Nghiên cứu thu nhận dịch đạm thuỷ phân từ gluten lúa mì để ứng dụng trong sản xuất thực phẩm

Sản phẩm thủy phân với Alacalase tiếp tục được thủy phân với Flavourzyme nhằm thu dịch thủy phân giàu acid amin tự do và các peptides ngắn.. vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT WGH: Wheat gluten hyd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THUỶ PHÂN TỪ

GLUTEN LÚA MÌ ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

THỰC PHẨM

Mã số: 2013/02-CNSHTPMT

Chủ nhiệm đề tài: TS NGUYỄN LỆ HÀ

Tp Hồ Chí Minh, 5/2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THUỶ PHÂN TỪ GLUTEN LÚA MÌ ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

THỰC PHẨM

Mã số: 2013/02-CNSHTPMT

Xác nhận của Chủ tịch HĐ nghiệm thu Chủ nhiệm đề tài

(ký, ghi rõ họ tên) (ký, họ tên)

Tp Hồ Chí Minh, 5/2017

C, pH 8.0, thời gian thủy phân 120 phút Dịch thủy phân thu được có hàm lượng Nitơ tổng 17.76±0.202g/L, hàm lượng amoniac 0.273±0.01g/L, hàm lượng acid amin tự do là 30.166mg/g Sản phẩm thủy phân với Alacalase tiếp tục được thủy phân với Flavourzyme nhằm thu dịch thủy phân giàu acid amin tự do và các peptides ngắn Điều kiện thủy phân với Flavourzyme là: tỷ lệ enzyme/cơ chất 0.204AU/g, pH 6.5, nhiệt độ

45oC, thời gian 210 phút Sản phẩm thủy phân với quy trình này có hàm lượng Nitơ tổng là 18.497±0.369 g/L, hàm lượng ammoniac lần lượt là và 0.474±0.012 g/L, và hàm lượng acid amin tự do102.527 mg/g Dịch thủy phân thu được bao gồm các peptides có khối lượng phân tử 35kDa và dưới 10KDa

ABSTRACT

In this work, we focused onprocess of wheat gluten hydrolyzed utilizing enzymes Alcalase and Flavourzyme to enrich peptides and acid amine.Protein concentration of wheat gluten is 75.7%, including glutenin and gliadin molecular are range from 52 to70 kDa and from 30 to 38 kDa, respectively.In addition, glutenin containlow molecular weight subunitsfluctuating between 12 and 15KDa.The parameters of hydrolysis using Alcalase and Flavourzyme were determined Pre-hydrolysis process was carried out by enzymes Alcalase, an endo-protease At the optimal of enzyme Alcalase concentrationof0.116 AU/g, temperature of60°C, pH of 8.0 and hydrolysis time of 120 minutes,hydrolyzate reached total nitrogen content of 17.76 ± 0.202 g/L, ammonia content of0.273 ± 0.01 g/L andfree acid aminecontent of 30.166mg/g Product was continued to hydrolyze by Flavourzyme to obtain free acid amine and short chain peptides The optimal parameters of hydrolysis using Flavourzyme were enzyme concentration of 0.204 AU/g, pH of 6.5, temperature of

45oC and hydrolysis time of 210 minutes Total nitrogen, ammonia and free acid amine content of product were 18.497±0.369 g/L, 0.474±0.012 g/L and 102.527 mg/g, respectively The final product presented peptides whose molecular weight is 35 kDa and less than 10 kDa

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân gluten lúa mì bằng Alcalase 36

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến quá trình thủy phân bằng Alcalase 36 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình thủy phân 40 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân 44 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến quá trình thủy phân bằng enzyme Alcalase 48

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân 57 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân 60 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân 64

3.4.1 Hàm lượng nito tổng và amoniac trong dịch thủy phân 68 3.4.2 Kết quả phân tích khối lượng phân tử của dịch thủy phân và nguyên liệu 68 3.4.3 Kết quả phân tích thành phần acid amin tự do bằng HPLC 70

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 2 Hàm lượng protein và hàm lượng protein hòa tan khi thủy phân bằng các

Bảng 2 1 Thành phần gluten lúa mì do nhà sản xuất cung cấp 17

Bảng 2 2 Các đặc tính của enzyme Alcalase do nhà sản xuất cung cấp 18

Bảng 2 3 Các đặc tính của enzyme Flavourzyme do nhà sản xuất cung cấp 18

Bảng 3 1 Hoạt tính enzyme Alcalase và Flavourzyme 34

Bảng 3 2 Thành phần nguyên liệu gluten lúa mì 35

Bảng 3 3 Hàm lượng Nito tổng và amoniac trong dịch thủy phân 68

Bảng 3 4 Thành phần aicd amin tự do trong dịch thủy phân 70

Comment [NT1]: số trang để cuối dòng

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Kích thước hạt protein trong mạng gluten ở trạng thái tự do (a) và kéo căng

Hình 1 2 Mức độ thủy phân của gluten theo thời gian với các enzyme khác nhau

ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED

Hình 1 3 Cơ chế phản ứng thủy phân cơ chất protein của Substilisin Carlsberge 14

Hình 2 1 Nội dung nghiên cứu 20

Hình 2 2 Sơ đồ tiến hành thủy phân gluten bằng enzyme Alcalase 21

Hình 2 3 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ E/S đến quá trình thủy phân bằng Alcalase

23

Hình 2 4 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình thủy phân bằng Alcalase

24

Hình 2 5 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng pH đến quá trình thủy phân bằng Alcalase 25

Hình 2 6 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến quá trình thủy phân bằng Alcalase

26

Hình 2 7 Sơ đồ thủy phân bằng enzyme Flavourzyme có tiền xử lý Alcalase 27

Hình 2 8 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến quá trình thủy phân bằng

