];

f: hệ số pha loãng dịch thủy phân;

7: thể tích dịch phản ứng trong ống nghiệm [V casein + V e + V TCA ] (ml); 0,5: thể tích dịch enzym tham gia phản ứng (ml);

1000: hệ số quy đổi thể tích ra 1 gam chế phẩm enzyme;

10: thời gian thủy phân (phút);

Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hơi nước có trong mẫu cho đến khi nước bay

hơi hết ( sấy đến lượng không đổi)

Cách tiến hành:

Hộp nhôm được sấy khô ở 1050C trong 4 giờ và cân (chính xác đến 0,0001g) (M) Cân khoảng 3g Bã đậu nành cho vào hộp nhôm và cân (M1) Đặt hộp nhôm vào tủ sấy ở nhiệt độ 55-600C trong 2 giờ Sau 2 giờ nâng nhiệt lên 105oC sấy trong

vòng 2 giờ Sau đó lấy hộp nhôm ra làm nguội trong bình hút ẩm và cân Tiếp tục sấy hộp khoảng 30 phút rồi lại làm nguội và cân lại Quá trình sấy sẽ kết thúc khi

Tính kết quả:

Độ ẩm của mẫu (W) được tính theo công thức:

W (%) = x 100

Trong đó:

M1: Khối lượng hộp nhôm và mẫu trước khi sấy (g);

M2: Khối lượng hộp nhôm và mẫu sau khi sấy (g);

M: Khối lượng hộp nhôm ban đầu (g)

Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng màu giữa protein với thuốc

thử Folin Phương pháp này sử dụng kết hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên gốc tyrosine, tryptophane, hystidine để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm [20]

Chuẩn bị hóa chất:

Dung dịch A: cân 2,8598 g NaOH +14,3084 g Na2CO3 hòa tan trong 500ml nước cất

Dung dịch B: cân 1,4232 g CuSO4.5H2O trong 100 ml

Dung dịch C: cân 2,853 Natritatrate.2(H2O) trong 100ml nước cất

Dung dịch Lowry (tỷ lệ thể tích các dung dịch A: B: C = 100: 1: 1): Lấy 40

ml dung dịch A + 0,4ml dung dịch B + 0,4 ml dung dịch C

Thuốc thử Folin: từ thuốc thử folin 2N pha loãng 2 lần ta được dung dịch thuốc thử folin 1N

Dung dịch chuẩn BSA 100mg /l: cân 0,01 g BSA hòa tan bằng nước cất và định mức đến 100ml Các dung dịch khác được pha loãng từ dung dịch gốc được sử dụng để dựng đường chuẩn albumin Pha loãng theo bảng

Xây dựng đường chuẩn albumin:

Cho 1ml dung dịch albumin vào mỗi ống nghiệm và bổ sung 1,4 ml dung dịch Lowry và lắc đều bằng máy vortex, để mẫu trong bóng tối 20 phút Sau đó, bổ sung 0,2 ml thuốc thử Folin 1N và trộn đều mẫu bằng máy vortex và để trong bóng tối 30 phút Cuối cùng đo hấp thụ quang ở bước sóng 750nm Kết quả đo được:

Đường chuẩn albumin lập được:

Hình 2.2 Đường chuẩn albumin

Phương trình albumin: y= 0,0044x + 0,0713

Trong đó: x là nồng độ protein (albumin, mg/l)

y: là giá trị OD đo được

Đánh giá lượng protein thu được trong mẫu sau thủy phân:

P = X * f* V *10-3

Trong đó:

P: lượng protein có trong mẫu (mg);

X: Nồng độ protein hòa tan tương ứng giá trị OD theo đường chuẩn BSA [mg/ml];

f: hệ số pha loãng;

V: Thể tích dịch thu được sau ly tâm (ml)

Xác định nồng độ protein trong dịch trong sau thủy phân:

Tiến hành các bước như ở phần xây dựng đường chuẩn, nhưng thay 1 ml dịch albumin bằng 1ml dịch trong sau thủy phân của mẫu thí nghiệm

