iii Xác ñịnh ñược sự khác biệt so với giống gốc L18 về khả năng chịu hạn của ba dòng lạc RM48, RM47, R46 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước ñược xử lý bởi tia gamma 2krad kết hợp với t
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
Trang 2MỞ ĐẦU
1 Lý do chọn ñề tài
Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây thực phẩm, cây công nghiệp lấy dầu, ñược
nhiều quốc gia trên thế giới có nhu cầu ngày càng mở rộng phát triển sản xuất Cây lạc thuộc nhóm cây ñậu ñỗ có khả năng chịu hạn kém So với nhiều cây trồng khác, cây lạc có nhu cầu ñặc biệt về nước bởi rễ lạc không có lông hút, quả lạc hình thành dưới ñất Kết quả thống kê cho thấy, ở nước ta sản suất lạc chiếm khoảng 40% tổng diện tích ñất gieo trồng các cây công nghiệp ngắn ngày, trong ñó
có 2/3 diện tích trồng lạc phụ thuộc vào nước trời Đối với nhiều ñịa phương, cây lạc là cây trồng chính, tuy nhiên việc ñầu tư cho sự phát triển ngành sản xuất lạc ñược ñánh giá là chưa tương xứng với tiềm năng vốn có của nó
Có nhiều phương pháp cải tạo giống cây trồng, trong ñó nuôi cấy mô tế bào thực vật là một kỹ thuật hiệu quả, cho phép ứng dụng và cải tiến nhiều ñặc tính của cây trồng Trong quá trình nuôi cấy do ảnh hưởng của môi trường, các tế bào
có thể bị biến ñổi vật chất di truyền Nếu kết hợp với các tác nhân gây ñột biến thì tần số phát sinh ñột biến sẽ ñược tăng lên ñáng kể Điều này rất có ý nghĩa trong việc tạo ra nguồn vật liệu cho quá trình chọn giống Hiệu quả việc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật ñể nâng cao tính chống chịu với các ñiều kiện bất lợi của ngoại cảnh liên tục ñược khẳng ñịnh Ở Việt Nam, sự ra ñời của 2 giống lúa DR1
và DR2 có khả năng chịu hạn, chịu lạnh tốt là minh chứng ñầu tiên cho những khả năng ñó Tiếp sau là công trình nghiên cứu cải thiện khả năng chịu hạn, chịu muối
ở cây mía của Yadav và ñtg (2006), tăng khả năng chịu hạn cây lúa mỳ của Abdelsamad và ñtg (2007) …
Khả năng chịu hạn của thực vật là tính trạng do nhiều gen quy ñịnh, do vậy việc tìm kiếm và phân tích gen liên quan ñến ñặc tính chịu hạn ñược nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Một số gen liên quan ñến tính chịu hạn của cây
trồng ñã ñược phân lập và công bố như: gen LEA ở cây ñậu tương và ñậu xanh, gen P5CS ở cây ñậu tương, gen cystatin ở cây ñậu xanh, gen DREB ở cây Arabidopsis Gen cystatin (CYS) của thực vật ñược công bố ñầu tiên trên cây lúa bởi Abe và ñtg (1987) Đến nay, gen CYS ñược phân lập ở nhiều loài thực vật bậc cao, cả ở cây một lá mầm và hai lá mầm (CYS ở ñậu xanh, gen CYS ở khoai tây, gen CYS ở ngô) Các nghiên cứu về gen cystatin ñã ñược bàn luận nhiều về mối
liên quan của nó với khả năng chống chịu hạn, lạnh, mặn
Trang 3Từ những lý do trên và xuất phát từ nhu cầu thực tiễn của việc chọn tạo giống lạc theo hướng nâng cao khả năng chịu hạn, chúng tôi ñã tiến hành ñề tài
của luận án: “Tạo dòng chịu hạn và phân lập gen cystatin liên quan ñến tính chịu hạn ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)”
