Luận án tiến sĩ sinh học

Ở các động vật nhai lại, axit phytic được phân giải bởi các phytase do khu hệ vi sinh vật kị khí như nấm và vi khuẩn sống trong dạ cỏ sinh ra.. Trong số các phytase thương mại hiện nay,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

-

NGÔ THANH XUÂN

NGHIÊN CỨU TẠO PHYTASE TÁI TỔ HỢP

TỪ Aspergillus niger XP TRONG Pichia pastoris

VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHĂN NUÔI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi

Các kết quả công bố trong luận án là trung thực, chính xác và tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong luận án

Hà Nội, Ngày 11 tháng 11 năm 2011

NCS Ngô Thanh Xuân

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Mai Thị Hằng người thầy đã dìu dắt tôi những bước đi đầu tiên trong con đường nghiên cứu khoa học, người đã luôn động viên chia sẻ và tạo những điều kiện tốt nhất về thời gian và kinh phí để tôi tiến hành những nghiên cứu trong luận án

PGS Vũ Nguyên Thành người truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quí báu trong lĩnh vực sinh học phân tử, người luôn chỉ bảo tận tình theo dõi sát tiến độ và có những đóng góp mới mẻ, sâu sắc về lĩnh vực nghiên cứu Đồng thời thầy cũng tạo điều kiện tốt nhất về thời gian và cơ sở vật chất khi tôi thực hiện những nghiên cứu tại Viện Công nghiệp Thực phẩm

GS Nguyễn Thành Đạt, PGS Vương Trọng Hào những người thầy đầu tiên định hướng, truyền đạt kiến thức cho tôi về lĩnh vực Vi sinh vật từ khi còn là sinh viên, đồng thời các thầy tham gia góp ý cho tôi từ xây dựng đề cương đến quá trình thực hiện luận án

TS Dương Minh Lam, TS Phan Duệ Thanh, Ths Tống Thị Mơ, Ths Trần Hữu Phong, Ths Đào T Hải Lý, CN Phạm T Hồng Hoa, CN Phạm Thị Vân (Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, Khoa Sinh – ĐHSP Hà Nội) về những

hỗ trợ kỹ thuật, điều kiện thực nghiệm cũng như đã giúp đỡ tôi hoàn thiện các seminar khoa học ở Bộ môn

NCS Lê Thùy Mai, CN Trần T Thanh Tâm, Ths Nguyễn Hương Giang, Ths Đinh T Mỹ Hằng, Ths.Nguyễn Thanh Thủy, Ths Dương Anh Tuấn, CN Đào Anh Hải những người bạn đồng nghiệp tại Bộ môn Vi sinh – Viện Công nghiệp Thực phẩm luôn chia sẻ động viên tôi, giúp đỡ và hỗ trợ kỹ thuật cũng như chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm nghiên cứu

Ban Giám Hiệu và các đồng nghiệp Trường Cao đẳng Cộng đồng Lào Cai đã tạo mọi điều kiện về mặt thời gian, luôn động viên khích lệ tôi trong quá trình học tập

Ban lãnh đạo Viện Công nghiệp Thực phẩm, Trung Tâm Bảo tồn giống vật nuôi - Viện Chăn nuôi Quốc Gia, Khoa Y Sinh- Viện Pháp Y Quốc Gia về những giúp đỡ và hợp tác trong nghiên cứu

Ban Giám Hiệu, Phòng quản lý Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học Trường ĐHSP Hà Nội đã động viên và tạo những điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cơ quan Hợp tác Phát triển Quốc tế Thuỵ Điển (SIDA) đã hỗ trợ kinh phí cho tôi trong suốt quá trình học tập

Gia đình luôn yêu thương, ủng hộ động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án

Hà Nội, Ngày 11 tháng 11 năm 2011

NGHIÊN CỨU SINH

Ngô Thanh Xuân

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BMM Buffered minimal methanol (Môi trường tối thiểu chứa methanol)

bp base pair (cặp bazơ)

BSA Bovine serum albumin (albumin huuyết thanh bò)

CNTP Viện Công nghiệp Thực phẩm

EDTA Ethylene diamine tetra acetate

FTU Phytase unit (đơn vị phytase)

HIV Human immunodeficiency virus

(vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người)ITS Internal transcribed spacer

IU International unit (đơn vị quốc tế)

MW Molecular weight (trọng lượng phân tử)

NMR Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)

NRRL

Northern regional research laboratory (hiện là National center for agricultural utilization research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)

OD Optical density (mật độ quang)

PCR Polymerase chain reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi)

PDA Potato dextrose agar

Phosphate Phốt phát

Kí hiệu Diễn giải

SDS- PAGE Sodium dodecyl sulphat polyacrylamide gel electrophoresis TAE Tris acetic acid EDTA

TCA Trichloroacetic acid

TTTĂ Tiêu tốn thức ăn

YPD Yeast peptone dextrose

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích của đề tài 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Nội dung nghiên cứu 3

5 Những đóng góp mới của luận án 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Axit phytic 4

1.1.1 Cấu trúc hóa học của axit phytic 4

1.1.2 Chức năng sinh lý của axit phytic 5

1.1.3 Phân bố và thành phần của axit phytic 5

1.1.4 Hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic 6

1.2 Enzyme phân giải phytate (phytase) 6

1.2.1 Cấu trúc phytase 8

1.2.1.1 Histidine Acid Phosphatase (HAP) 8

1.2.1.2 β-Propeller Phytase (BPP) 10

1.2.1.3 Cysteine Phosphatase (CP) 11

1.2.1.4 Purple Acid Phosphatase (PAP) 12

1.2.2 Nguồn phytase 13

1.2.2.1 Phytase từ vi sinh vật 13

1.2.2.2 Phytase từ thực vật 15

1.2.2.3 Phytase từ động vật 15

1.2.3 Đặc điểm phytase 15

1.2.3.1 Đặc điểm phân tử 15

1.2.3.2 Đặc tính nhiệt độ và pH 16

1.2.3.3 Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính phytase 17

1.2.4 Ứng dụng của phytase 18

1.2.4.1 Trong chăn nuôi 18

1.2.4.2 Trong công nghệ thực phẩm 22

1.2.4.3 Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphate 22

1.2.4.4 Trong công nghiệp giấy 23

1.2.4.5 Trong cải tạo đất 23

1.3 Nghiên cứu chuyển gen mã hóa phytase 24

1.3.1 Gen mã hóa phytase 24

1.3.2 Một số thành tựu chuyển gen mã hóa phytase 25

1.3.2.1 Thực vật chuyển gen 25

1.3.2.2 Động vật chuyển gen 26

1.3.2.3 Vi sinh vật chuyển gen 27

1.4 Hệ biểu hiện 29

1.4.1 Các hệ biểu hiện phổ biến 29

1.4.2 Đặc điểm của hệ biểu hiện P pastoris 30

1.5 Cấu trúc vector biểu hiện ở P pastoris 31

1.6 Tình hình sử dụng và nghiên cứu phytase ở Việt Nam 32

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Nguyên liệu 34

2.1.1 Hóa chất 34

2.1.2 Plasmid và mồi PCR 34

2.1.3 Vi sinh vật 35

2.1.4 Thiết bị 35

2.1.5 Môi trường và dung dịch đệm 35

2.1.5.1 Môi trường nuôi cấy 35

2.1.5.2 Môi trường biểu hiện 37

2.1.5.3 Dung dịch đệm 37

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.2.1 Các phương pháp vi sinh 37

2.2.1.1 Định loại Aspergillus bằng phương pháp truyền thống 37

2.2.1.2 Định loại Aspergillus bằng phân tích 28S rRNA 38

2.2.2 Các phương pháp hoá sinh 39

2.2.2.1 Xác định hoạt tính phytase 39

2.2.2.2 Xác định protein tổng số 41

2.2.2.3 Tinh sạch phytase 43

2.2.2.4 Điện di SDS - PAGE 44

2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt tính enzyme 45

2.2.2.6 Nghiên cứu hai pha tiêu hóa trong ống nghiệm 46

2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 46

2.2.3.1 Tách chiết DNA genome của Aspergillus và Pichia 46

2.2.3.2 Tách chiết plasmid 47

2.2.3.3 Phương pháp PCR 47

2.2.3.4 Tinh sạch DNA 48

2.2.3.5 Xác định trình tự gen 48

2.2.3.6 Ghép nối plasmid 48

2.2.3.7 Biến nạp DNA vào E coli bằng sốc nhiệt 48

2.2.3.8 Biến nạp DNA vào P pastoris bằng phương pháp xung điện 49

2.2.3.9 Tuyển chọn dòng mang gen biến nạp 50

2.2.3.10 Định lượng số copy bằng realtime-PCR 50

2.2.4 Các phương pháp thử nghiệm ứng dụng phytase 52

2.2.4.1 Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm phytase thô từ A niger XP trên gà Lương Phượng nuôi thịt 52

2.2.4.2 Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm phytase tái tổ hợp từ A niger XP trên lợn giai đoạn 10 - 50 kg 54

