Nghiên cứu thu nhận pectic oligosaccharide (POS) từ dịch thủy phân pectin và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

NGUYỄN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN PECTIC OLIGOSACCHARIDE POS TỪ DỊCH THỦY PHÂN PECTIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG N

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN PECTIC OLIGOSACCHARIDE (POS) TỪ DỊCH THỦY PHÂN PECTIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2016

-*** -

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN PECTIC OLIGOSACCHARIDE (POS) TỪ DỊCH THỦY PHÂN PECTIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

PGS TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, em đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè

Trước hết, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM – Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh

học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực hiện

đề tài

Em xin chân thành cảm ơn TS Vũ Kim Dung, Viện Công nghệ sinh học – Đại

học Lâm nghiệp cùng các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn học viên, sinh viên phòng thí nghiệm Vi sinh- Hóa sinh - Sinh học phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Xin cảm ơn các thầy cô và bạn bè thân thiết đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Những lời cảm ơn chân thành nhất của em xin được gửi đến các thành viên trong gia đình, những người đã luôn quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho

toàn chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào

Mọi dữ liệu, hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Hà Nội, ngày 21 tháng 09 năm 2016

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 3

1.1 Prebiotic và Pectic oligosaccharide (POS) 3

1.1.1 Prebiotic 3

1.1.2 Pectic oligosaccharide (POS) 4

1.2 Cơ chất pectin 5

1.3 Thu nhận Pectic oligosaccharide (POS) 7

1.3.1 Kỹ thuật thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme thu POS trong hệ thống có tích hợp màng lọc 10

1.3.2 Cô đặc, tách, tinh sạch POS 13

1.3.3 Sấy tạo sản phẩm 17

1.3.4 Bao gói và điều kiện bảo quản sản phẩm 19

1.4 Đánh giá pectic oligosaccharide (POS) 20

1.4.1 Phân tích định tính 20

1.4.2 Phân tích định lượng 21

1.4.3 Đánh giá hoạt tính sinh học 23

1.5 Ứng dụng POS sản xuất nước bí đao chức năng 25

1.5.1 Tiềm năng ứng dụng của POS 25

1.5.2 Ứng dụng sản xuất nước bí đao bổ sung POS 26

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị 28

2.1.1 Vật liệu 28

2.1.2 Môi trường và các dung dịch sử dụng 28

2.1.3 Hoá chất chính 29

2.1.4 Thiết bị 30

2.1.5 Màng lọc 31

2.2 Phương pháp phân tích 33

2.2.1 Phương pháp vi sinh 33

2.2.2 Phương pháp hoá lý - hoá sinh 34

2.3 Phương pháp nghiên cứu 36

2.3.1 Thu nhận dịch thủy phân 36

2.3.2 Cô đặc dịch thủy phân 37

2.3.3 Loại muối khỏi dịch thủy phân bằng kết tủa ethanol 37

2.3.4 Sấy phun 37

2.3.5 Tính toán hiệu suất thu hồi POS 37

2.3.6 Lựa chọn bao bì và điều kiện bảo quản chế phẩm POS 38

2.3.7 Nghiên cứu sản xuất nước bí đao bổ sung POS 38

2.4 Phương pháp đánh giá cảm quan 38

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm POS 42

3.1.1 Cô đặc dịch thủy phân 42

3.1.2 Loại muối đệm khỏi sản phẩm POS 44

3.1.3 Sấy phun thu chế phẩm POS 47

3.2 Nghiên cứu bảo quản chế phẩm POS 52

3.3 Đánh giá chế phẩm POS bột 57

3.3.1 Đánh giá chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS 57 3.3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm POS 61

3.4 Nghiên cứu ứng dụng POS để sản xuất nước bí đao chức năng 64

3.4.1 Nghiên cứu sản xuất nước bí đao bổ sung POS 64

3.4.2 Phân tích thành phần nước bí đao có bổ sung POS 68

3.4.3 Xây dựng quy trình sản xuất nước bí đao bổ sung POS 70

3.4.4 Đánh giá chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm nước bí đao bổ sung POS 72

KẾT LUẬN 74

KIẾN NGHỊ 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

PHỤ LỤC 87

GalOS Galacto oligosaccharide

GOS Galacto oligosaccharide

HGA Homogalacturonan

HM High methyl ester (Pectin có mức độ methyl hóa cao)

HPAEC-PAD High performance anion exchange chromatography

(HPAEC) with pulsed amperometric detection (PAD) (Sắc kí

trao đổi anion hiệu năng cao với detector điện hóa)

HPLC High performance liqiquid chromatography (Sắc ký lỏng

hiệu năng cao)

kDa kilo Dalton

LD50 Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm

LM Low methyl este (Pectin có mức độ methyl hóa thấp)

MOS Mannooligosaccharide

MPa Mega Pascal

MWCO Molecular weight cutoff

NMWL Nominal molecular weight limit (Giới hạn khối lượng phân

w/v weight/volume (Khối lượng/thể tích)

XOS Xylo – oligosaccharide

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thông số kỹ thuật của màng 50 kDa (GE Healthcare, Mỹ) 31

Bảng 2.2 Thông số kỹ thuật của màng 1 kDa (GE Healthcare, Mỹ) 31

Bảng 2.3 Thông số kĩ thuật màng nano spiral wound 0.3 kDa(Model: DL2540F1072) 32

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm thử độc tính cấp 34

Bảng 2.5 Phép thử tam giác 40

Bảng 3.1 Xác định hiệu suất thu hồi của bước cô đặc bằng lọc nano 43

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol : dịch đến hiệu quả kết tủa và khả năng loại muối (kết tủa ở 4˚C trong 4 giờ) 45

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của các điều kiện kết tủa đến hiệu suất thu hồi POS 46

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô dịch POS trước khi sấy phun 49

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của chế độ sấy đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm 51

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của loại bao bì đến các thông số của bột POS 53

Bảng 3.7 Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại trong POS thành phẩm 58

Bảng 3.8 Bảng theo dõi trọng lượng chuột khi cho ăn POS 60

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của POS tới sự phát triển củavi khuẩn có lợi và gây hại 62

Bảng 3.10 Kết quả phân tích hoạt tính sinh học của POS bột 63

Bảng 3.11 Xác định công thức nước bí đao bổ sung POS 65

Bảng 3.12 Hàm lượng POS trong nước bí đao bổ sung POS 66

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá cảm quan bằng phép thử tam giác 67

Bảng 3.14 Thành phần dinh dưỡng trong nước bí đao(tính trên 100 mL) 69

Bảng 3.15 Kết quả phân tích chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại trongnước bí đao bổ sung POS 73

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo của D - Monogalacturonic và một pectic oligosaccharide [21] 4

Hình 1.2 Cấu trúc pectin [11] 6

Hình 1.3 Sơ đồ sản xuất POS theo phương pháp thủy phân pectin bằng enzym 9

Hình 1.4 Sơ đồ mô hình phản ứng thủy phân có tích hợp bộ phận lọc dòng ngang 10

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn monogalacturonic 35

Hình 3.1 Sắc ký của các dung dịch thử nghiệm với màng 0.3kDa 43

Hình 3.2 Kết tủa POS (A) sau kết tủa cồn và Phổ sản phẩm POS (B) trong kết tủa 47

Hình 3.3 Chế phẩm POS bột sau sấy phun 52

Hình 3.4 Chế phẩm POS bảo quản trong túi PE và túi thiếc 54

Hình 3.5 Quy trình thu nhận chế phẩm POS dạng bột 55

Hình 3.6 Một số hình ảnh của quá trình thu nhận POS trên quy mô pilot 57

Hình 3.7 Kiểm tra độ bền của POS sau thanh trùng 65

Hình 3.8 Sản phẩm nước bí đao bổ sung POS 69

Hình 3.9 Quy trình thu nhận nước bí đao bổ sung POS 71

Hình 3.10 Sản phẩm nước bí đao chứa POS 2% 72

MỞ ĐẦU

Cuộc sống hiện đại mang lại cho chúng ta nhiều tiện nghi, thoải mái nhưng hệ lụy của nó mang lại cũng không hề nhỏ Với sự bận rộn của cuộc sống ngày nay, những bữa ăn nhanh đang dần thay thế những bữa ăn với đầy đủ chất dinh dưỡng làm cho số lượng người mắc các căn bệnh như: béo phì, tiểu đường, bệnh tim mạch, ung thư… đang dần tăng lên Nhận thức được những nguy cơ này, con người ngày càng quan tâm hơn đến sức khỏe của mình, đặc biệt là trong việc phòng chống bệnh tật Xu hướng và nhu cầu sử dụng thực phẩm chức năng để bổ sung dưỡng chất cho cơ thể đồng thời giúp phòng chống bệnh ngày càng phổ biến Điều này đã thúc đẩy mạnh nhu cầu sử dụng prebiotic và nghiên cứu sản xuất các thế hệ prebiotic mới