2 Mục tiêu nghiên cứu
- Tạo ñược dòng lạc có khả năng chịu hạn cao hơn giống gốc bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
− Xác ñịnh ñược sự khác biệt trong trình tự của gen cystatin giữa dòng lạc chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo và các giống lạc có khả năng chịu hạn khác nhau
3 Nội dung nghiên cứu
− Sàng lọc dòng mô sẹo chịu mất nước dưới tác ñộng của thổi khô và tác ñộng của chiếu xạ tia gamma kết hợp với thổi khô
− Phân tích sự biến ñộng một số tính trạng số lượng, chất lượng hạt và khả năng chịu hạn của các dòng chọn lọc
− So sánh và xác ñịnh sự sai khác trong hệ gen của các dòng chọn lọc bằng kỹ thuật RAPD
− Khuếch ñại, tách dòng và xác ñịnh trình tự gen cystatin của dòng lạc chọn lọc
và giống gốc
4 Những ñóng góp mới của luận án
i) Luận án xây dựng ñược quy trình chọn dòng lạc chịu hạn theo cách sử dụng kết hợp các phương pháp nuôi cấy mô tế bào, gây ñột biến bằng tia gamma
và sử dụng chỉ thị phân tử RAPD; tách dòng và so sánh sự khác biệt trình tự gen cystatin liên quan ñến tính chịu hạn Quy trình này có thể rút ngắn thời gian cần thiết và nâng cao hiệu quả cho công tác chọn giống lạc
ii) Xử lý mô sẹo bởi tia gamma ñã làm giảm chiều cao và tỷ lệ tái sinh cây, biến ñổi màu sắc và hình dạng lá Phát hiện ñược 5 chỉ thị RAPD ñặc trưng cho hai dòng lạc chọn lọc RM47 và RM48: RM48/OPA07-750bp; RM48/OPA08-500bp; RM48/OPB05-900bp; RM48/UPC348-200bp; RM47/OPH08-250bp Phát hiện gen cystatin của cây lạc thuộc nhóm I của phytocystatin, có có sự tương ñồng cao nhất với cystatin của ñậu xanh (81,3%), thấp nhất với cystatin của quả kiwi (42,9%) Gen có chứa 1 intron và 2 exon mã hóa cho protein có 98 amino acid Cystatin của dòng RM48 có nguồn gốc từ mô sẹo ñược xử lý bởi tia gamma kết hợp với thổi khô
Trang 4ñã có 7 vị trí amino acid sai khác so với giống gốc L18 Sự thay thế amino acid của dòng RM48 bởi amino acid của giống gốc các ở vị trí 29 (Glu →Asp), 30 (His→Thr), 31 (Asn→Thr), 32 (Lys →Arg), 33 (Lys →Asn), 34 (Glu →Arg), 36 (Gly →Ala)
iii) Xác ñịnh ñược sự khác biệt so với giống gốc L18 về khả năng chịu hạn của ba dòng lạc RM48, RM47, R46 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước ñược
xử lý bởi tia gamma (2krad) kết hợp với thổi khô liên tục 9 giờ trong hệ thống
nuôi cấy in vitro
5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1 Ý nghĩa khoa học
i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về ứng dụng công nghệ tế bào thực vật ñể cải tiến khả năng chịu hạn của cây lạc Kỹ thuật chọn dòng tế bào chịu mất nước và xử lý mô sẹo ñể tăng tần số phát sinh ñột biến Cách tiếp cận và phương pháp ñánh giá sự khác biệt của các dòng lạc chọn lọc so với giống gốc trên phương diện hình thái, biểu hiện tính trạng cấu thành năng suất, khả năng chịu hạn, ñặc ñiểm hóa sinh hạt và sự sai khác trong hệ gen