2.2.4.3 Xác định khả năng sinh trưởng của vật nuôi thí nghiệm 55

2.2.4.4 Xác định tiêu tốn và chi phí thức ăn 56

2.2.4.5 Tỷ lệ nuôi sống 56

2.2.4.6 Đánh giá năng suất thịt ở gà nuôi 56

2.2.4.7 Xác định hàm lượng nước trong thịt gà 57

2.2.4.8 Phân tích hàm lượng phytate trong phân 58

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59

3.1 Tuyển chọn, phân loại và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chủng nấm mốc thu phytase 59

3.1.1 Tuyển chọn chủng nấm mốc sinh phytase 59

3.1.2 Định loại chủng nấm mốc đen XP 59

3.1.2.1 Định loại bằng hình thái 59

3.1.2.2 Định loại bằng phân tích 28S rRNA 61

3.1.3 Lên men bề mặt thu phytase 62

3.2 Tinh sạch và đánh giá đặc tính của phytase 63

3.2.1 Tinh sạch phytase 63

3.2.2 Một số đặc tính hóa lý của phytase 66

3.2.2.1 Đặc tính pH 66

3.2.2.2 Đặc tính nhiệt độ 67

3.2.3 Thử nghiệm khả năng phân giải cơ chất ở hai pha tiêu hoá in vitro 68

3.3 Tính đa dạng nguồn gen mã hoá phytase (phyA) từ A niger 69

3.3.1 Tách DNA genome của Aspergillus 70

3.3.2 Nhân dòng phyA từ A niger 70

3.3.3 Giải và phân tích trình tự các gen phyA 71

3.4 Biểu hiện gen phyA trong Pichia pastoris 77

3.4.1 Thiết kế vector thể hiện phyA không chứa đuôi His-tag và C-myc-epitope 77

3.4.1.1.Thiết kế mồi 77

3.4.1.2 Nhân dòng gen 78

3.4.1.3 Gắn phyA vào vector pPICZA 78

3.4.1.4 Kiểm tra sự có mặt của phyA có trong E coli bằng PCR colony 79

3.4.1.5 Tách chiết plasmid 80

3.4.1.6 Kiểm tra trình tự của thiết kế mới tại các vị trí liên kết 81

3.4.2 Chuyển plasmid biểu hiện pPICZA/phyA vào P pastoris 82

3.4.2.1 Mở vòng pPICZA/phyA 82

3.4.2.3 Tuyển chọn dòng tế bào P pastoris biến nạp dương tính 83

3.4.3 Biểu hiện phyA trên P pastoris 84

3.4.4 Tuyển chọn chủng biến nạp có hoạt tính phytase cao 85

3.5 Tuyển chọn và xác định số copy trong dòng biến nạp mang đa gen 86

3.5.1 Tuyển chọn dòng tế bào 87

3.5.2 Định lượng số copy của 3 thể biến nạp P pastoris bằng realtime-PCR 89

3.5.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu phục vụ định lượng copy 89

3.5.2.2 Xác định tính đặc hiệu của cặp mồi thiết kế 89

3.5.2.3 Xác định mối tương quan giữa gen chỉ thị và gen đích 90

3.5.2.5 Xác định số copy ở các chủng P pastoris biến nạp mang đa gen 92

3.6 Một số đặc tính hóa lý của phytase tái tổ hợp 94

3.6.1 Đặc tính pH của phytase tái tổ hợp 95

3.6.2 Đặc tính nhiệt độ của phytase tái tổ hợp 95

3.6.3 Xác định các thông số động học của phytase 96

3.6.4 Ảnh hưởng của các ion kim loại 98

3.6.5 Nghiên cứu tính mẫn cảm với enzyme thủy phân protein trong đường tiêu hóa động vật 99

3.6.5.1 Ảnh hưởng của hệ enzyme trong dạ dày 99

3.6.5.2 Ảnh hưởng của hệ enzyme trong ruột non 100

3.6.6 Nghiên cứu tiêu hóa hai pha in vitro 101

3.7 Xác định điều kiện lên men và thu hồi phytase tái tổ hợp 102

3.7.1 Ảnh hưởng của nồng độ methanol 102

3.7.2 Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến khả năng biểu hiện phytase 103

3.7.3 Nghiên cứu thu hồi phytase ở qui mô phòng thí nghiệm 106

3.7.3.1 Nghiên cứu qui trình tinh chế phytase từ môi trường nuôi cấy 106

3.7.3.2 Nghiên cứu qui trình tạo chế phẩm enzyme dạng bột 107

3.7.3.3 Nghiên cứu tính bền nhiệt của chế phẩm dạng bột 107

3.8 Thử nghiệm phytase trên vật nuôi 108

3.8.1 Ảnh hưởng của chế phẩm phytase thô từ A niger XP trên gà Lương Phượng

3.8.1.1 Ảnh hưởng của các chế phẩm enzyme lên sự tăng khối lượng ở gà 109

3.8.1.2 Ảnh hưởng của chế phẩm enzyme lên hiệu quả sử dụng thức ăn 109

3.8.1.3 Ảnh hưởng của chế phẩm lên chất lượng thịt và các nội quan của gà 110

3.8.2 Ảnh hưởng của chế phẩm phytase tái tổ hợp từ A niger XP trên lợn giai đoạn 10 - 50 kg 114

3.8.2.1 Ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm enzyme đến hệ số chuyển hóa thức ăn 115

3.8.2.2 Ảnh hưởng của phytase lên lượng P thải qua phân 116

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 118

CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 120

TÀI LIỆU THAM KHẢO 122 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại về cấu trúc của enzyme thủy phân phytate 13

Bảng 1.2 Sử dụng phytase trong chăn nuôi [118] 19

Bảng 1.3 Biểu hiện phytase trong một số thực vật chuyển gen [118] 25

Bảng 1.4 Tách dòng và biểu hiện phytase ở vi sinh vật [118] 27

Bảng 1.5 Đặc điểm của vector biểu hiện pPICZA [72] 31

Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng 34

Bảng 2.2 Tương quan giữa hàm lượng Pvc và OD700 nm 40

Bảng 2.3 Tương quan giữa hàm lượng BSA và OD595 nm 42

Bảng 2.4 Chuẩn bị gel tách 10,5% và gel cô 5% acryamide 44

Bảng 2.5 Đặc điểm của mồi cho gen MET2 và Ble 51

Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm tác dụng của chế phẩm phytase thô trên gà Lương Phượng nuôi thịt 53

Bảng 2.7 Thành phần enzyme ở các chế phẩm sử dụng trong thí nghiệm 53

Bảng 2.8 Khẩu phần cơ sở cho gà Lương Phuợng sau 4 tuần tuổi 54

Bảng 2.9 Bố trí thí nghiệm 54

Bảng 2.10 Khẩu phần thức ăn cơ sở đầy đủ P giai đoạn 1 (10-20 kg) 55

Bảng 2.11 Khẩu phần thức ăn cơ sở đầy đủ P giai đoạn 2 (20-50 kg) 55

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng nấm mốc XP trên các môi trường 60

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh phytase trong lên men bề mặt 63

Bảng 3.3 Các bước tinh sạch phytase từ A niger 66

Bảng 3.4 Hai pha tiêu hoá in vitro 69

Bảng 3.5 Danh sách các chủng sử dụng trong nhân dòng phyA 70

Bảng 3.6 Độ tương đồng (%) trình tự DNA và số lượng nucleotide khác biệt của các gen phyA tách dòng 74

Bảng 3.7 Độ tương đồng (%) trình tự protein và số lượng axit amin khác biệt của các PhyA tách dòng 74

Bảng 3.8 Hoạt tính phytase của các thể biến nạp KM71H và X33 86

Bảng 3.9 So sánh họat tính phytase giữa các thể biến nạp A và B 88

Bảng 3.10 Các chủng xác định số lượng copy 89

Bảng 3.12 Xác định số copy cho từng thể biến nạp 93

Bảng 3.13 Các thông số động học của phytase tái tổ hợp 98

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính phytase tái tổ hợp 98

Bảng 3.15 Biểu hiện phytase trên các môi trường và thời gian khác nhau 104

Bảng 3.16 Tinh sạch phytase tái tổ hợp bằng phương pháp lọc luân hồi 106

Bảng 3.17 Hiệu suất thu làm khô chế phẩm bằng đông khô 107

Bảng 3.18 Khả năng bền nhiệt của chế phẩm phytase 108

Bảng 3.19 Ảnh hưởng chế phẩm phytase thô từ chủng A niger XP đến sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của gà Lương Phượng nuôi thịt 112

Bảng 3.20 Kết quả mổ khảo sát chất lượng thịt của gà thí nghiệm ở 12 tuần tuổi 113 Bảng 3.21 Ảnh hưởng của việc bổ sung enzyme đến khả năng sinh trưởng và hiệu quả chuyển hóa thức ăn 115

Bảng 3.22 Kết quả phân tích lượng P thải qua phân 117

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử (a) và cấu trúc không gian (b) của axit phytic 4

Hình 1.2 Phản ứng xúc tác của phytase 7

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Histidine acid phosphatase (a), β-propeller phytase (b) và cysteine Phosphatase (c) 9

Hình 2.1 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng Pvc 41

Hình 2.2 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng protein 43

Hình 3.1 Cây phả hệ xây dựng dựa trên trình tự ITS của chủng XP và các loài liên quan 62

Hình 3.2 Sắc kí đồ loại muối bằng Sephadex G25-fine 64

Hình 3.3 Sắc kí đồ trao đổi ion 64

Hình 3.4 Sắc kí đồ lọc gel bằng Superdex 200 65

Hình 3.5 Điện di đồ SDS- PAGE các sản phẩm quá trình tinh sạch phytase 65

Hình 3.6 pH tối ưu (a) và độ bền pH (b) của phytase từ A niger XP 67

Hình 3.7 Nhiệt độ tối ưu (a) và độ bền nhiệt (b) của phytase từ A niger XP 68

Hình 3.8 Nhân dòng gen phyA bằng PCR 70

Hình 3.9 Trình tự axit amin và sự khác biệt giữa 09 gen tách dòng 73

Hình 3.10 Độ tương đồng trình tự gen mã hóa phytase của các chủng nghiên cứu và những chủng trong GenBank 75

