TÌM HIỂU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO

Sau thời gian thực tập tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng em đã tiếp thu được rất nhiều kiến thức quý báu từ các anh, chị chuyên viên để có thể hoàn thành bài báo cáo này và vững bước trên con đường mình đã chọn. Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn các anh, chị chuyên viên công tác tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng, đặc biệt là chị Nguyễn Thị Thu Hương là người trực tiếp hướng dẫn, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em nghiên cứu, tiếp cận với thực tế, vận dụng những kiến thức đã học mà phát huy khả năng của mình, đồng thời biết được những nhược điểm mà khắc phục, sửa đổi để hoàn thành tốt chuy

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐÀ NẴNG TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI

TÌM HIỂU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN

VITRO CÂY HOA LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.) TRÊN

QUY MÔ CÔNG NGHIỆP

Giáo viên hướng dẫn: Đoàn Thị Vân

Sinh viên thực hiện: Hồ Thị Hiền Thu

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực tập tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng em đã tiếp thuđược rất nhiều kiến thức quý báu từ các anh, chị chuyên viên để có thể hoàn thành bàibáo cáo này và vững bước trên con đường mình đã chọn

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn các anh, chị chuyên viên công tác tạiTrung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng, đặc biệt là chị Nguyễn Thị Thu Hương làngười trực tiếp hướng dẫn, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em nghiên cứu, tiếp cận vớithực tế, vận dụng những kiến thức đã học mà phát huy khả năng của mình, đồng thờibiết được những nhược điểm mà khắc phục, sửa đổi để hoàn thành tốt chuyên đề tốtnghiệp này

Đồng thời em xin chân thành cảm ơn thầy, cô Khoa Sinh- Môi trường trườngĐại học Sư Phạm- Đại học Đà Nẵng đã trực tiếp dạy dỗ, dìu dắt và truyền đạt cho emkiến thức nghề nghiệp trong thời gian học tâp tại trường

Lời cuối cùng, em xin gửi tới quý thầy cô Khoa Sinh- Môi trường trường Đạihọc Sư phạm- Đại học Đà Nẵng, các anh chị chuyên viên tại Trung tâm Công nghệSinh học Đà Nẵng lời chúc sức khỏe, thành đạt trong cuộc sống, chúc Trung Tâm luônphát triển và đạt được nhiều thành công

Do kiến thức còn hạn hẹp nên không tránh khỏi những thiếu sót trong cáchhiểu, lỗi trình bày Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý thầy cô, Banlãnh đạo và các anh chị trong Trung tâm để báo cáo tốt nghiệp này đạt được kết quả tốthơn

Em xin chân thành cảm ơn

Đà Nẵng, ngày 10 tháng 03 năm 2016

Sinh viên thực hiện

Hồ Thị Hiền Thu

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

BAP : Benzyl amino purine

4.1 Sơ đồ quy trình nuôi cấy hoa Lan Hồ Điệp 31 4.2 Quy trình vào mẫu hoa lan Hồ Điệp 34

4.5 Cấy nhân nhanh protocorme 36 4.6 Mẫu protorme sau 4 tháng 36

4.8 Chồi phát sinh từ mẫu cấy sau tháng 36

4.13 Cây hoa lan Hồ Điệp được huấn luyện từ 7-10 ngày 39 4.14 Cây hoa lan Hồ Điệp đạt tiêu chuẩn ra ngôi 40 4.15 Quy trình ra ngôi cây hoa lan Hồ Điệp 41

MỞ ĐẦU

Cuộc sống ngày nay bận bịu với công việc, học tập, gia đình… đôi lúc làm chúng

ta căng thẳng và muốn tìm tới những niềm vui để xã stress Ngày nay, công nghệthông tin phát triển, những thú đem lại qua phim ảnh, âm nhạc, game… thật sự là rấtlớn Cũng có người tìm đến thể thao để rèn luyện sức khỏe, nấu ăn, làm đẹp, muasắm… Bên cạnh đó, có không ít người tìm đến hoa như là một thú vui để có nhữngphút giây thực sự thư giãn với những loài hoa rực rỡ sắc màu Hoa là một món ănkhông thể thiếu trong đời sống tinh thần của mọi người Hoa tượng trưng cho cái đẹp,

sự thuần khiết, tình yêu thiên nhiên, vạn vật của con người Chúng đem lại cho conngười sự thoải thái, thư giãn khi thưởng thức vẻ đẹp của chúng

