Nghiên cứu điều kiện khử protein phế liệu tôm bằng phương pháp enzyme và vi sinh vật

Chính vì vậy mà hiện nay chitin và các dẫn xuất của nó được ứng dụng nhiều trong y học, dược phẩm, công nghệ thực phẩm, nông nghiệp, trong xử lý môi trường… Việc sản xuất chitin và chito

Trang 1

Nguyễn Thị Huyền Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG

ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu điều kiện khử protein phế liệu tôm bằng

phương pháp enzyme và vi sinh vật”

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THANH HÀ

Hà Nội - Năm 2011

Trang 2

MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG 5

DANH MỤC HÌNH 8

MỞ ĐẦU 10

PHẦN I TỔNG QUAN 12

I TỔNG QUAN VỀ CHITIN 12

1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin trong tự nhiên 12

1.2 Thành phần hóa học của vỏ tôm 13

1.3 Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý của chitin 14

1.3.1 Cấu trúc hóa học của chitin [5, 9, 16] 14

1.3.2 Tính chất của chitin [6, 11, 21] 16

1.4 Các phương pháp thu nhận chitin 16

1.4.1 Phương pháp hóa học 17

1.4.2 Phương pháp sinh học 19

1.4.3 Phương pháp hóa học kết hợp sinh học 23

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của chitin – chitosan trên thế giới và ở Việt Nam 25

1.5.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan trên thế giới 25

1.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan ở Việt Nam 25

1.5.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitin – chitosan vào thực tế 26

II CHẾ PHẨM ENZYME PROTEAZA VÀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 29

2.1 Nhóm enzyme proteaza [4] 29

2.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis 31

2.3.1 Đặc điểm hình thái của B subtilis [6] 31

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của B subtilis 31

2.3.3 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để loại protein phế liệu tôm 33

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

I VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 35

1.1 Đối tượng nghiên cứu 35

1.2 Môi trường sử dụng cho nghiên cứu 35

1.3 Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu 35

1.3.1 Các thiết bị chính dùng trong nghiên cứu 35

1.3.2 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 36

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Quá trình khử protein 37

2.2 Quá trình khử khoáng 38

Trang 3

2.3 Công thức thực nghiệm 38

III CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 38

3.1 Phương pháp vi sinh 38

3.1.1 Hoạt hoá, cấy truyền và giữ giống 38

3.1.2 Xác định số lượng sinh khối tạo thành 39

3.1.3 Phương pháp quan sát hình thái tế bào (Phương pháp nhuộm Gram) 39

3.2 Phương pháp hoá sinh 39

3.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Biuret 39

3.2.2 Phương pháp tách chiết protein bằng NaOH 40

3.2.3 Phương pháp phân tích thành phần rỉ đường 40

3.2.4 Xác định pH của dịch nuôi cấy 42

3.2.5 Xác định hàm ẩm của nguyên liệu 42

3.2.6 Xác định hàm lượng tro 42

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

I XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC BAN ĐẦU CỦA PLT 43

II TUYỂN CHỌN CHỦNG SINH TỔNG HỢP PROTEIN CAO 43

2.1 Định tính bằng phương pháp đo đường kính vòng thủy phân 43

2.2 Định lượng bằng phương pháp đo hoạt lực proteaza tạo thành theo phương pháp Anson cải tiến 44

III NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ ĐỊNH TÊN CHỦNG DT2 45

3.1 Đặc điểm hình thái chủng DT2 45

3.2 Định tên vi sinh vật 46

IV KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ PROTEIN VÀ KHỬ KHOÁNG TRONG PLT CỦA CHỦNG DT2 46

4.1 Động học sinh trưởng của chủng DT2 46

4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH dịch lên men tới khả năng khử protein và khử khoáng trong phế liệu tôm của chủng DT2 47

4.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường tới khả năng khử protein và khử khoáng trong phế liệu tôm của chủng DT2 49

4.4 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới khả năng khử protein và khử khoáng trong phế liệu tôm của chủng DT2 50

4.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men tới khả năng khử protein và khử khoáng trong phế liệu tôm của chủng DT2 51

V KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ PROTEIN TRONG PLT CỦA ENZYME NEUTRAZA 52

5.1 Lựa chọn các yếu tố và miền khảo sát 52

Trang 4

5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình khử protein của enzyme neutraza 53

5.3 Ảnh hưởng của pH dịch thủy phân tới quá trình khử protein của enzyme neutraza 54

5.4 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein của enzyme Neutraza 55

5.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme tới quá trình khử protein của enzyme neutraza 56

5.6 Kết quả khi kết hợp điều kiện khuấy liên tục trong quá trình thủy phân 58

VI NGHIÊN CỨU KẾT HỢP ENZYME NEUTRAZA VÀ VI KHUẨN B SUBTILLIS ĐỂ KHỬ PROTEIN PLT 59

6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới hiệu quả khử protein và khử khoáng của DT2 59

6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men tới hiệu quả khử protein và khử khoáng của DT2 61

6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới hiệu quả khử protein và khử khoáng của DT2 62

6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường tới hiệu quả khử protein và khử khoáng của DT2 64

VII QUÁ TRÌNH LOẠI KHOÁNG SỬ DỤNG AXIT LACTIC 65

VIII ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THU CHITIN 66

8.1 Quy trình thu chitin sử dụng lên men của vi khuẩn B Subtillis kết hợp phương pháp hóa học 67

8.2 Quy trình thu chitin sử dụng enzyme neutraza kết hợp phương pháp hóa học 67

8.3 Quy trình thu chitin kết hợp enzyme neutraza và lên men của vi khuẩn B Subtillis 68

8.4 So sánh các quy trình thu nhận chitin 68

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 71

I KẾT LUẬN 71

II MỘT SỐ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT 71

Trang 5

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn khoa học của tôi Các kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các số liệu, tính toán được

là hoàn toàn chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào

Trang 6

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Hàm lượng chitin trong phế liệu vỏ 12

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của phế liệu tôm 13

Bảng 1.3: Tính chất của chitin thu được 33

Bảng 2.1: Thành phần rỉ đường 40

Bảng 3.1: Thành phần hóa học của nguyên liệu……… 42

Bảng 3.2: Đường kính vòng thủy phân 43

Bảng 3.3 Hoạt độ proteaza của 3 chủng nghiên cứu 44

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của pH tới hiệu quả khử protein và khử khoáng 47

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường tới hiệu quả khử protein và khử khoáng 48

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới hiệu suất khử protein và khử khoáng 49

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của thời gian lên men tới hiệu suất khử protein và khử khoáng 50