Hình 3.11 Sản phẩm PCR 78

Hình 3.12 Điện di đồ DNA sau khi cắt bằng EcoRI và XbaI và tinh sạch bằng kit 79

Hình 3.13 Kết quả điện di PCR colony từ 15 khuẩn lạc 80

Hình 3.14 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp 80

Hình 3.15 Sơ đồ hoạt động của cặp mồi chéo 81

Hình 3.16 Kiểm tra sự có mặt phyA bằng cặp mồi chéo 81

Hình 3.17 So sánh độ tương đồng của đoạn gen pPICZA-phyA tại vị trí ghép nối EcoRI (a) tại vị trí ghép nối XbaI (b) với phyA (Z16414) ở phía tương ứng 82

Hình 3.18 Cắt plasmid tái tổ hợp bằng PmeI 83

Hình 3.19 Kiểm tra sự có mặt phyA trong P pastoris bằng cặp mồi chéo 84

Hình 3.20 Hoạt tính phytase trên đĩa 96 giếng từ chủng P pastoris KM71H (a) và từ chủng P pastoris X33 (b) 85

Hình 3.21 Khả năng sinh trưởng trên nồng độ kháng sinh cao 87

Hình 3.22 So sánh khả năng kháng zeocin giữa các thể biến nạp A và B 88

Hình 3.23 Biểu đồ đường tan chảy (a) và điểm tan chảy (b) của sản phẩm PCR 90

Hình 3.24 Biểu đồ realtime-PCR mẫu chuẩn với cặp mồi Ble (a) và MET2 (b) 91

Hình 3.25 Mối tương quan tuyến tính giữa độ pha loãng mẫu chuẩn với Ct của các cặp mồi MET2 và Ble 92

Hình 3.26 Biểu đồ realtime-PCR của P pastoris A3 (a), P pastoris A7 (b),

P pastoris B3 (c) 93

Hình 3.27 Điện di đồ SDS-PAGE và zymogram của phytase tái tổ hợp 94

Hình 3.28 pH tối ưu (a) và độ bền pH (b) của phytase tái tổ hợp 95

Hình 3.29 Nhiệt độ tối ưu (a) và độ bền nhiệt (b) của phytase tái tổ hợp 96

Hình 3.30 Sự biến thiên vận tốc phản ứng của phytase phụ thuộc vào nồng độ

Na- phytate và pNPP 97

Hình 3.31 Sự phụ thuộc giữa 1/V và 1/[S] của với Na-phytate (a) và pNPP (b) 97

Hình 3.32 Tác động của pepsin lên phytase tái tổ hợp 100

Hình 3.33 Tác động của pancreatin lên phytase tái tổ hợp 101

Hình 3.34 Hai pha tiêu hóa in vitro 102

Hình 3.35 Ảnh hưởng của nồng độ methanol lên khả năng sinh phytase 103

Hình 3.36 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng biểu hiện phytase 105

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Diện tích ngũ cốc, cây họ đậu và cây cho hạt lấy dầu chiếm hơn 90% tổng diện tích cây trồng của thế giới Những thực vật này là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho con người và động vật Một trong những hợp chất dự trữ nguồn phosphate

chủ yếu là axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate), chiếm hơn 80% tổng số

phốt pho (P) có trong những thực vật này [121] Trong thực vật axit phytic liên kết chặt chẽ với những nguyên tố khoáng như: Ca, Mg, Fe và Zn, các axit amin, các protein và ức chế các enzyme tiêu hóa [104] Vì thế, axit phytic là một yếu tố kháng dinh dưỡng trong thức ăn và thực phẩm có nguồn gốc từ những thực vật trên Do đó, việc dùng phytase để thủy phân, loại bỏ axit phytic trong thành phần thức ăn là rất cần thiết

Ở các động vật nhai lại, axit phytic được phân giải bởi các phytase do khu hệ

vi sinh vật kị khí như nấm và vi khuẩn sống trong dạ cỏ sinh ra Nhưng những động vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và cá không thể sử dụng muối phytate vì trong đường tiêu hóa của chúng thiếu hụt enzyme quan trọng này Bởi vậy, người ta thường bổ sung phốt pho vô cơ (Pvc) vào trong thức ăn để đáp ứng nhu cầu P cho cơ thể, nhằm đảm bảo cho động vật sinh trưởng, phát triển bình thường Tuy nhiên, bổ sung Pvc không làm giảm được hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic mà còn gây ô nhiễm môi trường, do P dư thừa thải qua phân động vật Đồng thời làm tăng chi phí khẩu phần thức ăn Vì vậy, giải pháp tốt nhất thay thế cho việc bổ sung Pvc

là thêm phytase vào thức ăn của vật nuôi, nhằm phân giải phytate thực vật sẵn có trong thức ăn, giải phóng Pvc dễ hấp thụ cho vật nuôi

Bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi động vật không những mang lại hiệu quả về mặt dinh dưỡng và kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi trường [139] Ngoài ứng dụng vào trong thức ăn chăn nuôi, phytase còn được sử dụng cho thực phẩm ở

người, trong điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dược phẩm,

ứng dụng trong công nghiệp giấy và cải tạo đất trồng Bởi thế, việc nghiên cứu sản xuất phytase đã và đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học [78]

Với tầm quan trọng trong ứng dụng cho ngành chăn nuôi, phytase hiện đang được thử nghiệm và sử dụng ở Việt Nam Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

đã đưa phytase vào danh mục thức ăn chăn nuôi được nhập khẩu theo Quyết định

số 88/2008/QĐ-BNN ngày 22/8/2008 Chính vì vậy, những nghiên cứu về sản xuất phytase giá thành thấp thay thế phytase nhập khẩu đang được nhiều nhà khoa học trong nước quan tâm [1], [4], [11] Trong số các phytase thương mại hiện nay,

phytase từ Aspergillus niger được quan tâm nhiều nhất vì có ưu điểm như: khả năng

hoạt động ở pH axit; hoạt tính cao; chống chịu được tác động của các proteinase trong hệ tiêu hóa của vật nuôi Do vậy, việc phát hiện nguồn gen mã hóa phytase từ

A niger từ Việt Nam và ứng dụng công nghệ gen để sản xuất phytase tái tổ hợp là

một hướng đi đúng đắn, hướng tới sản xuất thay thế phytase nhập khẩu trong tương lai

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, tôi đã thực hiện đề tài:

"Nghiên cứu tạo phytase tái tổ hợp từ Aspergillus niger XP trong Pichia pastoris

và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi " Đây là một phần trong dự án: “Nghiên cứu sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp để sản xuất enzyme vi sinh vật cho chăn nuôi gia súc gia cầm ở Việt Nam” được tổ chức SIDA/SAREC Thụy Điển tài trợ

và đề tài: "Khai thác và phát triển nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm"

do Viện CNTP chủ trì

2 Mục đích của đề tài

Tuyển chọn chủng A niger có khả năng sinh phytase ngoại bào trên các phế

phụ phẩm nông nghiệp với các đặc tính phù hợp cho chăn nuôi Nghiên cứu dùng công nghệ gen tạo chủng sinh phytase tái tổ hợp năng suất cao

3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Phytase và gen mã hóa phytase từ các chủng nấm mốc trong bộ sưu tập giống của Bộ môn Công nghệ sinh học - Vi sinh (ĐHSP Hà Nội) và Bộ môn Vi sinh (Viện CNTP)

- Phạm vi nghiên cứu: Tuyển chọn, nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phân loại chủng nấm sợi sinh phytase, tách dòng và biểu hiện phytase, xây dựng quy

hành tại: Bộ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh (ĐHSP Hà Nội); Bộ môn Vi sinh (Viện CNTP) và Trung tâm Thực nghiệm và Bảo tồn vật nuôi (Viện chăn nuôi Quốc gia)

4 Nội dung nghiên cứu

- Tuyển chọn, định loại chủng nấm sợi có khả năng sinh phytase trên bã sắn phế thải với đặc tính phù hợp cho chăn nuôi

- Nghiên cứu tính đa dạng nguồn gen mã hóa phytase (phyA) từ A niger Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa phytase (phyA) có nguồn gốc từ A niger trong Pichia

pastoris Tuyển chọn và xác định số copy của dòng tế bào biến nạp mang đa gen có hoạt

5 Những đóng góp mới của luận án

- Đây là luận án đầu tiên nghiên cứu toàn diện về một chủng A niger phân

lập từ Việt Nam có khả năng sinh phytase axit có tiềm năng ứng dụng cao trong chăn nuôi (từ khâu tuyển chọn và định loại đến loài, nghiên cứu các đặc điểm của phytase đáp ứng các nhu cầu cho chăn nuôi, nâng cao năng suất chủng sản xuất bằng kỹ thuật ADN tái tổ hợp)

- Nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam thành công trong việc nhân dòng, biểu

hiên gen phyA từ A niger trong P pastoris và thiết lập được quy trình sản xuất chế

phẩm phytase tái tổ hợp

- Bổ sung vào GenBank 07 trình tự gen mã hóa phytase từ các chủng A

niger, làm đa dạng gen phyA

- Xây dựng phương pháp và xác định số copy trong các thể biến nạp P pastoris

mang đa gen bằng kỹ thuật realtime - PCR

- Bước đầu thử nghiệm tác động của phytase tự nhiên và phytase tái tổ hợp trên vật nuôi với kết quả tốt, mở ra tiềm năng ứng dụng của enzyme này cho chăn nuôi sạch ở Việt Nam