Flavourzyme sau khi xử lý Alcalase 28

Hình 2 9 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân bằng

Flavourzyme sau khi xử lý Alcalase 29

Hình 2 10 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân bằng

Flavourzyme sau khi xử lý Alcalase 30

Hình 2 11 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân bằng

Flavourzyme sau khi xử lý Alcalase 31

Hình 3 1 Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân của gluten theo thời gian ở các tỷ lệ E/S

Hình 3 2 Mức độ thủy phân sau 120 phút với các tỷ lệ E/S khác nhau 37

Comment [NT2]: số trang để cuối dòng

Hình 3 6 Mức độ thủy phân sau 120 phút ở các nhiệt độ khác nhau 42

Hình 3 7 Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hòa tan theo thời gian ở các nhiệt độ

Hình 3 10 Mức độ thủy phân tại các nhiệt độ khác nhau 46

Hình 3 11 Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hòa tan ở các pH khác nhau theo thời gian 47

Hình 3 12 Hàm lượng protein hòa tan ở các pH khác nhau 48

Hình 3 13 Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân theo thời gian 49

Hình 3 15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến hàm lượng aa theo thời gian

52

Hình 3 17 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến DH 54

Hình 3 18 Mức độ thủy phân sau 180 phút theo các nồng độ enzyme khác nhau 55 Hình 3 19 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng aa theo thời gian

57

Hình 3 20 Hàm lượng aa sau 180 phút theo các nhiệt độ khác nhau 58

Hình 3 21 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến DH 59

Hình 3 22 Mức độ thủy phânsau 180 phút tại các nhiệt độ khác nhau 60

viii

Hình 3 23 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hàm lượng aa theo thời gian 61 Hình 3 24 Hàm lượng aa sau 180 phút tại các giá trị pH khác nhau 62

Hình 3 25 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến DH 63

Hình 3 26 Mức độ thủy phân sau 180 phút tại các pH khác nhau 64

Hình 3 27 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng aa 65 Hình 3 28 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian lên mức độ thủy phân 66 Hình 3 29 Khối lượng phân tử của gluten (NL), dịch thủy phân Alcalase 2h, dịch thủy phân với Alcalase 3h, dịch thủy phân với Alcalase và Flavourzyme(A-L) 69

vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

WGH: Wheat gluten hydrolysates : dịch thủy phân gluten lúa mì

WG: Wheat gluten: gluten lúa mì

DH: Degree hydrolysis: mức độ thủy phân

aa: Acid amin

EAI: Emulsification activity index: chỉ số tạo nhũ

E/S: Enzyme/substract : tỷ lệ enzyme/cơ chất

ACE: Angiotensin-converting enzyme : chất ức chế men chuyển

UF: Ultrafiltration – Siêu lọc

AU: Anson unit: đơn vị Anson

ADG: acetic deamide gluten: deamide gluten bằng acid acetic

HDG: acid clohydric deamide gluten: deamide gluten bằng acid HCl

1

GIỚI THIỆU

Glutenlà protein lúa mì được tách ra trong quá trình sản xuất bột mì Hiện nay, gluten lúa mì được sử dụng chủ yếu để làm tăng độ dai, đàn hồi của khối bột nhào khi sản xuất bánh mì và giúp tạo cấu trúc cho các sản phẩm thực phẩm như xúc xích, thức

ăn cho vật nuôi…Tuy nhiên, một số người không thể sử dụng được các sản phẩm có chứa gluten bởi vì gluten gây ra triệu chứng dị ứng gọi là bệnh Celiac, hệ đề kháng trong cơ thể người bệnh sẽ chống lại chất đạm trong lúa mì và các loại ngũ cốc khác Gluten chứa đầy đủ các acid amin trong đó có cả các acid amin không thay thế, ngoài

ra trong gluten còn chứa lượng lớn acid glutamic, một acid amin góp phần tạo nên vị umami cho dịch đạm Là một nguồn thực phẩm tốt, có giá trị dinh dưỡng cao, nhưng ứng dụng của gluten lúa mì bị hạn chế bởi khả năng hòa tan kém của nó

Nhiều nghiên cứu tập trung vào các phương pháp hóa học hoặc enzyme để thủy phân gluten lúa mì nhằmtăng cường độ hòa tan, tạo bọt và tăng tính chất nhũ hóa Có thể thủy phân gluten bằng xúc tác vô cơ, nhưng nhược điểm là tạo nhiều sản phẩm không có lợi chosức khỏe Khi thủy phân bằng HCl không điều khiển được quá trình thủy phân, HCl kết hợp với chất béo trong nguyên liệu tạo thành hợp chất tiền ung thư: mono-dichloropropanols, monocholoropropanols (Nagodawithana, 1994).Quá trình thủy phân bằng NaOH phá hủy một số acid amin thiết yếu như tryptophan, serine, cysteine(Hall, 1992).Phương pháp thủy phân bằng enzyme thể hiện nhiều ưu điểm hơn

so với thủy phân bằng phương pháp hóa học: quá trình thủy phân không đòi hỏi các điều kiện nhiệt độ và áp suất cao như thủy phân bằng phương pháp hóa học, sản phẩm thủy phân chứa nhiều acid amin cần thiết cho cơ thể Ngoài ra, phản ứng thủy phân bằng enzyme có tính đặc hiệu cao, sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao Tuy nhiên, quá trình thủy phân bằng enzyme cần thời gian kéo dài hơn so với quá trình thủy phân bằng phương pháp hóa học

Dịch thủy phân có nhiều ứng dụng khác nhau: bổ sung vào thực phẩm, làm phụ gia, làm gia vị Hiên nay, natriglutamate được sử dụng như chất tạo vị bằng con đường lên men, tuy nhiên người tiêu dùng mong muốn sử dụng sản phẩm gia vị có nguồn gốc