Bảng 3.8: Thành phần vỏ tôm sau khi lên men bởi DT2 51

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới DP (%) và hàm lượng protein còn lại (%) 52

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH dịch thủy phân tới quá trình khử protein của enzyme neutraza 54

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein của enzyme Neutraza 55

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme tới quá trình khử protein của enzyme Neutraza 56

Bảng 3.13: Thành phần nguyên liệu sau khi thủy phân bằng enzyme neutraza 58

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của pH dịch lên men tới hiệu quả khử protein và khử khoáng của vi khuẩn B Subtillis DT2 lên PLT đã qua xử lí enzyme neutraza lần 1 60

Trang 7

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của thời gian lên men tới hiệu quả khử protein và khử khoáng của vi khuẩn B Subtillis DT2 lên PLT đã qua xử lí enzyme neutraza lần 1 61 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống tới hiệu quả khử protein và khử khoáng của vi khuẩn B Subtillis DT2 lên PLT đã qua xử lí enzyme neutraza lần 1 62 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của tỉ lệ rỉ đường tới hiệu quả khử protein và khử khoáng của vi khuẩn B Subtillis DT2 lên PLT đã qua xử lí enzyme neutraza lần 1 63 Bảng 3.18: Điều kiện khử khoáng 65 Bảng 3.19: So sánh các quy trình thu chitin 68

Trang 8

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Một số loại giáp xác chứa chitin 11

Hình 1.2: Sắp xếp các mạch trong cấu trúc của chitin 14

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Chitin 14

Hình 1.4: Quy trình sản xuất chitosan của Pháp 17

Hình 1.5: Sản xuất chitin kết hợp E neutrase, bromelin, papain và E nội tại trong PLT ……… 21

Hình 1.6: Quy trình thu chitin từ phế liệu vỏ giáp xác 23

Hình 1.7: Cơ chế thủy phân của proteaza 28

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu sản xuất chitin 36

Hình 3.1: Vòng phân giải protein của 9 chủng nghiên cứu 42

Hình 3.2: Đặc điểm hình thái của chủng DT2 Hình thái tế bào dưới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần (A), hình thái khuẩn lạc (B) 44

Hình 3.3: Cây phân loại của chủng DT2 Trình tự gene của các chủng dùng để so sánh được lấy ở ngân hàng gen có kí hiệu tương ứng như trên hình 45

Hình 3.4: Đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis DT2 46

Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH (A), nồng độ rỉ đường (B), tỷ lệ tiếp giống (C) và thời gian lên men (D) tới hiệu quả khử protein (cột màu trắng) và khoáng (cột màu ghi)của DT2 47

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả khử protein và hàm lượng protein còn lại trong PLT của enzyme neutraza 52

Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH tới hiệu quả khử protein và hàm lượng protein còn lại trong PLT của enzyme neutraza 53

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu quả khử protein và hàm lượng protein còn lại trong PLT của enzyme neutraza 54

Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme tới hiệu quả khử protein và hàm lượng protein còn lại trong PLT của enzyme neutraza 56

Trang 9

Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất khử protein (cột màu đen) và hiệu suất khử khoáng (côt màu ghi) trong điều kiện có thanh trùng (cột tô màu) và không thanh trùng (cột không tô) 59 Hình 3.11 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu suất khử protein (cột màu đen) và hiệu suất khử khoáng (côt màu ghi) trong điều kiện có thanh trùng (cột tô màu) và không thanh trùng (cột không tô) 60 Hình 3.12 Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống đến hiệu suất khử protein (cột màu đen)

và hiệu suất khử khoáng (cột màu ghi) trong điều kiện có thanh trùng (cột tô màu)

và không thanh trùng (cột không tô) 62 Hình 3.13 Ảnh hưởng của tỉ lệ rỉ đường đến hiệu suất khử protein (cột màu đen) và hiệu suất khử khoáng (côt màu ghi) trong điều kiện có thanh trùng (cột tô màu) và không thanh trùng (cột không tô) 63 Hình 3.14 Quy trình thu chitin đề xuất 65 Hình 3.15: Sản phẩm chitin thu được từ các quy trình: 1 – sử dụng enzyme neutraza; 2 – sử dụng B subtillis lên men; 3 – kết hợp enzyme neutraza và B Subtillis 68

Trang 10

ô nhiễm môi trường trầm trọng

Tuy nhiên, nguồn phế liệu này lại chứa một lượng lớn protein, chitin, sắc tố…, trong đó chitin là một polime sinh học rất có giá trị Chitin và các dẫn xuất của

nó có hoạt tính sinh học cao như kháng nấm, kháng khuẩn và có khả năng tự phân hủy sinh học Chính vì vậy mà hiện nay chitin và các dẫn xuất của nó được ứng dụng nhiều trong y học, dược phẩm, công nghệ thực phẩm, nông nghiệp, trong xử lý môi trường…

Việc sản xuất chitin và chitosan hiện nay có ba phương pháp chính là phương pháp hóa học, phương pháp sinh học và phương pháp hóa học kết hợp sinh học Phương pháp hóa học chủ yếu sử dụng NaOH để loại protein và HCl để loại khoáng Phương pháp này có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn tuy nhiên chất lượng chitin không cao, không tận thu được các thành phần có giá trị như protein làm thức ăn gia súc, chất màu… Phương pháp sinh học chủ yếu sử dụng lên men của vi khuẩn có khả năng sinh proteaza trong quá trình loại protein và vi khuẩn lactic đồng thời loại protein và khoáng đạt hiệu quả khá cao Tuy phương pháp này cho chitin chất lượng cao, tận thu được các sản phẩm có giá trị nhưng có nhược điểm là thời gian kéo dài, tốn công sức lao động và không loại được protein hoàn toàn Do đó, hiện nay, việc nghiên cứu kết hợp phương pháp sinh học và hóa học đang rất được quan tâm Một hướng nghiên cứu mới hiện nay đó là sử dụng chế phẩm enzyme proteaza hoặc vi khuẩn có khả năng sinh proteaza để loại protein Phương pháp này đã mang lại một số kết quả rất khả quan: tận thu được dịch protein và các axit amin, giảm thiểu hóa chất sử dụng trong khâu xử lí protein,

Trang 11

chitin thu được có chất lượng cao… Tuy nhiên, phương pháp này chưa thực sự được ứng dụng rộng rãi vào thực tiễn

Nhằm góp phần nghiên cứu và phát triển phương pháp sản xuất chitin có chất lượng cao theo hướng sinh học, thân thiện môi trường chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu luận văn với tiêu đề: “Nghiên cứu điều kiện khử protein phế liệu tôm

bằng phương pháp enzyme và vi sinh vật” Nội dung chính của luận văn gồm:

• Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh protease cho quá trình loại protein phế liệu tôm

• Nghiên cứu tối ưu điều kiện loại protein bằng chủng lựa chọn đượcNghiên cứu khả năng khử protein trong phế liệu tôm của enzyme neutraza để thu chitin

• Nghiên cứu kết hợp enzyme neutraza và vi khuẩn lựa chọn được để thu

chitin

• Đề xuất một số quy trình thu nhận chitin dựa trên kết quả thu được và đánh giá một số chỉ tiêu của chitin thu được theo các qui trình đề xuất

Trang 12

PHẦN I TỔNG QUAN

I TỔNG QUAN VỀ CHITIN

1.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin trong tự nhiên

Chitin là một polisaccharide tồn tại trong tự nhiên với số lượng lớn đứng thứ hai sau xenlulose Chitin tồn tại trong cả thực vật và động vật

Trong động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong động vật bậc cao monome của chitin là thành phần chủ yếu trong mô da, nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết ở da

Hình 1.1: Một số loại giáp xác chứa chitin

Trong thực vật, chitin có trong thành tế bào nấm họ Zygenmyctes, sinh khối

nấm mốc, một số loại tảo…

Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, nang mực hàm lượng chitin khá cao dao động từ 3 – 41% so với trọng lượng khô (Bảng 1) Vì vậy, vỏ tôm, cua, nang mực là nguồn chính để sản xuất chitin

Trang 13

Bảng 1.1: Hàm lượng chitin trong phế liệu (vỏ) (Synowiecki et al., 2003)[38]

Nguồn chitin Hàm lượng chitin (%)

Cua

Collinectes sapidus Chinoecetes opilio

13.5 26.6 Tôm

Pandalus borealis Crangon crangon Penaeus monodon

17.0 17.8 40.4 Tôm hùm

1.2 Thành phần hóa học của vỏ tôm

Protein: thành phần protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở hai dạng: dạng tự do và dạng liên kết

Dạng tự do: dạng này tồn tại ở phần thịt tôm từ một số tôm bị biến đổi và vứt

đi lẫn vào phế liệu hoặc phần đầu và thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của tôm

Trang 14

Nếu công nhân vặt đầu không đúng kĩ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu này khó xử lý hơn

Dạng phức tạp: ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chitin, canxi cacbonat, với lipit tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo protein carotenoit…như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm

Chitin: tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các protein dưới dạng phức hợp chitin – protein, liên kết với các hợp chất khoáng và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng

Canxi: trong vỏ, đầu tôm, vỏ ghẹ…có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là muối CaCO3, hàm lượng Ca3(PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây khó khăn cho quá trình khử khoáng

Sắc tố: trong vỏ tôm thường có nhiêu loại sắc tố nhưng chủ yếu là astaxanthin Enzyme: theo tạp chí thủy sản (số 5/1993) hoạt độ enzyme proteaza của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/ gam tươi Các enzyme chủ yếu là enzyme của nội tạng trong đầu tôm và của vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu

Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần khác như: nước, lipit, photpho

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của phế liệu tôm (No et al., 1989)

Phế liệu protein chitin lipit tro canxi photpho

Đầu

1.3 Cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý của chitin

1.3.1 Cấu trúc hóa học của chitin [5, 9, 16]

Chitin có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X người ta đã chứng minh được rằng chitin tồn tại ở 3 dạng cấu hình: α, β, γ – chitin Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt

Trang 15

xích N – acetyl – β – D – glucosamin trong mạch Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu mũi tên chỉ nhóm – CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm – NHCOCH3 thì các cấu trúc α, β, γ – Chitin được mô tả như sau:

Hình 1.2: Sắp xếp các mạch trong cấu trúc của chitin

α – Chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn nên ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi của nó còn có liên kết hydro giữa các lớp liền kề nhau nên rất bền vững Đây là dạng phổ biến trong tự nhiên

β, γ – Chitin do mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β – Chitin) và hai song song một ngược chiều (γ – Chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro Dạng β – Chitin cũng có thể chuyển sang dạng α – Chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn

Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc, người

ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N – acetyl – β – D – glucosamin liên kết với nhau bởi liên kết β – 1 – 4 glucozit

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Chitin

Trang 16

Công thức phân tử của chitin (C8H13O5N)n với n thay đổi tùy thuộc từng loại nguyên liệu Chẳng hạn ở tôm he: n = 400 – 500, ở tôm hùm: n = 700 – 800 và ở cua: n = 500 – 600

Chitin khó hòa tan trong thuốc thử Schweizei Sapranora Điều này có thể do nhóm acetamit (-NHCOCH3) ngăn cản sự tạo thành các phức chất cần thiết

Khi đun nóng trong dung dịch HCl đậm đặc thì chitin sẽ bị phân hủy hoàn toàn thành 88,5% D - Glucosamin và 11,5% axit acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xẩy

ra ở mối nối Glucozit, sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3)

(C32H54N4O21)x + 2H2O → (C28H50N4O19)x + 2(CH3-COOH)x

Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan

Chitin + nNaOH (đậm đặc) → Chitosan + nCH3COONa

Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng: λ = 884÷890 nm

Phản ứng este hóa của chitin: chitin có tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm Chitin nitrat Chitin tác dụng với anhydrit sunfuric trong pyridin, dioxan và N,N – dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat

1.4 Các phương pháp thu nhận chitin

Do chitin trong vỏ tôm rất hiếm tồn tại ở trạng thái tự do và luôn luôn liên kết cộng hóa trị với các protein, các chất khoáng và các hợp chất hữu cơ khác, quá trình thu nhận chitin từ vỏ tôm là quá trình chế biến phức tạp để tách chitin ra khỏi các

Trang 17

chất khác Nói chung quá trình chế biến vỏ tôm thu nhận chitin bao gồm ba bước: khử khoáng, khử protein và khử màu (Synowiecki and Al-Khateeb, 2003) [38] Có hai phương pháp chính để thu chitin hiện nay là phương pháp hóa học và phương pháp sinh học

1.4.1 Phương pháp hóa học

Trong phương pháp này người ta dùng axit và kiềm để loại protein và loại khoáng trong phế liệu tôm, cụ thể như sau:

Quá trình khử protein:

Quá trình khử protein được thực hiện bằng việc sử dụng NaOH 4% ở nhiệt độ

65oC trong 2 giờ với tỷ lệ phế liệu/ dung dịch NaOH là 1/10 Quá trình khử protein thích hợp cũng có thể được thực hiện bằng việc sử dụng dung dịch KOH

Quá trình khử khoáng:

