KHÓA LUẬN TOT NGHIEP THU Y 051214

Xuất phát từ thực tiễn của tình hình thức ăn bị nhiễm khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn tươi gây ngộ độc thực phẩm cho con người, với mục đích cung cấp tư liệu khoa họ

Thực phẩm có nguồn gốc động vật rất đa dạng như: Thịt, trứng, sữa Trong đó thịt lợn là loại sản phẩm thông dụng thường được dùng để chế biến cácmón ăn trong thực đơn hàng ngày của mỗi gia đình Thịt lợn có giá trị dinhdưỡng cao cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển và hoạt động sống của conngười, trong thịt có nước, protit, lipit, các chất khoáng và vitamin Do đó thịt lợnkhông những là thức ăn tốt cho con người mà còn là môi trường thích hợp cho visinh vật phát triển Để có được thịt an toàn cần một dây chuyền sản xuất thựcphẩm bắt nguồn từ con giống, thức ăn, nước uống, thực hiện quy trình vệ sinhthú y trong chăn nuôi đến khi đưa gia súc đến nơi giết mổ, điều kiện vệ sinh thú

y ở cơ sở và quy trình thực hiện trong giết mổ, quá trình bảo quản pha lọc, vậnchuyển đến nơi chế biến và tiêu thụ phải được đảm bảo

Tuy nhiên trong những năm gần đây, ngộ độc thực phẩm xảy ra thườngxuyên với số vụ ngộ độc thực phẩm rất lớn làm ảnh hưởng không nhỏ tới sứckhỏe và kinh tế của con người Bộ Y tế xếp thịt lợn là một trong 10 nhómthực phẩm có nguy cơ cao và một trong các tiêu chuẩn quan trọng quy địnhgiới hạn tối đa cho ô nhiễm sinh học đối với thịt lợn là không được nhiễm

Salmonella [3] Vì vậy, những tác động của các mối nguy có trong thịt lợn tới

sức khỏe qua quá trình tiêu dùng là đáng lo ngại

Xuất phát từ thực tiễn của tình hình thức ăn bị nhiễm khuẩn, đặc biệt là

vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn tươi gây ngộ độc thực phẩm cho con người,

với mục đích cung cấp tư liệu khoa học có liên quan về đặc điểm dịch tễ, đặc

tính sinh học, đặc tính kháng nguyên của mầm bệnh để từ đó lựa chọn nhữngbiện pháp phòng bệnh phù hợp, từng bước khống chế ngộ độc thực phẩm, tôi

tiến hành đề tài: “Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp trong thịt lợn tươi bán tại một số chợ của Thái Nguyên và Tuyên Quang”.

1.2 Mục đích, mục tiêu và ý nghĩa đề tài

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp trên thịt lợn.

- Tìm hiểu một số đặc tính sinh học hóa học, tính gây bệnh và serovar

của các chủng Salmonella phân lập được.

1.2.2 Mục đích của đề tài

Giúp cho các cơ quan chức năng và người tiêu dùng thấy rõ được thựctrạng vệ sinh thịt lợn ở một số chợ của Thái Nguyên và Tuyên Quang Từ kếtquả nghiên cứu được tiến hành thử nghiệm tính mẫn cảm của vi khuẩn

Salmonella đối với một số thuốc kháng sinh để đề ra biện pháp phòng và trị

bệnh một cách hiệu quả nhất

1.2.3 Ý nghĩa của đề tài

1.2.3.1 Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học

- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn tươi.

- Xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Salmonella đã

phân lập được

- Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được

trên chuột bạch khỏe

- Xác định tính mẫn cảm của các chủng Salmonella đã phân lập được

đối với một số loại kháng sinh

Kết quả nghiên cứu của đề tài là những tài liệu có giá trị phục vụ cho việchọc tập và nghiên cứu khoa học của sinh viên trong các trường Nông Nghiệp

1.2.3.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

Đề tài nghiên cứu góp phần nào làm rõ thực trạng vệ sinh, giết mổ vàbuôn bán thịt lợn tại các chợ của Thái Nguyên và Tuyên Quang Đồng thờigiúp người tiêu dùng có nhận thức đúng đắn hơn về sản phẩm động vật sửdụng hàng ngày để tránh xảy ra những trường hợp ngộ độc gây tử vong đángtiếc do không có sự hiểu biết về vệ sinh an toàn thực phẩm

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1 Tình hình ô nhiễm thịt lợn do vi khuẩn

2.1.1 Thịt tươi và các dạng hư hỏng của thịt

2.1.1.1 Thịt tươi

Theo Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Văn Quang (2000) [12]: Thịt tươi

là thịt chưa bị biến chất bởi men của bản thân nó và của vi sinh vật, làm thayđổi cảm quan và hình thành những chất có hại Thịt tươi là một trong nhữngsản phẩm động vật có giá trị dinh dưỡng cao được sử dụng rộng rãi bởi thịt cóđầy đủ những chất dinh dưỡng sinh học cần thiết cho sự sinh trưởng, pháttriển và hoạt động sống của con người

Bảng 2.1 Đánh giá kết quả cảm quan thịt

Tên chỉ tiêu Thịt tươi Thịt kém tươi, thịt ôi

1.Trạng thái

bên ngoài

- Bề mặt thịt khô, sạch, không dính lông và tạp chất lạ

- Có độ đàn hồi, ấn ngón tay vào thịt không để lại dấu trên bề mặt thịt

- Tuỷ trong, bám chặt vào thành ống tuỷ (nếu có)

- Gân trong, bám chặt vào thành ống xương, độ đàn hồi bình thường.

- Bề mặt thịt khô, có khi ướt nhớt, màu sẫm

- Hơi nhão, ấn tay vào để lại vết nhẹ (thịt kém tươi), vết hằn sâu, không mất (thịt ôi)

- Tuỷ đục, co lại không đầy ống xương, mùi ôi, róc ra khỏi ống tuỷ

- Gân kém trong, độ đàn hồi kém

2 Vết cắt - Hơi ướt, màu hồng - Ướt nhớt, màu thẫm

3 Màu sắc - Màu đặc trưng của sản phẩm - Có màu khác thường

4 Mùi - Đặc trưng của sản phẩm,

không có mùi lạ - Có mùi vị ôi

5 Mỡ - Màu sáng, độ rắn và mùi tự

nhiên của thịt tươi - Màu tối, độ rắn giảm

6 Nước luộc - Trong, mùi vị thơm ngon, trên

mặt có giọt mỡ to

- Mùi vị ôi, đục, váng mỡ nhỏ hoặc hầu như không còn vết mỡ

Theo phương pháp sinh hoá học, thịt tươi, thịt kém tươi và thịt ôi đượcđánh giá bằng các phản ứng sinh hoá học dựa theo các tiêu chuẩn sau:

Bảng 2.2 Tiêu chuẩn đánh giá thịt tươi bằng các phản ứng sinh hoá học

Nước thịt vẩn đục hoặc có hạt

Nước thịt đục có cặn sánh như keoPhản ứng

peroxydaza (thử

benzidin)

Nước thịt ngâm, lọc có màu xanh lá

mạ, sau mấy phút chuyển màu nâu

Nước thịt ngâm, lọc không có hoặc lâu mới có màu xanh lá mạ

Nước thịt ngâm, lọc không biến đổi màu sắc

Phản ứng Nestler

tìm NH3

Nước thịt ngâm, lọc không màu

Nước thịt ngâm, lọc có màu xanh

lá mạ

Nước thịt ngâm, lọc có màu vàng

vỏ chanhPhản ứng H2S

(dùng axetat chì)

Giấy lọc giữ nguyên màu

Giấy lọc có màu nâu nhạt

Giấy lọc có màu nâu sẫm hoặc đenBằng phương pháp soi kính, thịt được đánh giá như sau:

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn đánh giá thịt tươi bằng phương pháp soi kính Phẩm

Thịt kém tươi Mỗi vi trường có 20-30 vi khuẩn, đôi khi cơ thớ cơ bị hư hỏngThịt ôi Mỗi vi trường có trên 30 vi khuẩn, có nhiều thớ cơ bị thối rữa

Theo phương pháp vi khuẩn học, tiêu chuẩn Việt Nam 7046 : 2002[30] quy định giới hạn tối đa cho phép của một số vi sinh vật có trong 1gam thịt tươi

Bảng 2.4 Các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi

(TCVN 7046 : 2002) [30]

Giới hạn tối đa

1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm 106

2 E.coli, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 102

3 Samonella, số vi khuẩn trong 25g sản phẩm 0

4 Bacillus cereus, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 102

5 Staphylococcus aureus, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 102

6 Clostridium perfringens, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 10

7 Clostridium botulinum, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 0

2.1.1.2 Các dạng hư hỏng của thịt

Thịt trong quá trình bảo quản có thể bị biến chất và hư hỏng Sau khigiết mổ, thịt chưa bị biến chất nhưng giữ thịt lâu chưa kịp tiêu thụ hoặc cất đểdùng dần ở những điều kiện không thích hợp sẽ bị biến chất bởi các enzyme

có sẵn trong thịt và vi sinh vật dẫn đến ôi thiu, hư hỏng về trạng thái cảmquan, hình thành những chất có hại

Những hiện tượng hư hỏng của thịt thường gặp là: thịt nhớt, thối rữa,lên men chua, có các chấm màu trên bề mặt thịt, thịt mốc… Tuy nhiên, trong

thịt bảo quản lạnh vẫn có các vi sinh vật ưa lạnh như nhóm: Pseudomonas, Achrmobacter, Flavobacterium, nấm men, nấm mốc vẫn phát triển Thịt có

mùi đất là do xạ khuẩn mọc, thịt muối vẫn tồn tại vi sinh vật ưa mặn và làmhỏng thịt (Lương Đức Phẩm, 2000) [14]