2

tự nhiên Ở Nhật nhiều sản phẩm thủy phân có nguồn gốc tự nhiên như: dịch thủy phân

từ thực vật, cá, chất chiết nấm men đã được nghiên cứu (Ueda Y, 1997) Hedwig và Amado (2002) cũng cho rằng các peptides từ protein thực vật như: lúa mì, bắp, đậu nành khi thủy phân bằng enzyme chứa nhiều acid glutamic và acid pyroglutamic tạo vị umami cho sản phẩm Chất lượng dịch thủy phân được cải thiện là do thành phần amino acid, các peptides nhỏ, muối và các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi

Thông qua các tài liệu tham khảothì Alcalase làenzyme cho hiệu quả thủy phân cao nhất Tuy nhiên Alcalase khi thủy phân tạo ra các peptides mạch ngắn trong đó có nhiều peptides kỵ nước tạo vị đắng cho sản phẩm Một phương pháp nhằm giảm vị đắng này là sử dụng kết hợp exo-peptidase Trong số các exo-peptidase thì Flavourzyme là enzyme thủy phân các peptides tại vị trí N-, tạo ra các acid amin tự do

và peptides mạch ngắn hơn, tăng chất lượng dịch thủy phân và cơ thể dễ hấp thu hơn

Vì vậy trong đề tài này chúng tôi tâ ̣p trung nghiên cứu thủy phân gluten lúa mì bằng enzyme Alcalase vàFlavourzyme với các nội dung như sau:

 Khảo sát quá trình thủy phân gluten lúa mì bằng enzyme Alcalase

 Khảo sát quá trình thủy phân gluten lúa mì bằng enzyme Flavourzyme sau khi xử lý với enzyme Alcalase

Chúng tôi hy vọng kết quả nghiên cứu sẽ thu hút nhiều sự quan tâm , dịch thủy phân thu được có nhiều ứng dụng nhằm nâng cao giá trị sử dụng của gluten

3

1.1 Thành phầngluten lúa mì

1.1.1 Giới thiệu chung gluten lúa mì

Protein của lúa mì được chia làm bốn loại: albumin, globulin, gliadin, và glutenin Trong đó albumin và globulin chiếm khoảng 20%, gliadin và glutenin chiếm khoảng 80% (tỷ lệ của hai loại protein này xấp xỉ nhau).Thành phần chất khô của gluten lúa mì dao động từ 60-85% protein, 5-10% lipid, phần còn lại là tinh bột và các carbohydrates khác Gluten lúa mì chứa khoảng 20 loại acid amin, các acid amin không thay thế đều có trong thành phần lúa mì, đặc biệt nổi bật với hàm lượng acid glutamic, glutamine và proline cao, hàm lượng các acid amin chứa nhóm tích điện thấp

Ở pH=7.0 các protein của gluten ít tích điện Hàm lượng glutamine cao hình thành nhiều liên kết hydro giữa các chuỗi peptides với nhau hoặc với phân tử nước do

đó tạo cho gluten có tính nhớt cao Hàm lượng các acid amin ưa béo tham gia vào cấu trúc bậc 4 của glutenin và liên kết với lipid Hàm lượng prolin rất cao (10-15%) đặc biệt là gliadin cũng ảnh hưởng đến cấu trúc bậc 2 của protein gồm xoắn α và xếp β, các gốc cystine vượt xa các gốc cystein chứng tỏ có liên kết disulfua trong liên kết protein.Trong gluten lúa mì có khoảng 20 aa trong đó các aa không thay thế đều có trong thành phần gluten lúa mì.(Clodualdo và cộng sự, 1994)

Khi tiến hành thủy phân gluten lúa mì và các phân đoạn protein Glutenin và Gliadin bằng HCl 6M trong 24h ở 110oC, sau đó cô đặc dịch thu được và tiến hành phân tích HPAEC-IPAD thu được thành phần acid amin như sau:

Bảng 1 1Thành phần amino acid trong gluten lúa mì khi thủy phân bằng HCl 6M

trong 24h ở 110 o

C(Ine Rombouts, 2009)

α- gliadin là tên gọi riêng của prolamin lúa mì Trong lúa mì có 2 prolamin chính:

- Gliadin α, β, γ có phân tử lượng 30000-45000 Da

- Gliadin ω có phân tử lượng nằm giữa 60000-80000 Da

- Các gliadin của lúa mì có tính đa hình lớn Các gliadin lúa mì ở dạng đơn chuỗi Dựa vào sự phân bố các acid amin ở đầu tận cùng N- của các gliadin α, β, γ người ta biết được 30 acid amin đầu của chúng rất giống nhau trong đó có 20 acid amin đầu

5

tiên tạo thành peptid có tín hiệu ưa béo Peptid này có gốc lysine ở gần cuối N, tiếp

đó là các acid amin ưa béo và cuối cùng là gốc alanine nối với protein Các gliadin ω

có hàm lượng glutamine và prolin rất cao Phần lớn các gốc glutamine đều dưới dạng amide Gliadin ω có chứa hoặc không chứa các acid amin có S do đó trong phân tử không có cầu disulfua Các gliadin α,β,γ còn có một số cầu disufua trong phân tử do đó làm cho cấu trúc bậc 3 chặt và bền

- Các gliadin ω có hàm lượng glutamine và prolin rất cao chiếm 75% Phần lớn các gốc acid glutamic đều ở dưới dạng amide gliadin ω chứa rất ít hoặc không chứa các acid amin có S trong phân tử không có cầu disulfua.Khi hình thành mạng lưới gluten các gliadin sẽ liên kết với nhau bằng cầu hydro giữa các gốc glutamine để tạo ra những sợi có phân tử lượng hàng triệu Da