Trong vỏ tôm, thành phần khoáng chủ yếu là muối CaCO3, MgCO3 và rất ít

Ca3(PO4)2 Vì thế người ta hay dùng các loại axit như HCl, H2SO4 để khử khoáng Khi khử khoáng nếu dùng HCl thì cho hiệu quả cao hơn H2SO4, mặt khác khi sử dụng H2SO4 sẽ tạo muối khó tan nên ít được sử dụng Phản ứng của HCl khi khử khoáng như sau:

Trang 18

của sản phẩm Tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch axit HCl cũng ảnh hưởng tới hiệu quả khử khoáng

Sau khi khử khoáng tiến hành rửa trung tính Công đoạn này có tác dụng rửa trôi hết các muối, axit dư tan trong nước Sản phẩm thu được ở dạng chitin thô

Hình 1.4: Quy trình sản xuất chitosan của Pháp [21]

Hình 1.4 là quy trình thu nhận chitin theo phương pháp hóa học của Pháp từ vỏ tôm khô

Nguyên liệu (phế liệu tôm) rửa sạch, hấp chín, phơi khô, sau đó đem đi xay nhỏ Khử protein bằng NaOH 3,5%, với tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ 65oC, sau thời

Trang 19

gian 2h vớt ra rửa trung tính Tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2h Tiến hành tẩy các chất màu hữu cơ bằng acetone với tỷ lệ w/v = 1/5, ở nhiệt độ phòng sau 30 phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằng nước Javen (NaOCl + NaCl) 0,135%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ phòng Sau

6 phút lấy ra rửa trung tính, thu được chitin sạch đẹp Sau đó tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt độ 85oC sau thời gian 4h đem rửa trung tính thu được chitosan

Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp, sạch do có hai bước khử sắc tố Tuy nhiên, NaOCl là một chất oxi hóa mạnh, ảnh hưởng đến mạch polyme, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt Mặt khác, acetone đắt tiền, lại tổn thất nhiều nên giá thành sản phẩm cao Chưa kể các yếu tố trong an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ở nước ta hiện nay

Hiệu quả của quá trình khử protein phụ thuộc vào nhiệt độ, nồng độ và tỷ lệ của dung dịch với khối lượng của vỏ giáp xác Nồng độ của NaOH thường được sử dụng trong khoảng 1 – 10% và trong nhiệt độ 50 – 100oC Quá trình khử protein thích hợp cũng có thể đạt được bằng việc xử lý với dung dịch KOH

Quá trình khử khoáng cũng diễn ra với thời gian dài, nồng độ axit cao, nhiệt độ cao

Như vậy phương pháp hóa học có nhược điểm như gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến chất lượng chitin, không tận thu được các thành phần có giá trị khác như: chất màu, protein làm thức ăn cho gia súc… và như thế không giảm được giá thành sản phẩm, không nâng cao được hiệu quả cho việc sản xuất chitin

1.4.2 Phương pháp sinh học

Do nhược điểm của phương pháp hóa học, cho đến nay có khá nhiều các nghiên cứu đi theo hướng ứng dụng sinh học để xử lí phế liệu tôm Trong phương

pháp sinh học người ta sử dụng vi khuẩn sinh protease (Jo et al., 2008 [23]; Oh et

al., 2000 [44]; Rao et al., 2000 [32]; Sini et al., 2007 [40]; Waldeck et al., 2006

Trang 20

[28]; Wang et al., 1998 [36]) hay chế phẩm protease (Chakrabarti, 2002 [35]; De Holanda et al., 2006 [24]; Gildberg et al., 2001 [20]; Mizani et al., 2005 [31]; Synowiecki et al., 2000 [27]) để loại protein, vi khuẩn lactic (Jung et al., 2006 [43]; Jung et al., 2005 [41]; Pacheco et al., 2009 [33]) hay Bacillus (Sini, Santhosh et al.,

2007 [40]; Wang and Chio, 1998 [36]) để loại khoáng

Sử dụng vi khuẩn sinh protease hay chế phẩm protease để loại bỏ protein

ra khỏi phần vỏ của phế liệu tôm

Theo nghiên cứu của Jo, chủng Serratia marcescans FS-3 có thể khử tới 84%

protein sau 7 ngày lên men Trong nghiên cứu khác của Oh (Oh, Shih et al., 2000

[44]), chủng Pseudomonas aeruginosa K-187 có thể loại được 78% protein cũng sau 7 ngày lên men Nghiên cứu của Sini chỉ ra rằng chủng Bacillus subtilis không

những có thể loại được 84% protein mà còn loại được tới 72% khoáng sau 12 ngày lên men Phương pháp dùng vi sinh vật có ưu điểm là rẻ tiền do chỉ cần thêm nguồn cacbon là glucose, dextrose hay rỉ đường nhưng lại có nhược điểm là thời gian thường kéo dài

Một phương pháp sinh học khác loại protein cũng khá hiệu quả là phương pháp dùng chế phẩm protease Các chế phẩm enzym sử dụng khá đa dạng như trypsin, papain, pepsin (Chakrabarti, 2002) [35], chymotrysin, pancreatin (De Holanda and Netto, 2006) [24] nhưng có hiệu quả và hay sử dụng hơn cả là Alcalase (De Holanda and Netto, 2006 [24];Gildberg and Stenberg, 2001 [20];Mizani, Aminlari et al., 2005 [31];Synowiecki and Al-Khateeb, 2000 [27]) Phương pháp enzym có ưu điểm là thời gian ngắn (trong vài giờ) và có thể thu hồi protein và asthaxatin có chất lượng cao làm thức ăn gia súc Tuy nhiên phương pháp enzym có giá thành cao hơn so với phương pháp vi sinh

Nhược điểm chính của phương pháp sinh học là loại protein không triệt để Lượng protein dư còn lại trong vỏ tôm khi xử lí bằng phương pháp enzym thường

>3% (De Holanda and Netto, 2006 [24]) trong khi bằng phương pháp hóa học có thể giảm đến <1%

Trang 21

Sử dụng vi khuẩn lactic để loại khoáng ra khỏi phần vỏ của phế liệu tôm

Việc sử dụng vi khuẩn lactic để loại khoáng ra khỏi phế liệu tôm là một xu hướng mà hiện nay nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Trong quá trình lên men lactic,

ở giai đoạn đầu vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác hoạt động, số lượng vi khuẩn lactic chiếm đa số Đồng thời với số lượng vượt trội vi khuẩn lactic sẽ hấp thu cơ chất, sinh trưởng phát triển và sinh ra axit lactic Axit lactic sẽ làm hạ pH và ức chế hoạt động của vi khuẩn gây thối rữa Thành phần canxi cacbonat trong vỏ tôm sẽ tác dụng với axit lactic để tạo ra lactat canxi ở dạng không hòa tan Phản ứng này tương

tự như quá trình khử khoáng bởi HCl trong phương pháp hóa học Sơ đồ của phản ứng như sau:

CaCO3 + 2CH3CHOHCOOH → (CH3CHOHCOO)2Ca + H2O + CO2

Đồng thời trong quá trình này protein sẽ bị hóa lỏng do hệ enzyme proteolytic

có sẵn trong nguyên liệu và do vi khuẩn lactic gây ra

H2N-R1CH-CO-NH-R1CH- → H2N-R1CH-COOH- + H2N-CHR1

-CO-NH-CHR1

Hall và De Silva (1994) [23] đã đề xuất phương pháp khử khoáng đơn giản bằng việc lên men lactic như một phương pháp bảo quản phế liệu Phương pháp này

là dạng ủ chua ban đầu được phát triển cho bảo quản phế liệu tôm panda trước quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt đới Ủ chua là một quá trình đơn giản của việc bảo quản nguyên liệu tránh vi sinh vật gây thối và đã được ứng dụng cho bảo quản cá trong nhiều năm (Hall và De Silva, 1994) So với loại protein, phương pháp sinh học loại khoáng dùng vi khuẩn lactic đạt hiệu quả khá cao, thường loại >90% khoáng (Jung, Jo et al., 2006) [43] thậm chí có thể loại được đến 99.7% khoáng chỉ

trong thời gian 2-3 ngày (Xu et al., 2008) [45] So với loại khoáng bằng phương

pháp hóa học, phương pháp lên men lactic ngoài việc cho chitin có chất lượng cao, thân thiện môi trường còn cho phép tận thu dịch lên men dùng làm thức ăn cho gia súc có giá trị Tuy vậy nhược điểm của phương pháp là thời gian lên men kéo dài

Trang 22

Trong đa số các nghiên cứu, quá trình sinh học thường chỉ áp dụng cho một trong hai quá trình khử protein hay khử khoáng Tuy vậy một số các tác giả đã tìm cách dùng phương pháp sinh học hoàn toàn để lên men đồng thời vi khuẩn sinh protease và vi khuẩn tạo acid lactic để loại protein và khoáng đồng thời và đã cho

hiệu quả khá cao (Jung et al., 2007 [42];Xu, Gallert et al., 2008 [45]) Tuy phương

pháp này cho chitin chất lượng cao lại có nhược điểm là thời gian kéo dài và tốn công sức lao động và không loại được protein hoàn toàn Để khắc phục nhược điểm này, các nghiên cứu kết hợp phương pháp hóa học với sinh học đã được thực hiện

Hình 1.5: Sản xuất chitin kết hợp E neutrase, bromelin,

papain và E nội tại trong PLT [18]

Năm 2010, Trần Cảnh Đình và cộng sự (Viện Nghiên cứu Hải sản) [18] đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế độ thủy phân phế liệu đầu tôm bằng enzyme” sử dụng enzyme neutraza (một loại enzyme proteaza có sẵn trên thị trường) Kết quả thu được cho thấy sử dụng chế phẩm neutraza thủy phân phế liệu tôm là rất hiệu quả trong quy trình công nghệ sản xuất dịch hương tôm dùng cho các sản phẩm mô phỏng giả tôm, mỳ tôm hay làm nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi

Trang 23

Điều kiện thủy phân thích hợp của chế phẩm neutraza đối với đầu tôm là ở nhiệt độ 55oC, trong thời gian 2h, tỷ lệ E/ PLT là 1,5ml/ 100ml, hiệu suất thủy phân đạt cao nhất là 49,88%

Khi kết hợp giữa enzyme neutraza và enzyme nội tại trong đầu tôm thì điều kiện thủy phân thích hợp là nhiệt độ 50oC, trong thời gian 2h và tỷ lệ E/ PLT là 1ml/100ml, tỷ lệ E/ PLT được giảm đi 0,5ml/ 100ml, hiệu suất đạt cao nhất là 51,7% Điều này có ý nghĩa về mặt kinh tế và phù hợp với việc sản xuất thức ăn chăn nuôi

Điều kiện thủy phân tối ưu của chế phẩm papain là nhiệt độ 55oC, thời gian 2,5h, E/ PLT là 0,3/ 100ml, hiệu suất đạt cao nhất là 44,8%

1.4.3 Phương pháp hóa học kết hợp sinh học

Việc sản xuất chitin theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học cũng thực hiện theo các bước: khử khoáng, khử protein và loại màu

Trang 24

Hình 1.6: Quy trình thu chitin từ phế liệu vỏ giáp xác

(Synowiecki and Al-Khateeb, 2000) [27]

Sự khử khoáng có thể đạt được từ 1 – 3 giờ bằng cách ngâm vỏ tôm với HCl loãng (1 – 8%) ở nhiệt độ phòng Tiếp đó, sử dụng enzyme alcalase được chiết từ

Bacillus licheniformis để khử protein Sự thủy phân protein thu được những amino

axit cần thiết (46%) và hàm lượng protein còn lại trong sản phẩm khoảng 2,74% Khác với xử lý kiềm, thủy phân bởi enzyme đảm bảo loại bỏ hoàn toàn protein, sản phẩm protein bị biến tính phụ thuộc vào việc lựa chọn enzyme sử dụng và điều kiện của quá trình Khi chitin được sử dụng để làm chitosan thì protein còn lại dễ dàng được loại bỏ bởi dung dịch kiềm được sử dụng trong các bước tiếp theo

Việc loại bỏ sắc tố còn lại của chitin có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng với aceton, chloroform, ethyl acetat hoặc dung dịch NaOCl, H2O2

Trang 25

1.5 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của chitin – chitosan trên thế giới và

ở Việt Nam

1.5.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan trên thế giới

Trước đây, người ta đã thử chiết tách chitin từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ đáp ứng nhu cầu sản xuất Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua Trong một thời gian, các chất phế thải này không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường Năm 1977 Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có giá trị sử dụng trong công nghiệp Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần chitin thu được

sẽ dùng như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp

Hiện nay đi đầu trong lĩnh vực này là Nhật và Mỹ đã sản xuất theo thứ tự là

600 tấn/năm và 400 tấn/ năm; chất chitosan với giá từ 200 – 300 USD/ kg Ngoài ra còn có các nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp cũng sản xuất sản phẩm này nhưng với số lượng thấp (khoảng 2 tấn/ năm)