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Axit phytic

Axit phytic là dạng dự trữ P chủ yếu ở ngũ cốc, cây họ đậu và các loại hạt có chứa dầu Trong thực vật, axit phytic có chức năng sinh lý quan trọng, nó cũng ảnh hưởng tới đặc điểm dinh dưỡng và đặc tính của thức ăn, thực phẩm có nguồn gốc từ những thực vật trên Công thức hóa học của axit phytic là: C6H18O24P6, khối lượng

phân tử là: 659,86 (đvC), tên khoa học là: myo-inositol 1,2,3,4,5,6 - hexakis

dihydrogen phosphate [74] Trong thực vật axit phytic không tồn tại tự do mà tồn tại dưới dạng muối phytate của các kim loại Mg, K, Ca (muối K-Mg phytate có trong gạo; muối Ca-K-Mg phytate có trong đậu tương), cũng như tham gia liên kết với các protein (hình 1.1a)

Chú thích: Những hình tròn thể hiện các nhóm phốt

phát Nguyên tử các bon được đánh số từ 1-6

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử (a) và cấu trúc không gian (b) của axit phytic

1.1.1 Cấu trúc hóa học của axit phytic

Cấu trúc của axit phytic được đã được mô tả bằng phương pháp phân tích tia

X [23] và phương pháp 31P-NMR [76] Johnson và Tate (1969) đã đề xuất rằng nhóm phốt phát ở vị trí số 2 là vị trí trục, còn những nhóm phốt phát còn lại có vị trí xích đạo (quay xung quanh trục) Ngược lại, Blank và CS (1971) lại cho rằng những nhóm phốt phát ở vị trí 1-, 3-, 4-, 5-, và 6- mới là vị trí trục, còn nhóm phốt phát ở

vị trí số 2 là vị trí xích đạo Sau này, những kết quả nghiên cứu của Costello và CS

(1976) đã ủng hộ quan điểm về cấu tạo axit phytic của Johnson và Tate (1969) Cấu tạo không gian phù hợp nhất của axit phytic được mô tả qua hình 1.1b

1.1.2 Chức năng sinh lý của axit phytic

Một số vai trò sinh lý của axit phytic trong hạt cây trồng và hạt ngũ cốc đã được đề xuất Bao gồm những chức năng:

(1) Nguồn dự trữ P

(2) Nguồn dự trữ năng lượng

(3) Nguồn các ion dương (cation)

(4) Nguồn cung cấp myo-inositol (chất tiền thân của thành tế bào)

(5) Khởi xướng trạng thái ngủ cho hạt

Hơn nữa, có thể axit phytic có một vài chức năng khác trong hạt cây trồng mà vẫn chưa được biết đến [121] Vai trò của axit phytic như là một chất chống oxy hóa

tự nhiên trong giai đoạn nghỉ của hạt đã được Graf và CS (1987) nghiên cứu [55]

Axit phytic cũng được thử nghiệm làm tác nhân chống ung thư biểu mô ruột kết

và ung thư biểu mô vú ở động vật Sự có mặt của axit phytic trong ruột kết có thể chống lại sự phát triển của ung thư biểu mô ruột kết [45] Những nghiên cứu cuối thập niên 80

và đầu thập niên 90 đã xác minh vai trò các dẫn xuất của inositol phosphate trong việc vận chuyển vật chất vào trong tế bào Đặc biệt là vai trò về tín hiệu truyền tính trạng và điều hòa chức năng tế bào của inositol triphosphate đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu [162]

1.1.3 Phân bố và thành phần của axit phytic

Axit phytic có mặt ở trong các phần khác nhau của hạt ngũ cốc và hạt cây họ đậu, nó được tổng hợp ở hạt trong quá trình chín của quả Quá trình này xảy ra đồng thời với sự tổng hợp các hợp chất dự trữ khác như tinh bột và lipid Trong ngũ cốc

và cây họ đậu, axit phytic được tổng hợp trong hạt Aleurone và tinh thể hình cầu [121] Nội nhũ của lúa mỳ và hạt gạo hầu như không có phytate, mà nó lại nằm tập trung trong mầm và trong lớp vỏ Aleurone của tế bào hạt gạo Ferguson và Bollard (1976) đã tìm thấy rằng 99% phytate ở hạt đậu Hà Lan khô có trong lá mầm và 1%

trong phôi mầm [47] Lượng phytate cao nhất trong số ngũ cốc được tìm thấy ở ngô (0,83 – 2,22%) Theo Reddy và CS (1989) trong các cây họ đậu, hàm lượng phytate cao nhất đạt 5,92 – 9,15% ở cây đậu dolique [121]

1.1.4 Hiệu ứng kháng dinh dƣỡng của axit phytic

Axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dưỡng rất mạnh [104] Hiệu ứng này biểu hiện rõ ràng khi chúng ta quan sát cấu trúc phân tử đặc biệt của nó (Hình 1.1a) Axit phytic liên kết chặt chẽ với các phân tử protein và các nguyên tố kim loại như

Ca2+, Mg2+, Zn2+ Chính những liên kết này tạo thành phức hợp không hòa tan trong đường tiêu hóa, dẫn đến ức chế khả năng hấp thụ khoáng của động vật [40], [121]

Kẽm là một nguyên tố vi lượng mà hoạt tính sinh học của nó bị ảnh hưởng lớn nhất bởi axit phytic Rimbach và Pallauf (1992) đã chỉ ra rằng khi axit phytic được bổ sung vào thức ăn đã làm giảm mạnh khả năng hấp thụ ion Zn2+ và giảm khối lượng của chuột [122] Axit phytic còn tương tác với protein trong dải pH rộng

để tạo thành phức hợp phytate – protein Ở pH thấp, axit phytic liên kết chặt chẽ với những protein thực vật khi điểm đẳng điện của những protein này dao động trong khoảng pH 4,0 – 5,0 Trong khoảng pH 6,0 - 8,0, axit phytic và phần lớn protein thực vật tích điện âm Tuy vậy, trong điều kiện này, sự tạo thành phức hợp giữa axit phytic và protein vẫn khá phổ biến [30] Liên kết giữa protein thực vật với axit phytic làm giảm độ hòa tan, giảm khả năng bị phân cắt của protein và do vậy làm giảm giá trị dinh dưỡng của chúng Hơn nữa, khi liên kết với muối khoáng, protein, axit phytic vẫn tiếp tục tương tác với các enzyme tiêu hoá như trypsin, pepsin, α-amylase và β-galactosidase, làm giảm hoạt tính của những enzyme này [43], [71], [140]

1.2 Enzyme phân giải phytate (phytase)

Phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) xúc tác phản ứng thủy phân myo-inositol hexakisphosphate (axit phytic) thành những gốc phosphate

đơn vô cơ và những dẫn xuất đơn giản hơn của myo-inositol phosphate Trong một vài trường hợp phản ứng có thể giải phóng myo-inositol tự do (Hình 1.2)

Hình 1.2 Phản ứng xúc tác của phytase

Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại phytase thành hai dạng là:

Dạng 1: kí hiệu (EC 3.1.3.8)

Tên đề xuất: 3-phytase

Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 3 phosphohydrolase

T ên khác: phytase; phytate-3-phosphatase

Dạng 2: kí hiệu (EC 3.1.3.26)

Tên đề xuất: 6-phytase

Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 6 phosphohydrolase

Tên khác: phytase; phytate-6-phosphatase

Sự phân loại này dựa trên cơ sở vị trí nhóm phosphate đầu tiên bị phytase tấn công, 3-phytase (EC 3.1.3.8) tấn công vào nhóm phosphate ở vị trí thứ 3; đây là dạng phytase điển hình của vi sinh vật và 6-phytase (EC 3.1.3.26) tấn công đầu tiên vào nhóm phosphate số 6; đây là dạng điển hình cho phytase từ thực vật [159]

1.2.1 Cấu trúc phytase

Hiện nay, người ta chia phytase ra 4 nhóm như sau: (1) Histidine Acid Phosphatase (HAP), (2) β-Propellar Phytase (BPP), (3) Cysteine Phosphatase (CP)

và (4) Purple Phosphatase Acid (PAP) Các nhóm này khác nhau về cấu trúc phân

tử và cơ chế xúc tác, cho phép chúng sử dụng axit phytic làm nguồn cơ chất trong các môi trường khác nhau

1.2.1.1 Histidine Acid Phosphatase (HAP)

Tất cả các enzyme của nhóm HAP thường có chung một cơ chế xúc tác và

vị trí hoạt động Trình tự axit amin cấu thành vị trí hoạt động ở tận cùng đầu N là RHGXRXP và đầu C là HD [162] Khi trình tự axit amin được cuộn gập đúng, các

vị trí đó cấu thành với nhau để tạo thành vị trí xúc tác của nhóm phosphatase này Những trình tự xa nhau kết hợp lại hình thành một trung tâm xúc tác duy nhất, đây

là nơi bắt đầu hai bước phản ứng thủy phân liên kết phosphomonoester [151]

HAP là một nhóm axit phosphatase lớn có khả năng thủy phân nhiều loại cơ chất khác nhau Vì vậy, không phải tất cả các enzyme thuộc nhóm HAP đều có thể phân giải muối phytate Cơ chất phytate thường tích điện âm Do đó, vị trí hoạt động của HAP ở cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn chủ yếu tích điện dương, ở pH axít giúp tăng cường hiệu quả thủy phân phytate Oh và CS (2004) chỉ

ra rằng nhóm Histidine Acid Phytase (HAPhy) trong HAP là có hiệu quả thủy phân phytate nhất [100] HAPhy được biết đến ở cả sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn,

HAPhy đặc trưng nhất ở sinh vật nhân sơ là phytase của E coli [59] Mô hình cấu

trúc phân tử 3-D của phân tử này đã được xác định [166] Ở sinh vật nhân chuẩn, HAPhy có trong một số chủng nấm mốc và ngô [97] Trong đó phytases của