* Sinh nhớt

Thịt sinh nhớt hay còn gọi là thịt hóa nhầy trên bề mặt, đây là hiệntượng thường thấy ở bề mặt thịt ướp lạnh Thực chất của hiện tượng này làgiai đoạn đầu của sự hư hỏng Lớp nhớt này gồm có nhiều vi khuẩn khác

nhau: Micrococcus albus, Micrococcus liquefaciens, Micrococcus aureus,

Micrococcus candicus, Streptococcus liquefaciens, E.coli, Escherichia paracoli, Bacillus subtilis Tốc độ phát triển lớp nhầy này không những phụ

thuộc vào độ ẩm không khí, mà còn phụ thuộc vào sự biến động của nhiệt độ.Nhiệt độ tối ưu cho sự hóa nhầy là 2 - 100C

Khi thịt hóa nhầy, trên 1cm2 của thịt có tới hàng trăm triệu tế bào vikhuẩn Sự hóa nhầy vừa làm cho thịt giảm giá trị cảm quan, vừa làm giảmchất lượng của thịt

Để hiện tượng này được ngăn ngừa và hạn chế, ta nên bảo quản thịt tốtnhất ở 00C và độ ẩm tương đối của không khí là 85 - 90%, thịt sẽ không códấu hiệu bị hư hỏng trong ba tuần lễ

* Thịt lên men chua

Do vi khuẩn Lactic và nấm men hoặc quá trình tự phân giải kết hợp với

tác động của vi khuẩn lên men làm chua thịt thường là những thịt có nhiềuglycogen Sản phẩm của quá trình lên men là các axit hữu cơ Ban đầu cácaxit này ức chế các vi khuẩn thối rữa phát triển nhưng ở môi trường axit, nấmmốc lại dễ phát triển Nấm mốc phát triển tạo ra amoniac và kiềm nitrat làmtrung hòa môi trường axit, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối rữa phát triển.Thịt bị chua có màu xám và có mùi khó chịu Hiện tượng này báo hiệu thịtsắp bị thối

* Sự thối rữa của thịt

Quá trình thối rữa của thịt được bắt đầu từ bề mặt rồi tiến sâu vàotrong Tác nhân gây nên sự thối rữa của thịt chủ yếu là vi khuẩn Các vi khuẩnthuộc hai nhóm hiếu khí, yếm khí và không có nha bào Thành phần hệ sinhvật có sự thay đổi dần dần trong quá trình thối rữa Cầu khuẩn hiếu khí thamgia đầu tiên rồi đến trực khuẩn hiếu khí Quá trình thối rữa càng tiến sâu vàobao nhiêu thì nhóm hiếu khí giảm, nhường chỗ cho vi khuẩn yếm khí Vikhuẩn phân hủy protein trước rồi đến các loài đồng hóa các sản phẩm phânhủy (Lương Đức Phẩm, 2000) [14]

Cùng quan điểm như trên, Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Văn Quang(2000) [12] cũng cho rằng: Thịt bị thối rữa là do vi khuẩn gây thối phát triển

và hoạt động mạnh trên bề mặt thịt Các vi khuẩn này tiết men proteaza làmphân giải protit và tạo ra các sản phẩm có mùi hôi thối như amoniac, indol,

scatol, mercaptan… Quá trình thối rữa dần dần ăn sâu vào trong theo các lớptiếp giáp giữa cơ với xương hoặc các mạch máu lớn.

* Sự biến đổi sắc tố của thịt

Theo Lương Đức Phẩm (2000) [14]: Màu đỏ của thịt có thể biến thànhmàu xám, nâu hoặc xanh lục do các vi sinh vật hiếu khí phát triển trên bề mặt

như: Bacterium prodigiosum sinh ra các vết đỏ, Pseudomonas pyocianea xanh, Pseudomonas fluorescens - lục, các sản phẩm là do oxy hóa hoặc hydro sunfua tạo thành Một số loài Lactobacillus và Leuconostoc làm cho xúc xích,

-lạp xường có màu xám

Trường hợp thịt bị biến đổi sắc tố, nếu mùi của thịt vẫn bình thường vàkhông tìm thấy những chất có độc tính thì chỉ cần cắt bỏ những vết màu, còn thịtvẫn sử dụng bình thường (Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Văn Quang, 2000) [12]

* Hiện tượng lân quang

Do vi khuẩn phát quang phát triển trên bề mặt thịt gây ra Thịt phátsáng không kèm theo quá trình thối rữa (Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn VănQuang, 2000) [12]

* Thịt mốc

Do các mốc Mucor và Aspergillus phát triển thành, làm cho thịt giảm

tuyệt đối các chất hòa tan, tăng tính kiềm do phân hủy protein và lipit, tạothành các axit béo bay hơi Mốc mọc trên bề mặt của thịt và ăn sâu vào trongtới 2 - 5 mm, làm cho thịt có mùi mốc, nhớt dính, biến màu Không nên bảoquản và vận chuyển thịt mốc (Lương Đức Phẩm, 2000) [14]

2.1.2 Ô nhiễm thịt tươi do vi khuẩn

* Ô nhiễm vi khuẩn từ nước

Sinh vật có mặt trong môi trường nước ở nhiều dạng khác nhau Bêncạnh các vi sinh vật có ích còn có nhiều nhóm vi sinh vật gây bệnh hoặctruyền bệnh cho người và động vật Mà nguồn gây ô nhiễm chủ yếu là từphân, rác, nước thải sinh hoạt, xác chết sinh vật,… chúng sẽ làm cho nước bị

ô nhiễm và làm mất cân bằng sinh thái tự nhiên của sông, suối, ao, hồ… gâyảnh hưởng trầm trọng tới sức khoẻ cộng đồng dân cư

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1976) [17] nước tự nhiên có chứa các giống

vi khuẩn như Pseudomonas, Chromobacterrium, Proteus, Achromobacter, Micrococcus, ngoài ra có thể bị ô nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác như Bacillus, Enterobacter, E.coli từ môi trường.

Nước bị ô nhiễm nặng thì số lượng vi sinh vật càng tăng, ở tầng nướcsâu sẽ ít vi sinh vật hơn lớp nước trên bề mặt

Người ta dùng chỉ số Coliforms để đánh giá chất lượng nước dưới góc

độ ô nhiễm tác nhân sinh học Đây là chỉ số phản ánh số lượng vi khuẩn trongnước, thường không gây bệnh cho người và động vật nhưng biểu hiện sự ô

nhiễm nước bởi các tác nhân sinh học Để xác định chỉ số Coliforms người ta

nuôi cấy mẫu trong các dung dịch đặc biệt và đếm số lượng chúng sau mộtthời gian nhất định Ô nhiễm nước được xác định theo các giá trị tiêu chuẩnmôi trường

* Ô nhiễm vi khuẩn từ không khí

Không khí chuồng nuôi, sân bãi, nhà xưởng… có thể chứa một lượng

vi sinh vật rất lớn Độ ẩm không khí càng cao thì mật độ vi sinh vật càng cao.Đặc biệt môi trường không khí dễ làm phát tán nhanh chóng vi sinh vật nhất.Bên ngoài và bên trong khu vực chuồng nuôi gia súc, gia cầm, lò giết mổ…

có thể tìm thấy những vi khuẩn gây bệnh như: Staphylococcus, Salmonella, Streptococcus, E.coli…

Ngoài ra, trong đất cũng chứa một lượng lớn vi sinh vật có nguồn gốckhác nhau Những vi sinh vật này sẽ gián tiếp làm ô nhiễm thực phẩm Đầutiên chúng sẽ nhiễm vào động vật sinh sống trên bề mặt, sau đó chúng sẽ đượcphát tán vào không khí, nước và cuối cùng nhiễm vào thực phẩm

* Ô nhiễm vi khuẩn trong quá trình giết mổ và pha lọc thịt

Thịt động vật khoẻ sẽ đảm bảo chất lượng và ít có nguy cơ bị xâmnhiễm của vi sinh vật gây ô nhiễm Tuy nhiên, trong quá trình giết mổ khôngthực hiện nghiêm ngặt quy trình vệ sinh cũng dẫn đến thịt dễ bị ô nhiễm

Tại nơi giết mổ gia súc không được nghỉ ngơi hợp lý và chế độ chămsóc trước không tốt sẽ ảnh hưởng tới chất lượng thịt Trong một số trườnghợp, sau khi giết mổ hiện tượng xác cứng không xảy ra bởi vì cơ thể gia súcđói, mất nước, những liên kết không còn giữ nguyên được hình dạng, tính dẻodai của thịt bị giảm và làm mất tính kháng khuẩn tự nhiên của thịt, bên cạnh

đó glucogen dự trữ trong cơ thể thấp sẽ làm cho lượng axit lactic giảm và làmcho pH của thịt cao, như vậy sẽ thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào thịt pháttriển tốt (Kauffmann, 1997) [40]

Ngoài ra, trong quá trình sơ chế sản phẩm: thái, lọc da, cạo lông…thịt cũng dễ bị nhiễm vi khuẩn từ con vật qua: da, lông, sừng, móng, ốngtiêu hoá…

Mặt khác, khi giết mổ chính dao mổ, vải bọc, chân tay, quần áo bảo hộlao động của công nhân không vệ sinh cũng góp thêm một nguyên nhân làm ônhiễm sản phẩm thịt

