Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức hiệu quả trong sản xuất các hoạt chất sinh học hoặc các chất chuyển hóa của chúng.. Xuất phát từ những cơ sở trên,
Trang 1was suitable for cell growth of Zedoary in flask 250 mL The cell
biomass was maximum with 10.44 g fresh weight (0.66 g dry weight)
after 14 culture days with inoculum size of 3 g
3 The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented
with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; agitation speed 150 rpm/min,
aeration rate 2,5 L/min was suitable to growth of Zedoary cells in 10 L
bioreactor The cell biomass was maximum with 603 g fresh weight
(53.25 g dry weight) after 14 culture days with inoculum size of 200 g
4 The concentration of essential oil in cells reached maximum at
2.57% dry weight after 14 culture days, 1.6 times higher than that in
rhizome The concentration of curcumin in cells reached maximum at
1.16% after 14 culture days, 2.7 times higher than that in rhizome
There was a biotransformation of curcuminoid in cell culture The
concentration of polysaccharide in cell was maximum at 6.55% dry
weight after 10 culture days, 1.4 time lower than that in rhizome
There was accumulation of sesquiterpenes in cell culture The
compositions of sesquiterpene distributed in suspension cells was less
than that in rhizome There were 3-4 peaks of sesquiterpene distributed
similar to rhizome There was a biotransformation of sesquiterpene in
cell culture
5 Essential oil could inhibit growth of B cereus ATCC 11778 (31
mm), S aureus ATCC 6538 (22.33 mm) and E coli ATCC 25922
(18.33 mm) Overall, the antibacterial ability of essential oil derived
from culture cell was high
RECOMMENDATION
1 More studies to enhance the accumulation ability of
bioactive compounds in Zedoary cells
2 More studies in composition as well as bioactivities of
curcumin, sesquiterpenes, polysaccharides produced from
Zedoary cells
MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Thực vật là nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm Hơn nữa, thực vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật
đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất đã đuợc công bố Việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn Vấn đề đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất nhanh chóng do sự biến động của điều kiện môi trường và địa lý, cũng như sự khai thác bừa bãi của con người Điều này buộc các nhà khoa học cần phải tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế để cung cấp nguyên liệu
ổn định cho ngành công nghiệp sản xuất dược phẩm
Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm 1950 Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức hiệu quả trong sản xuất các hoạt chất sinh học hoặc các chất chuyển hóa của chúng Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này như anthraquinone, vincristine, berberin, diosgenin, taxol, ginsenoside… Nghệ đen là loài thảo dược quý, không độc, có chứa các chất như curcumin, terpenoid và tinh dầu Curcumin của nghệ đen
có khả năng ức chế khối u; chống lại một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng; curcumin cũng có tác dụng chống đông máu và hạ huyết áp;
Trang 2curcuminoid và sesquiterpen là những chất có khả năng ức chế sự hình
thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng
chống viêm nhiễm; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả
năng bảo vệ tế bào Tinh dầu nghệ đen có tác dụng kháng khuẩn và
kháng đột biến rất cao Bên cạnh đó, polysaccharide của nghệ đen ức
chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt (sarcoma 180), ngăn ngừa
đột biến nhiễm sắc thể, có hoạt tính kích thích đại thực bào Trong tự
nhiên, nghệ đen là loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian
dài để tạo củ nên hệ số nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc
biệt là phụ thuộc rất lớn vào điều kiện khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân
công và vật tư sản xuất Mặt khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc
các bệnh như thối củ và đốm lá Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên
liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng lớn các hoạt tính sinh học quý
của cây nghệ đen sử dụng trong bào chế dược phẩm
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria
Roscoe) và khảo sát khả năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính
sinh học của chúng”
2 Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy
thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định
khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong
tế bào cây nghệ đen nuôi cấy huyền phù
3 Nội dung nghiên cứu
- Tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro;
- Nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen;
- Khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tinh sinh học của tế bào;
- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu của tế bào
4 Những đóng góp mới của luận án
- Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây
(22.33 mm) and finally E coli (18.33 mm) Meanwhile, essential oil derived from rhizome can inhibit the growth of B Cereus; E coli; S aureus (16 mm; 17.67 mm and 14 mm) respectively
Table 3.18 The antibacterial ability of essential oil in Zedoary cells
D-d (mm) Bacteria
Control Essential oil of cells Rhizome essential oil
B cereus ATCC 11778 0 22.33b 16.00a
Figure 3.14 Antibacterial ability of essential oil A: E coli ATCC 25922 B:
B cereus ATCC 11778 C: S aureus ATCC 6538 ĐC: control TN: essential
oil of rhizome TB: essential oil of cells
CONCLUSION AND RECOMMENDATION CONCLUSION
1 The basic MS medium supplemented with 3% sucrose, 0.8% agar; 0.5 mg/L BA and 0.5 mg/L 2,4-D was suitable to callus
induction from leaf-base of in vitro Zedoary The yellow compact and
friable callus were most suitable for cell suspension culture
2 The basic MS medium contained 3% sucrose, supplemented with 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D; shaking speed of 120 rpm/min
Trang 3Figure 3.13 Distribution of sesquiterpene A: Accumulation of sesquiterpene in rhizome;
B: kinetics of sesquiterpene accumulation in suspension cells from day 2 to 18
3.5 Antibacterial activity of essential oil in Zedoary cells
Results performed in table 3.18 indicated that, essential oil
extracted from both cells and rhizome can depress growth E coli, S
aureus and B cereus Overall, essential oil collected from suspension
cells could be antibacterial (Figure 3.14) The essential oil from
culture cells depressed most to S aureus (31 mm), then to B cereus
nghệ đen in vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định
một cách có hệ thống các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn định của tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác và trong hệ lên men 10 lít
- Đã khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu, curcummin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen
- Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào cây
nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả
năng ức chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh
5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ thống về nuôi cấy tế bào cây nghệ đen và khả năng tích lũy một số hoạt chất sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật
5.2 Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của luận án sẽ là cơ sở khoa học để phát triển nuôi cấy tế bào cây nghệ đen nhằm sản xuất nhanh sinh khối, cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định để chiết tách thu hồi các hợp chất thứ cấp dùng làm dược liệu, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng
6 Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 105 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được chia thành các phần: Phần Mở đầu có 4 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 32 trang; Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu, 7
Trang 4trang; Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận, 36 trang; Phần Kết
luận và đề nghị, 2 trang; Các công trình đã công bố liên quan đến luận án:
1 trang, Tài liệu tham khảo: 23 trang với 193 tài liệu tham khảo bằng
tiếng Việt và tiếng Anh; Luân án có 18 bảng số liệu và 16 hình
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo 17 tài liệu tiếng Việt và 189 tài liệu tiếng
Anh với các nội dung liên quan gồm: (1) Nuôi cấy tế bào thực vật; (2)
Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật nuôi cấy in
vitro; (3) Giới thiệu về cây nghệ đen
Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực
vật hoàn chỉnh được công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh
lý thực vật người Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra
phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật Những thử nghiệm đầu tiên
trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược phẩm đã được tiến hành
trong những năm 1950 tại công ty Charles Pfizer Đến nay, một thế kỷ
sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ cấp đã được
sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật
Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các
tế bào không phân hóa, được gọi là callus Nuôi cấy callus đạt được
bằng cách nuôi cấy các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh
dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar Nuôi cấy huyền phù tế bào
thường được khởi đầu bằng cách chuyển các khối callus vào nuôi cấy
trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc
xoay Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết lập
được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất Nuôi cấy
huyền phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy
nhất cho những nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất
chuyển hóa Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật cần thiết phải
For examples, peak 1 (retention time 4.7 min) had absorption of 6.05 mAU in rhizome but got just 2.55 mAU in suspension cells, meanwhile, peak 4 (retention time 7.5 min) in suspension cells had absorption of 7.33 mAU and 2.23 mAU in rhizome Some peaks appeared in rhizome (5-8) were absent or trace (< 1 mAU) in suspension cells However, in suspension cells, some new peaks appeared (not numbered) that had retention time about 6.8; 7.8; 8.2 and 9.2 min and the absorption of 1.38-4.10; 5.62-7.54; 1.70-8.41 and 1.06-8.38 mAU respectively These resultd indicated that many biotransformation of sesquiterpene were occuring in process of cell culture, producing different sesquiterpene types compared with the rhizome control
Table 3.17 Comparision of eluted peak heights (mAU) for rhizome control and suspension cells of Zedoary at different culture times
Compound number/retention time (min) Culture
time (day) 1/4.7 2/5.1 3/6.0 4/7.5 5/12.7 6/13.8 7/19.2 8/20.5 9/26.7
Trang 5Study showed that the appearance of separated peaks in rhizome
was more than that in suspension cells (Figure 3.13) Overall, peaks
had retention time related to sesquiterpene compounds (numbered 1-9)
in the rhizome and in suspension cells had different absorption
spectrums (mAU), particularly peaks numbered 1 and 4 (Table 3.17)
quan tâm đến các yếu tố sau: Môi trường nuôi cấy như các chất điều hòa sinh trưởng, nguồn carbon và các điều kiện nuôi cấy như: cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu, sự khuấy trộn, sục khí…Trình tự của một quá trình nâng cấp điển hình bắt đầu từ nuôi cấy tế bào trong các chai, lọ đến bình tam giác nuôi cấy lắc có dung tích 1 L, sau đó đến hệ lên men bằng thuỷ tinh từ 1-10 L, và sau đó nâng cấp đến hệ lên men bằng thép không rỉ từ 30-150 L rồi đến 1000 L Hệ lên men là một hệ thống nuôi cấy tự động mà chức năng chính của nó là cải thiện kiểm soát môi trường để đạt được các điều kiện tối ưu cho sinh trưởng của tế bào và/hoặc hình thành sản phẩm
Trong vài thập kỷ qua, những bằng chứng từ thực nghiệm và trong thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở thực vật có các chức năng cơ bản sau: Bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật ăn cỏ; kháng nấm và vi khuẩn; kháng virus Các hợp chất hóa học này còn được dùng nhiều trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo mùi, thuốc trừ sâu Các hợp chất thứ cấp của thực vật có thể phân thành
ba nhóm chính đó là terpene, phenol và các hợp chất chứa nitrogen Nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy đã được tiến hành bởi các nhà khoa học thực vật và vi sinh vật ở nhiều quốc gia Hầu hết các ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong công nghệ sinh học đều nhằm vào mục đích sản xuất các hợp chất thứ cấp Những thành tựu đạt được trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất dùng để chữa bệnh đã tạo ra khả năng có thể sản xuất trên qui mô lớn các chất thuộc nhóm alkaloid, terpenoid, steroid, saponin, phenol, flavonoid và các amino acid
Ở nước ta, công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật phát triển vào những năm 1970 và đến nay đã đạt được một số thành công Một trong những kết quả nuôi cấy tế bào thành công nhất đó là nuôi cấy tế bào cây sâm Ngọc Linh Ngoài ra còn có một số nghiên cứu nuôi cấy tế bào các loài cây thuốc khác như cây thông đỏ, cà gai leo, rau má, dừa
Trang 6cạn… Nghệ đen là cây thảo dược có chứa các nhóm chất như tinh dầu
bao gồm các chất thuộc sesquiterpene và monosesquiterpene;
curcuminoid Ngoài ra, nghệ đen còn chứa các chất như tinh bột, chất