Pectic oligosaccharide (POS) là một trong những prebiotic thế hệ mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây POS là một hợp chất carbohydrate, bao gồm từ 2 –

10 đơn phân D - monogalacturonic nối với nhau bằng liên kết α (1 – 4) glucoside và có nhiều đặc tính quý

Là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên POS có tính acid tương tự như một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác nhân gây bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn các loại oligosaccharide trung tính Bên cạnh đó, POS được các vi sinh vật có trong đường ruột

sử dụng và sản phẩm của quá trình lên men này có những ảnh hưởng tích cực đối với

cơ thể vật chủ POS được chứng minh là thúc đẩy quá trình tự chết apoptosis của các tế bào ung thư ruột ở người, có khả năng bảo vệ tim mạch, làm giảm tổn thương của cơ thể dưới tác dụng của các kim loại nặng, chống béo phì, chống nhiễm trùng, chống nhiễm khuẩn và chống oxy hóa Từ những lợi ích rất thiết thực trên, oligosaccharides prebiotics nói chung và POS nói riêng có tiềm năng làm thực phẩm bổ sung trong công nghệ chế biến các sản phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Hiện nay POS được sản xuất bởi một số phương pháp như tổng hợp hóa học, phân cắt pectin bằng chiếu xạ và sử dụng enzyme thủy phân giới hạn pectin Trong đó, hướng nghiên cứu sử dụng enzyme thủy phân giới hạn pectin được quan tâm hơn cả do cho hiệu quả tốt nhất với điều kiện phản ứng enzyme êm dịu, thân thiện với môi trường, cường lực xúc tác của enzyme mạnh và đặc hiệu

Trên thế giới hiện nay đã có nhiều nghiên cứu công bố về quá trình thủy phân giới hạn pectin thu POS bằng phương pháp thủy phân gián đoạn [17, 55, 56, 59] và phương pháp thủy phân có tích hợp màng lọc [21, 36, 38, 40] cho hiệu quả cao Tuy nhiên, có rất ít công trình trên thế giới và trong nước nghiên cứu thu hồi POS từ hệ thống thủy phân trong bình phản ứng thông thường cũng như vẫn chưa có công trình nào công bố về quy trình sản xuất, thu hồi POS từ hệ thống thủy phân có tích hợp màng lọc và ứng dụng POS vào sản xuất thực phẩm chức năng Xuất phát từ những lí

do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thu nhận Pectic Oligosaccharide (POS)

từ dịch thủy phân pectin và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng”

Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình thu nhận POS có chất lượng và hiệu suất cao từ dịch thủy phân pectin ứng dụng vào sản xuất nước bí đao chức năng

Nội dung nghiên cứu

 Xây dựng quy trình thu nhận và tinh sạch Pectic oligosaccharide (POS) từ dịch thuỷ phân pectin thu từ hệ thống thủy phân có tích hợp màng lọc

 Hoàn thiện sản phẩm và đánh giá các chỉ tiêu chất lượng, vệ sinh an toàn thực phẩm của chế phẩm POS

 Nghiên cứu ứng dụng POS vào sản xuất nước bí đao chức năng, đánh giá chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm Xây dựng quy trình sản xuất nước bí đao

bổ sung POS

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Prebiotic và Pectic oligosaccharide (POS)

1.1.1 Prebiotic

Prebiotic là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm cacbonhydrate mà cơ thể vật chủ không tiêu hóa được (oligosaccharides), kích thích sự phát triển và hoạt động của vi khuẩn có lợi trong ruột [27] Như vậy, nhờ có prebiotic mà vi sinh vật hữu ích có điều kiện phát triển mạnh mẽ hơn, do đó cải thiện hệ tiêu hóa cho vật chủ Tinh bột bền (resistant starch), Xylo oligosaccharide (XOS), Fructo oligosaccharide (FOS), Inulin và Pectic oligosaccharides (POS) là những ví dụ đại diện cho các dòng sản phẩm dạng này

Ở Việt Nam trong những năm gần đây đã có một số cơ sở trong nước nghiên cứu

và đưa vào sản xuất một số sản phẩm prebiotic Tại Viện Công nghiệp thực phẩm, Trịnh Thị Kim Vân, Nguyễn Hoàng Anh đã thực hiện các đề tài nghiên cứu sản xuất Fructooligosaccharide (FOS) bằng enzyme để ứng dụng sản xuất một số thực phẩm chức năng [6] Nhóm nghiên cứu của Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã sử dụng enzyme endo-1,4-β-mannosidase

từ Aspergillus niger BK01 để thủy phân bã cơm dừa, thu chế phẩm đường chức năng

Mannooligosaccharide (MOS) ứng dụng cho sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm [2] Với các đặc tính ưu việt của enzyme tái tổ hợp, cùng hiệu suất biểu hiện cao, quá trình ứng dụng enzyme tái tổ hợp này trong sản xuất chế phẩm MOS cao độ đang được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn nuôi tôm,…[3]

1.1.2 Pectic oligosaccharide (POS)

Pectic oligosaccharides là các oligosaccharide có nguồn gốc từ pectin, cấu tạo từ

2 - 10 đơn phân D - Monogalacturonic nối với nhau bằng liên kết α (1 - 4) glucoside [21] (hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu tạo của D - Monogalacturonic và một pectic oligosaccharide [21]

Pectic oligosaccharide có phân tử lượng không lớn lắm và chúng có một số tính chất của một acid hữu cơ, mang điện tích âm, có độ nhớt thấp và ít ngọt hơn đường sucrose [8]

Là một oligosaccharid dễ tan trong nước và khi thủy phân bằng acid hoặc enzyme

sẽ làm đứt các liên kết glucoside, giải phóng các đơn phân Monogalacturonic và các oligosaccharide mạch ngắn hơn

Các nghiên cứu về pectic oligosaccharide cho thấy POS có hoạt tính của một prebiotic, POS được các vi sinh vật có trong đường ruột sử dụng và sản phẩm của quá trình lên men này có những ảnh hưởng tích cực đối với cơ thể vật chủ Một số ảnh hưởng có lợi của POS cho sức khỏe của con người như:

- Bảo vệ các tế bào đường ruột chống lại tác dụng của của độc tố Shiga [63];

- Ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật gây bệnh đường tiết niệu [30];

- Thúc đẩy quá trình tự chết apoptosis của các tế bào ung thư ruột ở người [62];

- Có khả năng bảo vệ tim mạch [47], làm giảm tổn thương của cơ thể dưới tác dụng của các kim loại nặng, chống béo phì, các bệnh về da, chống độc, chống nhiễm trùng, chống nhiễm khuẩn và chống oxy hóa

Hoạt tính prebiotic của POS phụ thuộc vào đặc điểm hóa học và hóa lý của chúng Mức độ methyl hóa của pectin cũng giữ một vai trò quan trọng trong các thuộc tính lên men của POS Người ta đã chứng minh được rằng POS có mức methyl hóa thấp được vi khuẩn lên men tốt hơn POS có mức methyl hóa cao [26]

Năm 2003, Olano-Martin, Rimbach và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu khả năng thúc đẩy quá trình apoptosis của tế bào ung thư ruột ở người [62]

Một nghiên cứu khác về hoạt tính prebiotics của POS có nguồn gốc từ pectin táo gai được Li và cộng sự công bố năm 2010 [47] cho thấy POS có khả năng làm giảm nồng độ cholesterol và triglyceride tổng số giúp ức chế sự tích tụ chất béo của cơ thể