* Ô nhiễm trong quá trình phân phối thực phẩm

Quá trình phân phối thực phẩm là thời gian thuận lợi cho vi khuẩn xâmnhập vào thực phẩm Hiện nay, hệ thống giết mổ, vận chuyển, phân phối chủyếu là thủ công nên khó kiểm soát được nguy cơ lây nhiễm vi sinh vật

Theo Herry (1990) [37] tỷ lệ ô nhiễm vi khuẩn Salmonella vào thực

phẩm qua quá trình vận chuyển là 40% Trong quá trình vận chuyển thựcphẩm chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như vật liệu bao gói, phương tiện vậnchuyển Những yếu tố này tác động trực tiếp vào thực phẩm Theo Đặng ThịHạnh (1998) [7] cho biết sự chênh lệch tổng số vi khuẩn hiếu khí của thịt lấy

từ các chợ và thịt lấy ở các đầu mối giao thông là khá cao, bình quân khoảng1,7x10 vi khuẩn/g

2.2 Ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella

2.2.1 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

Vi khuẩn Salmonella sống trong phủ tạng của gia súc, gia cầm và vấy

nhiễm vào thịt khi giết mổ Chúng cũng có mặt ở phân và dễ dàng xâm nhập

vào trứng gia cầm qua những lỗ nhỏ li ti ở vỏ Những thức ăn giàu dinh

dưỡng như thịt, cá, trứng, sữa rất dễ bị nhiễm Salmonella trong quá trình

chế biến, bảo quản, vận chuyển nếu không bảo đảm vệ sinh

Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển tại đó, sau đó theo hệ thống bạch huyết

và tuần hoàn gây ra tình trạng nhiễm trùng huyết Do đó trong thời kỳ đầu, lấymáu người bệnh nuôi cấy sẽ phát hiện vi khuẩn Vi khuẩn gây viêm ruột, pháhỏng tế bào niêm mạc ruột, tiết ra độc tố Độc tố này thấm qua thành ruột vàomáu Ngoài ra, vi khuẩn trong hệ tuần hoàn tiết ra nội độc tố Nội độc tố chủyếu tác động trên hệ thần kinh vận động của huyết quản, làm giảm độ bền củathành mao quản và giảm chức năng điều tiết thân nhiệt của cơ thể

2.2.2 Triệu chứng của bệnh

Triệu chứng biểu hiện phụ thuộc vào số lượng và tỷ lệ nhiễm của vikhuẩn vào thực phẩm Thời gian ủ bệnh khoảng 12 - 24 giờ, có khi vài giờnhưng cũng có khi vài ngày Triệu chứng trước tiên là nhức đầu, chán ăn, mặttái nhạt, toát mồ hôi, nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy Thân nhiệt tăng lên 38

- 400C trong vòng 2 - 4 ngày sau khi phát bệnh và tùy theo mức độ nặng nhẹ

mà kéo dài 3 - 7 ngày Bệnh nặng gây viêm dạ dày - ruột, vi khuẩn tồn tạitrong ống tiêu hóa từ 6 - 8 tháng và tiếp tục bài thải ra môi trường bên ngoài

Vi khuẩn thải 50% ở đầu tuần thứ 2 và còn 15% ở tuần thứ 4

2.2.3 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella

2.2.3.1 Thực trạng ngộ độc thực phẩm do Salmonella trên thế giới

Năm 2003 tại Bỉ có tới 12.849 trường hợp ngộ độc do vi khuẩn

Salmonella, 6.556 trường hợp nhiễm vi khuẩn Campylobacter và một số vi

khuẩn khác mà nguyên nhân chủ yếu là chế biến thực phẩm chưa kỹ trong đóthịt nhiễm bẩn chiếm tới 20% (Bộ Y tế, 2005) [2]

Ngày 14/2/2005 tại Anh hơn 160 khách hàng bị ngộ độc sau khi ăn thịt

nướng bị nhiễm Salmonella tại một cửa hàng thịt nướng ở London [51].

Tháng 7 năm 2007 tại Rumani có 117 người lớn và trẻ em bị ngộ độc

do ăn bánh kem trong thời gian cắm trại Tháng 8 năm 2007, tại Hungaryxảy ra vụ ngộ độc tại một cửa hàng ở Budapest làm 31 du khách ngộ độc.Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là các vi khuẩn Thương hàn,

trong đó hàng đầu là Salmonella typhimurium (Cục An toàn Vệ sinh thực

phẩm, 2008) [6]

Tháng 11/2007 tại Bosnia Herzegovinia, hơn 400 người phải nhập viện

do nhiễm Salmonella sau khi ăn bánh mì gà tại một cửa hàng thức ăn nhanh ở

trung tâm thành phố Sarajevo [51]

Ngày 9/7/2008 tại Mỹ đã có trên 1.000 người bị ngã bệnh vì vi khuẩn

Salmonella đây được xem là con số lớn từ 10 năm qua tại Hoa Kỳ vì ngộ độc

thực phẩm Thủ phạm chính bị nghi ngờ là cà chua, ớt đỏ và ngò tươi Tốc độnhiễm trung bình là 25 - 40 ca mỗi ngày, lan tràn trong 41 tiểu bang TạiCanada cũng có 4 trường hợp [49]

Năm 2009, cũng tại Mỹ, một nhà máy sản xuất bơ đậu phộng nhiễm khuẩn

Salmonella typhimurium làm ít nhất 691 người bị ngộ độc thực phẩm [49].

Ngày 05/08/2011, Công ty chế biến thịt Cargill, trụ sở ở bang Arkansas(Mỹ) đã thu hồi tự nguyện khoảng 16,3 triệu kg thịt gà tây xay sau khi loại

sản phẩm này bị xem là mối liên hệ với đợt bùng phát khuẩn Salmonella ở 26

bang, làm 1 người thiệt mạng và 76 người bị bệnh [48]

Năm 2013, Theo Trung tâm Khoa học về Lợi ích Cộng đồng (Mỹ),trong vòng 6 tháng đã có khoảng 278 người tại 18 bang ở Mỹ bị nhiễm bệnh

và nhiều người trong số này đã phải nhập viện do ăn phải thịt gà có nhiễm

Salmonella - một loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm [50]

2.2.3.2 Thực trạng ngộ độc thực phẩm do Salmonella trong nước

Ở Việt Nam vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm là một vấn đề đã và đangđược Đảng và Nhà nước quan tâm Tuy nhiên, vấn đề này trên thực tế lạikhông hoàn toàn dễ dàng trong quá trình thực hiện Tình trạng ngộ độc đã xảy

ra ở hầu hết các địa phương, nguyên nhân ngộ độc rất đa dạng: ngộ độc dothức ăn bị nhiễm khuẩn, do hoa quả phun thuốc trừ sâu, bánh phở có hàn the Nhưng nguyên nhân do vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 32,8-55,8%; đặc biệt là

vi khuẩn Salmonella đã gây ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm.

Ngộ độc thức ăn ở Việt Nam từ năm 1983-1989, có tổng số 269 vụ ngộđộc theo dõi với 5.756 người mắc, tử vong 156 (2,7%) mà nguyên nhân chủ

yếu do Salmonella.

Năm 1994 tại thành phố Hồ Chí Minh có 370 ca ngộ độc thực phẩm do

ăn bánh mì, hủ tiếu nhiễm Salmonella 300 người của tỉnh Thái Bình phải vào viện cấp cứu do ăn nem thính bì lợn nhiễm Salmonella enterritidis (Phan Thị

Kim, 2002) [11]

Ngày 16/5/2005 vụ ngộ độc kem Tràng Tiền làm 13 người gia đình chịNgô Mai Lan phải vào viện Bạch Mai Nguyên nhân chính là do trong kem

nhiễm vi khuẩn Salmonella [53]

Ngày 9/5/2008 theo ông Trần Đáng - Cục trưởng cục vệ sinh an toàn thựcphẩm (Bộ Y tế) thông báo qua kiểm tra 100 nhà hàng, quán ăn, cơ quan chứcnăng đã đóng cửa, tạm đình chỉ hoạt động 60 cơ sở vi phạm vệ sinh an toàn thựcphẩm, trong đó có 23 quán thịt chó Qua xét nghiệm mẫu thớt và mẫu dồi chó đã

phát hiện vi khuẩn thương hàn (Salmonella) Có vi khuẩn tả trong mẫu rau diếp

cá và trong thớt ở một số nhà hàng trên phố Cầu Giấy, Trường Chinh đã gây radịch tiêu chảy cấp tại địa bàn thành phố Hà Nội [52]

Ngày 10/7/2013, hơn 100 công nhân làm việc tại công ty may Foremart(Hưng Yên) nhập viện trong tình trạng sốt, đau bụng và tiêu chảy Cục Antoàn Thực phẩm cho biết nguyên nhân của vụ ngộ độc bếp ăn tập thể tại công

ty may Foremart làm hơn 100 người mắc là do vi khuẩn Salmonella và độc tố

của chúng gây ra [47]

Ngày 4/10/2013 tại công ty TNHH một thành viên Wondo Vina (trụ sởtại xã Long Bình Điền, huyện Chợ Gạo tỉnh Tiền Giang) khoảng 1.200 côngnhân nhập viện vì ngộ độc thực phẩm Sau đó, thủ phạm của vụ ngộ độc tập

thể được xác định chính là vi khuẩn Salmonella có trong món thịt viên nhồi

trứng cút [47]

Ngày 16/10/2013, trên địa bàn thị trấn Khe Sanh huyện Hướng Hóatỉnh Quảng Trị đã xảy ra vụ ngộ độc thực phẩm sau khi ăn bánh mỳ làmkhoảng 382 người phải nhập viện Nguyên nhân được Sở Y tế tỉnh Quảng Trị

xác định là do vi khuẩn Salmonella hiện diện trong thực phẩm bày bán tại cơ

sở sản xuất bánh mỳ Quang Trung [47]

2.3 Đặc điểm sinh vật học của vi khuẩn Salmonella gây ô nhiễm thịt

2.3.1 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Salmonella

Salmonella là vi khuẩn Gram âm, hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích

thước 0,4 - 0,6 x 1- 3µm, không hình thành nha bào và giáp mô Đa số cácloài đều có khả năng di động mạnh do có từ 7 - 12 lông xung quanh thân (trừ

S gallinarum và S pullorum gây bệnh cho gia cầm), là loại vi khuẩn hiếu khí

hoặc yếm khí tùy tiện Vi khuẩn dễ nhuộm màu với các thuốc nhuộm thôngthường, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu Gram âm, bắt màu đều ở toàn thân hayđậm ở hai đầu (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [21].