 Glutenin

Các glutenin có xu hướng tự liên kết với nhau bằng các tương tác ưa béo, bằng liên kết hydro và cầu disulfua lớn hơn so với gliadin.Các glutenin còn có tính đa hình mạnh mẽ Khi phá hủy cầu disulfua giữa các phân tử người ta thu được 25 tiểu đơn

vị glutenin Chia thành 3 kiểu:

- Tiểu đơn vị kiểu A : không hoàn tan trong etanol, có khối lượng phân tử thấp (10000-70000 Da) và rất giàu các acid amin có tính bazo

- Tiểu đơn vị kiểu B không hoàn tan trong ethanol nhưng có khối lượng phân tử cao (60000-1400000 Da) giàu glycine, proline và glutamine, nghèo cystine tỷ lệ xoắn α trong phân tử thấp

- Tiểu đơn vị kiểu C hoàn tan trong ethanol có phân tử 35000-45000

Các tiểu đơn vị liên hợp với nhau bằng cầu hydro, tương tác ưa béo, disulfua Khi các tiểu đơn vị liên hợp lại tạo thành các sợi Ở trạng thái ngậm nước, các glutenin tạo ra một khuôn hoặc màng mỏng chắc, đàn hồi, có tính cố kết cao, chịu kéo căng.(J.A.Bietz và cộng sự, 1970)(J.H.Woychik và cộng sự, 1961)

6

Hình 1 1Kích thước hạt protein trong mạng gluten ở trạng thái tự do (a) và kéo căng

(b)

1.2 Tính chất dịch gluten lúa mì sau thủy phânvà ứng dụng trong thực phẩm

1.2.1 Tính chất dịch gluten lúa mì sau thủy phân

Khả năng hòa tan trong nước

Alder Nissen (1986)cho rằng sự gia tăng độ tan của dịch thủy phân so với protein ban đầu là do việc giảm cấu trúc bậc hai và do enzyme giải phóngpolypeptidesngắn hơn từ protein Chobert và cộng sự (1988) cho rằng khi thủ y phân protein có bathay đổicơbản: tăng số lượngnhómphân cực, làm tăng tính ưa nướcsản phẩm, giảmkhối lượng phân tử, và thay đổi cấu tạophân tử Saukhithủy phân,mốiliênkếtthứ cấp trongprotein glutenlúa mì bị phá hủy làmsuy yếusự gắn kết và sứcbám dính củamạnggluten làm tăng khả năng hòa tan

Jinshui Wang và cộng sự (2006) tiến hành thủy phân gluten (DH = 2.8%) sau đó tiến hành lọc UF phân tách các phâncác đoạn peptides với khối lượng phân tử khác nhau: 100, 50, 20 kDa Các phân đoạn thủy phân có độ hòa tan cao hơn so với gluten lúa mì và dịch thủy phân ban đầu tại tất cả các giá trị pH

Khả năng tạo nhũ

7

Theo Jinshui wang và cộng sự (2006) thì khả năng tạo nhũ (EAI) của các phân đoạn peptidesphụ thuộc vào giá trị pH EAI của gluten lúa mì giảm trong môi trường

pH trung tính, nhưng tăng trong môi trường có tính acid và kiềm Theo Chiai và cộng

sự (1982)EAI thấp nhất có thể tương ứng với điểm đẳng điện của protein Ngoài ra khả năng ổn định nhũ tương của dịch thủy phân gluten lúa mì và các phần phân đoạn peptides tại các giá trị pH acid và kiềm cao hơn so với khi ở pH 7.0 (Yves Popineau, Blandine Huchel, 2002)

Khả năng tạo bọt

Protein là những tác nhân tạo bọt tốt, chúng nhanh chóng khuếch tán đến bề mặt không khí-nước Sự tạo bọt tương ứng với số lượng amino acid kỵ nước tiếp xúc trên

bề mặt của phân tử protein(Damodaran, 1990).Sự phân tán protein làm giảm sức căng

bề mặt tại bề mặt nước/không khí, do đó tạo ra khả năng tạo bọt (Turgeon và cộng sự, 1992)

XiangZhen Kong(2007) cho rằng khi thủy phân có giới hạn làm tăng số lượng các mạch polypeptidesgiúp tăng hoạt động bề mặt, giúp nhiều khí được giữ lại hơn, khả năng tạo bọt tăng Khi mức độ thủy phân tăng lên (DH 10% và 15%), khả năng tạo bọt giảm, điều đó được giải thích do sự tạo thành các mạch peptides ngắn làm giảm hoạt động bề mặt

Tính chất chống oxy hóa

Gluten lúa mìcóáilựcmạnh với dầu và các chấtkhông phân cựckhác, glutenthủy phânsẽ có tác dụng chống lạisự oxy hóa củaacid béo Kunio Stuetsuna và cộng sự (2002) phân tách các peptides thu được khi thủy phân gluten với enzyme trích ly từ dạ dày heo với cột SaphadexG25, kết quả là phân đoạn có M = 5400-8000 Da có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn tocopherol với thời giam cảm ứng 7.5 ngày

Theo Kexue Zhu và cộng sự (2006),dịch thủy phân gluten bằng Alcalase có một

số peptidescó khả năng chống oxy hóa Các peptides này gồm 5-16 amino acid, bao gồm cả các acid amin kỵ nước, Val hoặc Leu, tại các vị trí N-, và Pro, Tyr và His.Chen

8

và cộng sự (1998) cho rằng histidine N- có khả năng chống oxy hóa cao hơn các peptides Ngoài ra, các acid amin, chẳng hạn như Tyr, Met, His, Lys, và Trp, thường được xem như là chất chống oxy hóa