Năm 2004 và 2007, Holchkiss và cộng sự cũng công bố nghiên cứu chứng tỏ rằng POS có khả năng làm tăng số lượng các loài vi khuẩn có lợi trong đường ruột như

bifidobacteria, lactobacilli [32, 33]

Bên cạnh đó, các công trình nghiên cứu khác ở môi trường in vivo và in vitro

cho thấy POS có tính acid không độc hoặc gây đột biến, thích hợp bổ sung vào thực phẩm dành cho trẻ em và trẻ sơ sinh [25]

1.2 Cơ chất pectin

Pectin là polysaccharide phân nhánh phức tạp có trục chính bao gồm các phân tử D-monogalacturonic (GalA) liên kết với nhau theo liên kết α-1,4-glucoside, trong đó một số gốc cacboxyl -COOH có thể bị acetyl hóa và/hoặc methyl hóa ngẫu nhiên

Pectin được tìm thấy trong tế bào của tất cả các thực vật bậc cao và chiếm khoảng

22 - 35% khối lượng khô của tế bào [15] Pectin giữ nhiều vai trò quan trọng của thành

tế bào và của thực vật [57]

Pectin có cấu trúc khá phức tạp và gồm ba phần chính:

Homogalacturonan (HGA) và Rhamnogalacturonan (RG) I và II [11] Cấu trúc pectin

được biểu diễn trên hình 1.2

Hình 1.2 Cấu trúc pectin [11]

Trong 3 loại trên, HGA là thành phần chiếm tỷ lệ lớn và có mặt ở nhiều loại thực vật nên được nghiên cứu sâu rộng hơn các thành phần khác

Một vài nhóm carboxyl -COOH của phân tử monogalacturonic trong chuỗi pectin

bị este hóa bởi nhóm methyl và phần trăm các nhóm carboxyl bị este được gọi là mức

độ este hóa, ký hiệu là DE (Degree of esterification) Mức độ este hóa ảnh hưởng lớn đến các tính chất của pectin, đặc biệt là tính hòa tan và khả năng tạo gel

Dựa vào mức độ este hóa, pectin được chia thành 2 nhóm chính:

- Pectin este metyl hóa cao (High methyl este - HM) với số gốc acid của pectin được metyl hóa lớn hơn 50%

- Pectin este metyl hóa thấp (Low methyl este - LM) với số gốc acid của pectin được methyl hóa nhỏ hơn 50% [69]

Khả năng este hóa cao nhất có thể đạt được ở các dịch chiết nguyên liệu thô

tự nhiên khoảng 75%

1.3 Thu nhận Pectic oligosaccharide (POS)

Pectic oligosaccharide là một prebiotic có nguồn gốc từ pectin Hiện nay, có một

số phương pháp sản xuất POS như: tách chiết từ thực vật [48], tổng hợp và phân cắt pectin tạo POS [34]

Thu nhận POS từ nguồn cơ chất pectin đang được nghiên cứu nhiều với các phương pháp khác nhau:

 Phương pháp hoá học:

- Tổng hợp hóa học: tiến hành glycosyl các mono và disaccharide thích hợp, sau

đó thực hiện phản ứng nối các trihexagalacturonate đã được methyl este hóa chọn lọc [50]

- Xử lý hóa chất: sử dụng acid pha loãng hoặc acid cô đặc (đến 2M) như hydrochloric acid, sulfuric acid, trifloacetic acid, formic acid hoặc nitric acid đun nóng

từ 50 - 90˚C để phân cắt pectin tạo POS [19]

 Phương pháp vật lý:

Một số tác nhân vật lý được sử dụng như nhiệt, vi sóng, bức xạ γ và sóng siêu

âm [31, 37] Ví dụ, chiếu xạ pectin thu được các mảnh oligosaccharide với hiệu suất cao Tuy nhiên, khi chiếu xạ sẽ làm tăng nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng lên đến hơn 100˚C, điều này sẽ làm lượng protein hoặc peptide còn lại trong mẫu có thể gây ra phản ứng Maillard, do đó có thể hình thành các phân tử không mong muốn và độc hại [37]

 Phương pháp sinh học

Pectin có thể được phân cắt thành các pectic oligosaccharide nhờ endo- polygalacturonase [21, 38] Phương pháp thủy phân bằng enzyme có nhiều ưu điểm như: phản ứng được thực hiện dưới các điều kiện êm dịu, môi trường thủy phân không gây ăn mòn thiết bị, không có chất độc hoặc hóa chất tồn dư, quá trình thủy phân có mức độ chọn lọc cao, enzyme chỉ xúc tác cho các liên kết hoặc đơn vị cơ chất đặc biệt của riêng nó, sản phẩm thu được nhiều hơn so với phương pháp hóa học và tránh được

sự hình thành của các hợp chất không mong muốn Từ những ưu điểm trên cho thấy phương pháp thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme là phương pháp đơn giản, hiệu quả và khắc phục được nhược điểm của phương pháp vật lý và hóa học

Hình 1.3 là sơ đồ chung sản xuất POS theo phương pháp thuỷ phân pectin bằng enzym Sơ đồ gồm các bước chính sau:

- Thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme ở các điều kiện thích hợp diễn ra trong bình phản ứng thông thường hoặc trong bình phản ứng có tích hợp màng lọc

- Từ dịch thuỷ phân thu được, tiến hành cô đặc, tách, tinh sạch bằng các phương pháp lọc nano, kết tủa ethanol, hoặc lọc gel để tách riêng các thành phần POS phục vụ cho các mục đích nghiên cứu và phân tích khác

- Hoàn thiện sản phẩm: bao gồm công đoạn sấy phun thu chế phẩm dạng bột, nghiên cứu các điều kiện bao gói và bảo quản sản phẩm

- Đánh giá, ứng dụng: tiến hành đánh giá các chỉ tiêu về chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm và hoạt tính prebiotic Ứng dụng POS vào sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng

Hình 1.3 Sơ đồ sản xuất POS theo phương pháp thủy phân pectin bằng enzym

1.3.1 Kỹ thuật thủy phân giới hạn pectin bằng enzyme thu POS trong hệ thống có tích hợp màng lọc

Một số nghiên cứu về động học phản ứng của quá trình thủy phân pectin bởi endo polygalacturonase cho thấy tốc độ phản ứng bị kìm hãm bởi sản phẩm thủy phân của chúng [38, 41] Để tránh hiện tượng này, một số nhóm nghiên cứu đã áp dụng hệ thống bình phản ứng dạng màng [9, 21] Với hệ thống này, các sản phẩm thủy phân có kích thước nhỏ hơn lỗ màng có thể qua màng dễ dàng và được loại ra khỏi hệ thống, trong khi các phần tử có khối lượng và kích thước lớn (cơ chất và enzyme) được giữ lại Tuy nhiên hệ thống thủy phân này là hệ thống lọc màng truyền thống (dead-end filtration) nên có thể gặp trở ngại trong quá trình vận hành do hiện tượng tắc màng bởi thành phần phức tạp và độ nhớt của dịch phản ứng

Một trong những cách tiếp cận có thể đồng thời giải quyết được các vấn đề này là

sử dụng hệ thống bình phản ứng tích hợp với bộ phận lọc dòng ngang

Hình 1.4 Sơ đồ mô hình phản ứng thủy phân có tích hợp bộ phận lọc dòng ngang

Lọc dòng ngang (Cross flow filtration - CFF) là một kỹ thuật lọc trong đó dung dịch ban đầu chuyển động tiếp tuyến dọc theo bề mặt màng lọc Do có sự chênh lệch áp suất qua màng nên các phân tử có kích thước nhỏ hơn lỗ màng sẽ đi qua, những

Màng 1 Màng 2

thành phần lớn hơn bị giữ lại, dịch chuyển dọc theo bề mặt màng và quay trở lại bình chứa ban đầu

Dung dịch chuyển động định hướng đến bề mặt màng gọi là dòng cấp (feed) Dung dịch chuyển động dọc theo bề mặt màng và quay trở lại bình chứa ban đầu gọi là dòng hồi lưu (retentate) Dòng hồi lưu thường được bơm trở lại bình chứa ban đầu và được tuần hoàn Dung dịch đi qua màng được gọi là dòng ra (permeate)

Kỹ thuật lọc dòng ngang khác với kỹ thuật lọc truyền thống ở chỗ:

- Màng lọc sử dụng cho CFF được thiết kế riêng trong khi lọc truyền thống sử dụng rất nhiều loại màng khác nhau, giấy hoặc các vật liệu khác như bi thủy tinh để phân đoạn các thành phần có dòng cấp

- CFF là một hệ thống tuần hoàn khép kín của dòng hồi lưu Đối với lọc truyền thống, dòng cấp thường chỉ đi qua màng lọc một lần

- Trong hệ thống CFF, dòng hồi lưu được giữ lại như một dung dịch và có thể được tái

sử dụng một cách trực tiếp [75]

Rất nhiều các công trình nghiên cứu đã thành công khi ứng dụng kỹ thuật màng cho quá trình thủy phân pectin bằng enzyme [36, 38, 40] Bình phản ứng có tích hợp hệ thống lọc dòng ngang chủ yếu sử dụng màng siêu lọc (ultrafiltration) và màng lọc nano (nanofiltration) Mô hình phản ứng này có nhiều ưu điểm: (1) enzyme có thể được giữ lại cho quá trình thủy phân liên tục trong thời gian dài; (2) màng cho phép lọc tại chỗ các sản phẩm có kích thước nhỏ hơn lỗ màng và (3) cho phép loại bỏ một cách liên tục sản phẩm để hạn chế tối đa quá trình ức chế phản ứng bởi sản phẩm, từ đó giúp làm tăng sản lượng và tỷ lệ chuyển hóa [60] Bên cạnh đó, mô hình thủy phân dạng này còn tiết kiệm năng lượng, dễ dàng theo dõi và điều chỉnh các thông số hoạt động như áp suất, nhiệt độ, tốc độ dòng vào, tốc độ khuấy và dễ dàng nâng cấp lên các quy mô sản xuất lớn hơn [54]

K Be´lafi-Bakó (2007) đã thủy phân pectin bằng enzyme polygalacturonase trong hệ thống bình phản ứng dạng màng siêu lọc cut off 30kDa Hệ thống thủy phân hoạt động ổn định trong hơn 50 giờ và giúp nâng hiệu suất chuyển hóa pectin lên 40.6% so với mô hình thủy phân mẻ truyền thống do các phân tử cơ chất có khối lượng phân tử thấp như D-monogalacturonic được giải phóng ra từ quá trình phân cắt pectin liên tục được loại bỏ khỏi hệ thống [38] A Lama-Munoz và cộng sự sử dụng nhiều loại màng kích thước khác nhau: 10 kDa, 5 kDa, 3 kDa và 1 kDa để thu nhận POS từ

LM – pectin oliu Kết quả nghiên cứu cho thấy POS chủ yếu nằm ở phân đoạn 1 – 3 kDa và chiếm 23% đường tổng số [7] Nhóm các nhà nghiên cứu José M Rodriguez-Nogales và cộng sự (2008) đã sử dụng mô hình bình phản ứng lọc màng với enzyme tự

do để thủy phân pectin táo bằng hỗn hợp enzyme thô polygalacturonase và pectin lyase Mô hình này vận hành tốt nhất dưới điều kiện tỷ lệ enzyme/cơ chất 23.3, nhiệt

độ 48˚C, tốc độ hồi lưu 36 l/h và áp suất qua màng 34.5 kPa với màng có khối lượng phân tử giới hạn (NMWL) 10 000 Độ nhớt của dịch thủy phân giảm đến 88% chỉ sau

15 phút và tỷ lệ chuyển hóa đạt 68% sau 2.5 giờ tương đương với khoảng 1.6 mg monogalacturonic/ mL [36] Cũng với hệ thống thủy phân dạng màng K Kiss (2009) lắp đặt thêm một máy hút chân không sau màng 30 kDa nhằm làm tăng tốc độ phân đoạn sản phẩm khỏi hệ thống phản ứng khi thử nghiệm thủy phân pectin từ nhiều nguồn khác nhau để thu các sản phẩm POS POS thu được nhiều hơn, 24.3; 21.5 và 19.4 g sản phẩm/h.g enzyme lần lượt với pectin bã nho đen, củ cải đường và pectin nho

đỏ so với 9.7g sản phẩm/h.g enzyme với pectin họ citrus [40]

Trong sản xuất và tinh sạch POS, phương pháp siêu lọc và lọc nano thường được ứng dụng để thu nhận các oligo có mức độ trùng hợp DP < 30 (3.8 kDa) J Holck

và cộng sự đã sử dụng màng cellulose 3 kDa cho mục đích này [35], trong khi K Iwasaki và Y Matsubara tinh sạch POS (thủy phân từ pectin bột cam quýt) bằng màng

50 kDa để giữ lại các hợp chất có khối lượng phân tử lớn và sau đó lọc tiếp tục qua màng 15 kDa [39]

1.3.2 Cô đặc, tách, tinh sạch POS

Các nhà khoa học mô tả rằng các monome monogalacturonic không có tác dụng ngăn chặn sự bám dính của các tác nhân gây bệnh lên các tế bào, đặc biệt là các tế bào biểu mô đường tiêu hóa và đường sinh dục, trong khi tỷ lệ ngăn chặn lên đến 91.7% hoặc 84.6% tương ứng với digalacturonic và trimonogalacturonic, và hiệu quả ngăn chặn mong muốn giảm cùng với trọng lượng phân tử ngày càng tăng của các galacturonic [14] Như vậy, việc loại bỏ các thành phần không mong muốn như đường monosaccharide, muối đệm là cần thiết để cải thiện hoạt tính prebiotic của chế phẩm POS Hơn nữa, việc tinh sạch giúp mở rộng khả năng ứng dụng của POS tinh khiết trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Vì vậy, tùy theo mục đích sử dụng mà POS được thu hồi từ dịch thủy phân dưới các dạng chế phẩm khác nhau nhờ một số phương pháp khác nhau

Quy trình thu nhận của đề tài nhằm thu được chế phẩm POS tinh sạch cho ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng Các phương pháp chính được sử dụng trong quy trình thu nhận này bao gồm: phương pháp lọc nano, phương pháp kết tủa và phương pháp sắc ký POS sau khi tách và tinh sạch được tạo chế phẩm dạng bột bằng phương pháp sấy phun để bảo quản lâu dài và thương mại hóa

Các phương pháp lọc màng nói chung cho phép đồng thời thực hiện các quá trình tinh sạch và cô đặc dung dịch Trong đó lọc nano là một phương pháp có nhiều tiềm năng trong tinh sạch và cô đặc POS ở quy mô công nghiệp Màng kích thước nano

có giới hạn khối lượng phân tử (MWCO) trong khoảng 200 – 1000 Da Đường kính lỗ của hầu hết các màng kích thước nano trong khoảng 0.6 – 2.0 nm, trung bình 0.8 – 0.9

nm Đường kính của monosaccharides là 0.6 – 0.8 nm Bên cạnh đó, màng nano có thể tách riêng ion đơn (monovalent ions) ra khỏi hỗn hợp chất đa ion (multivalent ions) Vì vậy, màng kích thước nano có thể phân riêng monogalacturonic ra khỏi digalacturonic

và oligogalacturonic

Có nhiều báo cáo về việc sử dụng phương pháp lọc nano trong tinh sạch các

oligosaccharide Pruksasri và cộng sự sử dụng một màng NF (NP030) để tinh sạch

GOS cho độ tinh khiết của sản phẩm đạt 85% (dựa trên hàm lượng monosaccharide) và

hiệu suất thu hồi oligosaccharide đạt 82% [67]

Feng và cộng sự đánh giá ảnh hưởng của áp suất vận hành (0.2-0.8 MPa) và nồng độ thấp (5-60 g/l) trong tách GOS sử dụng màng lọc nano cellulose acetate Một màng NF-3 với giới hạn trọng lượng phân tử 0.8-1 kDa đã được chọn để phân tách một chế phẩm GOS thương mại có hàm lượng oligosaccharide thấp bằng phương pháp lọc pha loãng (diafiltration) ở 50˚C và áp suất 6 bar Theo đó, 90.5% monosaccharide và 52.5% lactose trong hỗn hợp đã được loại bỏ, năng suất thu hồi oligosaccharides đạt

70.0% [24]