Theo Lê Văn Tạo (1993) [20] khi quan sát trên kính hiển vi điện tử đãcho biết: bằng phương pháp nhuộm của Haschem người ta phát hiện trên bề

mặt vi khuẩn Salmonella ngoài lông còn có các cấu trúc Fimbriae Đây là

một cấu trúc ngắn hơn lông vi khuẩn, thường có kết cấu hình xoắn, đượcmọc lên từ một hạt gốc nằm trên thành tế bào, có thể quan sát được dướikính hiển vi điện tử có độ phóng đại từ 2 - 400 Fimbriae, với 2 chức năng làgiúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non để gây bệnh và giúp

vi khuẩn liên kết với nhau để trao đổi thông tin di truyền bằng hình thức tiếphợp, di truyền ngang

2.3.2 Đặc tính nuôi cấy

Theo Nguyễn Như Thanh và cs (2001) [21] cho biết vi khuẩn Salmonella

phát triển trong điều kiện hiếu khí, nhưng có thể phát triển trong điều kiện yếmkhí, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH thích hợp từ 7,2 - 7,6 Trong môi trường hiếu

khí Salmonella mọc tốt hơn trong môi trường yếm khí.

Vi khuẩn Salmonella dễ dàng phát triển ở các môi trường dinh dưỡng

thông thường và rất khó phân biệt được với sự phát triển của các vi khuẩnđường ruột khác

Nuôi cấy trên môi trường nước thịt ở 370C sau 24 giờ môi trường đục đều,

có cặn trong điều kiện phát triển mạnh Khi lắc, cặn tan thành canh khuẩn đồng

nhất, rất hiếm khi hình thành màng Sự phát triển của vi khuẩn Salmonella xảy

ra nhanh chóng trong khoảng 12 - 18 giờ đầu, sau đó giảm ở thời gian 48 - 72

giờ Tốc độ phát triển của vi khuẩn Salmonella phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy,

pH, nồng độ muối và mức độ dinh dưỡng có trong môi trường

Nhiệt độ thích hợp của Salmonella là từ 35 - 370C, nhưng nó có thểphát triển ở biên độ nhiệt độ rộng từ 5 - 470C Nhiều tác giả chỉ ra rằng: khả

năng phát triển của vi khuẩn Salmonella ở nhiệt độ thấp phụ thuộc vào serotyp: S.panama phát triển ở 40C, S.heidelberg và S.monte ở 5,70C sau 7ngày nuôi cấy Về mặt lý luận nhiệt độ càng thấp thì càng kéo dài pha ức chế

của vi khuẩn Trong môi trường nuôi cấy, vi khuẩn Salmonella bị ức chế với

nồng độ 3 - 4% muối Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ muối khácnhau trong môi trường trypticase soy broth (pH=5,0 - 6,5) có bổ sung từ 2 -

8% muối đối với 23 chủng Salmonella, cho thấy khả năng ức chế sự phát triển

của vi khuẩn sẽ tăng khi tăng nồng độ muối và giảm nhiệt độ nuôi cấy Trongmột số trường hợp, vi khuẩn có thể phát triển ở nồng độ muối cao nếu nhiệt

độ nuôi cấy tăng như:

S heidelberg, S typhimurium (không kể S derby) phát triển tốt ở 80Ctrong môi trường dinh dưỡng với nồng độ muối 1%, trong khi đó cả 3 chủngtrên có thể phát triển ở 120C với nồng độ muối là 4% và 220C với 5% muối

Giá trị pH thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn Salmonella từ 6,5

-7,5; tuy nhiên, nó có thể biến động từ 4,5 - 9,0 Việc sử dụng môi trường nuôicấy lỏng hay đặc, ảnh hưởng tới mức độ chịu đựng pH của vi khuẩn

Salmonella như: S heidelberg phát triển trong dãy pH từ 5,0 - 9,0 trên

trypticase soy agar nhưng trong môi trường lỏng giống môi trường trên giá trị

pH phải là 6,0 - 8,0

Nhiệt độ nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến pH thích hợp cho sự phát triển

của vi khuẩn Salmonella Trong môi trường acid pH = 4,0 với acid Citric thì

vi khuẩn S anatum phát triển ở nhiệt độ nuôi cấy từ 25 - 320C Tuy nhiên vikhuẩn này không phát triển ở cùng độ pH trên khi nuôi cấy ở nhiệt độ thấphơn 160C và cao hơn 370C hoặc 430C, ở điều kiện nuôi cấy này để vi khuẩn cóthể phát triển được thì đòi hỏi pH là 4,3

- Trên môi trường MacConkey: Bồi dưỡng ở 370C, sau 18 - 24 giờ vi

khuẩn Salmonella mọc thành những khuẩn lạc tròn, trong, màu xám, nhẵn

bóng, hơi lồi ở giữa

Trong môi trường XLD (Xylose Lysine Deoxycholate Agar): Sau 18

-24 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 370C, các khuẩn lạc Salmonella có dạng S, màu

đen, tròn, bóng, hơi lồi ở giữa

- Trên môi trường thạch thường (Nutrient Broth Agar): Sau 24 giờ nuôicấy những khuẩn lạc tròn, đường kính 1 - 5mm, hình thái khuẩn lạc khác

nhau: khuẩn lạc có thể trong sáng hoặc xám, mặt hơi lồi, nhẵn bóng, thỉnhthoảng có thể thấy khuẩn lạc dạng R (Rough), nhám, mặt trong hơi mờ.

- Trên môi trường Rambach: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, khuẩn lạctròn, rìa gọn, có màu đỏ ở giữa, xung quanh trong suốt

- Trong môi trường XLT4: Khuẩn lạc có dạng giống như trên môitrường XLD

- Trên môi trường gelatin: Vi khuẩn không làm tan chảy gelatin

2.3.3 Đặc tính sinh hóa

Theo Nguyễn Quang Tuyên (2008) [33], trực khuẩn Salmonella phần

lớn lên men và sinh hơi đường glucoza, mannit, mantoza, galactoza, leviloza,

arabinoza Trừ một số Salmonella chỉ lên men các loại đường này nhưng không sinh hơi như: Salmonella abortus equi, Salmonella abortus bovis, Salmonella abortus ovis, Salmonella typhi suis, Salmonella gallinarum và Salmonella enteritidis dublin

Theo Quinn và cs (2002) [45], giống vi khuẩn Salmonella được chia

thành 7 phân nhóm, mỗi phân nhóm có khả năng lên men một số loại

đường nhất định và không đổi Phần lớn phân loài Salmonella enterica gây

bệnh cho động vật máu nóng Chúng lên men đường: glucoza, mannit,mantoza, galactoza, dulcitol, arabonoza, sorbitol và sinh hơi Cũng ở nhóm

này, hầu như các chủng vi khuẩn Salmonella đều không lên men lactoza và

saccaroza

Đa số các vi khuẩn thuộc giống Salmonella không làm tan chảy gelatin,

không phân giải urê, không sản sinh indol Phản ứng MR, Catalaza dương

tính (trừ S choleraesuis, S gallinarum-pullorum có MR âm tính) Phản ứng

Oxidaza âm tính Phản ứng sinh H2S dương tính (trừ S paratyphi A, S typhisuis, S choleraesuis).

Trong quá trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella thì đặc tính

sinh hóa có ý nghĩa rất quan trọng Đây là bước không thể bỏ qua khi xét

nghiệm vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Salmonella nói riêng.

Bảng 2.5 Các tính chất sinh hóa cơ bản của Salmonella

- Lên men Glucid (+) Kèm theo sự tổng hợp acid

- Lên men Glucose sinh khí (+) Trừ một số chủng thuộc loài

S.typhi và S gallinarum

- Sử dụng Citrate (+) Trừ S typhi và S paratyphi A

- Sinh H 2 S (+) Trừ một số chủng thuộc loài

Vi khuẩn Salmonella tồn tại trong ống tiêu hóa của cả động vật máu

nóng và máu lạnh, trong môi trường tự nhiên, phân, đất, đặc biệt trongthực phẩm như bột thịt, xương, thực phẩm… tồn tại được 9 tháng hoặc lâu

hơn Salmonella sống trong thịt ướp muối 29% được 4 - 8 tháng ở nhiệt

độ 6 - 120C

Với nhiệt độ, vi khuẩn có sức đề kháng yếu, 500C bị diệt sau 1h, 700Ctrong 20 phút, sôi 1000C sau 5 phút, khử trùng bằng phương pháp Pasteurcũng diệt được vi khuẩn.