Tạo vị cho umani cho dịch thủy phân

Noguch và cộng sự (1975) cho rằng protein thực vật thủy phân được sử dụng làm gia vị cho thực phẩm vì sản phẩm thủy phân tạo hương vị "umami" giống như glutamate.Hedwig Schlichtherle-Cenny và Renato Amado (2002) tiến hành thủy phân gluten lúa mì bằng 3 phương pháp khác nhau: WGH-1 được thủy phân chỉ sử dụng protease Flavourzyme WGH-2 bổ sung glutaminase để xúc tác cho sự chuyển đổi glutamine sinh ra thành acid glutamic tự do WGH-3 được xử lý HCl trước khi thủy phân để chuyển đổiprotein- glutamine thành axit glutamic- protein Cácmức độ thủy phân của dịch thu được từ 25 đến 35%, cho thấy rằngphần lớn các acid amin có mặt làpeptidescó khối lượng phân tử nhỏ WGH-1 chứa nồng độ cao của glutamine tự do 5.7% và chỉ có rất ítacid glutamic tự do 0.8% Mặt khác, WGH-2 glutaminetự do 0.6%, acid glutamic tự do 7.6% Nồng độ acid glutamine và glutamic trong WGH-3 là 3.5và 2.5% Theo các tác giả này , dịch WGH-3 là ít đắng nhất và cho vị giống umami nhất.Trong dịch thủy phân ngoài acid glutamic,thì các acid hữu cơ cũng góp phần tạo hương vị cho dịch thủy phân.Bốnpeptides pyroglutamyl được xác định: pGlu-Pro-Ser, pGlu-Pro, pGlu-Pro-Glu, và pGlu-Pro-Gln cho vị giống như umami

Seung Hyun Koo và cộng sự (2011) tiến hành thủy phân gluten với 3 loại enzyme khác nhau: Alcalase, Flavourzyme, Protamex Tiến hành đánh giá cảm quan thì dịch thủy phân với Alcalase đắng nhất Còn Flavourzyme và Protamex khi tăng mức độ thủy phân thì tăng vị đắng và vị umami không bị ảnh hưởng Ngoài ra dịch thủy phân bằng Alcalase sau 24h còn có hoạt tính chống oxy hóa cao

Hoạt tính opioid

Peptides có hoạt tính opioid (an thần, giảm đau) bắt nguồn từ các protein thực vật Ngoài protein sữa, gluten lúa mì là nguồn giàu các peptides opioid (exorphins) Theo Anne Pihlanto và cộng sự (2003) các enzyme như Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin

IC50là1.21±0.25và1.57±0.21mg protein/mL.Các tác giả cũng lọc tách các phân đoạn trong dịch thủy phân bằng màng UF và xác đi ̣nh được hoa ̣t tính opioid tâ ̣p trung ở các peptides có phân tử lượng <3kDa

1.2.2 Ứng dụng dịch đạm thủy phân

Hiện nay ứng dụng gluten lúa mì rất hạn chế như làm phụ gia trong quá trình sản xuất xúc xích, bánh mì Gluten lúa mì thủy phân cho các hỗn hợp peptides có khả năng hòa tan cao và thay đổi khả năng tạo bọt và nhũ hóa Các tính chất này phụ thuộc đặc điểm, tùy thuộc vào mức độ thủy phân Ngoài mục đích thủy phân gluten lúa mì nhằmcải thiện cáctính chất chức năng mà protein lúa mì không có thì một số nghiên

Gonzalez-Tello(1994)peptidesnàycólợi thế làđượchấp thụ trongruộtvàcótác dụnggây dị ứngthấp Theo các nghiên cứu thì dịch thủy phân có những tính chất công nghệ như tạo bọt, tạo nhũ có thể dùng làm phụ gia tạo bọt Ngoài ra, dịch thủy phân với hàm lượng đạm cao và các peptides mạch ngắn có thể được sử dụng làm gia vị, làm nước chấm Trong dịch thủy phânchứa các peptidescó khả năng chống oxy hóa chất béo Do

đó có thể sử dụng dịch hydrolysates gluten lúa mì làm chất chống oxy hóa tự nhiên thay thế cho các chất chống oxy hóa tổng hợp như BHA, BHT… Các peptides trong dịch thủy phân còn có hoạt tính sinh học như: an thần, giảm đau, ức chế ACE

Hiệu suất thủy phân protein bằng các enzym khác nhau đã được đưa ra trong Bảng 1.2 Mặc dù có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân, loại enzyme được sử dụng cóảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất và tính chất của sản phẩm cuối cùng

Bảng 1 2Hàm lượng protein và hàm lượng protein hòa tan khi thủy phân bằng các

Các tác giả cho rằng sự gia tăng độ tan của dịch thủy phân so vớiprotein ban đầu

là do việcgiảm cấu trúc thứ cấp và cũng do enzyme thủy phân protein tạo thành polypeptidesngắn hơn Dịch thủy phân với với Alcalase tạo thành polypeptidescó phân tử lượng dưới 10 kDa

11

1.3.2 Phương pháp kết hợp

1.3.2.1 Kết hợp xử lý nhiệt và thủy phân bằng enzyme

Theo Zhang (2012) đã tiến hành sấy gluten ở 120oC trong 30 phút, sau đó gluten được đem thủy phân bằng Alcalase ở 55o

C, pH8.0 Mức độthủyphâncủa gluten lúa mìđãđượccải thiện đáng kểbởitiền xử lýnhiệt DHđạt30%sau1hthủy phânvàcho thấytăng10%so vớiglutenlúa mì không qua xử lý.Lượng các peptides có M<1000Da tăng từ 17.6% lên 30.7% so với với gluten không qua xử lý nhiệt

Tốc độ thủy phân gluten lúa mì bằng Alcalase cóthểđược tăng tốc bằng tiền xử

thấp(M<5000Da).So sánh cấu trúc thứ cấpcủa gluten nguyên liệu và gluten xử lý nhiệt kết quảthu được số lượng gấp nếp βtăng từ 41.5 đến 51.2% và tăng xoắnαtừ 24.5 đến 26% và sự biến mất của các cấu trúc mở rộng.Cấu trúc mở rộng là những cấu trúc thứ cấp phổ biếnnhư xoắn polyproline và gấp nếp α.Tỷ lệ xoắn α và gấp nếp βgiảm trong gluten qua xử lý nhiệtvà chứng tỏ sự biến đổi của cấu trúc bậc 2

