NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

 Trên mỗi mạch đơn, các nucleotide được nối với nhau bằng các liên kết phosphodiester ◦ Các nhóm phosphate liên kêết C3’ củủa đườờng này vờếi C5’ củủa đườờng kêế tiêếp taẬo thành chủỗỗi

NHẬẬP MÔN CÔNG NGHỆẬ SINH HỌẬC

 Giới thiệu về giải trình tự

 DNA là cơ sở vật chất mang thông tin di truyền

 Các tế bào sinh vật và một số virus chứa DNA

 Trước kia, người ta xem tổng thông tin di truyền chứa trong bộ nhiễm sắc thể của một sinh vật được gọi là bộ gen (genome)

 Sau khi phát hiện ra plasmid và khám phá ra vai trò của lục lạp và ti thể trong di truyền khái niệm bộ gen bao gồm

cả DNA nằm trong các thể trong tế bào chất

•d.ATP: deoxyadenosine triphosphate

•d.GTP: deoxyguanosine triphosphate

•d.TTP: deoxythymidine triphosphate

•d.CTP: deoxycytidine triphosphate

deoxynucleoside triphosphate

(dNTP)

 Trên mỗi mạch đơn, các nucleotide được nối với nhau bằng các liên kết phosphodiester

◦ Các nhóm phosphate liên kêết C3’ củủa đườờng này vờếi C5’ củủa đườờng kêế tiêếp taẬo thành chủỗỗi dài

 Kỹ thuật giải trình tự DNA (DNA sequencing) là kỹ thuật xác định tất cả các hợp phần do nucleotide hình thành nên phân tử DNA chuyên tính nào đó

 Trình tự của DNA mã hóa các thông tin cần thiết để cho các cơ thể sống có thể tồn tại và tái sản sinh

 Việc xác định trình tự vì thế rất hữu ích với các nghiên cứu 'thuần túy' để lí giải tại sao và bằng cách nào mà

chủ đề mang tính ứng dụng

 Vì bản chất quan trọng của DNA đối với các sinh vật sống, hiểu biết về trình tự DNA có thể trở nên hữu ích với các nghiên cứu sinh học và ứng dụng

 Sự ra đời của hệ thống giải trình tự DNA tự động đã góp phần đáng kể vào công việc phân tích đa dạng di truyền giữa các giống loài, bổ sung cho các phương pháp trên hoàn chỉnh hơn

 Sự ra đời của hệ thống giải trình tự DNA tự động đã góp phần đáng kể vào công việc phân tích đa dạng di truyền giữa các giống loài, bổ sung cho các phương pháp trên hoàn chỉnh hơn

 Gen chỉ huy sự tổng hợp protein, cho nên việc xác định được chức năng của gen => chức năng của protien được tổng hợp => tính trạng

 Nhận diện, định danh sinh vật

 Vào năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học

 Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau

Dimethyl sulphat làm đứt mạch tại G

Axit (pH=2) gây đứt mạch đơn tại A hoặc G

Hydrazin gây đứt mạch đơn tại T và C

Hydrazin với nồng độ muối cao làm đứt

mạch đơn tại C

 Phương pháp này dựa trên nguyên tắc là khi mạch DNA đang được tổng hợp, nếu gặp dideoxy nucleotide thì bị dừng lại và các đoạn nucleotide có độ dài khác nhau được tạo ra.

 Đầu tiên quá trình tổng hợp DNA đòi hỏi phải có primer và hoá chất để tổng hợp oligonucleotide Sự tổng hợp DNA thực hiện qua sự hiện diện của 4 deoxy nucleotide Giải mã trình tự dựa vào dideoxy triphosphate Đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ P32

trong 4 dideoxy nucleotide triphosphate

Dideoxy nucleotide là phân tử bị mất nguyên tử oxy ở vị trí C3’ của đường deoxyribose

 Máy giải trình tự ABI 3130 hoạt động cũng trên nguyên tắc của phương pháp dideoxy của Fred Sanger

 Cái khác của máy giải trình tự tự động so với phương pháp của Sanger là vật liệu đánh dấu

qủang cùng gắến vào các ddNTP’s

 http://www.dnalc.org/resources/animations/sangerseq.html

 http://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html

sangerseq.html

cycseq.html

1 Tinh sạch sản phẩm PCR theo kit Invitrogen.

2 ThưẬc hiêẬn phaủn ưếng Cycle

Seqủencing (PCR gắến hủỳnh qủang)

BiH2O 5µl

Primer PCR 3.2 pmol

BigDye Terminator V3.1 5X

Qui trình thực hiện

3 Giải trình tự DNA

• Cho vào 20 µl HiDye Fomamide

• Đặt tuýp vào máy PCR ở nhiệt độ 950C, 5 phút

• Cho vào máy giải trình tự ABI 3130

• Đọc kết quả

Mô phỏng quá trình đọc kết quả

Ống mao quản (capilary)

H ệ thống quang

A G T T G T A T C T C

Đoạn DNA được tách thành sợi đơn trong 15μl formamide ở 95 o C, 5’

 Chia làm 6 nhóm:

Thaủo lủậẬn 10p

PHƯƠNG PHÁP ƯU ĐIỂM KHUYẾT ĐIỂM

Các bườếc thưẬc hiêẬn đờn giaủn

Sưủ dủẬng đỗờng viẬ phóng xaẬ -> đỗẬc Xác điẬnh trình tưẬ ngắến Cậờn tỗếi ưủ điêờủ kiêẬn phaủn ưếng

vài ngàn nủ.

ĐỗẬ chính xác cao Nhanh

An toàn do khỗng sưủ dủẬng đỗờng viẬ phóng xaẬ

Chi phí cao do trang thiêết biẬ và hóa chậết đắết tiêờn

Đòi hoủi kyỗ thủậẬt cao