Bên cạch đó, hoa còn mang lại nguồn lợi kinh tế cao Ở nước ta, nghề trồng hoa

đã mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhiều địa phương, góp phần không nhỏ trongviệc chuyển đổi cơ cấu cây trồng Do đời sống người dân được nâng cao nên nhu cầuhoa tươi ngày càng cao, bên cạnh đó ngành trồng và sản xuất hoa đang đặt mục tiêukhông chỉ phục vụ trong nước mà còn hướng ra thị trường quốc tế

Theo thống kê của Cục Trồng trọt cho thấy, năm 2014, cả nước có khoảng22671,9 ha diện tích trồng hoa Thu nhập bình quân trồng hoa, cây cảnh trên cả nướcnăm 2014 là 285 triệu đồng/ha/năm So với giá trị thu nhập/ha canh tác toàn ngànhtrồng trọt là 82-83 triệu đồng/ha/năm, mức thu nhập này gấp gần 3,5 lần Trong vòng

10 năm gần đây (2005-2015) diện tích hoa đã tăng hơn 2,3 lần, giá trị sản lượng tăng7,2 lần (đạt 6.500 tỷ đồng, trong đó xuất khẩu xấp xỉ 50 triệu đô-la Mỹ) Mức tăng giátrị thu nhập trên một đơn vị héc-ta là ba lần, hình thành nhiều mô hình đạt từ 800 triệuđến 2,5 tỷ đồng trên một héc-ta [1] Đây là lĩnh vực sản xuất cho thu nhập cao gấpnhiều lần so với các loại cây trồng thông thường khác trong cùng điều kiện canh tác

Ngày nay, có vô số những loài hoa mới thơm, rực rỡ và những loại hoa chấtlượng cao phục vụ cho việc xuất khẩu như : Lay ơn, Hồng Môn, Tuylip, Phong Lan,Địa Lan, Lily…Trong đó, các loại lan nói chung và lan Hồ Điệp nói riêng được xem làcây trồng đem lại hiệu quả kinh tế cao Do đó cũng đã có nhiều nhà vườn mạnh dạn

cao gấp 2-3 lần so với cây trồng khác Lan Hồ Điệp hiện nay rất được yêu thích khôngchỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một vẻ đẹp sang trọng và trang nhã.

Hoa lan là một loài hoa có giá trị kinh tế cao và hiện rất được ưa chuộng trong vàngoài nước Trồng hoa Lan Hồ Điệp đang thu hút lớn các nhà đầu tư cả trong và ngoàinước Nó là hướng đi mới giúp người nông dân đẩy nhanh việc xóa đói giảm nghèo,tạo công ăn việc làm giảm tỷ lệ thất nghiệp ở nông thôn và cũng là hướng giúp chuyểndịch nhanh cơ cấu trong nông nghiệp Chính vì vậy, việc trồng và sản xuất hoa lan HồĐiệp đang được chú ý đầu tư

Tuy nhiên, lan Hồ Điệp là loài lan khó nhân giống và việc nhân giống bằng kỹ

thuật nuôi cấy mô in-vitro tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền và đáp

ứng giá cả phải chăng là rất hữu ích Đó là lý do tôi thực hiện chuyên đề tìm hiểu về: “

Quy trình nuôi cấy in vitro lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) trên quy mô công nghiệp.