ii) Cung cấp những thông tin về cystatin và gen cystatin ở cây lạc Xử lý mô sẹo bởi chiếu xạ kết hợp với thổi khô gây mất nước là tác nhân làm xuất hiện ñột biến gen cystatin ñược minh chứng bằng sự sai khác trong trình tự gen của dòng RM48 (có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ kết hợp với thổi khô) so với các dòng R46 (có nguồn gốc từ mô sẹo chịu thổi khô) và giống gốc L18
5.2 Ý nghĩa thực tiễn
Những kết quả ñánh giá toàn diện khả năng chịu hạn của cây lạc ở mức ñộ
mô sẹo, hạt nảy mầm và cây non làm căn cứ ñể ñánh giá và ứng dụng biện pháp cải thiện ñược khả năng chịu hạn của cây lạc Kết quả chọn tạo 3 dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu xử lý bởi chiếu xạ và thổi khô ưu việt về khả năng chịu hạn và một số ñặc ñiểm nông sinh học, hoá sinh hạt có thể bồi dưỡng thành giống mới hoặc làm vật liệu cho lai giống
6 Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 128 trang (kể cả tài liệu tham khảo), ñược chia thành các phần: Phần Mở ñầu gồm có 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 39 trang; Chương 2:
Trang 5Vật liệu và Phương pháp, 14 trang; Chương 3: Kết quả và thảo luận, 54 trang; Phần Kết luận và ñề nghị: 2 trang; Các công trình ñã công bố liên quan ñến luận án: 1 trang Tài liệu tham khảo: 15 trang với 145 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh Luận án có 22 bảng số liệu, 20 hình
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án ñã tham khảo và tổng kết 34 tài liệu trong nước và 98 tài liệu nước ngoài với các nội dung liên quan, bao gồm: (1) Cây lạc và ñặc tính chịu hạn của cây lạc; (2) Nghiên cứu nâng cao khả năng chịu hạn của cây trồng bằng công nghệ
tế bào thực vật; (3) Phân tích, ñánh giá các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ nuôi cấy mô sẹo (4) Gen liên quan ñến tính chịu hạn ở cây lạc; (5) Cystatin và vai trò của cystatin ở thực vật
Với các dẫn liệu thu thập ñược, kết quả phân tích ñã khẳng ñịnh, cây lạc có giá trị và vị trí quan trọng trong nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới Xu thế biến ñổi khí hậu ñã làm thay ñổi các yếu tố của ñiều kiện môi trường, vì vậy ngày càng có nhiều nghiên cứu ñánh giá, chọn tạo giống lạc theo hướng nâng cao tính chống chịu ñược thực hiện Cũng giống như những cây trồng khác, các phương pháp sử dụng trong chọn tạo giống lạc bao gồm lai giống, tạo giống ñột biến, chọn lọc từ quần thể và sử dụng công nghệ sinh học hiện ñại Ứng dụng kỹ thuật hiện ñại của công nghệ sinh học ñể nâng cao tính chống chịu của cây trồng ñược tiến hành theo hai hướng, ñó là chọn dòng biến dị soma và chuyển gen Thành công của kỹ thuật chuyển gen ñã ñược công bố trên nhiều loại cây trồng và nhiều ñặc tính liên quan ñến khả năng chịu hạn của thực vật ñã ñược cải thiện