A niger (hình 1.3a) và A fumigatus được nghiên cứu rộng rãi nhất

Yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính và duy trì cấu trúc của HAPhy là

sự glycosyl hóa Quá trình này, giúp ổn định và hỗ trợ cho quá trình cuộn gập của các enzyme được chính xác Tất cả phytase ngoại bào có nguồn gốc từ nấm được

biết đến nay đều có sự glycosyl hóa đặc trưng A niger NRRL 3135 PhyA có tới 10

vị trí N được glycosyl hóa [166] Một thành phần quan trọng cấu thành HAPhy là cầu disulfide đóng vai trò trong việc duy trì cấu trúc 3 chiều cho phép phytase hoạt

động xúc tác tốt [96] Có tất cả trên mười cysteine có mặt trong PhyA của A niger

và A fumigatus tham gia vào sự hình thành của các cầu disulfide Tám cysteine trong phytase E coli tham gia vào các liên kết disulfide Tuy nhiên, hoạt tính của

các phytase này được tăng cường đáng kể khi vị trí liên kết đặc hiệu với cơ chất bị đột biến mất một cầu disulfide [166] Điều đó gợi ý cho chúng ta rằng việc loại bỏ cầu disulfide cho phép tăng cường tính linh hoạt vị trí gắn cơ chất nhờ đó nâng cao hiệu quả xúc tác của enzyme

phân tử PhyA từ A niger, nó phân bố xung quanh vị trí hoạt động của enzyme Trong SSS của phytase từ A niger NRRL 3135 có hai axit amin tính axit và 4 nhóm

axit amin tính bazơ: E228, D262, K91, K94, K300 và K301 [85], [97] Ở pH 2,5

bốn axit amin tính bazơ; K91, K94, K300 và K301 trong SSS A niger đều tích điện

dương và sẽ thu hút các phân tử phytate Ngoài ra, điện tích của SSS vẫn liên kết với cơ chất phytate khi pH được nâng lên 5,0

Wyss và CS (1999a) đã chia HAPhys của vi sinh vật thành hai nhóm dựa trên cơ chất đặc trưng Nhóm đầu tiên có phổ cơ chất rộng nhưng có hoạt tính enzyme thấp với phytate, nhóm thứ hai có phổ cơ chất hẹp và có hoạt tính cao với phytate [163] Người ta phát hiện ra rằng có sự tương quan giữa vị trí axit amin 300 trong thành phần của SSS và mức độ hoạt động của enzyme đối với axit phytic [97] Theo Wyss và CS (1999a) enzyme có hoạt tính phân giải cao với cơ chất phytate khi tại vị trí 300 là một axit amin có tính axit hoặc tính bazơ Ngược lại, khi phytases có hoạt tính thấp khi ở vị trí đó có một axit amin trung tính [96]

Đối với phytase ngoại bào thứ hai của A niger là PhyB thì SSS có vai trò

quan trọng trong việc xác định pH tối ưu và tính đặc hiệu với cơ chất [166] PhyB

chỉ có nguồn gốc từ chủng A niger pH tối ưu của PhyB là 2,5 và khác với PhyA

chúng không có khả năng thủy phân phytate ở pH 5,0 PhyB và PhyA có chung vị trí hoạt động nhưng SSS của chúng khác nhau Kostrewa và CS (1999) chỉ ra rằng SSS của PhyB chỉ có hai axit amin, D75 và E272 Điều này lý giải tại sao PhyB có

pH hoạt động khác với PhyA Ở pH 5,0 các axit amin mang tính axit của SSS PhyB

sẽ tích điện âm, trong khi ở pH 2,5 nó không tích điện Cơ chất phytate mang điện tích âm như vậy chúng sẽ bị đẩy ở pH cao hơn 5,0 [85]

Nghiên cứu cho thấy SSS có một vai trò quan trọng với enzyme trong việc thủy phân cơ chất Các axit amin của SSS có chức năng trong việc xác định loại cơ chất nào có thể được gắn và tương tác vị trí hoạt động của enzyme Chính vì vậy việc nghiên cứu đột biến điểm làm thay đổi thành phần SSS của enzyme, sẽ giúp enzyme thay đổi pH hoạt động cũng như khả năng xúc tác với các cơ chất khác nhau

1.2.1.2 β-Propeller Phytase (BPP)

Cấu trúc phân tử của phytase chịu nhiệt (TS-phy) từ Bacillus

amyloliquefaciens đã được xác định [60] Enzyme này thủy phân phytate nhưng

không thuộc nhóm Histidine Acid Phosphatase (HAP) mà là đại diện cho một nhóm

enzyme hoàn toàn mới Phytase Bacillus (Hình 1.3b) được nghiên cứu và có tên gọi

là β-Propeller Phytase (BPP) [60]

BPP có nguồn gốc từ Bacillus và tương đồng với phytase của các loài vi

khuẩn Các enzyme này có đặc điểm giống nhau là cần ion Ca2+ cho khả năng xúc tác và bền nhiệt Nghiên cứu về động lực học cho thấy ở pH 7,0- 8,0 BPP vẫn có khả năng thủy phân cơ chất canxi-phytate [100] Hai phần chính là tham gia vào cơ chế xúc tác của BPP là "vùng ái lực" - gắn cơ chất và "vùng phân tách" - thủy phân nhóm phosphate Mô hình này giải thích BPP có ái lực mạnh với phytate, do phytate có 6 nhóm phosphate nên hai nhóm phosphate cạnh nhau sẽ chiếm giữ cả 2

vị trí ái lực và phân tách Các enzyme thuộc BPP sẽ ưu tiên thủy phân tất cả các nhóm phosphate thứ hai Kết quả enzyme lần lượt phân hủy các nhóm phosphate

với sản phẩm cuối cùng là myo-inositol triphosphate (IP3) Quá trình làm biến đổi phytate tới IP3 xảy ra rất nhanh, nhưng không thủy phân IP3 tiếp thành các myo-

inositol bởi vì IP3 thiếu nhóm phosphate lân cận

Dựa trên phạm vi của cơ chất, cần canxi để xúc tác và IP3 trở thành sản phẩm chủ yếu từ thủy phân phytate, Oh và CS (2004) có đề xuất xếp phytase kiềm thực vật vào nhóm BPP Đề xuất này có cơ sở khi phytases kiềm của một số thực

vật, như phấn hoa loa kèn (Lilium longiflorum) và một số cây họ đậu, hoạt tính

được tăng cường khi bổ sung canxi [166]

1.2.1.3 Cysteine Phosphatase (CP)

Từ lâu người ta đã phỏng đoán về sự có mặt của vi sinh vật sinh phytase trong dạ cỏ, nó giải thích nguyên nhân động vật nhai lại có thể sử dụng axit phytic trong khi động vật dạ dày đơn lại không thể Công trình nghiên cứu các vi khuẩn kỵ

khí trong dạ cỏ gần đây đã phát hiện phytase trong Selenomonas ruminantium

Phytase từ vi sinh vật này được tách chiết và nghiên cứu đặc điểm Đây là enzyme một tiểu phần, kích thước 46 kDa, pH tối ưu 4,0-5,5, nhiệt độ tối ưu 50-55C và bị

ức chế bởi cation sắt và một số kim loại khác Nghiên cứu về cấu trúc phát hiện enzyme này không phải là HAP hay BPP [33] Dựa trên cấu trúc và cơ chế xúc tác

người ta xếp nó là thành viên của siêu họ cysteine phosphatase (CP) Trình tự axit amin chứa vùng hoạt động HCXXGXXR (T/S) và tương đồng với protein tyrosine phosphatase (PTP) – enzyme thuộc nhóm CP Vị trí hoạt động của PTP tạo thành một vòng có chức năng như một túi liên kết với cơ chất (hình 1.3c) Độ sâu của túi này rất quan trọng, bởi vì nó xác định tính đặc hiệu cơ chất [42] Khi nghiên cứu về

phytase của S ruminantium (CP) cho thấy có một túi rộng hơn và sâu hơn PTP do

đó có thể chứa đầy đủ các nhóm inositol phosphoryl hóa của axit phytic [33] Điều này, cộng với sự có mặt của điện trường thuận lợi, cho phép nó giữ phytate và thủy phân cơ chất trong khi các thành viên khác của nhóm enzyme này thiếu khả năng trên Các mô hình hiện nay chỉ ra rằng quá trình liên kết ban đầu của phytate vào vị trí hoạt động của CP thuận lợi là vì phytate tích điện âm Sự thủy phân của các nhóm phosphate bắt đầu liên tục cho tới sản phẩm cuối cùng là inositol 2-monophosphate [33] Sắt và cation kim loại khác (Cu2+, Zn2+ và Hg2+) ức chế enzyme do nó liên kết với cơ chất, nhưng các cation có tác dụng tăng cường hoạt động của enzyme vẫn còn là vấn đề chưa giải thích được [166]

1.2.1.4 Purple Acid Phosphatase (PAP)

Tất cả enzyme của nhóm PAP đều chứa tập hợp của bảy vị trí axit amin có gắn kim loại Bảy vị trí axit amin gắn kim loại là: D, D, Y, N, H, H, H [131], 7 axit amin này tập hợp thành 5 kiểu liên kết sau: DXG; GDXXY; GNH (E, D); VXXH; GHXH.Đây là một nhóm phosphatase lớn được biết đến với các đại diện có cả ở thực vật, động vật có vú, nấm và vi khuẩn [101], [131] Giống như HAP và CP, không phải tất cả các PAP đều sử dụng phytate như là nguồn cơ chất Phần nhân trung tâm của PAP động vật gồm hai ion sắt, trong khi ở PAP thực vật ion sắt thứ hai được thay thế bằng ion kẽm hoặc mangan [101] PAP thực vật được chia thành hai nhóm nhỏ hơn: protein monomeric nhỏ (khoảng 35 kDa) và protein homodimeric lớn (khoảng 55 kDa) Người ta phát hiện trong nhóm này có một

trường hợp duy nhất PAP của nấm giống PAP của thực vật PAP của nấm A niger

(Apase 6) đã được phân lập và tách dòng [97], [148], enzyme này không phân cắt

cơ chất phytate Vị trí hoạt động của Apase 6 tương đồng với vị trí hoạt động của

PAPhy đậu tương Tuy nhiên, không giống như HAP, BPP và CP, chưa có nghiên cứu về cấu trúc không gian bằng tia X trên phytase PAP nên chưa có những thông tin về sự tương tác giữa vị trí hoạt động PAPhy với cơ chất phytate Việc phân nhóm phytase dựa trên cấu trúc được mô tả tóm tắt qua bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân loại về cấu trúc của enzyme thủy phân phytate