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP1.1 Lịch sử, bộ phận chức năng và tình hình hoạt động của Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng

1.1.1 Lịch sử của Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng

Tên đơn vị: Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng

Tên giao dịch tiếng anh: Danang Biotechnology Center (DanaBC)

Địa chỉ: Tổ 25, phường Hòa Thọ Tây, quận Cẩm Lệ, thành phố Đà Nẵng

Hình 1.1 Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng

1.1.2 Các bộ phận chức năng của Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng

+ Ban giám đốc+ Phòng Hành chính Tổng hợp+ Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật+ Phòng Công nghệ Vi sinh

+ Trạm sản xuất – kinh doanh

1.1.3 Tình hình hoạt động của Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng

 Nghiên cứu khoa học

Triển khai các dự án thuộc chương trình nông thôn miền núi gồm các dự án sau:

- Nghiên cứu tuyển chọn giống nấm thích nghi phát triển ở môi trường khíhậu tại Đà Nẵng

- Dự án mô hình sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu

- Dự án ứng dụng khoa học công nghệ, xây dựng mô hình nhân giống vàsản xuất Lan Hồ Điệp quy mô công nghiệp tại Đà Nẵng

- Dự án xây dựng mô hình của việc ứng dụng và phát triển khoa học công nghệ trồng hoa chậu phục vụ phát triển kinh tế nông nghiệp và dulịch sinh thái bền vững cho Đà Nẵng

- Hoạt động dịch vụ

Cung cấp các loại giống nấm ăn và nấm dược liệu như: sò, rơm, linh chi, mộcnhĩ, đùi gà, kim châm

Cung cấp cây giống nuôi cấy mô các loại:

- Phong Lan: Hồ Điệp, Dendro, Vũ nữ, Moocara

- Các loại hoa Cúc: Pha lê, Cúc Nhật, Bốn số chín

- Cây đặc hữu ở Đà Nẵng: Lá đỏ

Cung cấp các loại cây giống và cây thương phẩm, hoa chậu, hoa thảm như: TôLiên, Ngọc Thảo, Ly Ly,

Triển khai mô hình ứng dụng cho nông dân trong địa phương thành phố:

- Mô hình công nghệ nuôi trồng nấm sò

- Mô hình công nghệ nuôi trồng nấm rơm trái vụ

- Mô hình công nghệ nuôi trồng nấm linh chi

- Mô hình nuôi trồng thanh long ruột đỏ

- Mô hình trồng cây cải ngọt bằng phương pháp thủy canh

- Mô hình sản xuất phân vi sinh

Chuyển giao quy trình công nghệ:

- Công nghệ thiết kế nhà lưới cấp 1, cấp 2

- Quy trình công nghệ nhân giống nấm cao cấp: kim châm trắng, kim châm vàng,đùi gà

- Quy trình công nghệ nhân giống và nuôi trồng các loại nấm thông dụng: nấmlinh chi, nấm rơm, nấm sò, mộc nhĩ

- Quy trình công nghệ nhân giống các loại hoa chậu, hoa thảm,…

- Quy trình công nghệ trồng và chăm sóc hoa lan Dendro, Moocara,…

1.2 Giới thiệu về phòng công nghệ tế bào thực vật

HÓA CHẤT VIỆC VIỆC

Hình 1.2 Sơ đồ phòng công nghệ tế bào thực vật

1.2.1 Chức năng, nhiệm vụ của phòng công nghệ tế bào thực vật

 Chức năng của phòng Công nghệ tế bào thực vật

Tham mưu và giúp lãnh đạo Sở Khoa học và Công nghệ Đà Nẵng, ban lãnh đạoTrung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng thực hiện hoạt động ứng dụng công nghệtrong lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật, phục vụ công tác bảo tồn và nhân giốngcây trồng, nguồn gen thực vật quý hiếm

 Nhiệm vụ của phòng Công nghệ tế bào thực vật:

Cung cấp các giống cây từ nuôi cấy mô tế bào cho các vùng trồng trọt, các nhàvườn, hộ nông dân trên địa bàn thành phố Đà Nẵng và các vùng lân cận

Thực hiện công tác đào tạo, chuyển giao công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vậtcho các cá nhân, tổ chức có nhu cầu

Triển khai sản xuất giống (hoa cao cấp, cây lâm nghiệp, các loại nấm ăn,…)