Kỹ thuật chọn dòng tế bào ở thực vật bậc cao ứng dụng dựa trên cơ sở hiểu biết về tính toàn năng của tế bào; sự không ñồng nhất của mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy; ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy trong quá trình hình thành một cơ thể hoàn chỉnh làm cho quần thể tế bào nuôi cấy có thể coi là quần thể tế bào thực vật, do ñó sàng lọc các cá thể sẽ nhanh hơn và hiệu quả hơn các phương pháp chọn giống thông thường áp dụng trên cây nguyên vẹn Chọn dòng theo hướng tăng cường khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi của ngoại cảnh ñã khá thành công trên một số ñối tượng như lúa nước, lúa cạn, lúa mỳ, thuốc lá Đây chính là
Trang 6những gợi ý ñể chúng tôi lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy in vitro ñể nâng cao khả năng
chống chịu hạn ở cây lạc
Tính chịu hạn của thực vật là tính trạng do nhiều gen quyết ñịnh Xu hướng tìm kiếm gen chịu hạn là mối quan tâm nghiên cứu của nhiều tác giả Các gen liên quan ñến khả năng chịu hạn của cây lạc ñược công bố trong những năm gần ñây như: gen
LEA liên quan ñến sự mất nước của tế bào Nghiên cứu của Su và ñtg (2010) trên
giống lạc Luhua 14 phát hiện có ít nhất 8 loại gen LEA Gen AhNCED mã hóa tổng
hợp 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase cũng ñược xác nhận có liên quan với khả
năng chống chịu của thực vật, trên cây lạc AhNCED ñược phân lập bởi Wan và ñtg (2005) có kích thước 2486bp, mã hóa một protein gồm 610 amino acid Gen PLD mã
hóa phospholipase D cũng ñược khẳng ñịnh có liên quan ñến hạn ñã ñược phát hiện ở
lạc gồm hai loại là AhPLD1 và AhPLD2 nhờ nhóm nghiên cứu của Nakazwa
(2006) Cystatin ở thực vật gọi là phytocystatin, gồm có hai nhóm, khác biệt nhau về kích thước, khối lượng và những vùng gắn với cysteine proteinase Từ năm 1987, gen cystatin ñược phân lập trên cây lúa, ñến nay gen cystatin ñược phân lập ở nhiều loài thực vật, tuy nhiên trên cây lạc còn ít ñược biết ñến Nghiên cứu chức năng của cystatin, nhiều tác giả bàn luận mối liên quan của cystatin với tính chống chịu của thực vật Sự phức tạp trong cấu trúc của gen cystatin, khả năng biểu hiện của gen trong các giai ñoạn sinh trưởng khác nhau của cây trồng và trong mối liên quan với tính chống chịu các yếu tố bất lợi của ngoại cảnh Một số công bố về biểu hiện của gen cystatin liên quan ñến khả năng chịu hạn ñã ñược minh chứng trên cây ñậu cove, cây rau giền, cây cải biển, cây lúa mỳ ñông ñó là những căn cứ ñể chúng tôi tiếp tục tìm và phân tích gen cystatin trên cây lạc
Trang 72.2 Hoá chất và thiết bị
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và chuyên dụng có nguồn gốc từ các
hãng có uy tín như: các chất kích sinh trưởng của hãng Sigma; Taq-polymerase,
EDTA, SDS, agarose của hãng Invitrogen
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro
Để tạo ra các dòng lạc bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, quá trình nuôi cấy
gồm các bước: Tạo mô sẹo trong môi trường tối hoàn toàn (10 ngày); tiến hành gây mất nước bằng luồng khí vô trùng của box cấy và chiếu xạ sau ñó kết hợp gây mất nước bằng xử lý thổi khô; tái sinh cây; tạo cây hoàn chỉnh theo mô tả của Nguyễn Thị Tâm và ñtg (2006)