Tính kỵ nước bề mặt(Ho)của gluten lúa mìtăngtừ56.7đến74.5% sau khixử lý nhiệtkhô Khi proteinđược gia nhiệttrong dung dịch nướcHogiảmchủ yếu là dosự tương tác của nhiệttiếp xúc vớinhóm kỵ nướctrongprotein.Cùng với sự thay đổi cấu trúc thứ cấp,và phá vỡ liên kết disulfua giúp enzym có thể tiếp cận cơ chất

1.3.2.2 Kết hợp xử lý bằng acid và thủy phân bằng enzyme

Young Shick Hong và cộng sự (2011) tiến hành thủy phân gluten lúa mì với nồng độ 6% (w/w) có tiền xử lý acid HCl 0.1N ở 95oC trong 1 giờ và kết hợp với enzyme Alcalase thủy phân trong 3 giờ.Khối lượng phân tử của các phân tửpeptidestrongdịch thủy phânlúa mìđãđượcxácđịnhphù hợpvớithời gian xử lýtrongquátrìnhthủy phân Sau24 giờ thủy phân thì dịch thủy phân chứapolypeptides, oligopeptidesvà các acidamin tự dovới các kích thướckhácnhau

12

1.4 Giới thiệu về enzyme protease Alcalase và Flavourzyme

1.4.1 Enzyme Alcalase

Giới thiệu

Enzyme Alcalase là loại endopeptidase thủy phân protein, thuộc loại enzyme

một cấu tử, được thu nhận bằng quá trình lên men bề sâu của loài vi khuẩn Bacillus

Licheniformis

Thành phần chính trong sản phẩm thương mại enzyme Alcalase là Subtilisin Carlsberg (alkaline protease A), một serin protease.Trong hệ thống danh pháp MEROPS phân loại protease, Subtilisin (EC.3.4.21.62) thuộc phân nhánh SB của nhóm serine protease (EC.3.4.21.-) với điểm đặc trưng là chứa đơn phân serine nằm trong trung tâm xúc tác phản ứng của enzyme Subtilisin Carlsberg là một chuỗi polypeptides chứa 274 acid amin, khối lượng phân tử 27300 Da Subtilisin Carlsberg là một enzyme chịu nhiệt, với nhiệt độ hoạt động tối ưu từ 55oC đến 65oC, hoạt động tốt trong vùng

pH kiềm tính từ 7 đến 8.5

Trung tâm hoạt động

Trung tâm hoạt động của Subtilisin Carlsberg bao gồm bộ ba acid amin: serine ở

vị trí 221, histidine ở vị trí 64, và aspartic acid ở vị trí 32

Protease có cấu trúc gấp nếp để các amino acid này có thể tương tác với nhau theo một cách nhất định nhằm thủy phân nhiều cơ chất khác nhau Histidine đóng vai trò như chất nhận proton, hay một bazơ, nhận nguyên tử H từ nhóm OH của serine Serine mất đi một proton, sẽ hình thành liên kết mới với nguyên tử C trong nhóm carbonyl của liên kết peptides trong cơ chất Nhóm carboxylic acid trong aspartic acid tích điện âm, giúp ổn định chuỗi điện tích dương của histidine

Cơ chế phản ứng thủy phân

Cơ chế thủy phân protein của Subtilisin Carlsberg được chia thành hai bước:

 Bước 2: Khử acyl hóa

Khi có mặt phân tử H2O, nguyên tử O trong nhóm -OH của H2O sẽ tấn công vào nguyên tử C trong nhóm carbonyl trên ester serine, liên kết giữa C và O của serine bị phá vỡ, hình thành một peptides độc lập Nguyên tử H còn lại của H2O sẽ hình thành liên kết với O của serine, giúp trung tâm hoạt động của enzyme được phục hồi.(DonLon, 2007)

1.4.2 Enzyme Flavourzyme

Enzyme Flavourzyme được sản xuất qua quá trình lên men của nấm mốc

Aspergilus Oryaze Flavourzyme thuộc loại enzyme aminopeptidase, enzyme sẽ xúc

tác thủy phân tại vị trí N- , sản phẩm thủy phân chủ yếu là các acid amin và dipeptides, tripeptides và các peptides mạch ngắn

Các ion Pb2+, Cu2+ và Fe2+ có tác dụng ức chế enzyme làm giảm hoạt tính enzyme Flavourzyme, trong khi đó ion Zn2+

có tác dụng hoạt hóa làm tăng hoạt tính enzyme lên 84% so với ban đầu, các ion Mg2+, Ca2+, Mn2+ không ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme (Shie-Jea Lin, 2010)

14

Hình 1 2Cơ chế phản ứng thủy phân cơ chất protein của Substilisin Carlsberge

1.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về quá trình thủy phân gluten

Jin-Shui Wang (2007) thủy phân gluten lúa mì với enzyme papain trong 6h ở

50oC pH 6.5 tỷ lệ E/S là 6000U/g Dịch thủy phân được vô hoạt sau đó làm lạnh và tiến hành phân tách protein bằng phương pháp siêu lọc với màng UF có kích thước 5KDa Kết quả cho thấy dịch thủy phân và phân đoạn UF có chứa một số chất có khả năng nhường electron và có thể phản ứng với các gốc tự do chuyển đổi chúng sangsản phẩm