2.7 Phương pháp xác định axit amin trong dịch sau thủy phân bằng

Ninhydrin[23]

Nguyên tắc: Bản chất của phương pháp là dùng Ninhydrin tác dụng với các α axit

amin nói chung và tạo phức chất màu tím rồi đem so màu trực tiếp và có thêm Pyridine làm chất ổn định

Dung dịch chuẩn axit amin: Pha dung dịch glutamic 1mg/ml Các dung dịch khác được pha loãng từ dung dịch gốc được sử dụng để dựng đường chuẩn glutamic Pha loãng theo bảng

Axit glutamic 1mg/ml (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Nồng độ glutamic (mg/ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Xây dựng đường chuẩn axit amin

+ Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,1 ml dịch glutamic với các nồng độ khác nhau vào các ống nghiệm, thêm vào mỗi ống nghiệm 1ml Ninhydrin 2% và

1ml Pyridine 20% Ngâm các ống nghiệm vào các cốc có nhiệt độ 70-75oC trong 7-10 phút Sau đó lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng Sau 30 phút đo màu dung dịch bằng máy đo quang điện ở bước sóng 570 nm với cuvet 1cm + Mẫu đối chứng: cách tiến hành như mẫu thí nghiệm, nhưng thay thế 0,1 ml dịch glutamic bằng 0,1 ml nước cất Từ kết quả thu được dựng đường thẳng biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ dung dịch với giá trị OD thu được

+ Kết quả dựng đường chuẩn:

Trong đó: Y: giá trị OD của mẫu

X: nồng độ axit amin tính theo [mg/ml]

Đánh giá lượng axit amin thu nhận được trong dịch trong sau thủy phân:

TNaa= X * f *V (mg)

Trong đó:

TNaa: lượng axit amin thu nhận được khi thủy phân (mg)

X: Nồng độ tương ứng giá trị OD theo đường chuẩn a/a [mg/ml] f: hệ số pha loãng

V: Thể tích dịch thu được sau ly tâm (ml)

Cách tiến hành xác định lượng axit amin trong các mẫu thí nghiệm:

Tiến hành các bước như ở phần lập đường chuẩn, nhưng thay 0,1 ml dịch glutamic bằng 0,1ml dịch trong sau thủy phân

Nguyên tắc: DPPH là một chất có màu tím, không tan trong nước, tan nhiều trong

dung môi hữu cơ, không phân hủy, không phản ứng với oxy, có độ hấp thụ cực đại tại 517nm

CTHH: C18H22N5O6

M= 394,32

Các chất có khả năng kháng oxy hoá sẽ trung hoà gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịnh phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt [9]

Phương trình phản ứng :

Cách tiến hành:

Pha dung dịch DPPH

Dung dịch thử DPPH được pha trong dung môi Methanol 99% có nồng độ 62,5µM

- Cân chính xác 0.0025g bột DPPH vào cốc đong thể tích 100ml

- Thêm vào 100ml MeOH 99% vào cốc hòa tan bằng đữa thủy tinh

Chú ý: Sau khi pha xong cần cho vào bình thủy tinh có nắp đậy tối màu do DPPH

được pha trong MeOH nên dễ bay hơi, có màu tím nên dễ bị mất màu khi gặp ánh sáng

Dịch cần xác định hoạt tính chống oxy hóa được sấy tới khối lượng không đổi

Abs: Độ hấp thụ của mẫu

Sử dụng hàm TREND trong EXCEL để xác định giá trị IC50 dựa trên các giá trị

đã xác định hàm lượng chất khô thể tích

100 µl, 200 µl, 300 µl

2.9 Sơ đồ nghiên cứu thủy phân Bã đậu nành bằng các chế phẩm protease

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình thu hồi protein sử dụng enzyme