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ñồng ruộng
Đánh dấu riêng các dòng cây tái sinh từ mô sẹo Thực hiện chế ñộ trồng và chăm sóc các dòng và giống như nhau theo chỉ dẫn của Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn Các chỉ tiêu nông học và năng suất ñược xác ñịnh vào thời kỳ chín của cây
2.3.3 Phương pháp sinh lý, hoá sinh
Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry; ñịnh lượng lipid theo phương pháp Soxhlet; Xác ñịnh hoạt ñộ α-amylase theo phương pháp Heinkel; Định lượng ñường bằng phương pháp vi phân tích
Đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo bằng phương pháp nhuộm màu tế bào với TTC của Towill và ñtg (1975)
Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai ñoạn hạt nảy mầm bằng phương pháp gây hạn với sorbitol 7%; xác ñịnh khả năng chịu hạn thông qua xác ñịnh hoạt ñộ α-amylase, hàm lượng ñường
Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai ñoạn cây non bằng phương pháp gây hạn nhân tạo theo Lê Trần Bình và ñtg (1998)
2.3.3 Phương pháp sinh học phân tử
Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp Gawell và ñtg (1991)
Phân tích ña hình DNA bằng kỹ thuật RAPD theo William và ñtg (1990)
Trang 8Phân lập gen bằng kỹ thuật PCR Tách dòng gen theo phương pháp của Sambrook và ñtg (2001)
Trình tự gen ñược xác ñịnh trên máy tự ñộng tại Viện Công nghệ Sinh học
2.3.4 Phương pháp phân tích số liệu
Phân tích các trị số thống kê bằng phần mềm Excel theo Chu Hoàng Mậu (2008); Phân tích số liệu RAPD bằng phần mềm NTSYSpc version 2.0; Kết quả phân tích gen bằng phần mềm BioEdit và DNAstar
2.4 Địa ñiểm nghiên cứu
Thí nghiệm ñược tiến hành tại trường Đại học Sư phạm; Trường Đại học Khoa học; Viện Khoa học Sự Sống- thuộc Đại học Thái Nguyên
Chiếu xạ tia gamma tại Trung tâm chiếu xạ Quốc gia, Từ Liêm- Hà Nội Trình tự DNA ñược xác ñịnh tại Viện Công nghệ Sinh học
Thí nghiệm ñồng ruộng ñặt tại Tổ Rừng Vầu, Phường Quang Vinh- Thành phố Thái Nguyên
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ TẠO DÒNG CHỊU HẠN BẰNG KỸ THUẬT XỬ LÝ MÔ
SẸO TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY IN VITRO
3.1.1 Sàng lọc dòng m ô sẹo chịu tác ñộng của thổi khô
3.1.1.1 Khả năng tạo mô sẹo và ñộ sinh trưởng của mô sẹo 10 giống lạc nghiên cứu
Với mục ñích ñánh giá khả năng tạo mô sẹo của các giống lạc trong hệ thống
nuôi cấy in vitro làm cơ sở cho các nghiên cứu tạo dòng lạc chịu hạn bằng công nghệ
tế bào thực vật, chúng tôi tiến hành thăm dò khả năng tạo mô sẹo từ các tế bào phôi mầm của hạt và tốc ñộ sinh trưởng của mô sẹo ở 10 giống lạc nghiên cứu Kết quả nghiên cứu cho thấy: Tỷ lệ tạo mô sẹo từ phôi mầm của 10 giống lạc dao ñộng từ 82,71% (L18) ñến 98,55% (V79) Các giống lạc có tỷ lệ tạo mô sẹo ñạt trên 97%
là các giống MD7, MD9, V79 Giống có tỷ lệ tạo mô sẹo thấp hơn 90% gồm các giống L18, L23, Đỏ BG Trong ñó, tỷ lệ tạo mô sẹo thấp nhất là giống L18 (82,71%) Khối lượng mô sẹo của các giống lạc ñược tạo thành dao ñộng từ