A niger

P lycii

E coli Zea mays L

β-Propeller

Phytase (BPP)

Hình dạng phân từ có 6 cánh β

Có vùng ái lực và vùng phân tách, vùng ái lực gắn với nhóm phosphate trong khi vùng phân tách thủy phân nhóm phosphate liền kề

HCXXGXXR(T/S)

Cơ chế phân tách nhóm phosphate giống protein tyrosine phosphatase

Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thường thấy nhất ở nấm mốc đặc biệt ở các

loài thuộc chi Aspergillus Shieh và Ware (1968) đã phân lập và tuyển chọn từ đất

hơn 2000 loài vi sinh vật để sản xuất phytase Hầu hết các chủng sản sinh phytase

nội bào, chỉ có 30 chủng sinh phytase ngoại bào và chúng đều là nấm sợi, trong đó

28 chủng thuộc chi Aspergillus, 1 chủng thuộc chi Penicillum và 1 chủng thuộc

Mucor Trong 28 chủng của chi Aspergillus sản sinh phytase, có 21 chủng thuộc về

loài A niger [135] Những nhóm nghiên cứu khác như Howson và Davis (1983), Volfova và CS (1994) đã khẳng định rằng A niger là loài có khả năng sản sinh

phytase ngoại bào tốt nhất Quan và CS (2004) đã phát hiện ra một phytase phân tử

lượng thấp (32,6 kDa) từ nấm Cladosporium sp FP-1 được phân lập từ không khí Chadha và CS (2004) đã công bố phytase từ chủng nấm Mucor pusillus chịu nhiệt

hoạt động khá tốt trong phạm vi pH rộng từ 3-7,8 [27]

Một số phytase từ một số nấm men khác đã được phát hiện như: Candida

krusei WZ-001 [115]; Pichia anomala [158], Saccharomyces cerevisiae [147] Một

số nấm men như Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castelii,

Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces fragilis và Schwanniomyces castelii,

cũng có khả năng sản sinh phytase [95], [98], [133]

Phytase cũng đã được tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn như: Aerobacter

aerogenes [56], Pseudomonas sp [73], Bacillus subtilis [113], [137], Klebsiella sp

[134], Escherichia coli [59], Enterobacter sp [172] và B amyloliquefaciens [80] Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào là những chủng thuộc về chi Bacillus và

Enterobacter Còn phytase từ E coli lại là enzyme nội bào Gần đây Cho và CS (2003)

đã phát hiện phytase từ Pseudomonas syringae Kim và CS (2003) phát hiện phytase mới từ Citrobacter braaki Phytase còn được tìm thấy trong Obesumbacterium proteus [177], vi khuẩn đất Klebsiella sp ASR1 [125], và trong một số loài thuộc chi

Bifidobacterium [66] Cheng (2005) mô tả cấu trúc phytase dạng β ở loài ưa lạnh Shewanella oneidensis MR-1 nó có 30% peptide tương đồng với trình tự phytase của Bacillus spp Đặc biệt với khả năng hoạt động ở nhiệt độ thấp nên phytase của loài này

có tiềm năng ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, do enzyme có thể hoạt động tốt trong môi trường nước khi nhiệt độ thường thấp hơn 30oC [29]

1.2.2.2 Phytase từ thực vật

Phytase được tìm thấy rộng rãi trong giới thực vật Phytase từ phấn hoa Lily hoạt động ở pH tối ưu 8,0 và nhiệt độ tối ưu 55C [75] Hegeman (2001) đã tìm ra gen mã hóa phytase từ mầm đậu tương Sự có mặt của phytase được tìm thấy trong ngũ cốc, cây họ đậu và hạt có dầu [157] hoặc rau quả như: lê tàu và lá hành tươi [109] Đặc biệt một số loại hạt ngũ cốc (lúa mì, lúa mỳ spenta, lúa mạch đen, lúa mạch, triticale (giống cây lai giữa lúa mạch và lúa mỳ)) có phytase với hoạt tính cao

có thể đạt trên 5000 IU/kg

1.2.2.3 Phytase từ động vật

Các nhà khoa học đã chứng minh có sự tồn tại phytase trong cơ thể động vật dạ dày đơn [22], [31], [34], [169] Tuy nhiên, phytase này trong ruột non động vật dạ dày đơn không có vai trò rõ ràng trong việc phân giải muối phytate

có trong thức ăn [161] Một enzyme giống như phytase cũng đã được tìm thấy

trong động vật nguyên sinh Paramecium [52] Trong loài cá Pecca lai sọc (hybrid

stripped bass) tồn tại phytase hoạt động ở pH tối ưu 3,5-4,5 [46]

1.2.3 Đặc điểm phytase

1.2.3.1 Đặc điểm phân tử

Hầu hết các loại phytase được biết đều là enzyme monomer, điển hình như

phytase từ nấm [45], [162], [163], từ E coli và K terrigena [58], [59] và từ B subtilis

[137] Tuy vậy, một số phytase từ thực vật và động vật được tạo thành từ nhiều tiểu đơn

vị Phytase được tổng hợp ở hạt ngô trong giai đoạn nảy mầm là enzyme dime bao gồm hai tiểu đơn vị kích cỡ 38 kDa [87] Trong khi đó, phytase tinh sạch từ ruột non của chuột thể hiện hai băng protein trên SDS-PAGE với khối lượng phân tử ước tính là 70 và

90 kDa [169] Tuy vậy, chỉ có tiểu đơn vị 90 kDa có hoạt tính thuỷ phân axit phytic, có thể hai băng protein là đại diện cho hai enzyme khác nhau (phosphatase kiềm và phytase)

Đặc biệt enzyme từ động vật nguyên sinh Paramecium có cấu trúc hexamer [52]

Phytase từ vi khuẩn thường nhỏ hơn phytase từ nấm Kết quả thực nghiệm cho thấy, phytase nấm có khối lượng khoảng 65 và 70 kDa và thường được glycosyl

hóa Phytase từ A niger NRRL 3135 được glycosyl hóa 27% Nó có đầu N liên kết

với chuỗi manose và galactose [148] Nghiên cứu của Wyss và CS (1999b) chỉ ra

rằng mức độ glycosyl hóa của phytase tái tổ hợp là không ổn định Ở Hansenula

polymorpha và S cerevisiae quá trình glycosyl hóa rất hay thay đổi Ngược lại, quá

trình này của enzyme trong A niger khá ổn định Điểm đáng chú ý là, sự glycosyl

hóa không chỉ khác nhau giữa các loài mà còn khác nhau giữa những lần lên men khác nhau của cùng một chủng [164]

Nhìn chung, mức độ glycosyl hóa có thể có vài tác động lên đặc tính của enzyme Đầu tiên, nó có thể ảnh hưởng đến đặc tính xúc tác hoặc tác động đến sự

ổn định của enzyme Thứ hai, nó có thể ảnh hưởng đến điểm đẳng điện của protein (pI) Thứ ba, nó có thể làm giảm mức độ biểu hiện của protein thông qua sự chi

phối năng lượng trao đổi [164]

1.2.3.2 Đặc tính nhiệt độ và pH

Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của các phytase dao động từ 45 đến 75C Wyss và CS (1999a) nghiên cứu sự ổn định nhiệt độ của ba phosphatase có nguồn

gốc từ nấm và đã kết luận rằng phytase từ A niger không bền với nhiệt độ hoặc

không có khả năng hồi lại hoạt tính sau khi đun nóng gây biến tính Ở 50 và 55C nó

mất khoảng 70-80% hoạt tính Phytase từ A fumigatus cũng không bền với nhiệt độ

nhưng có một đặc tính đáng quý là có khả năng hồi lại hoạt tính ban đầu sau 20 phút làm biến tính ở 90C So với phytase từ A niger và A fumigatus trên thì axit phosphatase từ A niger (hoạt động ở pH 2,5) có khả năng ổn định với nhiệt độ rất

cao; ở 80C enzyme chưa bị biến tính, chỉ mất hoàn toàn hoạt tính ở 90C [163]

Phytase từ A ficuum NTG-23 có nhiệt độ tối ưu 67°C; không bị mất hoạt tính khi xử

lý nhiệt 70°C trong 20 phút; hoạt động tối ưu ở pH 1,3 và chống chịu được sựu thủy

phân của pepsin và trypsin [173] Một phytase mới từ Erwinia carotovora var

carotovota có tiềm năng ứng dụng mới trong ngành thủy sản, do nó có nhiệt độ tối ưu

ở 40°C, ở 5°C enzyme vẫn thể hiện 24% hoạt tính [70]

Phytase từ chủng Bacillus sp DS11 có nhiệt độ tối ưu ở 70C, cao hơn nhiệt

độ tối ưu của những phytase thông thường Phytase này cũng rất bền với nhiệt: hoạt tính còn lại 100% sau 10 phút ủ tại 70C (vớisự có mặt của CaCl ) Khi không có

CaCl2 khả năng bền với nhiệt của phytase từ Bacillus sp DS11 giảm mạnh, hoạt tính

bị mất khi nhiệt độ trên 60C Ngược lại khi có mặt của CaCl2 nó có thể bền với nhiệt