1.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan ở Việt Nam

Việc nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất phục vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta Vào những năm 1978 đến 1980, trường ĐH Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitin – chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng

cụ thể trong sản xuất Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp

Trang 26

Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan như: Trường ĐH Nông Lâm - Thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm nghiên cứu polyme – Viện khoa học Việt Nam; Viện Hóa thuộc phân Viện Khoa học Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh; Trung tâm Công nghệ và Sinh học Thủy sản – Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2

Ở miền Bắc, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam đã kết hợp với xí nghiệp thủy sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ

Ở miền Nam, Trung tâm công nghệ và sinh học thủy sản phối hợp với một số

cơ quan khác: ĐH Y dược thành phố Hồ Chí Minh, phân Viện Khoa học Việt Nam, Viện Khoa học nông nghiệp miền nam, … đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin – chitosan trong lĩnh vực: nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm

1.5.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chitin – chitosan vào thực tế

Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt [11]

Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng nitơ; đồng thời hàm lượng các enzyme như amylaza, catalaza hay peroxidaza cũng tăng lên

Ngày nay, chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng

Những ứng dụng của chitin – chitosan và những dẫn xuất của chúng ngày càng phát triển Một số đã đưa vào ứng dụng như là: chỉ khâu tự huỷ, da nhân tạo [16], thấu kính chiết xuất, và một số ứng dụng khác còn đang nghiên cứu như: tác động kích thích miễn dịch, chống sự phát triển của khối u, đặc tính làm giảm cholesterol máu [5], trị bỏng nhiệt [19]

Trang 27

Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như ruột tấm vải và được bọc ốp lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi Da nhân tạo bị phân huỷ sinh học từ từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới Nó có tác dụng giảm đau, giúp cho các vết sẹo bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng Trường Đại học Dược Hà Nội, Đại học Y Hà Nội, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ Quốc gia cũng đã chế tạo thành công loại da nhân tạo này và bước đầu ứng dụng có hiệu quả

Chitin – chitosan và các oligome của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh

Những nghiên cứu gần đây hướng vào các oligome, N-acetyl-glucosamin và glucosamin, các chất này có một số tính chất của các polyme tương ứng nhưng lại

có ưu thế là tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ

Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng chitosan làm chất mang để

cố định enzyme và tế bào Enzyme cố định đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzyme trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích Enzyme cố định được sử dụng lâu dài, không cần thay đổi chất xúc tác Nhất là trong công nghệ làm sạch nước, làm trong nước hoa quả, sử dụng enzyme cố định rất thuận lợi và đạt hiệu quả cao Chitosan thoả mãn yêu cầu đối với một chất mang có phân tử lượng lớn, bền vững không tan và ổn định với các yếu tố hoá học

Do có cấu trúc tương tự như xenllulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn Trong sản xuất giấy, qua nghiên cứu người ta thấy nếu bổ sung 1% chitosan thì bộ bền của giấy tăng lên khi bị ướt hay tăng độ nét khi in

Chitosan kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm

Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da do tính chất của chitosan là có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –NH+4 Các nhóm này liên kết với các tế bào sừng hoá của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học đã

Trang 28

nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng chống nắng bằng cách ngăn các chất lọc tia cực tím với các nhóm –NH+4

Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng kết dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg do đó chitin được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm

Dịch keo chitosan (keo dương) còn được sử dụng để bảo quản chống mốc, chống sự phá huỷ của một số nấm men, vi sinh vật gram âm trên các loại hoa quả

Chitosan được sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm

Chitosan được sử dụng như một polyme cationit trong sản xuất agarose từ agar – agar có chất lượng kém

Chitin có tính tẩy màu mà không hấp thụ mùi và các thành phần khác nên nó được ứng dụng vào việc khử màu thức uống (đồ uống nước trái cây)

Do chitosan có tính chất diệt khuẩn nên nó được tạo thành màng mỏng để bao gói thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện khi chitosan tiếp xúc với thực phẩm sẽ:

+ Lấy đi từ các vi sinh vật này các ion quan trọng, ví dụ như Cu2+ Như vậy vi sinh vật sẽ bị chết do sự mất cân bằng liên quan đến các ion quan trọng (Muzzarelli, 1997)

+ Ngăn chặn, phá hoại chức năng màng tế bào

+ Gây ra sự rò rỉ các phần tử bên trong tế bào

+ Gây ra sự tổ hợp của polyelectrolyte với polymer mang tính axit trên bề mặt

tế bào vi khuẩn

Như vậy việc dùng chất chitosan bao bọc quanh bề mặt thực phẩm có thể kéo dài thời gian bảo quản, giảm sự hư hỏng do khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của

nó

Trang 29

II CHẾ PHẨM ENZYME PROTEAZA VÀ VI KHUẨN BACILLUS

SUBTILIS

2.1 Nhóm enzyme proteaza [4]

Nhóm enzyme proteaza (peptid – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid trong phân tử protein và polypeptid đến các sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều proteaza còn có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Hình 1.7: Cơ chế thủy phân của proteaza

Proteaza cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ

tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và vius) đến thực vật (đu đủ, dứa ) đến động vật (gan, dạ dày bê ) So với proteaza động vật và thực vật, proteaza vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Hệ proteaza vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng phân tử đồng nhất Cũng do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên proteaza vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi, cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng

Proteaza được phân chia làm hai loại : endopeptidase và exopeptidase

* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

Trang 30

* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:

+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

Trang 31

nó sẽ làm đứt gãy các liên kết peptit, phá hủy cấu trúc của các protein Neutraza được ứng dụng chủ yếu trong công nghệ thực phẩm

2.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis

2.3.1 Đặc điểm hình thái của B subtilis [6]

B subtilis là loài vi khuẩn thuộc giống Bacillus, họ Bacillaceae, bộ Bacillales,

lớp Baclli, ngành Firmicutes, giới Bacteria Vi khuẩn này có thể phân lập được dễ

dàng vì chúng tồn tại rất phong phú trong tự nhiên từ nhiều nguồn gốc khác nhau như: đất, nước, không khí, và các nguồn xác thực vật…

B subtilis có những đặc điểm điển hình đại diện cho các trực khuẩn Gram

dương, đặc biệt là quá trình hình thành nội bào tử, về khả năng di động bằng tiên mao, về phương thức phân chia tế bào và hình thái, cấu trúc tế bào

Đặc điểm hình thái của B subtilis là trực khuẩn hình que, có kích thước (0,7 –

0,8) x (2 – 3) µm Xung quanh tế bào có rất nhiều tiên mao tạo thành một nhóm giúp cho chúng chuyển động trong môi trường dễ dàng Bào tử của chúng có hình bầu dục, kích thước từ 0,9 x 0,6µm