Bốn loại màng NP010, NP030 (Microdyn Nadir, Germany), Desal-5 DL và

Desal-5 HL đã được Kuhn sử dụng trong thí nghiệm để lựa chọn loại màng thích hợp trong tinh sạch fructooligosaccharide (FOS) từ hỗn hợp với glucose, fructose và sucrose [42] Kết quả cho thấy màng NP030 cho khả năng giữ các loại đường khác nhau khác biệt nhất: FOS (0.66), glucose (0.18), fructose (0.15), và sucrose (0.24) Các kết quả đã chứng minh tiềm năng của phương pháp lọc pha loãng (diafiltration) sử dụng màng NP030 trong việc tinh sạch FOS từ hỗn hợp chứa mono và disaccharide

Phương pháp lọc nano cũng đã được nghiên cứu trên quy mô pilot được thực hiện bởi Zhang và cộng sự để nghiên cứu khả năng giữ disaccharide (lactulose và lactose) và chất xúc tác (NaCl và H3BO3) trong chế phẩm xi-rô lactulose Kết quả thu được cho thấy khả năng được giữ lại trên màng khác biệt lớn và giảm dần theo thứ tự:

disaccharide (94.7–98.5%) > NaCl (9.0–20.0%) > H3BO3 (−19.9–0.0%) Ngoài ra, một

mô hình đã được sử dụng để mô phỏng độ tinh khiết và hiệu suất thu hồi disaccharide trong quá trình diafiltration liên tục Theo mô phỏng, 25 bar đã được chọn làm áp suất vận hành tối ưu cho quá trình diafiltration liên tục Kết quả thử nghiệm cho thấy rằng hơn 96.5% NaCl và H3BO3 đã được loại bỏ khỏi xi-rô lactulose với chỉ một tỉ lệ thất

thoát disaccharide nhỏ (11.0%) và hệ số pha loãng là 5.0 cho màng sử dụng [74]

K Manderson và cộng sự tiến hành lọc dịch POS (sản xuất từ pectin vỏ cam bởi acid HNO3) bằng màng lọc nano DS-5-DL để làm giảm khoảng 5 lần hàm lượng muối

và loại monosaccharide Sau đó POS sau lọc được sử dụng để nghiên cứu hoạt tính prebiotic trên các vi khuẩn đường ruột [53]

Lọc nano có nhiều lợi thế hơn so với các kỹ thuật sắc ký khác như tiết kiệm năng lượng, chi phí vận hành và bảo dưỡng thấp, đơn giản trong hoạt động và mở rộng quy mô

Đối với quá trình cô đặc bằng lọc nano, các yếu tố ảnh hưởng chính đến hiệu suất thu hồi bao gồm áp suất, nhiệt độ và nồng độ dịch ban đầu Goulas và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của 3 yếu tố này trong một thí nghiệm tinh sạch chế phẩm oligosaccharide Kết quả cho thấy khả năng loại fructose tăng từ 0.1 đến 0.42 khi tăng

áp suất lọc bằng cách tăng vận tốc dòng dung môi, tuy nhiên khả năng tách loại glucose giảm từ 0.58 xuống 0.43 nếu nồng độ các chất này trong dung dịch cao hoặc khi tăng nhiệt độ lọc thì khả năng loại fructose giảm từ 0.72 xuống 0.48 Việc lựa chọn nhiệt độ lọc cũng phải dựa vào thông số kỹ thuật của từng loại màng [29]

 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Việc bổ sung các dung môi hữu cơ vào các dung dịch làm giảm khả năng hòa tan của một số thành phần trong dung dịch do làm giảm hằng số điện môi của môi trường Các dung môi hữu cơ thường dùng bao gồm ethanol, acetone và iso propanol Trong số

đó, ethanol là dung môi thông dụng nhất và thường được sử dụng để kết tủa POS

C Onumpai và cộng sự đã sử dụng ethanol với nồng độ cuối 64% kết tủa POS ở

4oC trong 18 giờ để nghiên cứu khả năng sử dụng POS của vi khuẩn đường ruột [13]

Dịch POS thu từ bã ép quả oliu được A Lama-munoz và cộng sự kết tủa phân đoạn bằng ethanol 20%, 40%, 60%, 80% và 90% [7] Kết quả cho thấy kết tủa bằng ethanol trên 80% thu được POS có kích thước 0.3 - 1 kDa

Dịch sau thủy phân bằng phương pháp thủy phân tích hợp màng lọc đã loại bỏ phần lớn cơ chất dư và enzyme, tuy nhiên vẫn còn chứa các thành phần không mong muốn như monosaccharide và muối đệm trinatri citrate Do đặc tính của muối trinatri citrate không tan trong ethanol nên phương pháp kết tủa bằng ethanol cũng được kì vọng để loại bỏ muối

Swennen và cộng sự sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn ethanol để nghiên cứu tách arabinoxylooligosaccharides (AXOS) từ dịch thủy phân arabinoxylan (AX) Các phân đoạn kết tủa bao gồm: F0-60% , F60-90% và F>90% (trên 90%) được để qua đêm ở 4˚C, thu hồi kết tủa bằng cách ly tâm 10 000 vòng/phút trong 20 phút ở 4˚C, sau đó hòa tan kết tủa trong nước khử ion và đông khô Các mẫu được được phân tích bằng GC, HPSEC và HPAEC- PAD Kết quả phân tích cho thấy phân đoạn F0-60% chứa thành phần AX với DP trung bình là 53 Phân đoạn F60-90% chứa AXOS phân tử trung bình với DP trung bình là 23 Phân đoạn F>90% chứa AXOS phân tử trung bình với DP trung bình là 5 và khối lượng phân tử trong khoảng 300-2000 Da, phân tích HPAEC cho thấy phân đoạn này chứa arabinose, xylose, xylobiose và xylooligosaccharides (XOS) với

DP 3-6 [68]

Sen và cộng sự đã sử dụng nồng độ ethanol cao (>70% v/v) để kết tủa chọn lọc galacto oligosaccharide (GOS) từ hỗn hợp GOS, lactose, glucose và galactose [20] Hàm lượng GOS đã được tăng lên 2.3 lần trong kết tủa ở nồng độ ethanol 90% v/v, trong khi hàm lượng GOS tăng 2.4 lần với phương pháp hấp thụ bởi than hoạt tính, 1.3 lần khi lên men chọn lọc monosaccharide bởi nấm men hay 1 lần với sắc ký loại trừ

theo kích thước, tuy nhiên kết tủa là phương pháp đơn giản và thuận tiện hơn cả Phương pháp kết tủa có thể sử dụng thay thế hoặc kết hợp với các phương pháp này Hơn nữa, thực hiện 2 lần kết tủa liên tiếp ở nồng độ ethanol 90%, hàm lượng monosaccharide giảm từ 48% (w/w) tổng lượng đường xuống còn 4% (w/w), như vậy khả năng loại monosaccharide của phương pháp này là rất cao

Trong thí nghiệm kết tủa của mình, Sen và cộng sự cũng đã nghiên cứu những ảnh hưởng của nồng độ ethanol sử dụng để kết tủa, nồng độ saccharide trong dung dịch ban đầu và nhiệt độ kết tủa [20] Theo đó, tại nồng độ 70% ethanol, kết tủa tạo ra là chưa rõ ràng, kết tủa tạo ra thấy rõ bằng mắt ở nồng độ 85% tại tất cả các mức nhiệt độ (10; 25 và 40˚C) và hàm lượng saccharide khảo sát (60 và 81 g/l) và tại 90% ethanol thì kết tủa tạo ra tại tất cả các phương án thí nghiệm Báo cáo cũng chỉ ra rằng việc tăng nồng độ saccharide tổng trong dung dịch ban đầu làm giảm khả năng hòa tan của từng loại saccharide riêng biệt, do đó lượng saccharide kết tủa được nhiều hơn Nhiệt

độ được biết là ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của các loại saccharide, nhiệt độ càng thấp thì khả năng hòa tan càng giảm dẫn đến hiệu suất kết tủa càng cao Tuy nhiên ở nồng độ ethanol cao, ảnh hưởng của sự biến đổi về nhiệt độ đến quá trình tinh sạch POS là không đáng kể