Ánh sáng mặt trời diệt khuẩn trong môi trường nước, sau 5h ở nướctrong và 9h ở nước đục

Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn dễ dàng: Axit phenic 5%,formol 0,5% diệt khuẩn sau 15 - 20 phút

Vi khuẩn Salmonella sống được lâu trong điều kiện lạnh, chúng có thể

sống trong bột thịt 8 tháng, nhưng ở điều kiện môi trường có độ pH ≤ 5 chúngchỉ sống được trong thời gian ngắn

Ở nồng độ muối 6-8% vi khuẩn phát triển chậm và ở nồng độ muối 19% thì sự phát triển của vi khuẩn bị ngừng lại Tuy vậy, với vi khuẩn gâyngộ độc thức ăn chỉ bị chết khi ướp muối với nồng độ bão hoà trong thờigian dài Như vậy thịt cá ướp muối, các món ăn kho mặn chưa thể là an toàn

8-đối với vi khuẩn Salmonella Salmonella hiện diện trong tất cả các loài thực

phẩm: trứng, thịt, thuỷ hải sản, sữa, rau quả,…

2.3.5 Các yếu tố độc lực của vi khuẩn

* Cấu tạo kháng nguyên

Cấu tạo kháng nguyên của Salmonella rất phức tạp, có những thành phần kháng nguyên chung cho một nhóm Salmonella, do đó ngoài kháng

nguyên đặc hiệu còn có kháng nguyên không đặc hiệu chung cho nhóm Vìvậy ngoài hiện tượng ngưng kết đặc hiệu còn có hiện tượng ngưng kết khôngđặc hiệu (tức là ngưng kết tương tự hoặc ngưng kết chéo giữa các loài

Salmonella với nhau).

Ở Salmonella cần phân biệt 4 loại kháng nguyên là: kháng nguyên thân

(O Antigen), kháng nguyên lông (H Antigen), kháng nguyên vỏ (K Antigen), kháng nguyên bám dính (F - Antigen) Trong đó kháng nguyên có ýnghĩa quan trọng trong chẩn đoán là kháng nguyên thân (O - Antigen) vàkháng nguyên lông (H - Antigen)

Kháng nguyên thân (O Antigen)

Kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella không phải là đơn chất mà

gồm nhiều phần tử kháng nguyên cấu tạo nên, nó được phân bố trên bề mặt

của tế bào Thành phần chủ yếu của nó là phospholipit, polysaccharit, trong

đó có 60% là polysaccharit, 20 - 30% là lipit và 3,5 - 4,5% hecsozamin Đặctính cơ bản của kháng nguyên O trong các phản ứng huyết thanh là do cácchuỗi đa đường polysaccharit quyết định và một khi oligosaccharit thuộcvùng 1 và vùng 2 của lipopolysaccharit (LPS) thay đổi thì gây ra sự thay đổipha của hình thái khuẩn lạc từ dạng S (Smooth) sang dạng R (Rough) và dẫnđến giảm độc lực của vi khuẩn

Kháng nguyên O của Salmonella rất phức tạp, hiện nay người ta tìm thấy có 65 yếu tố khác nhau Mỗi loại Salmonella có thể có một hoặc nhiều

yếu tố, mỗi yếu tố được ký hiệu bằng số la mã hay chữ số Ả Rập

Trong sơ đồ phân loại của Kauffman White, các serovar có cùng O

-Ag được xếp vào một nhóm và được ký hiệu bằng chữ cái A, B, C,…

Kháng nguyên O là kháng nguyên bề mặt, nằm trong màng tế bào vikhuẩn, có khả năng đề kháng với nhiệt độ 1000C trong 24 giờ và với cồnnhưng bị formol phá hủy

Kháng nguyên O không phải là độc tố nhưng là yếu tố gây bệnh của vikhuẩn, giúp vi khuẩn phòng chống lại khả năng phòng vệ của cơ thể, chốnglại hiện tượng thực bào

- Kháng nguyên lông (H - Antigen)

Bản chất của kháng nguyên H chính là protein trong thành phần lông của vi

khuẩn Salmonella và chia thành hai pha (pha 1 và pha 2) Pha 1 có tính đặc hiệu

gồm 28 loại kháng nguyên lông được biểu thị bằng chữ la tinh thường a, b, c,…còn pha 2 không đặc hiệu được biểu thị bằng các chữ số 1, 2, 3,… Tuy nhiêntrong từng tế bào vi khuẩn riêng biệt luôn luôn chỉ xuất hiện từng pha Bởi vậy mà

trong chẩn đoán cần phải nuôi cấy để tạo từng pha một Có các loài Salmonella như S typhi, S dublin, S arizonae chỉ tạo một pha Ngược lại, có những loài tạo

cả 2 pha như S typhimurium, S cholerae suis, S typhi suis…

Kháng nguyên H không chịu nhiệt, bị phá hủy ở nhiệt độ 700C nhưng

đề kháng với formol

Kháng nguyên H không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòngbệnh, không quyết định yếu tố độc lực và vai trò bám dính của vi khuẩn Tuyvậy, nó có vai trò bảo vệ cho vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi quá trình thực

bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong tế bào đại thực bào cũng như trongcác tế bào gan, thận.

- Kháng nguyên K (K - Antigen)

Năm 1945, Kauffman và White đã đưa ra khái niệm kháng nguyên K,

K là chữ đầu của kapsel nguồn gốc từ Đức, là ký hiệu chỉ vỏ bọc của vi khuẩnhoặc kháng nguyên vỏ bọc

Bằng phương pháp điện di, người ta đã phát hiện được bản chất hóahọc của kháng nguyên K là polysaccharit Kháng nguyên K dễ dàng bị chiếttách bởi dung dịch phenol 45%, sau đó đem ly tâm siêu tốc, dịch ly tâm chứakháng nguyên K Để thu được kháng nguyên K tinh khiết, dùng CetylTrimethyl Amonium Bromide hoặc Cetyl Pyridnium Chloride cho vào dungdịch trên thu được kết tủa chính là kháng nguyên K

Vai trò của kháng nguyên K chưa thống nhất Nhiều ý kiến cho rằng

nó có ý nghĩa về mặt độc lực vì tham gia bảo vệ vi khuẩn trước các yếu tốphòng vệ của cơ thể, chống lại các hiện tượng thực bào

Sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh trên nhung mao của niêm mạc ruột(tế bào Epitel) là bước đầu tiên và cơ bản cho việc gây bệnh ở phần lớn cácloài vi khuẩn gây bệnh

Fimbriae được xác định là yếu tố bám dính của vi khuẩn đường ruột nói

chung và của Salmonella nói riêng Nó được cấu tạo bởi dạng protein được

phân cực có cấu tạo bậc 1 bao gồm nhiều đơn vị xác định, có thể quan sát

được bằng kính hiển vi điện tử Fimbriae của Salmonella có trọng lượng phân

tử từ 8000 - 28000 Dalton (1Dalton = 10-27gr) Trong thành phần cấu tạo cótới gần 50% các axit amin không phân cực (Muller và cs, 1989) [42]

Trong công trình nghiên cứu của Tanaka cho thấy: khi gây nhiễm qua

miệng, các giống Salmonella có yếu tố bám dính cho chuột đã quan sát được Salmonella có trong đường tiêu hóa, đồng thời tìm thấy những vi khuẩn này

trong gan, lách và hạch lympho Vào ngày thứ 7, sau gây nhiễm đã phát hiệnđược kháng thể O và H trong huyết thanh con vật với hiệu giá ngưng kết bằng

1/10 - 1/40 Ngược lại, khi gây nhiễm bằng các chủng Salmonella không có yếu tố bám dính, Salmonella chỉ cư trú cục bộ và vận chuyển qua ống tiêu

hóa, không thể tìm thấy vi khuẩn trong hạch, lách và gan, cũng không xácđịnh được sự có mặt của kháng thể O và H trong huyết thanh chuột gây nhiễm(Lê Văn Tạo, 1989) [19]

Như vậy, khả năng bám dính của vi khuẩn lên tế bào biểu mô ruột đếnnay đã được khẳng định là yếu tố gây bệnh quan trọng, nó giúp cho vi khuẩnxâm nhập vào cơ thể vật chủ và gây bệnh Những vi khuẩn có độc lực cao cókhả năng bám dính tốt hơn là những vi khuẩn có độc lực thấp (Phạm HồngNgân, 2000) [13]

* Độc tố - yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella

Ngoài yếu tố gây bệnh giúp vi khuẩn Salmonella bám dính, xâm nhập

tế bào, các vi khuẩn đường ruột còn tiết ra các loại độc tố gây bệnh chủ yếu

cho người và gia súc Đối với vi khuẩn Salmonella chúng sản sinh ra ít nhất

ba loại độc tố chính đó là độc tố đường ruột (Enterotoxin), nội độc tố(Endotoxin) và độc tố tế bào (Cytotoxin) (Peterson, 1980) [43]

- Nội độc tố (Endotoxin)

Nội độc tố của vi khuẩn Salmonella đóng vai trò quan trọng trong việc

gây ra những biến đổi bệnh lý, nhất là giai đoạn nhiễm trùng huyết.Lipopolysaccharide (viết tắt là LPS) là một thành phần cấu trúc nên màng của

tế bào vi khuẩn, được coi là nội độc tố của vi khuẩn Salmonella.