Khuẩn lạc của B subtilis mọc trên môi trường thạch đặc có đặc điểm khô ráo,

màu trắng đục hoặc màu kem xám nhạt, bề mặt khuẩn lạc bong, trơn, mọc lan trên mặt thạch, có mép nhăn , lồi lõm

B subtilis là vi khuẩn không gây bệnh cho người, động thực vật và môi trường

sinh thái, là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên trong quá trình nuôi cấy phải đảm bảo cung cấp đầy đủ cho nhu cầu O2 Chúng sinh sản bằng phương thức nhân đôi tế bào,

từ một tế bào mẹ cho hai tế bào con và có khả năng tạo nội bào tử giúp chúng chống chịu được với những điều kiện sống khắc nghiệt nhất như: nhiệt độ cao, độ khô hạn,

pH quá cao hoặc quá thấp trong môi trường sống

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của B subtilis

A, Môi trường dinh dưỡng[6]

Nguồn cacbon

Trang 32

B subtilis là loài vi khuẩn có thể đồng hóa tốt các nguồn C hữu cơ hoặc vô cơ,

tuy nhiên với nguồn C hữu cơ thì chúng dễ dàng đồng hóa hơn Nó có thể sử dụng các loại đường monosaccarit như: glucoza, fructoza, các disaccarit như: maltoza, saccaroza, đường 5C như pentoza, các polysaccarit như tinh bột… Nhưng nguồn tốt nhất cho sự đồng hóa của chúng là đường glucoza

Nguồn N

N là cấu tử dinh dưỡng thứ hai sau C, là nguyên tố tham gia vào thành phần

cấu tạo tế bào của vi sinh vật nói chung và của vi khuẩn B.subtilis nói riêng N là

nguyên tố cấu tạo nên các axit amin cần thiết cho sự xây dựng các protein tạo nên tế bào Như vậy, nếu như trong môi trường dinh dưỡng cung cấp thiếu N thì chắc chắn

vi khuẩn không thể phát triển tốt được, nó có thể sử dụng cả nguông N dưới dạng

vô cơ và hữu cơ Nguồn N thường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn này là peptone, cao nấm men…

Lượng chất dinh dưỡng nếu cung cấp không hợp lý sẽ có tác dụng ngược gây

ức chế sự phát triển bởi nồng độ cơ chất sẽ cản trở quá trình đồng hóa và tốc độ trao đổi chất của chúng

Các nguyên tố khoáng

Trong quá trình phát triển của vi khuẩn chúng cũng cần được cung cấp các nguyên tố khoáng như P, S, Ca, K, Mg, Fe, Mn… các nguyên tố này có thể được cung cấp dưới dạng các muối để tạo ion khoáng chất trong môi trường, cũng có thể cung cấp các muối này dưới dạng trực tiếp với lượng cần thiết để chúng tham gia vào vai trò chuyển hóa các chất giúp cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn diễn ra thuận lợi

Vitamin

B subtilis hầu như không có khả năng tổng hợp ra các chất vitamin, song

chúng lại cần mặc dù với lượng rất nhỏ

Các vitamin này thường tồn tại trong các hợp chất dinh dưỡng như: cao nấm men, cao thịt, dịch chiết khoai tây Ngoài ra các chất kích thích sinh trưởng cũng có ảnh hưởng dương tính tới sự phát triển của vi sinh vật

Trang 33

B, Nhiệt độ

là 5 - 20oC Khoảng nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của B subtilis thường trong

khoảng 35 - 37oC Khi nhiệt độ vượt ra khỏi dải nhiệt độ chịu đựng của loài thì quá trình phát triển của chúng bị ức chế ngay, số lượng tế bào giảm, tốc độ tăng sinh

khối cũng giảm và tỉ lệ tế bào chết tăng lên Tuy nhiên, B subtilis trong điều kiện

không thuận lợi sẽ chuyển sang dạng bào tử để chống chịu và sống sót, thường là khi nhiệt độ tăng lên khoảng trên 80 - 100oC

C, pH

B subtilis có thể phát triển được trong môi trường pH từ 4,5 - 8,5 Tuy nhiên,

còn phụ thuộc vào đặc điểm chủng và đặc điểm của môi trường phân lập ra chủng Nếu điều kiện không thích hợp thì tế bào sẽ chuyển từ dạng tế bào dinh dưỡng sang dạng bào tử, gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển bình thường

D, Nguồn O 2

B subtilis là vi khuẩn sống hiếu khí bắt buộc nên thường được phân lập từ bề

mặt của các môi trường đất, nước, không khí… Do đó, trong qua trình phát triển, B

2.3.3 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để loại protein phế liệu tôm

Do vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh tổng hợp protease, đã có rất nhiều

nghiên cứu ứng dụng chúng để loại bỏ protein trong PLT Đề tài nghiên cứu: “

Nghiên cứu nuôi cấy trực tiếp vi khuẩn Bacillus subtilis để loại protein ra khỏi phần

vỏ của phế liệu tôm” của Đỗ Thị Bích Thủy – Trường Đại học Nông Lâm Đại học

Huế và Trần Thị Luyến – Trường Đại học Thủy Sản đã sử dụng chủng Bacillus

subtilis nuôi cấy với vỏ tôm trong điều kiện: 0,5% peptone; 0,15% cao thịt; 0,1%

cao nấm men; 0,5% NaCl; 5,5% bột sắn và 1,3% phế liệu tôm Sau 24h nuôi cấy, trộn với PLT theo tỉ lệ: 20ml canh trường + 20g phế liệu tôm + 160ml nước Kết quả phần trăm protein còn lại được so với ban đầu sau 24h nuôi cấy là 12,99% [3]

Trang 34

Nghiên cứu của Theruvathil K Sini và cộng sự (2007) [39] đã chỉ ra rằng

84% protein và 72% khoáng bị loại khỏi vỏ tôm sau quá trình lên men bởi Bacillus

subtilis Tính chất của chitin và chitosan thu được tương tự như trong sản phẩm

thương mại được làm từ những nguyên liệu giống như trong nghiên cứu

Bảng 1.3: Tính chất của chitin thu được [39]

Trang 35

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis DT2 được cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh

học và Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Enzyme Neutrase của hãng Novo: hoạt độ 400U/ml

PLT được thu nhận từ vùng biển Quảng Ninh Sau đó loại bỏ tạp chất, vận chuyển về phòng thí nghiệm