1.2.2 Giới thiệu một số dụng cụ, thiết bị, máy móc có tại phòng công nghệ tế bào thực vật

`Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật được trang bị hệ thống cơ sở vật chất để phục vụcho yêu cầu nghiên cứu như sau:

- Dụng cụ: Chai lọ thủy tinh, ống đong (100ml, 500ml,1l…); bình đong bằngnhựa (1l, 2l ); phễu (hủy tinh, nhựa,…); panh mềm, panh cứng, kéo, dao cắt,đèn cồn, nút bông, nilon,…

- Trang thiết bị, máy móc: Máy sấy, nồi hấp tuyệt trùng, tủ lạnh, cân phân tích,cân kỹ thuật, bếp từ, lò vi sóng, máy xay sinh tố, mất cất nước,tủ đững hóa chất,máy đo pH, tủ an toàn sinh học,

Model: OF-02G/12G/22G

Công dụng: Sấy khô các loại nguyên vật liệu trong việc xác định độ ẩm vật liệu, sấy

khô dụng cụ phòng thí nghiệm để có thể sử dụng liên tục để ít tốn thời gian hơn để khô

tự nhiên Bên cạnh đó, tủ sấy còn dùng để tiệt trùng các loại dụng cụ như que cấy, đĩaPetri, giấy cấy …

LỐI VÀO

Hình 1.3 Tủ sấy

Hình 1.4 Máy nước cất

Hình 1.5 Nồi hấp

Nguyên lý hoạt động: Gió được thổi qua hệ thống làm

nóng ( Giàn sấy- thanh trở nhiệt) đến nhiệt độ cần sấy,

quạt gió hút và đẩy khí nóng tuần hoàn trong tủ, khi nhiệt

độ đạt đến nhiệt độ sấy, role tự ngắt ngừng cung cấp điện

cho thanh trở nhiệt, giảm xuống - 2 độ C role lại cấp lại

dòng điện cho thanh trở nhiệt nâng nhiệt độ sấy Trong

quá trình sấy có thể cài đặt thời gian sấy, hết thời gian sấy

điện ngừng cung cấp cho thanh trở và quạt gió tuần hoàn,

quạt hút bật hút khí nóng mang hơi nước ra ngoài

 Máy nước cất

Model: Merit W4000

Công dụng: Chuyển nước cứng thành nước tinh khiết

phục vụ pha hóa chất, pha môi trường và xử lí mẫu

Nguyên lý hoạt động: Quá trình chưng cất dùng nhiệt độ

để đun nước, làm nước bay hơi và ngưng tụ Nước thu

được từ việc làm bay hơi và ngưng tụ này gọi là nước cất

Model: HIRAYAMA HV-110

Công dụng: Nồi hấp giúp thanh trùng, giúp diệt các vi khuẩn, nấm, từ đó đảm bảo yếu

tố vô trùng cho môi trường đem sử dụng nuôi cấy bằng cách sử dụng áp suất cao tronghơi nước bão hòa ở 1210C trong khoảng 15-20 phút tùy thuộc vào kích thước và dungtích của đối tượng cần hấp khử trùng

Nguyên tắc hoạt động: Làm bay hơi nước của nguyên sinh chất dẫn đến phá vỡ vỏ để

tiêu diệt vi sinh vật

Chu trình hoạt động: 1 chu trình tiệt trùng môi trường

thường kéo dài 2 giờ và gồm 4 chế độ chính:

- Chế độ chờ (stand by): Bắt đầu từ 33oC

- Chế độ làm nóng: Nâng dần nhiệt độ lên đến

- Lấy nắt ở phía trên của hộp cân ra.

- Đặt cốc cân lên đĩa

- Ẩn nút O/T để điều chỉnh khối lượng ban đầu về zero

- Đưa khối lượng mẫu vật cần đo vào cốc cân rồi đậy nắp hộp cân lại

- Cân xong phải tắt nguồn, vệ sinh cân và xung quanh bàn cân sau khi sử dụng

Chú ý: Tránh để mẫu vật rơi trên đĩa cân, nếu bị rơi thì tắt nguồn I/O dùng giấy lau

- Bật nguồn I/O, để cân ổn định, chỉ số về 0.00g

- Đặt hộp nhựa rỗng, hoặc miếng giấy lọc sạch lên

- Cân xong tắt nguồn, vệ sinh cân và xung quanh bàn

cân và khu vực gần cân

Model: HI 2211.

