Tiểu luận môn nhập môn công nghệ sinh học test kit

• Phương pháp chẩn đoán phân tử, điển hình là PCR và RT-PCR: Bổ sung môi trường phù hợp Nhận dạng thông qua sự phụ thuộc tăng trương, miễn dịch hoăc phân tử Phân lập Xét nghiệm kháng t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

TIỂU LUẬN MÔN: NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đề tài: Test Kit

Nhóm 8

Chiều thứ 6, tiết 11-12

GVHD: Trần Hoàng Ngâu

Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2016

DANH SÁCH THÀNH VIÊN

VÀ PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ

Họ và tên MSSV Nhiệm vụ Ghi chú

Phan Thị Băng Trâm 2008130142 -Tìm phần khái

niệm và phương pháp miễn dịch -Tổng hợp

Nhóm trưởng Hoàn thành

Trần Hoài Nam 2008130116 -Tìm phần phương

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 4

NỘI DUNG 4

I Khái niệm và phân loại: 4

II Sự phát triển của test kit: 6

III Cơ chế chẩn đoán miễn dịch: 7

1 Bản chất của sự kết hợp của kháng nguyên và kháng thể: 7

2 Phương pháp ELISA: 8

3 Phân loại ELISA: 10

3.1.Direct ELISA (ELISA trực tiếp) 10

3.2.ELISA gián tiếp 11

3.3 Sandwich ELISA 12

3.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp 13

3.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp 14

3.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh 14

3.4.1 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên 15

3.4.2 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể 17

4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA 17

Kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch 18

IV Cơ chế chẩn đoán phân tử: 20

1 Kỹ thuật PCR: 20

2 Quy trình kỹ thuật: 21

3 Phương pháp RT-PCR (PCR ngược) 21

4 Một số phương pháp chẩn đoán phân tử khác 23

5 Một số ứng dụng trong test kit 24

KẾT LUẬN 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

LỜI MỞ ĐẦU

Trong cuộc sống hiện đại, việc bảo vệ sức khỏe đang là một vấn đề hết sức được quan tâm

Vì thế việc sử dụng một công cụ để có thể dễ dàng hơn trong việc dự đoán về những căn bệnh hay vấn đề thường gặp là rất cần thiết Test kit là bộ công cụ như thế Thuật ngữ “test kit” không được dùng phổ biến, thế nhưng khi nhắc tới những sản phẩm của nó thì lại rất quen thuộc Test kit được dùng trong rất nhiều lĩnh vực trong cả công nghiệp hay nông nghiệp Ngoài những loại test kit gần gũi mà ta đã biết thì bài viết này sẽ trình bày thêm một số loại mới Hơn nữa, bài viết còn đề cập tới cơ chế hoạt động chung của một số loại test kit - những loại liên quan tới ngành công nghệ sinh học và y dược

Bài viết sẽ làm rõ những một số vấn đề liên quan tới test kit để ta có thể hiểu rõ hơn về công dụng và cơ chế của chúng Qua đó, chúng ta có thể chọn cho mình bộ test phù hợp để sử dụng Bài viết bao gồm các phần:

- Khái niệm và phân loại

- Sự phát triển của test kit

- Cơ chế chẩn đoán miễn dịch và ứng dụng

- Cơ chế chẩn đoán phân tử và ứng dung

Bài viết tham khảo nhiều tài liệu khác nhau nên chắc chắn sẽ có thiếu sót Mong nhận được

Tesst kit không chỉ là những sản phẩm nhỏ gọn được bán ra ngoài thị trường như

ta đã thấy mà những bộ kiểm tra/chẩn đoán trong bệnh viện hay phòng thí nghiệm cũng gọi là test kit

Hiện nay chúng được thiết kế nhỏ gọn, dễ sử dụng, độ chính xác khá cao Những sản phẩm đưa ra thị trường nước ta chỉ là một phần nhỏ và thông dụng như que thử thai, đo pH, test nhóm máu, test nước, hóa chất trong thực phẩm…

Nhưng ở các nước phát triển thì còn có các loại test kit phát hiện một số bệnh như tiểu đường, viêm gan B/C, test vi khuẩn, test DNA, thuốc…thậm chí là test HIV

2 Phân loại:

Có nhiều phương pháp sử dụng trong test kit, nhưng phương pháp phổ biến sử dụng trong ngành công nghệ sinh học và y dược cũng như các ngành khác là phương pháp chẩn đoán phân tử và phương pháp chẩn đoán miễn dịch

• Phương pháp chẩn đoán miễn dịch, điển hình là ELISA:

Test kit ELISA giúp cung cấp kết quả chính xác, nhạy cảm và nhất quán Mỗi đầu dò protein được nghiên cứu và các bộ dụng cụ được điều chỉnh để cung cấp đọ nhạy cảm về mặt sinh lý có liên quan Ngoài ra, bộ dụng cụ được xác nhận sử dụng các loại mẫu phổ biến, bao gồm huyết thanh, huyết tương và dịch nổi nuôi cấy tế bào Lysates (dịch phân giải) di động được sử dụng để xác nhận bộ dụng cụ phát hiện các protein truyền tín hiệu hoặc phosphoryl hóa