Trang 9115,00mg (L18) ñến 198,00mg (V79) Các giống L05, L23, MD7, MD9, SD30, V79 có khối lượng mô sẹo ñạt trên 180mg Bốn giống L16, L18, L24 và Đỏ BG có khối lượng mô sẹo tạo thành nhỏ hơn 160mg Kết quả thu ñược cho thấy, khả năng tạo mô sẹo và sự sinh trưởng của mô sẹo 10 giống lạc ñáp ứng cho các nghiên cứu tiếp theo trong chọn dòng tế bào
3.1.1.2 Khả năng chịu mất nước của mô sẹo các giống lạc nghiên cứu
Khả năng chịu mất nước của mô sẹo ñược xác ñịnh thông qua ñộ mất nước, qua kết quả ñánh giá nhanh sức sống của mô sẹo bằng phương pháp nhuộm TTC
và xác ñịnh tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau xử lý bởi thổi khô Kết quả xác ñịnh tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau xử lý bằng thổi khô thể hiện sức chịu ñựng của tế bào và ñây là cơ sở ñể sàng lọc dòng tế bào Các mô sẹo chịu mất nước thu ñược là nguồn nguyên liệu ñể thực hiện tái sinh cây phục vụ chọn dòng lạc chịu hạn
Kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh cây của mô sẹo chịu mất nước cho thấy, tất
cả các giống lạc tham gia thí nghiệm ñều có khả năng tái sinh cây từ các mô sẹo sống sót Các mô sống sót cho tỷ lệ tái sinh cây từ 83,33% ñến 100,00% Căn cứ vào kết quả nghiên cứu, chúng tôi chọn thời ñiểm mô mất trên 84% nước so với khối lượng tươi ban ñầu và tỷ lệ mô sống sót trong khoảng từ 10% ñến 20% là ngưỡng sàng lọc dòng
Xử lý mô sẹo lạc bằng kỹ thuật thổi khô mô sẹo, chúng tôi xác ñịnh giống lạc L18 có khả năng chịu mất nước kém nhất và lựa chọn mức thổi khô 9 giờ làm ngưỡng sàng lọc Kết quả ñánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo, kết hợp với ñánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống lạc ở giai ñoạn hạt nảy mầm khi bị hạn sinh
lý và giai ñoạn cây non khi bị hạn nhân tạo ñã cho thấy, trong 10 giống lạc nghiên cứu, giống L18 có khả năng chịu mất nước kém nhất, có hoạt ñộ α- amylase và hàm lượng ñường ở nhóm thấp nhất trong các ngày hạt nảy mầm khi bị hạn, có chỉ số chịu hạn thấp nhất Kết quả này phù hợp với công bố do Trung tâm Đậu ñỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm Việt Nam cung cấp
3.1.2 Ảnh hưởng của tia gamma kết hợp với thổi khô ñến tỷ lệ sống sót và tái sinh cây của giống lạc L18
Giống lạc L18 ñược xác ñịnh là giống có khả năng chịu hạn, chịu mất nước mất nước kém nhất trong số 10 giống lạc nghiên cứu Bên cạnh ñó, giống L18 có năng suất cao.Vì vậy, với mục tiêu cải thiện khả năng chịu hạn của giống lạc năng
Trang 10suất cao này, chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh hưởng kết hợp của chiếu xạ tia gamma với sàng lọc dòng chịu mất nước bằng kỹ thuật thổi khô ñối với mô sẹo giống lạc L18
Kết quả thăm dò ảnh hưởng của tia gamma ñược thực hiện trên 5 liều lượng chiếu xạ ở mức: 0,5krad; 1,0krad; 2,0krad; 3,0krad; 4,0krad kết hợp với thổi khô