Như vậy, phương pháp kết tủa có thể được sử dụng như là một bước để làm giàu

và cô đặc POS trước khi sắc ký Ngược lại, lọc nano có thể được sử dụng để cô đặc các dung dịch đường trước một bước kết tủa cuối cùng Và vì vậy, phương pháp này có tiềm năng lớn để áp dụng trong công nghiệp vì sự đơn giản trong vận hành và hiệu quả tinh sạch cao

1.3.3 Sấy tạo sản phẩm

Công nghệ sấy phun ngày nay phát triển mạnh mẽ, đã và đang được áp dụng rộng rãi trên thế giới từ lĩnh vực y tế, sinh học cho đến sản xuất thực phẩm Sấy phun là một

phương pháp tiên tiến, tạo nên những sản phẩm dạng bột có chất lượng cao, tốc độ sấy nhanh, thích hợp để tạo sản phẩm bột từ các nguyên liệu nhạy cảm với nhiệt độ, cần

giảm thiểu thời gian sấy [10] Mặc dù sấy ở nhiệt độ cao nhưng do sự tách nước diễn ra

nhanh trong một thời gian ngắn nên vẫn giữ nguyên được tính chất của sản phẩm Điều này làm cho sấy phun phù hợp để sấy nhiều sản phẩm có yêu cầu về đặc tính cao như enzyme, protein, sữa…Trong công nghiệp thực phẩm việc ứng dụng sấy phun để sấy các loại đường chức năng đã được áp dụng rộng rãi, trong công nghệ sinh học sử dụng

để sấy các chế phẩm vi sinh, men vi sinh, protein…

Năm 2006, Tôn Nữ Minh Nguyệt và cộng sự đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sấy phun trong sản xuất bột chanh dây với hàm lượng khô dịch quả trước sấy là 8%, nhiệt độ không khí đầu vào là 165oC, áp lực khí nén là 4.25 bar và tốc độ bơm nhập liệu là 22.5 mL/phút, lượng matodextrin bổ sung là 15% so với lượng dịch quả trước sấy Hiệu suất thu hồi sản phẩm của quá trình sấy phun đạt 75-78%, độ ẩm sản phẩm thấp hơn 5% [5]

Sấy phun cũng đã được áp dụng trong sản xuất POS Trong sáng chế của Canada

số CA 2 428 473, Kunz và cộng sự đã thủy phân dịch pectin tạo POS có DP 2 - 10 chiếm 93%, DP>10 chiếm 4% sau đó sấy phun tạo chế phẩm có hàm ẩm 4.4% [14]

Đối với quá trình sấy phun cần lưu ý các thông số như sau [18]:

+ Nồng độ chất khô của dịch trước sấy phun: Nồng độ chất khô của dịch trước sấy phun có ý nghĩa quan trọng trong vấn đề tiết kiệm chi phí và chất lượng sản phẩm Tăng nồng độ chất khô có nghĩa là tăng độ nhớt của dịch vào, từ đó làm tăng kích thước của hạt sản phẩm Nếu một sản phẩm được sấy với nồng độ dịch vào thấp, kích thước hạt sẽ mịn và tính hoàn nguyên kém, việc thu hồi bột từ cyclon và thiết bị lọc cũng thấp dẫn đến làm tăng giá thành của quá trình sấy phun Nồng độ dịch vào quá cao lại sản sinh ra các giọt và sợi lớn dẫn đến cần thời gian sấy dài và tính chất bột có

nhiều tác dụng bất lợi Thông thường nồng độ chất khô của dịch vào ở khoảng 20-50% tùy thuộc vào tính chất của dịch và loại vòi phun sử dụng

+ Nhiệt độ không khí sấy: Nhiệt độ không khí sấy liên quan trực tiếp đến độ nhạy của sản phẩm với nhiệt và cấu tạo máy sấy Khi nhiệt độ không khí sấy thấp, độ

ẩm của các hạt vật liệu sấy sẽ còn khá cao nên bám nhiều lên thành buồng sấy, làm giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm sau sấy Khi nhiệt độ cao, các hạt vật liệu đạt độ ẩm khá tốt nhưng dễ làm cháy vật liệu, gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Quá trình sấy thực phẩm thường sử dụng khoảng nhiệt độ từ 120-300˚C

+ Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu: Tốc độ bơm nhập liệu ảnh hưởng lớn đến lưu lượng dòng nhập liệu, năng suất thiết bị và nhiệt độ không khí đầu ra Tốc độ bơm tăng khiến thời gian lưu của vật liệu sấy trong buồng sấy giảm, hạt không đạt được độ ẩm mong muốn, phần hạt ẩm bám lại trên buồng sấy dẫn đến hiệu suất thu hồi giảm

Như vậy, quá trình thu hồi POS phụ thuộc vào rất nhiều thông số khác nhau như áp suất lọc, nhiệt độ lọc, nồng độ dịch lọc ban đầu, nồng độ ethanol kết tủa, nhiệt

độ kết tủa, nồng độ dịch đem kết tủa, nồng độ chất khô dịch trước sấy phun, nhiệt độ không khí sấy, tốc độ bơm nhập liệu, Do vậy cần dựa vào các đặc tính hóa lý của POS cùng với các mục tiêu về kinh tế - kỹ thuật để khảo sát và lựa chọn tối ưu các

thông số sao cho hiệu suất và chất lượng của quá trình thu hồi đạt tốt nhất

1.3.4 Bao gói và điều kiện bảo quản sản phẩm

Bao bì phải có tác dụng phòng ngừa sự biến đổi các thành phần hóa học và các tính chất cơ lý của sản phẩm trong thời gian nhất định, bảo tồn được tính chất cảm quan nguyên vẹn từ ban đầu cho đến khi sản phẩm được sử dụng Bao bì phải đảm bảo cho sản phẩm không bị lây nhiễm những chất khác hoặc vi sinh vật từ môi trường hoặc

từ chính bao bì, đặc biệt là những chất gây độc hại hoặc những chất làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm

Bao bì có rất nhiều chức năng như chức năng bảo vệ, chức năng thông tin, chức năng marketing, chức năng môi trường, chức năng văn hóa, Tuy nhiên trong khuôn khổ đề tài chỉ nghiên cứu chọn lựa loại bao bì thích hợp để bảo vệ sản phẩm khỏi những tác động làm thay đổi tính chất hóa lý và cảm quan của sản phẩm

Về nguyên tắc, vật liệu làm bao bì phải phù hợp với từng loại sản phẩm, càng dễ gia công càng tốt Giá trị của bao bì phải tương ứng với giá trị của sản phẩm cần chứa đựng, không làm tăng giá thành của sản phẩm một cách quá mức Vật liệu làm bao bì phải không làm thay đổi các tính chất hóa lý và đặc biệt là tính chất cảm quan của sản phẩm, không gây nhiễm độc cho thực phẩm

Yêu cầu chính đối với việc lựa chọn loại bao bì cho sản phẩm dạng bột phải đảm bảo mục đích chính là ngăn ngừa ô nhiễm từ các nguồn bên ngoài, chống thấm nước, thấm khí, môi trường bao bì phải làm chậm hoặc ngăn chặn sự tăng trưởng của các vi sinh vật không mong muốn bằng cách sử dụng phương pháp hút chân không hoặc sử dụng khí trơ, và nhất là đối với việc ứng dụng POS trong ngành dược phẩm thì bao bì đựng POS và dược phẩm nói chung phải đảm bảo được tính tiện lợi, nhanh chóng và hiệu quả cho người sử dụng lẫn chi phí cho nhà sản xuất Vì vậy hiện nay các nhà sản xuất đang đi theo xu hướng sử dụng các loại bao bì bằng chất dẻo, nhất là các loại bao bì nhiều lớp

Với sản phẩm POS dạng bột sẽ được nghiên cứu bảo quản ở điều kiện thường trong 6-12 tháng tương tự các sản phẩm thực phẩm, dược phẩm dạng bột khác hiện nay

1.4 Đánh giá pectic oligosaccharide (POS)

1.4.1 Phân tích định tính

Trong nghiên cứu về các sản phẩm POS, sắc ký lớp mỏng được sử dụng trong việc kiểm tra thành phần POS trong dịch thủy phân và sau khi thu hồi, tinh sạch POS [22, 46, 61, 65, 66]