Rỉ đường của nhà máy đường Lam Sơn – Thanh Hóa

1.2 Môi trường sử dụng cho nghiên cứu

+ Môi trường 1: Môi trường LB để giữ giống vi khuẩn Bacillus subtilis : Cao

nấm men 0,5%, peptone 1%, Glucose 1%, NaCl 1%

+ Môi trường 2: Môi trường để nhân giống vi khuẩn Bacillus subtilis: Glucose

0,5%, cao nấm men 0,75%, dung dịch muối khoáng 5% (NaCl 0,5%, KH2PO4 0,5%, MgSO4.7H2O 0,5%, FeSO4.7H2O 0,01%)

+ Môi trường xác định hoạt tính proteaza bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (3): Sữa gầy: 1%, Agar: 2%, pH: 7

+ Môi trường lên men: Rỉ đường

1.3 Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu

1.3.1 Các thiết bị chính dùng trong nghiên cứu

• Bình ổn nhiệt (Baths – Trung Quốc)

• Máy li tâm (EBA 20 – Hettich Zentrifugen – Đức)

• Cân điện tử (Max = 600g ; d=0,01g Denver Instrumen – Đức)

• Máy khuấy từ (Velp Scientifica )

• Vortex (Stuart Biocote – Đức)

• Máy đo quang (Genesys 20 Thermo Spectronic – Mỹ)

• Máy xay (Philips)

Trang 36

• Máy đo pH (Hanna Instruments pH 211 Microprocessor)

• Nổi thanh trùng (Nga)

• Tủ nuôi tĩnh (Boxun – Trung Quốc)

• Máy đốt tro (Barntead 48000)

• Chiết quang kế

• Kính hiển vi

1.3.2 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Hóa chất chuẩn bị môi trường nuôi cấy

• Dung dịch màu folin

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học kết hợp hóa học sử

dụng enzyme proteaza neutraza có sẵn trên thị trường, chủng B subtillis có khả

Trang 37

năng sinh proteaza và kết hợp sử dụng enzyme neutraza và chủng B subtillis theo

quy trình công nghệ như sau:

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu sản xuất chitin

2.1 Quá trình khử protein

• Khử protein bằng enzyme neutraza

Tiến hành thí nghiệm để tìm ra điều kiện tối ưu cho quá trình khử protein dưới ảnh hưởng của các yếu tố:

- Nhiệt độ thủy phân: 45 – 55oC

Trang 38

Tiến hành thí nghiệm để tìm ra điều kiện tối ưu cho quá trình lên men khử

protein trong phế liệu tôm của B subtillis trong miền khảo sát như sau:

- pH dịch lên men: 5,5 – 8

- Tỉ lệ rỉ đường (w/w): 5 – 15%

- Tỉ lệ tiếp giống (v/w): 2,5 – 10%

- Thời gian lên men: 42h – 60h

• Kết hợp khử protein bằng enzyme neutraza và vi khuẩn B Subtillis

Tương tự như trên, chúng tôi cũng tiến hành thí nghiệm để tìm ra điều kiện tối

ưu cho quá trình khử protein trong phế liệu tôm khi kết hợp sử dụng cả enzyme

neutraza và vi khuẩn B Subtillis

2.2 Quá trình khử khoáng

Vi khuẩn B Subtillis ngoài việc loại protein còn có khả năng loại một phần

khoáng trong quá trình lên men khử protein Do đó, chúng tôi vừa nghiên cứu hiệu

suất khử protein và khử khoáng của vi khuẩn B Subtillis

Đồng thời sử dụng axit lactic để khử khoáng với nồng độ 75g/l, ở nhiệt độ phòng

2.3 Công thức thực nghiệm

Hiệu suất thủy phân (%) được xác định dựa trên công thức của Rao và cộng

sự (2000) như sau:

Hiệu suất thủy phân protein (%) = [(Po x O)-(Pr x R)] x 100/(Po x O)

Po, Pr: Hàm lượng protein (g/g) tương ứng của mẫu phế liệu trước và sau khi thủy phân bằng enzyme neutraza

O, R: Khối lượng (g) tương ứng của mẫu trước và sau khi thủy phân

III CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.1 Phương pháp vi sinh

3.1.1 Hoạt hoá, cấy truyền và giữ giống

Giống B subtilis DT2 được giữ trong ống thạch nghiêng trên môi trường 1

Trang 39

3.1.2 Xác định số lượng sinh khối tạo thành

Lượng sinh khối tạo thành có thể xác định được bằng cách đo mật độ quang

OD Mật độ canh trường vi khuẩn được thực hiện trong các dụng cụ cuvet dung tích

1 ml Đo OD được thực hiện trên máy quang phổ hấp phụ ở bước sóng λ = 600 nm

3.1.3 Phương pháp quan sát hình thái tế bào (Phương pháp nhuộm Gram)

Nuôi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu trong môi trường Lb lỏng 24 giờ Dùng que cấy tròn lấy một giọt canh trường dàn đều lên phiến kính sạch Cố định vết bôi bằng cồn 960 hoặc hơ lên phần không khí nóng của ngọn lửa đèn cồn Đặt lên vết bôi một miếng giấy lọc nhỏ rồi nhuộm thuốc tím gential lên trên, giữ 1-2 phút Sau

đó, bỏ miếng giấy ra, đổ thuốc nhuộm thừa, không rửa nước Nhỏ dịch lugol lên chỗ vết bôi, giữ một phút rồi đổ đi Nhúng bản mẫu vào cồn 960 trong 0,5-1 phút, rửa bằng dòng nước chảy nhẹ Tiếp đó, nhỏ thuốc nhuộm fuchsin lên chỗ vết bôi, giữ 1-

2 phút Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ Đợi cho khô, sau đó quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần Vi khuẩn gram (+) sẽ bắt màu tím, vi khuẩn gram (-) sẽ bắt màu hồng

3.2 Phương pháp hoá sinh

3.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Biuret

+ Chuần bị dung dịch màu

Cân 1,5g CuSO4 và 6g KNaC4H4O6 rồi hòa tan trong 500ml dung dịch nước cất và khuấy đều Sau đó thêm 300ml NaOH 10% vào dung dịch vừa pha Định mức dung dịch đến vạch ngấn của bình 1000ml bằng nước cất

+ Xây dựng đường chuẩn

Hòa tan dung dịch phần trăm thể tích Albumin nguyên chất với nước cất sẽ được một dung dịch protein cô đặc có nồng độ 10mg/ml Đường chuẩn sẽ được xác định trong khoảng nồng độ từ 0 – 0,8mg/ml được pha từ dung dịch mẹ vừa pha Cho vào mỗi ống nghiệm khoảng 4ml thuốc thử, lắc đều và để phản ứng trong 30 phút Sau đó giá trị màu dung dịch hấp thụ được sẽ được đo bằng máy đo màu ở bước sóng 570nm

Định dạng
Số trang	78
Dung lượng	3,47 MB