mô sẹo trong 9 giờ Kết quả xác ñịnh tỷ lệ mô sống sót tái sinh thành cây cho thấy, khả năng tái sinh cây của mô sẹo chịu ảnh hưởng kết hợp của chiếu xạ với thổi khô dao ñộng từ 21,30% ñến 88,87% So với khả năng tái sinh cây của mô sống sót chỉ chịu thổi khô, thì việc xử lý mô sẹo bằng chiếu xạ kết hợp với thổi khô ñã làm giảm tỷ lệ tái sinh cây Sự khác biệt quan trọng của cây tái sinh chịu tác ñộng của chiếu xạ kết hợp với thổi khô biểu hiện rõ nét ở ñặc ñiểm hình thái, ñặc biệt về màu sắc và hình dạng lá
Với liều chiếu xạ thấp (0,5krad; 1krad; 2krad), lá cây vẫn có màu xanh như những cây ñối chứng Nhưng với liều chiếu xạ cao như 3krad và 4krad thì màu xanh của lá xuất hiện trong khoảng 1-2 tuần ñầu sau ñó lá bắt ñầu chuyển màu vàng úa Hình thái lá nhỏ và xuất hiện hiện tượng xoăn lá Tốc ñộ sinh trưởng của cây tỷ lệ nghịch với cường ñộ của liều chiếu xạ Ở liều chiếu xạ cao cây có hiện tượng lụi dần, thân cằn cỗi Chiều cao cây tái sinh thấp hơn rất nhiều so với cây ñối chứng
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của chiếu xạ kết hợp với thổi khô 9 giờ ñến tỷ lệ sống sót và
tái sinh cây của mô sẹo ở giống lạc L18
Từ kết quả ñánh giá khả năng sống sót và tái sinh của mô sẹo sau khi xử lý mô sẹo bằng chiếu xạ tia gamma chúng tôi ñã xác ñịnh ñược liều tới hạn của mô sẹo
Hình thái cây tái sinh
vàng và rụng
Trang 11lạc là liều chiếu xạ 4krad Nếu vượt quá giới hạn 4krad ña số mô sẹo chết, không thể tạo số dòng mô ñủ lớn phục vụ những nghiên cứu tiếp theo, ñặc biệt là nghiên cứu chọn dòng Tuy nhiên, ñể thu ñược nhiều ñột biến cần xác ñịnh liều lượng chiếu xạ thích hợp, có thể vừa tạo ra những biến dị di truyền có lợi, vừa có tỷ lệ các dòng mô sống sót và tái sinh cao Do vậy, chúng tôi lựa chọn liều lượng 2krad kết hợp với thổi khô 9 giờ ñể sàng lọc dòng mô và tạo cây hoàn chỉnh
Hình 3.3 Một số hình ảnh cây tái sinh của giống lạc L18
ở giai ñoạn 6 tuần tuổi
A: Cây tái sinh không chịu thổi khô ; B: Cây tái sinh chịu thổi khô 9 giờ
C: Liều chiếu xạ 0,5krad + thổi khô 9 giờ; D: Liều chiếu xạ 2,0krad + thổi khô 9 giờ; E: Liều chiếu xạ 3,0krad + thổi khô 9 giờ; G: Liều chiếu xạ 4,0krad + thổi khô 9 giờ
Trang 12Kết quả xử lý mô sẹo trong hệ thống nuôi cấy in vitro của giống lạc L18
bằng thổi khô liên tục 9 giờ và chiếu xạ ở liều lượng 2krad kết hợp thổi khô liên tục 9 giờ ñã thu ñược 167 dòng mô, từ ñó có 198 dòng lạc ñược tạo ra
3.1.3 Đặc ñiểm nông sinh học của các dòng lạc ở thế hệ R 0 và RM 0
Nghiên cứu quần thể lạc R0 (cây tái sinh từ mô sẹo chịu thổi khô), RM0 (cây
tái sinh từ mô sẹo chịu chiếu xạ kết hợp với thổi khô) nhận thấy các dòng lạc chuyển
từ ống nghiệm ra trồng ngoài ñồng ruộng (vụ xuân, 2008) có sự biến ñộng di truyền lớn hơn nhiều so với giống gốc ở tất cả các chỉ tiêu nghiên cứu (bảng 3.7)
Bảng 3.7 Đặc ñiểm nông học của quần thể R0, RM0 tái sinh từ mô sẹo mất nước (X : Giá trị trung bình; S X: Sai số trung bình mẫu; Cv%: Hệ số biến ñộng)
Như vậy, quá trình chọn dòng lạc chịu hạn bao gồm: (1) Tạo mô sẹo và xử