độ lên tới 90C, sau 10 phút lượng enzyme mất đi khoảng 50% Nghiên cứu này chỉ

ra rằng ion Ca2+ có khả năng giúp phytase ổn định chống chịu với nhiệt độ cao [80]

Hiện nay một số phytase chịu nhiệt đã được tạo ra bằng công nghệ sinh học

phân tử Hai gen phytase chịu nhiệt từ A japonicus BCC18313 (TR86) và A niger BCC18081 (TR170) đã được tách dòng và chuyển thành công vào P pastoris thu

được 2 phytase tái tổ hợp r-PhyA86 và r-PhyA170 vẫn còn trên 50% hoạt tính sau

khi xử lý ở 100°C trong 10 phút [114] Phytase tái tổ hợp từ Bacillus sp MD2 biểu hiện trong E coli có thể chịu tới 100°C [144]

pH tối ưu của phytase dao động từ 2,2 đến 8,0 Hầu hết các phytase từ vi sinh vật, điển hình phytase từ nấm có pH tối ưu ở khoảng 4,5 - 5,6 Đặc biệt, khác

với hầu hết phytase từ nấm, phytase từ A fumigatus có dải pH tối thích từ 4,0 - 7,3 (còn giữ được ít nhất 80% hoạt tính) Trong khi đó phytase từ A niger NRRL 3135

và từ Citrobacter freundii mang đặc điểm khác biệt là có hai giá trị pH tối ưu Một vài phytase từ vi khuẩn, đặc biệt từ các loài Bacillus có pH tối ưu từ 6,5 - 7,5 pH

tối thích của phytase tách ra từ hạt thực vật dao động từ 4,0 - 7,0 còn hầu hết có pH tối thích ở 4,0 - 5,6 [78] Hai phytase kiềm từ thực vật có pH tối ưu vào khoảng 8,0

đã được nghiên cứu từ hạt ngũ cốc [132] và ở hạt phấn hoa huệ tây [65]

1.2.3.3 Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính phytase

Các ion kim loại có tác động khác nhau lên hoạt tính phytase Phytase của

Bacillus sp [117], B subtilis [78], [137], Bacillus sp DS11 [80], và Bacillus sp

KHU-10 phụ thuộc vào sự có mặt của ion Ca2+ Chất tẩy rửa như EDTA làm bất hoạt

phytase của B subtilis, với hàm lượng 2 mM của EDTA, Zn2+, Cd2+, Ba2+, Cu2+, Fe2+

và Al3+ gây ức chế hoạt tính phytase của B subtilis natto-77 [137] Tương tự phytase của Bacillus sp KHU-10 bị ức chế bởi các ion EDTA và Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr2+,Cu2+,

Hg2+ và Mn2+ Phytase của Enterobacter sp 4 bị ức chế yếu bởi Mg2+ và Mn2+ nhưng

bị ức chế mạnh bởi Zn2+, Cd2+, Al3+, EDTA ở nồng độ 1 mM; Trong khi phytase của

Zn2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, and Hg2+ và bị ức chế mạnh ở nồng độ 5 mM của Zn2+ Sự có mặt của Cu2+, Zn2+ hoặc EDTA (5 mM), gây ức chế nhẹ hoạt tính phytase của

Bacillus laevolacticus [118] Hoạt tính phytase của Emericella nidulans và A terreus

bị ức chế ở nồng độ 1 mM của Cu2+ Phytase từ A fumigatus bị ức chế ở nồng độ 1

mM của Cu2+, Zn2+, Ca2+, Co2+, Mn2+, Ni2+ và Fe3+ Trong khi đó sự có mặt của EDTA (1 mM và 10 mM) kích thích (~50%) hoạt tính enzyme [163] Tương tự hoạt tính phytase của lúa mỳ và lúa mạch bị ức chế bởi các ion: Cu2+, Zn2+, Ca2+, Co2+,

Mg2+, Mn2+, Ni2+, Fe2+, Fe3+, Na+ và Li+ ở nồng đồ 1 mM; Còn phytase từ đậu tương

bị ức chế bởi các ion Zn2+, Cu2+ và Hg2+ [118]

Ngược lại phytase từ hạt ngô được kích thích bởi Ca2+ và ức chế bởi Zn2+,

Fe2+ [87] Ion Mg2+ và Ca2+ không có tác động với phytase từ lúa mạch đen, trong khi các ion Hg2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ và Co2+ ức chế hoạt động của enzyme này

Tương tự như phytase từ Bacillus, enzyme từ hạt phấn của L longiforum và Typha

1.2.4 Ứng dụng của phytase

1.2.4.1 Trong chăn nuôi

Động vật nhai lại tiêu hóa được muối phytate là nhờ phytase do hệ vi sinh vật sống trong dạ cỏ tiết ra Phosphate vô cơ giải phóng trong dạ cỏ sẽ được khu hệ

vi sinh vật ở đó và bản thân động vật chủ sử dụng Tuy nhiên, động vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và cá không có khả năng tiêu hóa phytate vì chúng không có hoặc

có rất ít phytase trong đường tiêu hóa Do đó, để đáp ứng nhu cầu P cho cơ thể vật nuôi, người ta đã bổ sung P vô cơ vào thức ăn Điều này sẽ làm tăng chi phí thức ăn

và gây ra môi trường bị ô nhiễm phosphate, đặc biệt đối với ngành nuôi trồng thủy sản Do bởi phosphate dư thừa trong thức ăn sẽ nhanh chóng hòa tan vào môi trường nước, cộng với muối phytate không được tiêu hoá thải qua phân sẽ được vi sinh vật sống trong đất phân giải thành phosphate vô cơ Đây là điều kiện hết sức thuận lợi cho các loài tảo vì P là nhân tố rất phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật này Tảo phát triển quá mức sẽ gây hiện tượng "nước nở hoa", khi

đó tảo sử dụng hầu hết oxy hòa tan trong nước khiến các sinh vật thủy sinh (động

vật và thực vật) chết hàng loạt [3] Khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, phytase làm tăng khả năng đồng hóa phosphate ngay trong chính thành phần của thức ăn, đồng thời làm giảm lượng phosphate thải qua phân từ đó sẽ có những đóng góp tích cực cho môi trường sinh thái [6]

Trong hai mươi năm qua, đã có nhiều nghiên cứu nổi bật về ứng dụng phytase trong thức ăn chăn nuôi của lợn; gia cầm; cá (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Sử dụng phytase trong chăn nuôi [118]

A niger Lợn Ngô, đậu

tương Tăng sử dụng P sinh học 1995

tương Tăng sử dụng P sinh học 1995

Lúa mỳ, canola, đậu tương

Tăng trọng, tăng kahr năng tiêu hóa dinh dưỡng, tăng vật chất khô trong xương chân

2004

Tăng khả năng sử dụng protein

và P, giảm axit phytic thải qua phân

Cải thiện khả năng sử dụng kẽm, tăng khối lượng cơ thể và sức bền của xương

Kích thích ăn, tăng trọng cơ thể, tăng trao đổi năng lượng và tiêu hóa vật chất khô

2007

Natuphos Lợn Lúa mạch Cải thiện khả năng sử dụng và 2007

tiêu hóa P, giảm lượng P thải qua phân

Phyzyme XP

Lợn

Ngô, mỳ, đậu tương, canola

Cải thiện tiêu hóa P và giảm thải

tương

Giúp tăng năng lượng trao đổi, tăng trao đổi Nitơ, P và các axit amin

Phytase từ vi khuẩn có pH trung tính đang được phát triển để ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi Những nghiên cứu bước đầu chỉ ra rằng enzyme này có giá trị tương đương như phytase từ nấm sợi về hoạt tính sinh học Bổ sung kết hợp cả phytase từ vi khuẩn và nấm vào thức ăn chăn nuôi giúp tăng rõ rệt khả năng sử dụng

P và các loại muối khoáng, do tác động tương hỗ trong dạ dày và ruột non của động

vật Thí nghiệm đánh giá tác động của phytase từ Bacillus lên gà giai đoạn từ 1 – 28

ngày tuổi cho thấy, bổ sung phytase với hàm lượng 400 IU/kg thức ăn giúp tăng trọng cơ thể và hiệu suất sử dụng thức ăn của gà Gà ở lô đối chứng (không có phytase) có biểu hiện vận động yếu, ngược lại khi lô thí nghiệm có bổ sung thêm

phytase gà vận động tốt, khỏe mạnh bình thường Bổ sung phytase từ Bacillus vào

khẩu phần thiếu P giúp tăng vật chất khô của xương chân, điều đó chỉ ra rằng phytase giúp tăng khả năng khoáng hóa của xương, tăng khả năng sử dụng canxi và

P sinh học Hàm lượng P trong vật chất khô của xương bàn chân của gà bổ sung 400

IU phytase (13,33%) và gà bổ sung 200 IU phytase (13,01%) Trong khi đó tỷ lệ này là (12,63%) ở gà ăn khẩu phần thiếu P Mức độ tăng hàm lượng Ca cũng thấy

rõ cụ thể lô bổ sung 400 IU phytase là (32,60%), 200 IU (30,95%) và với lô không

bổ sung enzyme là (28.32%)

Việc bổ sung phytase với hàm lượng 200 IU/kg và 400 IU/kg giúp giảm hàm lượng phyate qua phân là 44,30% và 47,50%, khi so sánh với lô đối chứng Những nghiên cứu trên cho thấy bổ sung phytase sẽ giúp phân giải muối phytate và tăng khả năng sử dụng Pvc Phân tích mô cơ quan cho thấy không có sự khác biệt về gan,

thận, là lách của động vật ở các lô thí nghiệm Do đó phytase tái tổ hợp từ bacillus