Bã đậu nành ướt/khô

Phối trộn BD và nước (m/w) Điều chỉnh pH

Thủy phân bằng các chế phẩm enzyme

Neutrase và Flavourzyme ở các chế độ

nghiên cứu

Bất hoạt enzyme ở 900C trong 5 – 10 phút Lọc, ly tâm

Dịch trong

Thể tích Định

lượng protein

Định lượng axit amin

Xác định hoạt tính chống oxy hóa

Bã đậu ngâm với NaOH 2N

Các thông số công nghệ nghiên cứu:

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ phối trộn BĐ ướt và nước (w/v): 1:2; 1:4;

1:6, 1:8, 1:10

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ khuấy tới quá trình thủy phân BĐ ướt:

tĩnh, khuấy liên tục, khuấy gián đoạn

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzym: 10, 20, 30, 40 (U/g BĐ)

- Nghiên cứu kết hợp 2 loại enzym Neutrase và Flavourzyme trong thủy phân

bã đậu ướt

- Khảo sát tỷ lệ phối trộn BĐ khô và nước so sánh với BĐ ướt

Các chỉ tiêu đánh giá:

- Lượng axit amin trong dịch thủy phân (g/100g BĐ)

- Hiệu suất thu hồi protein trong bã đậu (g/100g BĐ)

- Hiệu suất thủy phân protein trong bã đậu (%)

- Hoạt tính chống oxy hóa ( giá trị IC50)

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố tới thủy phân protein trong Bã đậu

nành bằng các chế phẩm enzyme

Mẫu thí nghiệm: cân vào mỗi ống nghiệm 30g Bã đậu nành ướt, sau đó bổ sung nước cất để đạt tỷ lệ từ 1:2; 1:4; 1:6, 1:8, 1:10 và điều chỉnh tới pH 7 Sau đó cho vào mỗi ống 2ml dịch enzyme và để vào bể ổn nhiệt 50oC, thủy phân trong vòng 6h Kết thúc thủy phân bằng cách đun sôi cách thủy ở nhiệt độ 90-95oC trong vòng 5-10 phút để vô hoạt enzyme Cuối cùng lọc và ly tâm mẫu, thu dịch trong và

xác định hoạt tính chống oxy hóa, lượng protein, lượng axit amin

Mẫu đối chứng không có tác dụng của enzyme: mẫu đối chứng được thực hiện như trên, nhưng thay thế 2 ml dịch enzyme bằng 2 ml dịch enzyme đã được vô hoạt

Dịch trong nhận được sau ly tâm được đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 750nm, từ đó ta tính được lượng protein hòa tan trong mẫu thí nghiệm (PTN) và trong mẫu đối chứng không có tác dụng của enzyme (PĐC) Lượng protein thu nhận được do thủy phân sẽ là hiệu số của chúng:

Xác định lƣợng protein trong BĐ đƣa vào thủy phân (P ht )

Cân 30g bã đậu cho vào ống fancol thể tích 45ml Sau đó thêm vào trong ống

300 ml NaOH 2N ngâm qua đêm ở nhiệt độ phòng Sau đó, ta giữ ở bình ổn nhiệt ở

800C trong vòng 2-3 giờ, tiếp tục làm nguội xuống nhiệt độ phòng rồi lọc và ly tâm với tốc độ 6000v/phút trong khoảng 20 phút thu dịch Định lượng thể tích dịch nhận được và nồng độ protein trong dịch chiết, từ đó xác định được lượng protein trong

Bã đậu nành đưa vào thủy phân

Công thức tính hiệu suất thủy phân protein trong BĐ

Htp= x 100%

Trong đó: Htp: Hiệu suất thủy phân, %

PTP: lượng protein thu nhận được do thủy phân (mg);

Pht: lượng protein trong Bã đậu nành trước khi thủy phân (mg);

Xác định lƣợng protein tự chiết (P tc )

Cân 30g bã đậu cho vào bình tam giác thể tích 500ml Sau đó thêm vào thể tích nước và điều chỉnh pH tương ứng với mẫu trong khảo sát và tiến hành thủy phân cùng kiện (thời gian, nhiệt độ) tương ứng với mẫu thí nghiệm Kết thúc quá