Công dụng: Máy đo pH là một loại thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm, được

ứng dụng để đo độ pH của dung dịch mẫu cần đo một cách nhanh chóng và chính xác.

Hướng dẫn vận hành:

- Bật nguồn phía sau thiết bị

- Tháo nắp đậy đầu diện cực Chú ý, tránh làm đổ dung dich KCl bảo quản luônsẵn trong nắp này, cần thêm KCl nếu không có dung dịch bảo quản

- Ngâm cả 2 đầu đo pH, đầu đo nhiệt độ vào sâu 3-4 cm trong dung dịch môitrường chứa trong bình

- Điều chỉnh pH: Bằng cách bổ sung hóa chất, môi trường có pH kiềm thì bổsung acid HCl, môi trường có pH acid thì bổ sung NaOH Tránh va chạm đầu

- Sau khi chuẩn, vệ sinh đầu điện cực: Tráng bằng

nước cất, lau nhẹ bằng giấy mềm

- Đậy nắp trở lại, tắt nguồn

 Tủ an toàn sinh học

Model : AHC-4A1 (2 tủ) và AC-312 (2 tủ).

Công dụng: Tạo không gian vô trùng để tiến hành khử trùng mẫu và vào mẫu sạch,

đồng thời bảo vệ con người khỏi các tác nhân có thể gây bệnh

Nguyên lý hoạt động: Nguyên lý của tủ là cấp không khí vô trùng liên tục vào khoanglàm việc qua màng lọc vi trùng có khả năng lọc đến 99,99%

Hướng dẫn vận hành:

- Bật đèn UV trong 30 phút để vô trùng buồng cấy, sau khi đèn tắt bật quạt giókhoảng 30 phút mới vào phòng cấy

- Khử trùng tay, vệ sinh tủ cấy bằng cồn 700

- Dùng cồn 960 đốt các dụng cụ như dao, kéo, panh,

đĩa… để khử trùng

- Lau bình chứa mẫu và các bình môi trường bằng

cồn 700 trước khi đưa vào tủ cấy

- Khử trùng tay lần nữa rồi ngồi vào buồng cấy

- Khi làm việc với tủ cấy cần bật đèn chiếu sáng

Lưu ý :

- Trong khi cấy tuyệt đối không đưa tay qua các thiết

bị cấy và mẫu

- Trong khi cấy nếu cho tay ra ngoài thì phải lau tay

bằng cồn trước khi đưa lại vào buồng cấy

1.3 Nhà lưới Lan Hồ Điệp

Nhà lưới để sản xuất hoa lan Hồ Điệp theo quy mô công nghiệp phải có diện

tích tối thiểu 360m2, có thể trồng được 10000 cây thương phẩm (chiều dài nhà lưới tối

đa là 40 m để tăng hiệu quả sử dụng các thiết bị)

Hình 1.10 Nhà lưới lan Hồ Điệp tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng

Yêu cầu kỹ thuật nhà lưới lan Hồ Điệp:

- Xây dựng và xử lý thông số độ ẩm, nhiệt độ đúng theo yêu cầu của hoalan Hồ Điệp Nhiệt độ trong phạm vi trên 180C trong vụ đông, xuân và dưới

310C trong vụ hè, thu Nhiệt độ trong nhà lưới có thể tăng hoặc giảm tới 7-100C

so với nhiệt độ bên ngoài

- Có lưới cắt nắng trong và ngoài nhà, đối với khí hậu Việt Nam thì cólưới cắt nắng ngoài là tốt hơn hết

- Có quạt công nghiệp làm khô lá lan sau khi tưới vì duy trì độ ẩm lâu sẽkhiến sâu bệnh phát sinh

- Hệ thống tưới tự động

Các thiết bị chính sử dụng trong nhà lưới:

1.3.1 Quạt thông gió

Mục đích : Giúp không khí được thông thoáng , làm khô lá lan sau khi tưới vì nếu độ

ẩm quá nhiều sẽ rất dễ bị úng lá và gặp phải sâu bệnh

Nguyên tắc hoạt động: Quạt sẽ hút không khí ra ngoài nhờ các quạt gió dưới tác dụng

của dòng điện, đồng thời chúng sẽ hút một lượng không khí bên ngoài vào qua tấm lọckhí

Hình 1.11 Quạt thông gió

1.3.2 Bức tường nước

Mục đích: Lọc bụi, khói có trong không khí tạo ra luồng khí sạch đưa vào trong nhà

lưới Làm giảm nhiệt độ, tăng độ ẩm trong nhà lưới

Nguyên tắc hoạt động: Dựng bức tường có hệ thống nước chảy ở trong và quạt gió

công suất cao, lợi dụng việc bốc hơi nước để giảm nhiệt độ Khi cần giảm nhiệt độ chonhà lưới, mở quạt hút gió thật mạnh ra ngoài, tạo nên sự chênh lệch áp suất, đồng thờicho hệ thống máy bơm nước vào bức tường Không khí bên ngoài nhà lưới do chênhlệch áp suất mà bị hút vào nhà kính với một tốc độ tương đối, không khí chui qua kẽbức tường ướt theo hơi ẩm sẽ bị lạnh đi, khiến không khí ở trong nhà sẽ tự động giảmbớt

Hình 1.12 Bức tường nước

1.3.3 Đèn chiếu sáng

Mục đích: để thắp sáng những lúc cần thiết tạo đủ lượng ánh sáng cho cây phát triển

hoặc muốn hoa nở nhanh hơn

1.3.4 Máy vắt giá thể

Mục đích: Tách nước trong dớn (tảo, rêu…) sau khi ngâm thuốc diệt nấm.

Nguyên tắc hoạt động: Dưới tác động của lực ly tâm mạnh làm cho nước có trong dớn

sẽ được tách ra ngoài qua các lỗ nhỏ của máy ly tâm

1.3.5 Các kệ (giàn) đặt lan

Mục đích: Đặt các khay, chậu lan lên các kệ thuận lợi cho việc chăm sóc, tưới tiêu, có

tính thẩm mỹ cao Đồng thời tránh các tác nhân gây hại côn trùng

Hình 1.13 Máy vắt giá thể

Hình 1.14: Kệ (giàn) đặt lan

Chương 2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NUÔI CẤY MÔ

THỰC VẬT2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một lĩnh vực của công nghệ sinh học thực vật.dựa vào tính toàn năng của tế bào, khả năng phân hóa và phản phân hóa của chúng mà

ta có thể tái sinh cây từ một tế bào hay một mẫu mô nào đó [8]

Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều kiện như: nhiệt

độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật để điềukhiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêucầu đặt ra

2.2. Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [5]

2.2.1 Tính toàn năng của tế bào

Năm 1902, nhà sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôicấy tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năngtiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy mỗi tế bào của cơthể đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình nguyên phân Điều đó có nghĩa làmỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiêt của một cơthể hoàn chỉnh Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ pháttriển thành một cơ thể hoàn chỉnh

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận củaphương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật

2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của môchuyển hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Quá trình phân hóa tếbào có thể biểu diễn ở sơ đồ sau:

Tế bào phôi sinh  Tế bào giãn  Tế bào chuyên hóaMặc dù các tế bào đã chuyển hóa thành các mô chức năng nhưng chúng vẫnkhông mất đi khả năng phân chia của mình Trong điều kiện thích hợp, các tế bào lại

có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó được gọi làphản phân hóa tế bào (ngược lại với quá trình phân hóa tế bào).