ổn định hơn và chấm dứt chuỗi phản ứng Theo kết quả nghiên cứu quá trình oxy hóa acid linoleic bịức chế bởi việc bổ sung các sản phẩm thủy phân Trong số ba phân đoạn, phân đoạn trong dòng permeat có khả năng kháng oxy hóa cao nhất gần bằng với tocopherol Khả năng chống oxy hóa của các peptides phân lập từ proteinthủy phân phụ thuộc vào trình tự acid amin của mạch peptides trong dịch thủy phân

Lan Liao và cộng sự (2010) tiến hành thủy phân gluten lúa mì bằng enzyme Pancreatin với một số biện pháp hỗ trợ Mẫu đối chứng thủy phân bằng Pancreatin

15

trong 24h, mẫu ADG tiến hành deamide bằng acid acetic 121oC trong 10 phút, sau đó thủy phân bằng enzyme trong 24h Mẫu HDG tiến hành deamide bằng HCl 121oC trong 10 phút sau đó thủy phân bằng enzyme trong 24h Kết quả khảo sát cho thấy mẫu đối chứng cho vị đắng mạnh, ít vị umami, có vị mặn Mẫu HDG thì ngọt hơn vẫn có vị mặn, đắng và có hương vị nước sốt thơm, trong khi đó ADG có vị umami mạnh hơn, nhưng chua hơn so với HDG.Gluten lúa mì được coi làmột nguồn nghèo protein hơn các nguồn động vật và đậu tương vì chứa ít aicd amin thiết yếu lysine(Lys) Tuy nhiên sau quá trình thủy phân thì hàm lượng này tăng lên Tác giả nhận thấy so với mẫu đối chứng thì hàm lượng lys trong HDG tăng từ 51.96mg/100g lên 97.47mg/100g, với mẫu ADG thì tăng từ 51.96mg/100g lên 75.88mg/100g Phân tích khối lượng phân tử trong dịch thu được thì mẫu đối chứng chứa chủ chủ yếu các peptides có M>10KDa, mẫu ADG có M<3KDa, mẫu HDG có M<5kDa

Một nghiên cứu khác của Mondher Mejri và cộng sự (2005) tiến hành thủy phân gluten bằng enzyme Neutrase kết hợp với việc bổ sung NaCl 0.2%, KCl 0.2%, cysteine 0.2% Những ảnh hưởng của KCl, NaCl và cysteine đến khả năng hòa tan trong nước của dịch thủy phân đã được nghiên cứu tại các giá trị pH khác nhau.Theo kết quả nghiên cứu tính tan cải thiện 28-30% khi bổ sung KCl và cysteine, trong khi đó NaCl ít hiệu quả hơn Kết quả phân tích cấu trúc cho thấy sự gia tăng tỷ lệ gấp nếp β,giảm cấu trúc xoắnα Tác giảgiải thích tính hòa tan của gluten được cải thiệnlà nhờ có sự tăng cường liên kết nước- proteinvà giảm tương tác protein-protein Thay đổi cấu trúc dẫn đến khả năng tiếp xúc tốt hơn của các phân tử nước và protein

Ahmad Asoodeh và cộng sự (2014) tiến hành nghiên cứu các peptides có hoạt tính sinh học thu được từ dịch thủy phân gluten Trong nghiên cứu này, protease trypsin đã được sử dụng để thủy phângluten Hoạt tính ức chế ACE của peptides được

đo và so sánh với mẫu đối chứng là captopril Kết quả cho thấy tất cả các peptides tinh khiết có hoạt tính ức chế ACE ở các cấp độ khác nhau thay đổi từ 24% đến 94%.Hai peptides, IPALLKR (P4) và AQQLAAQLPAMCR (P6), có khả năng ức chế ACE cao

và P6 không chứadư lượng tryptophan, tyrosine,phenylalanine tuy nhiên, prolinevà acid amin kỵ nước có mặt trong cả hai peptides P4 liên kết với các vị trí ACE tự do, trong khi P6 liên kết với cơ chất và enzyme tự do.Ngoài ra, nghiên cứu cho thấy mức

độ hấp thụ của các peptides cao hơn ba lần so với captopril

Từ các tài liệu tham khảo, có thể thấy sản phẩm thủy phân gluten có nhiều ưu điểm hơn gluten, có thể ứng dụng rộng hơn trong thực phẩm Để thu nhận gluten thủy phân, phương pháp sử dụng enzyme là phương pháp tiên tiến, an toàn Tuy nhiên, còn một số hạn chế đòi hỏi phải khắc phục để áp dụng quy trình vào thực tế Nhiều nghiên cứu tập trung vào việc cải thiện tính chất chức năng của dịch thủy phân và thu các peptides có hoạt tính sinh học, tuy nhiên các nghiên cứu nhằm thu dịch thủy phân giàu đạm để bổ sung vào thực phẩm còn hạn chế Vì vậy, trong đề tài này chúng tôi tập trung nghiên cứu thủy phân gluten lúa mì bằng cách kết hợp hai enzyme Alcalase và Flavourzyme

17

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất

2.1.1 Gluten lúa mì

Gluten lúa mì của hãng Roquette (Pháp) được cung cấp bởi Công ty TNHH Định Hướng Mới Sản phẩm được đóng gói 1kg/gói với thành phần nhà sản xuất cung cấp được trình bày trong bảng 2.1 Sản phẩm được bảo quản nhiệt độ thường, nơi khô thoáng

Bảng 2 1 Thành phần gluten lúa mìdo nhà sản xuất cung cấp

2.1.2 Enzyme Alcalase và Flavourzyme

Enzyme Alcalasevà Flavourzyme của hãng Novorzyme được cung cấp bởi công

ty TNHH Phương Trâm

Enzmye Alcalase được sản xuất bằng phương pháp lên mem vi khuẩn Bacillus

licheniformis

18

Bảng 2 2 Các đặc tính của enzyme Alcalase do nhà sản xuất cung cấp

Flavourzyme được sản xuất từ nấm mốc Aspergillus oryzae thuộc loại aminopeptidase