Li S và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để khẳng định sự có mặt của monomonogalacturonic, các pectic oligosaccharide và hiệu quả của phản ứng

thủy phân pectin từ quả sơn tra bằng endopolygalacturonase được tách từ A niger Các

tác giả đã sử dụng hệ dung môi n-butanol: acetic acid: nước với tỷ lệ 4: 6: 3 (v/v/v), hiện màu ở 100˚C bằng dung dịch acid sulfuric có 99.5% ethanol với tỷ lệ 1:1 [46]

Trong khi đó, Nikolic M.V và Mojovic L sử dụng hệ dung môi ethyl acetate: acetic acid: nước tỷ lệ 4:2:3 (v/v/v), hiện màu bằng dung dịch amonium 10% trong bromophenol blue khi nghiên cứu quá trình thủy phân pectin táo bằng

Dịch POS sau khi thủy phân pectin là một hỗn hợp gồm nhiều thành phần với

DP 2 - 10 nên để định lượng POS cần thiết phải tách riêng sau đó định lượng từng thành phần riêng rẽ Các phương pháp phân tách thường được sử dụng gồm phương pháp sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion

Bằng cột chứa gel Superdex Peptide HR 10/30 (30x1cm) của Pharmacia Biotech, Thụy Điển, từ dịch thủy phân pectin bã oliu Lama-Munoz A và cộng sự phân tách monosaccharide ra khỏi POS và thu được POS với nồng độ 10 mg/ml [45]

Laere V và cộng sự đã sử dụng Bio-Gel P2 cho việc tách POS với DP 5 – 9 [44] Trong khi Yu L và cộng sự đã phân tách được 5 phân đoạn POS khi cho dịch thủy phân lần lượt qua ba cột Sephadex G-25, Sephadex G-75 và Sepharose CL-6B [73]

Olano-Martin E và cộng sự đã sử dụng cột TSK G6000 PWXL nối tiếp với cột TSK G4000 PWXL để phân tách và xác định được khối lượng phân tử của POS sản xuất

từ HM pectin và LM pectin [21] Hệ thống sắc ký lọc gel TSK-Gel (cột G3000 PW nối với cột thứ hai G4000PW nối với cột thứ ba G6000 PW) của Tosoh cũng được Mandalari G và cộng sự sử dụng để phân tách thành phần mono và oligosaccharide có trong dịch thủy phân pectin từ vỏ cam [52]

Phương pháp sắc ký trao đổi ion HPAEC có thể định lượng monomonogalacturonic và các oligosaccharide có trong sản phẩm phản ứng thủy phân pectin Trong nghiên cứu của nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp này để phân tách

và định lượng các thành phần POS có trong dịch thủy phân từ pectin bằng enzyme [16, 28]

Combo A.M.M và cộng sự sử dụng hệ thống HPAEC-PAD (Dionex ICS-3000 model, USA) đã phân tách được các oligosaccharide DP 1 – 9 ra khỏi nhau [16]

Manderson K và cộng sự sử dụng HPAEC-PAD để phân tách POS tạo ra từ pectin vỏ cam Khi so sánh với sản phẩm thủy phân polymonogalacturonic nhận thấy

có sự tương ứng với các oligosaccharide chuẩn [53] POS tạo ra từ pectin cam cũng được Ramachandran C và cộng sự sử dụng hệ thống sắc ký này để phân tích thành phần trước khi nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch [64]

Hiện nay có nhiều loại detector sử dụng trong định lượng các loại prebiotic như: detector khúc xạ - RID, UV/VIS, PAD (pulsed amperometric detection) tuy nhiên các tài liệu công bố cho thấy POS chỉ được phát hiện và định lượng bởi detector PAD

 Theo kit thử D – monogalacturonic

Khi xử lý với acid H2SO4, POS sẽ bị thủy phân hoàn toàn thành dạng mono là monogalacturonic D-monogalacturonic giải phóng ra được xác định bằng kit đo D-galacturonic (Megazyme, Ireland) Dựa vào phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng để định lượng monogalacturonic có trong mẫu trước và sau khi xử lý với H2SO4

Nguyên tắc của kit: D - Monogalacturonic bị oxy hóa bởi enzyme uronate dehydrogenase với sự có mặt của nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) để chuyển thành D - Galactarate và tạo thành nicotinamide adenine dinucleotide dạng khử (NADH)

( )

Lượng NADH hình thành trong phản ứng này tương đương với lượng D - Monogalacturonic có trong mẫu thử NADH được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 340 nm

1.4.3 Đánh giá hoạt tính sinh học

 Khả năng được lên men chọn lọc (với chủng thuần khiết)

Một hợp chất prebiotic phải được lên men chọn lọc bởi các vi sinh vật có lợi trong hệ tiêu hóa Tiêu chuẩn này được đánh giá trong phòng thí nghiệm bằng cách nuôi cấy các chủng thuần khiết của một số loài vi khuẩn có lợi điển hình (thường là

Lactobacillus và Bifidobacterium) và vi khuẩn có tiềm năng gây bệnh (như E coli, Enterococcus) trong môi trường có chứa hợp chất kiểm tra như nguồn carbon duy nhất

và xác định sự tăng sinh của vi khuẩn so với môi trường có chứa nguồn carbon là

glucose Có khá nhiều nghiên cứu đã tiến hành đánh giá, sàng lọc các hợp chất prebiotic tiềm năng theo cách này [43]

Theo M.J Hopkins và cộng sự, trên môi trường chứa Galactooligosaccharides

(GOS) các chủng Bifidobacterium phát triển với tốc độ mạnh hơn đáng kể so với các

gluxit khác Ở nồng độ 1% (w/v), sau 24 giờ GOS thúc đẩy sự tăng sinh của hàng loạt

các chủng Bifidobacteria và Lactobacilli [49] GOS cũng hỗ trợ cho quá trình phát triển của một số Enterobacteriaceae và Streptococci

 Khả năng không bị tiêu hóa

Một hợp chất prebiotic phải có khả năng không bị tiêu hóa ở phần trên của hệ tiêu hóa mà còn nguyên vẹn để đi đến ruột già Tiêu chuẩn này có thể đánh giá trong

điều kiện in vitro bằng cách kiểm tra độ bền của hợp chất khảo sát trong môi trường

pH acid và môi trường có mặt enzyme tiêu hóa của động vật (nước bọt, tụy tạng, ruột non)

Các mô hình in vivo cũng được sử dụng để đánh giá khả năng không bị tiêu hóa

bằng xác định lượng prebiotic còn lại trong phân chuột bị nhiễm chủ động mầm bệnh

và chuột đã được tiền xử lý với kháng sinh để tiêu diệt bớt một phần vi sinh vật đường ruột

Để kiểm tra khả năng được lên men chọn lọc và cân bằng hệ vi sinh đường ruột,

Y Wang và cộng sự đã chứng minh rằng khi chuột ăn thức ăn có bổ sung 2.5%

alginate oligosaccharide, số lượng Bifidobacteria và Lactobacilli trong phân tăng [72]

Kết quả oligosaccharide này cho hiệu quả prebiotic cao hơn so với FOS, một oligosaccharide đã được chứng minh là prebiotic

1.5 Ứng dụng POS sản xuất nước bí đao chức năng

1.5.1 Tiềm năng ứng dụng của POS

Từ những đặc tính sinh học thiết thực, prebiotic nói chung và POS nói riêng có tiềm năng làm thực phẩm bổ sung trong công nghệ chế biến các sản phẩm thực phẩm