Lipopolysaccharide chỉ giải phóng ra từ vách tế bào khi vi khuẩn bị dung giải

và tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ kích thích hìnhthành kháng thể

Nội độc tố gồm có 2 loại là: Độc tố ruột gây xung huyết, mụn loét trênruột và độc tố thần kinh gây triệu chứng thần kinh, hôn mê, co giật

- Ngoại độc tố (Enterotoxin)

Độc tố này có cấu trúc, tính năng và đặc điểm kháng nguyên giống với

choleratoxin (LT) do E.coli sản sinh ra Độc tố này có bản chất là một protein,

khối lượng phân tử 25 KDa và 12 KDa ứng với 2 tiểu phần A và B CT - likeEnterotoxin dễ bị phân hủy ở nhiệt độ 600C và các men phân giải protein Độc

tố này có tác dụng kích thích hoạt động của Aderylate có mặt trong màng tếbào biểu mô ruột non làm tăng AMCc (Adenozin Mono Phosphat-cycle) dẫnđến tăng cường phân tiết và bài xuất chất điện giải từ tế bào xoang ruột gâyhiện tượng ỉa chảy

- Độc tố tế bào (Cytotoxin)

Khi cơ thể người và động vật bị tiêu chảy kèm theo hiện tượng mấtnước và chất điện giải là hàng loạt tế bào biểu mô bị phá huỷ hoặc bị tổnthương ở những mức độ khác nhau Sự phá hủy hay tổn thương đó là do độc

tố tế bào của Salmonella gây nên.

Có 3 dạng độc tố tế bào

+ Dạng thứ 1: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với trypsin

+ Dạng thứ 2: Có nguồn gốc từ protein màng ngoài tế bào vi khuẩn+ Dạng thứ 3: Dạng độc tố này tác động lên tế bào theo cơ chế dunggiải các không bào nội bào

* Plasmid - yếu tố di truyền khả năng sản sinh độc tố

Plasmid là cơ quan cần thiết để di truyền các yếu tố độc lực của rất

nhiều chủng Salmonella Mỗi một serotype chứa một số lượng lớn khoảng

50 - 100 plasmid

Các chủng Salmonella typhimurium gây bệnh mang plasmid chứa các đoạn gen quy định độc lực của chúng Thí nghiệm trên các chủng Salmonella typhimurium mang plasmid độc lực với các chủng không có yếu tố độc lực này

cho thấy: số lượng vi khuẩn không mang plasmid độc lực ở gan và lách thấphơn nhiều so với chủng có yếu tố trên Điều đó đi đến kết luận một số gen trênplasmid quy định độc lực đảm bảo cho vi khuẩn phát triển ở gan và lách

Các vi khuẩn có các plasmid di truyền yếu tố độc lực có khả năng traođổi cho nhau làm cho yếu tố độc lực được nhân rộng nhanh

Cho đến nay đã phát hiện được 5 gen quy định độc lực nằm trên plasmid

của Salmonella, chúng được ký hiệu là: SpvR, SpvA, SpvB, SpvC và SpvD.

Trong đó SpvR là gen điều khiển, còn các gen khác quy định tổng hợp của cácdạng protein độc lực của tế bào, gen SpvD liên quan đến sức đề kháng vớihuyết thanh vật chủ Sự thiếu hụt gen SpvA, B, C, D được hoạt hóa bởi sựthiếu hụt Glucoza trong giai đoạn sinh trưởng của vi khuẩn Người ta nhận thấyrằng sự vắng mặt của gen SpvR là quá trình sao chép của tổng hợp các genSpvA, SpvB, SpvC, SpvD hoàn toàn bị mất và vi khuẩn mất độc lực Cácprotein điều khiển của SpvR là LysR, MetR hoạt hóa quá trình sao chép, bởiquá trình gắn vào DNA ở đoạn điều khiển tổng hợp gen SpvA và các gen Spvkhác

Tuy nhiên không phải tất cả các chủng Salmonella không có plasmid đều

không độc Như vậy quyết định gen của độc lực không hạn chế ở plasmid

2.3.6 Khả năng kháng kháng sinh

Việc sử dụng thường xuyên các loại kháng sinh phòng trị bệnh gia súc,gia cầm là một nguy cơ tồn tại làm tăng khả năng kháng kháng sinh cũng nhưduy trì bản chất gây bệnh của vi khuẩn đối với sức khỏe con người và gia súc

Việc sử dụng rộng rãi các loại kháng sinh điều trị, kích thích sinhtrưởng, bảo quản thực vật, xử lý môi trường - đã tạo ra nhiều giống vi khuẩn

có khả năng kháng thuốc, mang plasmit kháng kháng sinh sống rất lâu trongđộng vật cũng như trong môi trường sống Những vi khuẩn sẵn có những yếu

tố gây bệnh lại có thêm khả năng kháng kháng sinh sẽ tăng tính gây bệnh lên

gấp đôi Rất nhiều chủng vi khuẩn đường ruột, trong đó có Salmonella có khả

năng chống lại các ion kim loại nặng có tính diệt khuẩn như: Ag, As, Hg, (Dean và cs,1982) [35]

Những nghiên cứu mới đây về tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh

trong thú y cho thấy: trong 88 chủng Salmonella khi nghiên cứu về tính kháng

thuốc đối với Ampicillin, Chloramphenicol, Penicillin, Chlotetracyline,Neomycin, Furazolidon, Streptomycin và Sulphonamid cho thấy có tới 100%

chủng Salmonella kháng với Penicillin và Sulphonamid, chưa có chủng nào

kháng lại Furazolidon Chỉ có một chủng duy nhất kháng lại với Neomycin(Phạm Khắc Hiếu và cs, 1998) [10]

Nếu hệ vi khuẩn có lợi trong đường ruột bị tiêu diệt tạo điều kiện cho

Salmonella kháng thuốc nhân lên gấp bội.

2.4 Các biện pháp khống chế nhiễm khuẩn trên thịt và ngộ độc thực phẩm

thực phẩm và bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm:

* Biện pháp đối với cơ sở giết mổ

- Xây dựng khu giết mổ tập trung đáp ứng một số quy chuẩn như có hệthống mổ treo, cấp nước, thoát nước, xử lý chất thải được cơ quan có thẩmquyền cấp phép

- Gia súc, gia cầm đưa vào giết mổ phải khỏe mạnh, có nguồn gốc rõràng

- Công nhân trực tiếp giết mổ được khám sức khỏe trước khi tuyểndụng và định kỳ 6 tháng một lần theo quy định của Bộ Y tế

* Biện pháp với người kinh doanh thực phẩm

- Thịt gia súc, gia cầm tươi sống được mua bán, vận chuyển trên thịtrường phải có nguồn gốc từ các cơ sở giết mổ đã đăng ký kinh doanh và bảođảm đủ điều kiện kinh doanh được các cơ quan thú y kiểm tra, đóng dấu kiểmsoát giết mổ hoặc cấp giấy chứng nhận vệ sinh thú y

- Thịt gia súc, gia cầm tươi sống phải được bầy bán trên mặt bàn (quầy,sạp) cách mặt đất ít nhất là 0,8 mét Bàn (quầy, sạp) phải có bề mặt phẳng,nhẵn và phải làm bằng vật liệu không rỉ, không thấm nước, phải dễ làm vệsinh, khử trùng Ngoài ra các dụng cụ như: cân, dao, thớt phải được vệ sinhthường xuyên

- Cấm mua bán các loại thực phẩm tươi sống và chế biến bị bệnh, ôi,thiu, ươn Khi bán hàng phải mặc tạp dề, giữ vệ sinh cá nhân, móng tay phảicắt ngắn và giữ gìn sạch sẽ Cấm bán các loại thực phẩm ở dạng tươi sống vàchế biến chung trên một mặt bàn (quầy, sạp)

* Biện pháp với người tiêu dùng, người nội trợ

Thực hiện 10 nguyên tắc vàng chế biến an toàn thực phẩm phòng ngừangộ độc thực phẩm:

- Chọn thực phẩm tươi, sạch, an toàn

- Thực hiện “ăn chín uống sôi” Ngâm kỹ rửa sạch, gọt vỏ quả tươi

trước khi sử dụng

- Ăn ngay khi thức ăn vừa được nấu chín

- Che đậy bảo quản cẩn thận thức ăn sau khi nấu chín

- Đun kỹ lại thức ăn cũ trước khi sử dụng

- Không để lẫn thực phẩm sống với thực phẩm chín, không dùng chungdụng cụ chế biến thực phẩm sống và chín

- Rửa tay sạch trước khi chế biến thực phẩm đặc biệt sau khi đi vệ sinhhoặc tiếp xúc với các nguồn dễ ô nhiễm khác

- Bảo đảm dụng cụ, nơi chế biến thực phẩm phải khô ráo, gọn gàng,sạch sẽ, hợp vệ sinh

- Tuyệt đối không sử dụng thực phẩm ôi thiu, mốc hỏng, quá hạn

- Sử dụng nguồn nước sạch an toàn trong chế biến thực phẩm

Bên cạnh đó các cơ quan quản lý của nhà nước cần phải tăng cườngcông tác thanh tra, kiểm tra thường xuyên đối với cơ sở sản xuất, chế biếnthực phẩm, đồng thời phạt nặng những cơ sở vi phạm quy định về VSATTP

2.4.2 Các biện pháp phòng chống ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm

Salmonella là loại vi khuẩn nguy hiểm đối với sức khỏe con người nên

yêu cầu vệ sinh tối thiểu đặt ra cho tất cả các loại thực phẩm không được cóloại vi khuẩn này trong 25g mẫu thực phẩm (FAO, 1992) [36] Do đó để

phòng tránh bệnh do Salmonella người ta khuyến cáo không nên sử dụng thịt

sống, tái hoặc thức ăn chín xử lý nhiệt không đúng cách

Thịt, sữa là loại thực phẩm dễ bị ô nhiễm bởi vi khuẩn Salmonella

nên bắt buộc phải có biện pháp riêng biệt để loại bỏ nó Đặc điểm của

Salmonella là rất dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ thanh trùng Pasteur và không

sống sót sau khi thanh trùng ở nhiệt độ 750C trong 10 phút, nhưng nếu bảoquản lạnh hoặc khô thì sẽ phát triển rất nhanh và lại có thể gây bệnh Vì

vậy, việc đề phòng bệnh ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella cần

phải thực hiện các biện pháp sau:

- Kiểm tra vệ sinh nghiêm ngặt lò mổ và nơi giết mổ gia súc, gia cầm

- Đảm bảo vệ sinh tốt cho quá trình sơ chế biến thực phẩm

- Tất cả thực phẩm có nguồn gốc động vật đều phải được nấu chín

- Rửa tay bằng xà phòng trước khi ăn và sau khi đi vệ sinh

- Bảo vệ thực phẩm phòng sự ô nhiễm, phá hoại của côn trùng

2.5 Những nghiên cứu về bệnh do Salmonella gây ra

2.5.1 Những nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người

và động vật cũng đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 50 Viện Pasteur

Sài Gòn trong những năm 1951 - 1953 đã phân lập được 6 chủng Salmonella

ở người (4 chủng từ máu, 2 chủng từ nước tiểu) và 35 serotyp Salmonella ở

lợn tại lò giết mổ (Nguyễn Quang Tuyên, 1995) [32]

Trần Xuân Hạnh (1995) [9] đã phân lập và giám định vi khuẩn

Salmonella ở lợn tại TP Hồ Chí Minh cho kết quả: S typhisuis ở lợn bệnh là 16,9%; ở lợn bình thường 6 - 16 tuần tuổi là 4,2%; S paratyphi ở lợn 6 - 16 tuần tuổi là 2,8% Đặc biệt, vi khuẩn S choleraesuis chiếm 38,7% ở lợn bệnh

và 2,8% ở lợn bình thường

Theo Phùng Quốc Chướng (1995) [4] ở Tây Nguyên, mùa khô lợn mắc

bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra là 20,03%; vụ Đông là 28,66%

Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy tại 4

cơ sở chăn nuôi lợn thuộc miền Bắc nước ta của Cù Hữu Phú và cs (2000)[15]

cho biết: Tỷ lệ Salmonella trung bình ở lợn tiêu chảy là 80% Đây là điều

đáng lo ngại đối với ngành chăn nuôi lợn ở nước ta

Năm 2001, Võ Thị Bích Thủy [26] đã nghiên cứu tình hình nhiễm

Salmonella trên thực phẩm tại thị trường Hà Nội cho thấy tỷ lệ nhiễm cao

nhất là giò sống 46,67%; tiếp theo là thịt bò 40%; thịt gà 39,29%; thấp nhất làthịt lợn 33,33%

Ngoài ra, ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella cũng đã và đang

được rất nhiều tác giả quan tâm như:

Lê Minh Sơn (2003) [18] đã xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn

giết mổ tiêu dùng nội địa từ 10,91 - 16,67% và thịt lợn xuất khẩu trung bình 1,42%

Theo Tô Thu Liên (2005) [24] khi nghiên cứu tình trạng ô nhiễm một số

vi khuẩn vào thịt sau giết mổ của Hà Nội và một số phương pháp giảm sự nhiễm

khuẩn trên thịt đã cho biết tỷ lệ nhiễm Salmonella tại cơ sở giết mổ Hoàng Lộc

là 33,33%; tại cơ sở Thái Hà là 13,3%; tại cơ sở Long Biên là 40%

Năm 2006, Võ Thị Trà An và cs [1] nghiên cứu tình hình nhiễm

Salmonella trong phân và thân thịt (bò, lợn, gà) tại một số tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ mẫu phân mang Salmonella là 40,5% trong đó mẫu phân lợn chiếm

tỷ lệ cao nhất 49,3% Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở thân thịt là khá, thịt lợn là

55,9% và thịt gà là 64%

Năm 2009, Trần Thị Hạnh và cs [8] đã tiến hành nghiên cứu tỷ lệ ô

nhiễm Campylobacter tại cơ sở giết mổ lợn công nghiệp và thủ công nghiệp

và cho kết quả: tại cơ sở giết mổ lợn công nghiệp tỷ lệ nhiễm Salmonella ở

mẫu lau thân thịt là 70%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờ giết thịt là 40%,mẫu lau sàn giết mổ là 28% Tại cơ sở giết mổ thủ công tỷ lệ nhiễm

Salmonella ở mẫu lau thân thịt là 75%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờ giết

mổ là 70%, mẫu lau sàn giết mổ là 80%

Đỗ Ngọc Thúy và cs (2009) [25] đã xác định trong thịt tươi bán lẻ tại

các chợ và siêu thị trên địa bàn Hà Nội, tỷ lệ nhiễm Salmonella spp là khá cao, trong đó tỷ lệ nhiễm thịt lợn bị ô nhiễm Salmonella spp là 55% trầm

trọng hơn rất nhiều so với thịt bò (9,8%) và thịt gà (35,3%)

Lưu Quốc Toản và cs (2013) [31] qua nghiên cứu cho biết tỷ lệ

nhiễm Salmonella trong các sản phẩm thịt lợn bán lẻ tại chợ trên địa bàn

quận Long Biên (Hà Nội) rất phổ biến, khoảng 1/4 các mẫu thịt lợn bán lẻ

tại chợ bị nhiễm Salmonella, mật độ nhiễm dao động từ 100 - 27.500 vi

khuẩn/25 g thịt lợn

Như vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn Salmonella một cách toàn diện để

từ đó đề ra biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả, giữ gìn vệ sinh an toànthực phẩm, bảo vệ sức khỏe con người là một yêu cầu rất cần thiết Và vấn đềnày đang gặp rất nhiều khó khăn Đặc biệt là các loại thịt tươi, thịt đã đượcchế biến sẵn bán tại các chợ rất là phổ biến, trong đó điều kiện vệ sinh chợ, vệsinh dụng cụ chế biến và người trực tiếp chế biến thực phẩm chưa đảm bảo

2.5.2 Những nghiên cứu ngoài nước

Trong những năm gần đây, trên thế giới xảy ra rất nhiều trường hợp

ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật nói chung và do Salmonella nói riêng gây ra

với những hậu quả nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe của con người

Các quá trình nghiên cứu về sự phát triển Salmonella và các tác nhân gây

bệnh khác như vi khuẩn lao, dịch tả, nhiệt thán đã được bắt đầu từ hơn 100 năm

Năm 1880, Eberth lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn Salmonella dưới

kính hiển vi Bốn năm sau (1984), Gaffky đã nuôi cấy thành công vi khuẩnnày (Selbizt, 1995) [46]

Năm 1885, Salmo và Smit đã phân lập được vi khuẩn Salmonella choleraesuis (trực khuẩn phó thương hàn) từ lợn mắc bệnh dịch tả lúc đó là vi khuẩn có tên là Bacillis suipestife Đến năm 1903, Chweinitz và Dorset xác định được nguyên nhân gây dịch tả lợn là do virus còn vi khuẩn Salmonella choleraesuis chỉ đóng vai trò kế phát.

Năm 1891, Jensen đã phân lập được vi khuẩn Salmonella dublin trong

phân bê bị tiêu chảy, cùng năm đó ở Greiswald và Breslau vi khuẩn

Salmonella typhimutirium được phân lập.

Hai năm sau đó, năm 1893 tại Breslau xảy ra một vụ ngộ độc thựcphẩm do ăn phải thịt bò ốm Kaensche là người tìm thấy vi khuẩn vì vậy vikhuẩn được đặt tên là trực khuẩn Kaensche (Selbizt và cs, 1995) [46]

Năm 1896, Archard và Bensau đã tìm ra Salmonella paratyphi B

Năm 1909 Retga phân lập được Salmonella pullorum từ gà mắc bệnh bạch lỵ Lúc đó người ta cho rằng Salmonella pullorum và Salmonella galinarum (gây bệnh thương hàn gà) là một Sau này chúng được phân biệt

bằng khả năng lên men đường

Năm 1926, với những công trình nghiên cứu của White về cấu trúc kháng

nguyên của Salmonella đã bắt đầu một thời kỳ mới về giống vi khuẩn này.

Trong những năm 1930, số lượng loài đã tăng nhanh chóng Sau đó

Kauffmann tiếp tục thành công trong lĩnh vực nghiên cứu về Salmonella

(Selbitz và cs, 1995) [46]

Năm 1993 đã có 2375 serotyp Salmonella được định danh (Selbizt và cs,1995) [46] Đến năm 1997 con số serotyp Salmonella đã lên đến 3000

(Plonait và Bickhardt, 1997) [44] Năm 1998 tạo thêm 6 serotyp khác được bổ

sung Như vậy giống Salmonella luôn luôn thu hút được sự chú ý của các nhà

chuyên môn trong lĩnh vực vi sinh vật học và y học

Asai và cs (2002) [34] cho biết tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn sau cai

sữa bị tiêu chảy là 12,4%; lợn vỗ béo là 17,3%; lợn con theo mẹ là 4,5% Tác

giả cũng cho biết S typhimurium được phân lập thấy nhiều nhất ở lợn sau cai

sữa là 72,6%; lợn gần xuất chuồng là 73,8%

Kishima và cs (2008) [41] đã điều tra tỷ lệ nhiễm và phân bố của vi

khuẩn Salmonella trong phân lợn khỏe mạnh bình thường trên toàn lãnh thổ

Nhật Bản giữa năm 2003 và năm 2005 là 3,1%

Như vậy, vi khuẩn Salmonella và những bệnh do chúng gây ra được rất

nhiều các nhà khoa học trên toàn thế giới quan tâm nghiên cứu Mục đích lànhằm tìm ra các biện pháp để góp phần ngăn chặn và đẩy lùi bệnh do

Salmonella gây ra ở động vật và ở con người.