Bảng 2 3 Các đặc tính của enzyme Flavourzyme do nhà sản xuất cung cấp

19

2.1.3 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng để nghiên cứu:

- Hóa chất phân tích: NaOH, Ethanol, Albumin huyết thanh bò, Casein, Tyrosin, Glutamic,HCl,TCA, KH2PO4, Na2HPO4.12H2O, NaH2PO4.2H2O, CuSO4.5H2O Kali Natri tartrat,……

- Thuốc thử: Folin, Nihydrin, chất chỉ thị màu phenolphatalein…

 Bể điều nhiệt có lắc, cân 4 số, máy hút chân không, tủ sấy, tủ lạnh, máy sấy

ẩm hồng ngoại, máy cất đạm Kjeldalh

 Thiết bi ̣ ly tâm la ̣nh (Certomate® BS-1, Sigma, Hoa Kỳ)

 Thiết bị đo quang phổ (CT 2300 Spectrophotometer, Đài Loan)

 Một số thiết bị khác

20

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

o

Hình 2 1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu

- - Xác định hoạt tính enzyme Alcalase

Xác định thành

phần dịch thủy phân

-Hàm lượng Nito tổng -Hàm lượng NH 3 -Thành phần aa tự do

- Khối lượng phân tử

Ly tâm

NaOH

22

Thuyết minh sơ đồ

Cho gluten và nước theo tỷ lệ thí nghiệm 15%(w/w) Dùng dung dịch NaOH 1N

để chỉnh pH của hỗn hợp về giá trị pH khảo sát Tiến hành gia nhiệt hỗn hợp trong bể điều nhiệt có lắc đến nhiệt độ cần khảo sát trong 15 phút Sau đó, cho enzyme Alcalase vào mẫu thủy phân Sau thời gian thủy phân xác định, tiến hành vô hoạt enzyme ở

100oC trong 10 phút rồi làm nguội đến nhiệt độ thường bằng nước lạnh, ly tâm thu dịch thủy phân và xác định các thông số cần đo

 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến quá trình thủy

phân bằng Alcalase

Mục đích thí nghiệm tìm tỷ lệ E/S phù hợp Sơ đồ khảo sát được trình bày như hình 2.3

23

Hình 2 3 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ E/S đến quá trình thủy phân bằng Alcalase

 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân bằng

Alcalase

Tỷ lệ E/S

Gluten 15%(w/w)

Hòa tan Nước

Vô hoạt enzyme

Dịch thủy phân

Làm nguội

-Xác định DH -Hàm lượng protein hòa tan

Ly tâm

0.029AU/g 0.058AU/g 0.087AU/g 0.116AU/g 0.145AU/g 0.174AU/g

v = 5000g t= 30 phút

24

Mục đích thí nghiệm: tìm nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động nhằm thu

được DH cao nhất và hàm lượng protein hòa tan cao Sơ đồ khảo sát trình bày trong

Gluten 15%(w/w)

Hòa tan Nước

Làm nguội

-Xác định DH -Hàm lượng protein hòa tan

t= 30 phút

25

 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân

Mục đích thí nghiệm: Tìm giá trị pH mà enzyme hoạt động hiệu quả nhằm thu

hồi được nhiều protein hòa tan và các peptides mạch ngắn

Hình 2 5 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng pH đến quá trình thủy phân bằng Alcalase

Alcalase

pH thích hợp

Gluten 15%(w/w)

Hòa tan Nước

Làm nguội

-Xác định DH -Hàm lượng protein hòa tan

t= 30 phút

26

 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân

Mục đích thí nghiệm : tìm khoảng thời gian kết thúc phản ứng mà tại đó DH thu được cao nhất, hiệu suất thu hồi cao

Hình 2 6 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến quá trình thủy phân bằng Alcalase

2.3.2.2Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bằng enzyme

Flavourzymesau khi xử lý với Alcalase

Vô hoạt enzyme

Dịch thủy phân

T = TN2 E/S = TN1

Làm nguội

-Xác định DH -Hàm lượng protein hòa tan

Cảm quan

v = 5000g

t = 30 phút

Ly tâm

27

Các bước tiến hành quá trình thủy phân gluten lúa mì bằng enzyme Flavourzyme được trình bày trong hình 2.7

Hình 2 7 Sơ đồ thủy phân bằng enzyme Flavourzyme có tiền xử lý Alcalase

Gluten được thủy phân với Alcalase theo các điều kiện thích hợp là những kết quả khảo sát ở mục 2.3.2.1 Sau đó tiến hành vô hoạt enzyme, làm nguội đến nhiệt độ phù

Dịch thủy phân với

Alcalase

Chỉnh pH

Gia nhiệt

Thủy phân Flavourzyme

Vô hoạt enzyme

Làm nguội

Dịch thủy phân

Ly tâm HCl

28

hợp Chỉnh về pH thích hợp bằng HCl 0.2N, bổ sung enzyme Flavourzyme để tiếp tục thủy phân Các thông số cần xác định là tỷ lệ E/S, nhiệt độ, pH, thời gian phản ứng

 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất đến quá trình thủy

phânbằng Flavourzyme sau khi xử lý Alcalase

Mục đích thí nghiệm: tìmtỷ lệ E/S phù hợpnhằm thu dịch thủy phân giàu aa tự do

Hình 2 8Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ E/S đến quá trình thủy phân bằng

Flavourzyme sau khi xử lý Alcalase

Chỉnh pH 6.5

v = 5000g

t = 30 phút

Dịch thủy phân với Alcalase

Vô hoạt enzyme

Ly tâm Làm nguội

Dịch thủy phân

0.051AU/g 0.102AU/g 0.153AU/g 0.204AU/g 0.255AU/g 0.306AU/g

-Hàm lượng aa