Ưu điểm của những bộ kit ELISA:

 Dùng trên 800 đối tượng khác nhau

 Tối ưu hóa cho hiệu suất nhạy, chính xác và nhất quán

 Kết quả có trong 2,5 - 4h

 Xác định với nhiều loại mẫu

• Phương pháp chẩn đoán phân tử, điển hình là PCR và RT-PCR:

Bổ sung môi trường phù hợp

Nhận dạng thông qua sự phụ thuộc tăng trương, miễn dịch hoăc phân tử Phân lập

Xét nghiệm kháng thể: tìm kháng nguyên của vi sinh vật/virus, sử dụng kháng thể huỳnh quang, EIA… Xết nghiệm phân tử: tìm gen gây nguồn bệnh chính,lai hóa nucleic acid, PCR

Từ một khuôn DNA rất nhỏ như giot máu, sợi tóc hay một tế báo… người ta

có thể khuếch đại chính xác, trật tự lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho quá trình khảo sát trong phản ứng

PCR được ứng dụng rất rộng rãi trong y học : chẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRC1 – BRCA2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen NF-1,2 trong

u xơ thần kinh…), nghiên cứu kháng nguyên bạch cầu người…

Trong vi sinh vật thì PCR là một phương tiên hưu dụng để phát hiện tác nhân gây bệnh

II Sự phát triển của test kit:

1960s and earlier Phát hiện nhiều dấu ấn sinh học và xét nghiệm chẩn đoán

bệnh hoặc mầm bệnh Xét nghiệm miễn dịch phát triển 1980’s to 1990’s Những công ty dược bán và mua những công ty chẩn đoán,

hơp nhất thành những đối thủ lớn

1983 Công nghệ PCR sử dụng nhiệt và Tag polymerase enzyme

để khuếch đại đoạn DNA, đây là công cụ chính trong nghiên cứu công nghệ sinh học và phát triển trên toàn thế giới

1991 Ra những sản phẩm microarray

1997 FDA phê chuẩn việc bán các thuốc thử cần phân tích cho

các phòng thí nghiệm được ủy quyền

2000 Hoàn thành công trình nghiên cứu bộ gen người

Phòng thí nghiệm tự động, công nghệ microaray tăng, được thương mại hóa

2002 Khởi động đề án bản đồ haplotype (SNPs)(dự án

HAPMAP)

2003 FDA tổng hợp những hướng dẫn để sử dụng markers sinh

học trong những thử nghiệm lâm sàng

Biểu đồ về sự phát triển của thị trường chẩn đoán trong ống nghiệm (IDV) toàn cầu năm 2012, tỉ lệ các nhu cầu cầu chẩn đoán (theo Genetic Engineering News)

Top 10 công ty IVD (in vitro diagnostics) có doanh thu lớn năm 2007(theo top 10

Global In-vitro Diagnostics của Business Insights)

III Cơ chế chẩn đoán miễn dịch:

1 Bản chất của sự kết hợp của kháng nguyên và kháng thể:

Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt của kháng nguyên và kháng thể Sự kết hợp này xảy ra giữa một phần rất giwois hạn giữa

phần tử kháng nguyên (nhóm quyết định) và một phần rất giới hạn của phần tử kháng thể (trung tâm hoạt động)

Theo Pauling, phẩn tử kháng thể thường hóa tri hai, nghĩa cùng một lúc có thể kết hợp với hai phần tử kháng nguyên Còn kháng nguyên đa hóa trị nên cùng lúc có thể kết hợp với rất nhiều phần tử kháng thể Cho nên kháng nguyên và kháng thể có thể kết hợp với nhau tạo thành một phức hợp hình mạng lưới trong khong gian ba chiều

Vì kích thước quá lớn nên phức hợp kết tủa hoặc ngưng kết

Kháng nguyên và kháng thể có thể kết hợp với nhau theo bất cứ tỉ lệ nào nhưng phản ứng yếu đi nếu thừa hoăc thiếu kháng nguyên hoặc kháng thể Phản ứng rõ rệt nhất lúc số phân tử kháng nguyên tương đương với phân tử kháng thể

Sự kết hợp giữa phần tử kháng nguyên và kháng thể xảy ra nhờ các lực như: lực liên kết ion giữa các nguyên tử hoặc các nhóm hóa học mang điện tích trái dấu; lực liên kết của các cầu nối hydro giữa các nguyên tử hydro mang điện tích dương với các nguyên tử mang điện tích âm, lực Van der Walls giữa hai phân tử phụ thuôc vào tương tác giữa các đám mây điện tử ở mặt ngoài và lực ố thủy nếu diện tiếp xúc cả phía kháng nguyên và kháng thể đều có các acid amine ố thủy thì kháng nguyên và kháng thể kết hợp, nước sẽ bị đẩy ra tạo nên lưc gắn kết giữa các acid amine ố thủy đó, sự kết hợp này không phải là một phản ứng hóa học

Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể rất đặc hiệu Một kháng nguyên chỉ kết hợp với kháng thể do nó kích thích cơ thể tạo thành Do đó phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể được sử dụng để xác định kháng nguyên hoặc kháng thể nếu một trong hai phân tử đã biết Hiệu giá của kháng thể trong huyết thành người hoặc động vật có thể xác định nhờ kháng nguyên đã biết và do đó cho biết sự tiếp xúc trước đó với kháng nguyên Ngược lại nhờ kháng thể đã biết những kháng nguyên khác nhau của một vi sinh vật có thể nhận mặt Mặt khác sự hiểu biết cấu tạo kháng nguyên cho phép lựa chọn thích đáng vi sinh vật dùng để làm vaccine phòng ngừa bệnh nhiễm trùng

2 Phương pháp ELISA:

ELISA (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa dùng để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫ cần phân tích Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm thực phẩm

Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét

nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông

qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay)

Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể

và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên

tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong

(Trích từ Chemicon International)

3 Phân loại ELISA:

3.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)

Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

Sơ đồ: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp

- Ưu điểm: Đơn giản nhất

- Nhược điểm:

+ Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope

+ Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng

3.2 ELISA gián tiếp

Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme)

Sơ đồ : Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp

- Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa

- Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được

3.3 Sandwich ELISA

Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies) Kỹ thuật này cũng được phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich)

DAS ELISA gồm sự dính thụ động của kháng thể vào pha rắn (đáy giếng) Những kháng thể này sau đó kết hợp với các kháng nguyên được thêm vào Những kháng nguyên được pha loãng trong blocking buffer nhằm ngăn sự dính không chuyên biệt của chúng vào pha rắn Ở đây, những phần của blocking buffer không nên chứa bất kỳ kháng nguyên nào mà có thể kết hợp với kháng thể bắt Sau khi ủ và rửa, chỉ còn phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn

Kháng thể bắt sau đó được thêm vào Do vậy, đây là sự kết hợp trực tiếp với kháng nguyên đích và kháng thể bắt Kháng thể thứ hai này có thể giống kháng thể một hoặc khác về nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể Sau khi ủ, rửa, thêm cơ chất vào và đọc trên máy

đo quang phổ Vì sử dụng một kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới hạn về tính chuyên biệt và những thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt Điều này giới hạn sự linh

hoạt của phương pháp, ví dụ như mỗi kháng thể được sử dụng phải được đánh dấu riêng (cho những kháng nguyên khác nhau) Theo cách này, direct ELISA bị giới hạn về sự chuẩn bị kháng thể Hệ thống cũng bị giới hạn ở chỗ kháng nguyên phải có ít nhất hai epitope vì cả hai kháng thể bắt và phát hiện đều kết hợp trực tiếp với kháng nguyên

Kháng thể bắt trên pha rắn và kháng thể phát hiện có thể chống lại những epitope khác nhau trên phức hợp kháng nguyên Do đó, thuận lợi khi khảo sát sự khác biệt nhỏ giữa những kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể phát hiện và kháng thể bắt khác nhau Việc sử dụng cùng một kháng thể bắt và phát hiện có thể dẫn đến vấn đề khi có giới hạn về vị trí gắn kết sẵn có cho sự phát hiện Kích thước và mối quan hệ không gian của các epitope trên kháng nguyên đích là rất quan trọng và có thể ảnh hưởng mạnh đến thử nghiệm

Sandwich ELISA có thể được chia làm hai hệ thống:

3.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp

Sơ đồ :Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp

- Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau

- Vì phương pháp này có ưu điểm hơn hẳn những phương pháp khác mà chúng tôi chọn

phương pháp này để chẩn đoán bệnh virus đang nghiên cứu

Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện Mối quan hệ về kích thước và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm

3.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp

Sơ đồ: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp

Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể được gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên

Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh

3.4.1 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên

Trong hệ thống trực tiếp, lượng kháng nguyên trên bề mặt đĩa và lượng kháng thể gắn enzyme đã được chuẩn độ để tối ưu Kháng nguyên và kháng thể gắn enzyme được thêm vào đĩa cùng một lúc để tạo ưu thế cạnh tranh

Nếu kháng nguyên tương tự hoặc cùng như kháng nguyên đã được gắn trên đĩa thì kháng thể gắn enzyme sẽ gắn lên kháng nguyên này Khi nồng độ của kháng nguyên cạnh tranh cao sẽ ngăn cản bất kỳ sự kết hợp của kháng thể gắn enzyme với kháng nguyên trên bề mặt đĩa (cạnh tranh 100%) Nếu nồng độ kháng nguyên cạnh tranh giảm (ví dụ : pha loãng) sự cạnh tranh sẽ giảm Như vậy nồng độ kháng nguyên cạnh tranh càng cao thì độ hấp thu màu càng giảm

Kháng nguyên cạnh tranh có thể được thêm trực tiếp vào đĩa nếu nó được pha loãng trong blocking buffer trước khi thêm kháng thể gắn enzyme

Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tương quan của nồng độ phân tử cần kiểm tra và kháng nguyên trên bề mặt đĩa (và mức độ tương đồng của kháng nguyên)