được chứng minh là không có độc hại và được coi là chất phụ gia an toàn cho vật

nuôi [117] Đậu tương chuyển gen phytase có nguồn gốc từ A niger, khi bổ sung

cho gà giò đã giúp tăng khả năng sử dụng P, tăng trọng cơ thể, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn và tăng vật chất khô trong xương [118]

Ngoài ứng dụng cho nổi trội cho vật nuôi (bảng 1.2) phytase còn có vai trò rất quan trọng cho ngành thủy sản Thử nghiệm phytase trên loài cá da trơn Châu Phi

(Clarias gariepinus) giúp tăng hiệu quả khả năng sử dụng P [152] Cá hồi đại tây dương (Salmo salar) khi cho ăn phytase đã kích thích sinh trưởng và giảm tác động

kháng dinh dưỡng của axit phytic lên khả năng tiêu hóa protein [126] Bổ sung

phytase vào thức ăn có nguồn gốc thực vật cho cá trắm con (Labeo rohita) đã kích

thích sử dụng các loại khoáng và làm tăng tỷ lệ khoáng chất trong xương [17] Tác động tích cực của phytase còn được tăng thêm 3% khi bổ sung axit citric vào thức

ăn Cá con Basa (Pangasius pangasius) khi nuôi với khẩu phần chứa 35% protein

thô có bổ sung phytase đã cải thiện được tăng trọng, tăng vật chất khô và khả năng

sử dụng protein [41] Những nghiên cứu khác về việc bổ sung phytase trong ngành nuôi trồng thủy sản đã chỉ ra rằng phytase giúp tăng khả năng sử dụng P sinh học, nitơ sinh học và các muối khoáng đồng thời giảm lượng P thải ra môi trường nước [18], [99], [156]

Người ta dự tính, nếu phytase được sử dụng cho chăn nuôi động vật dạ dày đơn ở Mỹ thì enzyme này sẽ giải phóng lượng phosphate có trong thức ăn với giá trị tương đương 168 triệu USD và tránh được 8,23 vạn tấn phosphate dư thừa thải ra môi trường hàng năm Việc ứng dụng phytase trong chăn nuôi đã được 22 quốc gia

thực hiện Tổ chức FDA (The Food and Drug Administration) đã coi phytase là enzyme an toàn GRAS (Generally Regarded As Safe) [162] Ở Hà Lan, phytase từ

A niger đã được thử nghiệm thành công vào thức ăn chăn nuôi và làm giảm từ

30 - 40% lượng phosphate thải qua phân ra môi trường [77]

1.2.4.2 Trong công nghệ thực phẩm

Khẩu phần ăn hàng ngày của người chứa nhiều thành phần có nguồn gốc từ các cây ngũ cốc và cây họ đậu Những người ăn chay thường gặp phải vấn đề mất cân bằng dinh dưỡng do ăn quá nhiều ngũ cốc Những cư dân ở các quốc gia kém phát triển thường ăn bánh mỳ chay (loại bánh mỳ không được bổ sung nấm men) và trẻ em thường hay sử dụng nhiều sản phẩm từ đậu nành Những thực phẩm này đều

có chứa một lượng lớn muối phytate [139] Muối phytate không những không thể phân hủy được trong đường tiêu hóa của người mà còn gây cản trở sự hấp thụ các nguyên tố khoáng như: kẽm, caxi, magiê và sắt Nó cũng làm giảm khả năng tiêu hóa protein trong khẩu phần cũng như ức chế các enzyme tiêu hóa khác

Anno và CS (1985) đã loại bỏ phytate trong sữa đậu nành bằng cách sử

dụng phytase từ lúa mỳ để thủy phân [15] Bổ sung phytase từ nấm mốc A niger

vào bột mỳ có chứa cám lúa mỳ đã làm tăng khả năng hấp thụ sắt ở người [129] Như vậy, vai trò quan trọng của phytase với thực phẩm dành cho con người đã khá rõ ràng Phytase không những làm tăng khả năng tiêu hóa protein mà còn tăng hấp thụ khoáng Có lẽ trong tương lai không xa enzyme này sẽ được dùng phổ biến như một chất phụ gia cho thực phẩm

1.2.4.3 Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphate

Các dẫn xuất myo-inositol phosphate được ứng dụng rộng rãi trong y học

Inositol phosphate và phospholipid có vai trò nòng cốt trong việc truyền tín hiệu qua màng và huy động nguồn canxi dự trữ trong tế bào [21] Một số inositol triphosphate được sử dụng để phòng tránh viêm khớp, bệnh hen, hoặc làm thuốc giảm đau [141] Este của inositol triphosphate được sử dụng làm chất ức chế chống lại sự lây nhiễm các bệnh do nhóm retrovirus gây ra bao gồm cả HIV [142]

Những ứng dụng dược học của một số myo-inositol phosphate đặc hiệu ngày càng tăng lên Tuy nhiên, việc tổng hợp bằng con đường hoá học các myo-inositol

phosphate này gặp rất nhiều khó khăn, vì qui trình được thực hiện ở điều kiện nhiệt

độ và áp suất rất cao [21] Từ khi phytase được phát hiện có hoạt tính thủy phân các

myo-inositol hexaphosphate thành các dẫn xuất khác nhau thì việc sản xuất myo-inositol tự do từ myo-inositol phosphate, được thực hiện bằng con đường sinh

học để thay thế phương pháp tổng hợp hóa học Tổng hợp bằng con đường sinh học mang tính đặc hiệu, sản phẩm có độ tinh khiết cao, phản ứng diễn ra trong điều kiện

"ôn hoà" hơn Việc sản xuất D-myo-inositol 1,2,6-trisphosphate, D-myo-inositol 1,2,5-trisphosphate, L-myo-inositol 1,3,4-trisphosphate và myo-inositol 1,2,3- trisphosphate bằng con đường thủy phân axit phytic nhờ phytase đã được nghiên

cứu và thực hiện [57], [148]

1.2.4.4 Trong công nghiệp giấy

Việc loại bỏ axit phytic rất quan trọng trong ngành công nghiệp giấy Trước khi ứng dụng enzyme phytase, việc loại bỏ thành phần axit phytic trong thực vật được tiến hành bằng con đường hóa học Phương pháp này có mặt trái tạo ra những chất có khả năng gây ung thư và những chất thải có độ độc cao Trong khi đó ứng dụng công nghệ enzyme để loại bỏ axit phytic trong nguyên liệu làm giấy sẽ giúp cải thiện môi trường cũng như góp phần vào sự phát triển của công nghệ sạch [90] Những phytase bền ở nhiệt độ cao thường được sử dụng để phân giải axit phytic trong quá trình chế biến giấy

1.2.4.5 Trong cải tạo đất

Ở một số vùng, axit phytic và dẫn xuất của nó chiếm tới 50% tổng lượng P hữu cơ trong đất [38] Nghiên cứu của Findenegg và Nelemans (1993) cho thấy khả năng sinh trưởng của ngô tỷ lệ thuận với mức độ phân giải axit phytic khi bổ sung phytase vào đất trồng [50] Nghiên cứu này cũng mở ra một hướng trong tương lai

có thể chuyển và biểu hiện gen phytase vào rễ cây thực vật nhằm làm tăng giá trị P

dễ tan trong đất

1.3 Nghiên cứu chuyển gen mã hóa phytase

Trong những năm qua, tiềm năng ứng dụng to lớn của phytase trong nhiều lĩnh vực đã thu hút được sự quan tâm của các công ty công nghệ sinh học và các nhà khoa học Doanh thu từ phytase năm 2002 đạt 135 triệu USD, con số này đã tăng gấp đôi chỉ trong vòng hai năm Năm 2006, doanh thu từ phytase đạt 500 triệu USD và ước tính trong mỗi năm tới sẽ tăng thêm 30% [26] Để thu được phytase phù hợp với mục đích ứng dụng, các nghiên cứu một mặt tập trung tuyển chọn nguồn sinh phytase mạnh, tinh sạch và nghiên cứu các đặc tính của phytase; mặt khác ứng dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp để chuyển gen mã hoá phytase vào sinh vật biểu hiện phù hợp, đã có rất nhiều nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện gen phytase thành công trong các vật chủ biểu hiện khác nhau

1.3.1 Gen mã hóa phytase

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã giải mã trình tự gen phytase

của một số chủng nấm Gen mã hóa phytase từ A niger var awamori có tới hơn 97% tương đồng với gen phytase từ A niger NRRL 3135 (phyA) Trình tự phyA này

có độ tương đồng 65% với gen phytase của A fumigatus, 62% của A terrus, 62% của E nidulans, 61% của T thermophilus và 46% của M thermophila Protein PhyB của A niger NRRL 3135 có 99% trình tự axit amin tương đồng với protein tương ứng của A niger var awamori Điều thú vị là hai loại phytase của A niger

NRRL 3135 (PhyA và PhyB) lại chỉ có 25% độ tương đồng về axit amin [105]

Gen phytase của E coli và của chuột không có nhiều trình tự tương đồng với gen của A niger Tuy nhiên, chúng lại có cùng trình tự bảo thủ mã hóa cho trung

tâm hoạt động của enzyme [149] Thêm vào đó, chúng cùng mã hóa histidine và axit aspartic ở đầu C, những axit amin này tham gia trực tiếp vào phản ứng enzyme Những phytase này được xếp vào nhóm histidine acid phosphatase

Hai đoạn gen mã hóa phytase của ngô là PHYTI và PHYTII có trình tự gần

giống nhau nhưng lại rất khác biệt với các gen phytase khác Tuy nhiên, khi phân

tích vùng gen mã hóa 33 axit amin của PHYTI và PHYTII, Maugenest và CS (1997)