Hình 2.1 Sơ đồ sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào

Về bản chất sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, phân hóagen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen đượchoạt hóa (mà trước đây bị ức chế) để cho biểu hiện trạng thái mới, một số gen khác lại

bị đình chỉ hoạt động Điều này xả ra theo một chương trình đã được mã hóa trongkhối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng tế bàotạo điều kiện thuận lợi cho các gen được hoạt hóa Quá trình phân hóa được xảy ratheo một chương trình định sẵn

2.3. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

• Nuôi cấy nốt đơn thân

Phương pháp nuôi cấy này sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên mang mộtđoạn thân ngắn Chồi này sẽ được kích thích cho tăng trưởng, ra rễ để tạo thành câynguyên vẹn Chồi được thu từ chồi ngọn và ở các nách lá, sau đó cấy lên môi trườngdinh dưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng

• Nuôi cấy chồi bên

Về nguyên tắc, phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân.Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo dài chồi, thân

và thường không cần đến cytokinin để phát triển Trong phương pháp nhân chồi bên,chồi được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triểndưới ảnh hưởng của cytokinin với nồng độ cao

• Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thựcvật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chóp đỉnh và chồi bên) sau khi vôtrùng mẫu và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp Môi trường thích hợp thay đổitheo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cấy, nhưng cơ bản môi trường chứa đầy đủ

chất dinh dưỡng gồm các nguyên tố đa lượng, vi lượng và được bổ sung chất kíchthích sinh trưởng thích hợp

• Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn:

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là kỹ thuật tạo ra cây đơn bội kép Phươngpháp tạo cây đơn bội kép và chọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả chọnlọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra các biến dị di truyềnkhác như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo Đây là kỹ thuật không phức tạp lắm,nhưng lại rất có hiệu quả trong chọn tạo giống cây trồng

• Nuôi cấy cơ quan sinh sản:

Phương pháp nuôi cấy cơ quan sinh sản như phôi, noãn cũng là một những hướngnghiên cứu quan trọng trong nuôi cấy in vitro Trong công tác chọn giống thì đây làphương pháp khắc phục tính không giao phối của loài và đồng thời là công cụ để khắcphục tính bất thụ do lai xa Cấy phôi có thể nhận được phôi lai, cấy noãn có thể pháttriển thành hạt có phôi và nảy mầm thành cây con

• Nuối cấy protoplast:

Nagata và Takebe (1930) đã thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ

mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một huyền phù tế bào trong môitrường lỏng Những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần đang mở ra nhiều triểnvọng trong nghiên cứu di truyền soma, cải tạo, phục tráng và tạo giống cây mới ở thựcvật bậc cao nói chung Phương pháp này được ứng dụng thành công trên nhiều đốitượng khác nhau

• Nuôi cấy mô sẹo (callus):

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức và có màu trắng, vàng Khối mô sẹo cókhả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kíchthích sinh trưởng tạo mô sẹo Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ vàmột cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấyđỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn

2.4 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật [5]

• Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu

Mẫu cấy là mảnh thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cấy Để tiến hành

nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ

quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu, kíchthước và vị trí lấy mẫu đó Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và

khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodiumdichloroisocyanurate, clorua thủy ngân,…

• Giai đoạn 2: Tạo thể nhân giống

Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in

vitro Có hai thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Đối với những

loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụmchồi từ mô sẹo Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và cácchất hữu cơ khác

• Giai đoạn 3: Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôicấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôicấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôikhi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài.Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh Cây nhân

giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài

• Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bịchuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trườngbình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kíchthích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một

bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ thuộc vào

nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu

di truyền Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro

• Giai đoạn 5: Chuyển cây con ra vườn ươm

Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trongchậu, luống ươm có cơ chất dễ thoát hơi nước, tơi xốp, nơi có bóng râm, độ ẩm cao,cường độ chiếu sáng thấp,… Trong những ngày đầu, cần phủ nilon để tránh sự thoáthơi nước ở lá Rễ cây trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuấthiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chấtkích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ Đây là gian đoạn rất quantrọng trong quá trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về

điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro

2.5. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.5.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

• Điều kiện vô trùng:

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo tốt điều

kiện vô trùng, mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị nhiễm,

chết Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in

vitro Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa

học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn Vô trùng ban đầu là một thao táckhó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định Nếu tìm được nồng độ và thời gian xử

lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao

• Điều kiện ánh sáng

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gianchiếu sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng tácđộng đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa

số các loài cây là 12-18 giờ/ngày Cường độ chiếu sáng tác động đến sự phát sinh hìnhthái của mô nuôi cấy

• Điều kiện nhiệt độ:

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sựphân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫunuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho

sự sinh trưởng ở nhiều loài cây là 250C

2.5.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiếtcho sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy thực vật khác nhau Trong đó, có một sốmôi trường cơ bản được sử dụng phổ biến như: MS, B5, SH có hàm lượng khoáng đalượng cao và một số môi trường khác được mô tả bởi White, Gautheret, Nitsch, Loyd

và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp hơn Tuy có nhiều loại môi trườngnuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau:

muối khoáng đa lượng và vi lượng, nguồn cacbon, các vitamine và amino acid,các chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường, các chất điều hòa tăngtrưởng

 Các muối khoáng đa lượng và vi lượng:

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác

nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cungcấp là N, P, K, Ca, Mg và Fe

Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro

là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời,người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy Cácthí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hóa chất dùng để pha môi trường khôngtinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần nào cho môi trườngnuôi cấy Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I,Mo,…

 Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang hợp,

do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào.Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccharose, một

số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccharose nhưng chúngthường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật Ngoài ra, khi khử trùng môitrường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiện tượng đường hóa,làm môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của

tế bào

 Các vitamin và acid amin

Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các

loài khác nhau thì khác nhau Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiếtcho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Chúng cần vitamin để xúc tác các quá

trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài

vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng Các vitamin thườngđược sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (B3),pyridoxine (B6) và myo-inositol

 Các chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

Nước dừa: được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều

loại cây Thông thường nước dừa được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảoquản lạnh

Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô

tế bào

Agar: là chất thường sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn

trong nuôi cấy mô thực vật Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel vàtan ở nhiệt độ 60-100°C, đặc lại khi nhiệt độ xuống 45°C Vì vậy, agar ổn định trongtất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật.Hơn nữa agar không phản ứng với các chất trong môi trường Độ cứng của agar quyếtđịnh bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường

Than hoạt tính: Việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác

dụng khử độc Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điềuhòa sinh trưởng và làm đen môi trường Người ta cho rằng tác dụng cản tăng trưởngcủa mô cấy trong môi trường có than hoạt tính là do nó hút các chất điều hòa sinhtrưởng trong môi trường như: NAA, kinetin, BAP, IAA và 2iP Khả năng kích thích sựtăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc

do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy

Các chất điều hòa sinh trưởng: Các chất điều hòa sinh trưởng hay còn gọi là

chất kích thích sinh trưởng thực vật là các yếu tố hóa học cần thiết cho sự sinh trưởng

và phát triển của thực vật Chất điều hòa sinh trưởng thực vật có thể là những chất tựnhiên được sản xuất với một hàm lượng rất nhỏ trong một bộ phận nào đó của cá thểthực vật hoặc là những chất được tổng hợp nhân tạo Các chất điều hòa tăng trưởnggồm 2 nhóm chính: auxin và cytokinin

+ Auxin: Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rấtthường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thànhphần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo,huyền phù tế bào và điều hòa sự phát triển sinh hình thái, đặc biệt khi nó được phốihợp với cytokinin

+ Cytokinin: Cytokinin là một loại hormone thực vật kích thích tế bào phânchia Các hợp chất này xuất phát từ purine adenin, một trong các base của DNA vàRNA Hợp chất Cytokinin đầu tiên được khám phá là kinetin, tiếp theo là zeatin - mộthợp chất có trong phần lớn thực vật và vài vi khuẩn, cấu trúc gần giống Kinetin, nhưnghoạt tính cao hơn gấp 10 lần Sau zeatin, hơn 30 loại cytokinin khác cũng được cô lập.Ngày nay, người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm hợp chất tự nhiên hay nhân tạo, cóđặc tính sinh lý giống kinetin Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng đều

là các aminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6 như BA Cytokinin tác động lên cả hai