lý mô sẹo; (2) Tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh (3) Trồng, theo dõi và phân tích
di truyền các dòng chọn lọc
Xử lý mô sẹo lạc trong nuôi cấy in vitro, chọn lọc mô sẹo sống sót, tái sinh
cây và theo dõi quần thể R0 và RM0 có thể rút ra một số nhận xét sau:
(1) Các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu thổi khô có chiều cao cây tăng hơn so với giống gốc; còn các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ kết hợp với thổi khô có chiều cao cây giảm so với giống gốc
Chỉ tiêu theo dõi Giống gốc Quần thể R0 Quần thể RM0
X S
X ± 37,00 ± 0,58 57,00 ± 4,61 18,50 ± 1,91 Cao thân
X S
Trang 13(2) Cây ñược tạo ra bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có số nhánh/ cây ít hơn so với giống gốc Quần thể R0 ñạt 3 nhánh/cây, quần thể RM0 ñạt 6,75 nhánh/cây, giống gốc có 8,33 nhánh/cây
(3) Quần thể R0 có 22,80 quả/cây, nhiều hơn giống gốc (ñạt 110,30% so giống gốc), quần thể RM0 có số quả/cây ít hơn giống gốc, chỉ có 14,00 quả/cây (ñạt 67,73% so giống gốc)
(4) Hệ số biến ñộng di truyền của các chỉ tiêu nghiên cứu ở 2 quần thể cây ñược tạo ra bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật lớn hơn so với giống gốc
Từ kết quả ñánh giá ở thế hệ R0, RM0, chúng tôi ñã chọn ñược 7 dòng có nguồn gốc từ giống lạc L18, trong ñó 3 dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu ảnh hưởng của thổi khô là R44, R46, R48 và 4 dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu ảnh hưởng của chiếu xạ kết hợp với thổi khô là RM46, RM47, RM48, RM49 làm vật liệu khởi ñầu ñể ñánh giá, chọn lọc ở các thế hệ tiếp theo
3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH DÒNG LẠC CHỌN LỌC QUA CÁC THẾ HỆ 3.2.1 Đặc ñiểm nông sinh học các dòng lạc chọn lọc ở thế hệ thứ Nhất, thứ Ba
So với các cây trồng khác, hạt lạc là rất khó bảo quản và tỷ lệ nảy mầm thấp khi thời gian bảo quản kéo dài Số quả trên cây lạc ở những thế hệ ñầu không ñủ lớn ñể thực hiện các nghiên cứu liên quan ñến khả năng chịu hạn Vì vậy, toàn bộ hạt của 7 dòng lạc chọn lọc ở quần thể R0, RM0 chúng tôi trồng kế tiếp vào các vụ trồng trong năm Kết quả ñánh giá sự ổn ñịnh của các tính trạng nông học về chiều cao thân chính, số nhánh/ cây; số quả/ cây; số quả chắc/cây ở thế hệ R1, RM1 trồng
ở vụ thu ñông năm 2008 (bảng 3.8); thế hệ R3, RM3 trồng ở vụ thu ñông năm 2009 (bảng 3.9) ñã cho thấy sự ổn ñịnh của các tính trạng nông sinh học của các dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo ñã góp phần khẳng ñịnh giá trị của kỹ thuật nuôi cấy
mô tế bào thực vật có thể tạo giống mới và rút ngắn thời gian tạo giống, tăng hiệu quả của quá trình chọn giống
3.2.2 Đánh giá các dòng lạc chọn lọc ở thế hệ thứ Năm
Chúng tôi tiến hành ñánh giá các dòng chọn lọc ở thế hệ thứ Năm thông qua
sự phân tích một số tính trạng số lượng và các chỉ tiêu hóa sinh; ñánh giá khả năng chịu hạn ở giai ñoạn hạt nảy mầm, giai ñoạn cây non và sự sai khác trong hệ gen bằng kỹ thuật RAPD