POS là một oligosaccharide của các acid galacturonic nên mang tính acid

tương tự như một số oligosaccharide trong sữa mẹ, chúng có khả năng gắn với các tác nhân gây bệnh, ngăn chặn sự kết dính của chúng vào bề mặt biểu mô ruột hiệu quả hơn các loại oligosaccharide trung tính, ví dụ dimonogalacturonic ngăn ngừa sự bám dính

của các tế bào vi khuẩn E coli trong điều kiện in vitro [32] Đây sẽ là một lợi thế cho

dòng sản phẩm này để tăng cường hiệu quả cho các loại sữa bột trẻ em khi chúng được

bổ sung cùng với các prebiotic trung tính thông dụng khác như FOS, GOS, MOS

Người ta thử nghiệm bổ sung 15-25% POS vào sữa của trẻ sơ sinh cho thấy POS giúp trẻ tiêu hóa tốt hơn, hệ vi sinh đường ruột thay đổi và hạ thấp pH phân [23, 51] Năm 2010, Westerbeek đã thử nghiệm bổ sung hỗn hợp 80% GOS/FOS và 20% POS với hàm lượng 1.5 g/kg/ngày cho 113 trẻ sơ sinh Kết quả cho thấy những trẻ này

có khả năng hấp thụ và tiêu hóa tốt hơn, giảm mắc các bệnh do nhiễm khuẩn đường tiêu hóa hơn nhóm đối chứng [71] Như vậy, bổ sung prebiotic vào sữa công thức cho trẻ sơ sinh cũng là một hướng phát triển mạnh Phân tích cho thấy rằng thị trường sữa công thức cho trẻ sơ sinh được dự kiến sẽ tăng trưởng với tốc độ 11.3% từ năm 2012 đến 2018

POS mang điện tích âm do đó có thể kết hợp với các oligosaccharide điện tích dương khác như chitosan oligosaccharide để tạo ra sự tương tác tĩnh điện ứng dụng trong sản xuất bản film y tế, túi phân hủy sinh học hoặc trong điều trị vết thương,… [8] POS có độ nhớt thấp nên thuận lợi trong việc bổ sung vào thực phẩm, ví dụ như kết cấu của sữa chua có thể được cải thiện Do độ nhớt thấp nên POS cũng có thể được

sử dụng như là chất giữ ẩm

Ngoài ra, POS ít ngọt hơn đường saccharose và hàm lượng calo thấp nên thường được sử dụng để bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm cần độ ngọt thấp và ít béo, hay thịt và các sản phẩm ăn nhẹ [8, 76] Thêm nữa, các ứng dụng mới nhất của prebiotics trong lĩnh vực thức ăn chăn nuôi cũng trở thành một thị trường sinh lợi cao Nhu cầu prebiotic cho các ứng dụng thức ăn chăn nuôi dự kiến sẽ vượt qua 70 000 tấn vào năm

2018

Ở Việt Nam trong những năm gần đây, prebiotic được ứng dụng trong sản xuất một số sản phẩm thực phẩm như Fructooligosaccharide (FOS) và arabinoxylan được ứng dụng trong sản xuất một số thực phẩm chức năng như rau má FOS, sữa bột, kẹo, bánh bích quy bổ sung FOS, bột đậu nành bổ sung Arabinoxylan [1, 6], Mannooligosaccharide (MOS) ứng dụng bổ sung vào thức ăn nuôi tôm [2, 3] Tuy nhiên với nhu cầu trong nước ngày một gia tăng, sản lượng và chủng loại prebiotic không đủ cung cấp cho thị trường [4] Do đó, việc nghiên cứu các sản phẩm mới không chỉ để cung cấp dinh dưỡng thiết yếu mà còn có thể đồng thời phòng chống bệnh tật được khuyến khích và tăng cường

1.5.2 Ứng dụng sản xuất nước bí đao bổ sung POS

Hiện nay các prebiotic nói chung được các nhà khoa học khuyến cáo sử dụng với hàm lượng 3 – 13 g/người/ngày với người trưởng thành Ở Châu Âu, GOS được sử dụng với hàm lượng 12 g/người/ngày, FOS là 7 g/người/ngày, IMO là 8 g/người/ngày, XOS là 5 g/người/ngày Inulin được sử dụng ở Châu Âu với hàm lượng 3 - 11 g/người/ngày nhưng ở Mỹ là 1 – 4 g/người/ngày [77, 78]

Với chế phẩm POS vẫn đang trong giai đoạn thử nghiệm chưa thấy có sản phẩm lưu hành trên thị trường cũng như chưa có các công bố chính thức về liều lượng

sử dụng Nhóm nghiên cứu của đề tài cũng đã bước đầu ứng dụng chế phẩm POS trong

sản xuất bánh bích quy chức năng Bổ sung 2% POS, bên cạnh việc làm tăng sinh vi khuẩn có lợi, giảm số lượng vi khuẩn gây hại, bánh vẫn giữ được các tính chất cảm

quan đặc trưng về mùi vị, cấu trúc, việc bổ sung POS vào bánh cũng không cần thay đổi quy trình và trang thiết bị sản xuất Dựa trên kết quả này, POS tiếp tục được nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất nước bí đao chức năng nhằm làm đa dạng hóa các sản phẩm thực phẩm chức năng để phù hợp cho mọi đối tượng và mọi lứa tuổi

Sản phẩm nước bí đao bổ sung POS được đánh giá cảm quan và đánh giá các chỉ tiêu về thành phần và hoạt tính prebiotic Xây dựng quy trình hoàn chỉnh để sản xuất sản phẩm nước bí đao bổ sung POS tại nhà máy, kiểm tra và đánh giá chất lượng,

an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm nước bí đao sản xuất theo quy trình tại nhà

máy

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hoá chất và thiết bị

2.1.1 Vật liệu

- Pectin tách chiết từ vỏ chanh dây bằng phương pháp axit có mức độ este hoá (DE): 30%, hàm lượng pectin: 95%

- Maltodextrin (Trung Quốc)

- Các nguyên liệu sản xuất trà bí đao: Nước, đường hòa tan, nước cốt bí đao cô đặc (25 g/L), hương bí đao, màu caramen nhóm IV (150d), chất điều chỉnh độ acid, natri hydro carbonat (500ii)

- Chủng vi khuẩn đánh giá hoạt tính sinh học của POS: Lactobacillus rhamnosus

GG (L1), L amylovorus DSM16698 (L2), L acidophilus NCFM (L3), L reuteri DSM

17938 (L4), L casei Shirota (L5), L bulgaricus CH-3 (L6), L fermentum PCC (L7), L

plantarum 299V (L8), L johnsonii La1 (L9), Bifidobacterium lactis Bb12 (Bif), Escherichia coli 0157:H7, Salmonella enterica subsp enterica serotype Typhi ATCC

19430 (S typhi ATCC) và Staphylococcus aureus ATCC 25923 được lưu giữ tại bộ

sưu tập giống của Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học Phân tử, Đại học Bách Khoa

Hà Nội

2.1.2 Môi trường và các dung dịch sử dụng

- Môi trường nuôi cấy Lactobacillus (MRS - Man Rogosa Sharpe) (g/l): Pepton

(10), cao nấm men (5), cao thịt (5), glucose (20), amonicitrat (2), CH3COONa (5),

K2HPO4 (2), MgSO4.7H2O (0.1), MnSO4.4H2O (0.05), Agar (15), pH 6.5

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí tổng số (TGA - Trypton Glucose Agar) (g/l): trypton (5), glucose (4), cao nấm men (2.5), agar (15), pH 7.0

- Môi trường nuôi cấy nấm men, nấm mốc (YGC - Chloramphenicol glucose yeast extract agar) (g/l): cao nấm men (5), glucose (20), agar (18), Chloramphenicol (0.1), pH 6.6

- Môi trường nuôi cấy E coli (VRBL - Violet Red Bile Lactose Agar) (g/l):

Peptone (7), cao nấm men (3), muối Bile (1.5), natri chloride (5), đỏ trung tính (0.03), tím tinh thể (0.002), Lactose (10), Agar (12), pH 7.4

- Môi trường nuôi cấy Samonella (BSA - Bismuth Sulphite Agar) (g/l):

bismuth sulfite Bi2(SO3)3 (16), pancreatic casein (10), pancreatic mô động vật (10), cao thịt bò (10), glucose (10), natri phosphat (8), sulfate sắt (0,6), pH 7.7

- Môi trường nuôi cấy S aureus (TSA - Trypton casein Soy Agar) (g/l):

Tryptone (15), peptone đậu tương (5), natri chloride (5), agar (15), pH 7.3

- Dung dịch đệm citrate pH = 4 (0.1M)

+ C6H8O7.H2O: 13.86 g/l

+ C6H5O7.Na3.2H2O: 10.2 g/l + Nước cất

- Enzyme thủy phân pectin thu nhận POS: Pectinex Ultra SP-L (Novozymes);

- Bản mỏng silica TLC, Butanol, Acetic acid (Merck, Đức);