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, nguyên liệu và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là thịt lợn tươi sống bán ở một số chợ của TháiNguyên và Tuyên Quang

- Vi khuẩn Salmonella spp.

3.1.2 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

3.1.2.1 Mẫu xét nghiệm

- Thịt lợn tươi, sống

3.1.2.2 Các loại môi trường sử dụng cho quá trình nghiên cứu

- Môi trường thông thường và đặc hiệu để nuôi cấy, phân lập và giám

định tổng số vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn Salmonella spp là những môi trường

chế biến sẵn ở dạng tổng hợp:

+ Dung dịch muối sinh lý: Dùng để pha loãng mẫu

+ Môi trường Plate Count Agar (PCA): Dùng để nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí

+ Môi trường Nutrient Broth: Dùng để nuôi dưỡng vi khuẩn Salmonella.

+ Môi trường tăng sinh Selenite Broth: Dùng để nuôi tăng sinh, chọn

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm

- Địa điểm lấy mẫu: Một số chợ của Thái Nguyên và Tuyên Quang

- Địa điểm phân tích mẫu: Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học

sự sống - Đại học Thái Nguyên

3.2.2 Thời gian

Từ 06/2014 - 11/2014

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí và tỷ lệ nhiễm vi khuẩn

Salmonella spp trên thịt lợn tươi.

- Xác định các đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella đã phân lập

được

- Thử độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được trên

chuột bạch khỏe

- Xác định tính mẫn cảm của các chủng Salmonella đã phân lập được

đối với một số loại kháng sinh hóa dược

3.4 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện đề tài này, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp nghiêncứu thường quy định trong phòng thí nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩnViệt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn Quốc tế (ISO)

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm

- Thu thập mẫu thịt lợn theo phương pháp ngẫu nhiên từ các quầy bán thịt

- Dụng cụ lấy mẫu, vật chứa mẫu phải sạch, vô trùng và không gây ảnhhưởng đến hệ vi sinh vật của mẫu thịt

- Lấy mẫu thịt: Khử trùng dao bằng cồn 700C, sau đó dùng dao cắt lấy

100 - 200 gram thịt/mẫu rồi cho mẫu vào túi nilon vô trùng và ghi nhãn có cácthông tin cần thiết Các mẫu thịt lợn sau khi lấy phải bảo đảm không lẫn nhau.Sau khi mang về phòng thí nghiệm nếu không phân tích ngay thì phải bảoquản mẫu ở nhiệt độ từ 00C - 20C và phải kiểm tra trong vòng 24 giờ

3.4.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí trong thịt lợn tươi

Xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong thịt tươi áp dụng theo TCVN5667:1992 [29] Bao gồm các bước sau:

* Nguyên tắc

Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy láng, đếm vi khuẩn trên môi trường PlateCount Agar (PCA) có pH = 7,0 ± 0,2; ủ hiếu khí ở 370C trong thời gian 24h

Số lượng vi khuẩn hiếu khí có trong 1 gram mẫu theo số khuẩn lạc đếm được

từ đĩa thạch nuôi cấy theo các nồng độ khác nhau

* Cách tiến hành

- Chuẩn bị trước khi nuôi cấy: Trước khi tiến hành phân tích thực hiệnđồng nhất các bước như sau: Lấy thịt lợn ngẫu nhiên ở các vị trí khác nhau,cho vào cối sứ vô trùng nghiền nhỏ Cân chính xác trong điều kiện vô trùng10g mẫu rồi cho vào bình tam giác đã chứa sẵn 90ml muối sinh lý đã được

Cấy láng mẫu trên Plate Count Agar

hấp khử trùng Lắc đều trong một thời gian nhất định đảm bảo cho mẫu thịttan trong dung dịch muối sinh lý Sau khi đồng nhất mẫu, dung dịch thu được

có độ pha loãng 10-1 so với ban đầu

Dung dịch đồng nhất tiếp tục được pha loãng theo dãy thập phân bằngcách dùng pipetman có đầu hút vô trùng chuyển 1ml dung dịch mẫu ở bìnhtam giác sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý; ta thu được dungdịch có độ pha loãng 10-2 Sau đó sử dụng pipetman có đầu hút vô trùng kháchút 1ml dung dịch có độ pha loãng 10-2 chuyển sang ống nghiệm có chứa sẵn9ml nước muối sinh lý; ta thu được dung dịch có độ pha loãng 10-3 Thao táctương tự như vậy để có dung dịch mẫu có độ pha loãng 10-4 cho đến khi cóđược dung dịch mẫu có độ pha loãng cần thiết

- Nuôi cấy: Mẫu kiểm nghiệm nuôi cấy ít nhất 2 đậm độ liên tiếp, mỗiđậm độ cấy vào 2 đĩa thạch và phải dùng que cấy riêng Dùng pipetman vớiđầu vô trùng 0,1ml dung dịch mẫu pha loãng ở các nồng độ khác nhau rồi nhỏlên mặt thạch, láng đều sao cho dung dịch phân bố đều trên mặt thạch Sau đócho vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 24h rồi đọc kết quả

Chọn đĩa có từ 10 - 300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 nồng độ pha loãngliên tiếp Sự phân bố các khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy phải hợp lý: độ phaloãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít

Công thức tính số lượng vi khuẩn (CFU/g):

ΣC: tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại

n1 : số đĩa của độ pha loãng thứ nhất có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc

n2 : số đĩa của độ pha loãng thứ hai có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc

d : hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất

V : thể tích chất nuôi cấy được sử dụng ở mỗi đĩa

3.4.3 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tươi

Xác định chỉ tiêu vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tươi áp dụng theo

TCVN 5153:1990 [28] Bao gồm các bước sau:

Bước 1: Chuẩn bị, đồng nhất mẫu và tăng sinh lần 1:

Lấy thịt lợn ngẫu nhiên ở nhiều vị trí khác nhau của mẫu, cho vào cối

sứ vô trùng nghiền nhuyễn Cân chính xác trong điều kiện vô trùng 25g mẫucho vào bình tam giác chứa 225ml môi trường dinh dưỡng Nutrient Broth, lắcđều trong thời gian nhất định ta được dung dịch mẫu với độ pha loãng 10-1

Để tủ ấm 370C trong 16 - 24 giờ

Bước 2: Tăng sinh lần 2 mẫu đã đồng nhất (tăng sinh chọn lọc)

Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, sau đó dùng pipet vô trùng hút 1ml mẫu

đã đồng nhất và tăng sinh theo bước 1 cấy vào 9ml môi trường Selenite Broth,nuôi tủ ấm 430C trong 24 giờ (ở nhiệt độ này Proteus spp và nhiều vi khuẩn

tạp nhiễm từ phân bị ức chế không phát triển)

Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh Nutrient Broth

Chọn các khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ Salmonella giám định đặc

tính sinh hóa: lên men đường, H2S, Indole, urease, citrate…

Salmonella dương tính/âm

tính trong 25g mẫu

Bước 3: Phân lập và nhận diện

Dùng que cấy thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống

từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa thạch XLD - một loại môi trường phân lập

đặc trưng cho vi khuẩn Salmonella Sau đó nuôi dưỡng ở 370C trong 24 giờrồi đọc kết quả

Salmonella phát triển mạnh, không lên men lactose, khuẩn lạc dạng S,

màu đỏ, giữa có chấm đen, tròn (do sản sinh H2S)

3.4.4 Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được

Từ môi trường ta đã phân lập ở trên, chọn khuẩn lạc nghi Salmonella,

kiểm tra hình thái, kích thước 0,4 - 0,6 × 1 - 3μm, không có giáp mô, không

sản sinh nha bào, di động được do có lông, từ 7 - 12 lông (trừ Salmonella pollorum và Salmonella gallinarum), bắt màu Gram âm.

Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên

men đường glucose (+), lactose (-), manitol (+), H2S (+), Indole (-), urease (-),catalase (+)

- Kiểm tra khả năng sinh Indole của vi khuẩn: Lấy khuẩn lạc từ đĩathạch đã cấy thuần vào môi trường Nutrient Broth, bồi dưỡng trong tủ ấm ở

370C trong 18 - 24h, vi khuẩn sẽ sinh trưởng, phát triển và sản sinh Indole(nếu có) Tiến hành kiểm tra bằng cách nhỏ giọt 2 - 3 giọt dung dịch Kovac’svào ống nghiệm

Đọc kết quả:

+ Phản ứng dương tính: Trên bề mặt môi trường xuất hiện một vòngnhẫn màu đỏ tím hay màu hồng (đó là phản ứng kết hợp giữa Kovac’s màucafe và Indole không màu)

+ Phản ứng âm tính: Không có sự thay đổi màu

- Phản ứng catalase: Lấy một phiến kính sạch, dùng que cấy cẩn thậnlấy một phần của khuẩn lạc đặt lên giữa phiến kính Nhỏ một giọt hydrogenperoxidaza (H2O2) lên vùng có khuẩn lạc

Đọc kết quả: Phản ứng dương tính nếu ngay sau khi nhỏ chất phảnứng, bọt khí được hình thành Ngược lại không có bọt khí hình thành, kếtquả âm tính