dẻo và một số chất có vị đắng khác Cây nghệ đen đã được con người
dùng trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh Nhiều nghiên
cứu cho thấy, các hợp chất như tinh dầu, curcumin, sesquiterpene của
nghệ đen có các hoạt tính sinh học quý như: kháng ung thư, bảo vệ
gan, kháng loét, kháng viêm, kháng khuẩn và kháng nấm
Có một số công trình nghiên cứu về nhân giống in vitro ở cây
nghệ đen chẳng hạn như tái sinh chồi từ callus nghệ đen; nhân giống in
vitro cây nghệ đen từ chồi Ngoài các nghiên cứu nhân giống in vitro
cây nghệ đen, một số kết quả bước đầu trong nuôi cấy callus và huyền
phù tế bào cây nghệ đen cũng đã được công bố Cho đến nay, công
trình nghiên cứu nuôi cấy tế bào với khả năng tích lũy sinh khối cao
cũng như khảo sát sự tích lũy các hợp chất có hoạt tính học của tế bào
nghê đen nuôi cấy in vitro trong hệ lên men là rất hạn chế
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tương nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây nghệ đen Nguyên liệu nghiên cứu là
các tế bào callus được tạo từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Nuôi cấy callus
Bẹ lá của cây nghệ đen in vitro được nuôi trên môi trường MS có
2% sucrose và 0,8% agar, bổ sung 0,5-4,0 mg/L 2,4-D và 0,5-4,0 mg/L
BA để tạo callus
2.2.2 Nuôi cấy tế bào huyền phù
2.2.2.1 Nuôi cấy tế bào trong bình tam giác
Khoảng 2 g callus 2 tuần tuổi được chuyển vào bình tam giác 250
ml chứa 50 ml môi trường MS lỏng có 2% sucrose, bổ sung 0,5 mg/L
speak at 1.16% before gradually decreasing from day 16 to day 18 alongs to cell growth (Figure 3.9) Overall, concentration of curcumin
in culture cell with diferent culture time was higher than that in rhizome (0.43%)
Bảng 3.16 Concentration of curcumin in Zedoary cells cultured in 10L bioreactor Culture time
(day) Retention time (min) Peak square (mAU) concentration (%) Curcumin
Trang 73.4.2 Total water soluble polysaccharide
Table 3.15 showed the concentration of total water soluble
polysaccharide (% dry quantity) from Zedoary cells at variety time Overall,
concentration of polysaccharide increased from 2 to 10 and reached a peak at
6.55%, 1.4 time lower than that in Zedoary (9.46%) (p<0,05)
Table 3.15 Concentration of polysaccharide in Zedoary cells
Time (days) Concentration of polysaccharide (%)
Analysis results of HPLC were performed in Figure 3.10-3.12 and
Table 3.16 Standard curcumin has a retention time of 2.05 mins, one
another peak has a similar retention time was found in extractive
solution of rhizome (2.08 mins) and cells were cultured within
different time 2-18 days (1.97-2.09 mins) Besides, extractive solution
of natural Zedoary performed 2 other peaks Of them, one peak had
retention time that was similar to the second peak of culture cell (1.79
min), the another peak had a retention time of 1.21 min The extractive
solution of culture cell had the third peak with retention time of 1.6
minute The disappearance of the third peak of 1.21 min (in extractive
solution of rhizome) in vitro cells can be due to biotransformation
happening in culture process
Results in Table 3.16 showed that, the concentration of curcumin
(% dry weight) increased gradually from day 2 to day 14, reached
2,4-D và 0,5 mg/L BA, nuôi ở tốc độ lắc 100 vòng/phút để thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào Môi trường MS lỏng bổ sung nguồn carbon khác nhau (sucrose, glucose và fructose) và các chất ĐHST BA và 2,4-D ở dạng riêng rẽ hoặc tổ hợp, nuôi ở tốc độ lắc 120 vòng/phút để đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào
2.2.2.2 Nuôi cấy tế bào huyền phù trong hệ lên men
100 g sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) thu từ nuôi cấy lắc trong bình tam giác được đưa vào nuôi trong hệ lên men 14 L chứa 10 L môi trường MS lỏng có 3% sucrose, bổ sung 1,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA; với các điều kiện khác nhau như cỡ mẫu: 100-250 g, tốc độ khuấy: 100-200 vòng/phút và tốc độ sục khí: 1,5-3,5 L/phút Sinh khối tế bào được thu 2 ngày một lần trong suốt 18 ngày để khảo sát khả năng sinh trưởng của chúng
2.2.3 Xác định sinh trưởng của tế bào
Sinh khối tươi của tế bào thu được bằng cách lọc chân không dịch huyền phù tế bào, sau đó rửa bằng nước cất để loại bỏ môi trường và cân xác định khối lượng tươi
Khối lượng khô của tế bào được xác định bằng cách sấy sinh khối tươi trong tủ sấy ở 500C cho đến khi khối lượng không đổi và cân
2.2.4 Định lượng tinh dầu
Tách chiết và xác định hàm lượng tinh dầu theo phương pháp của
Manzan và cs 2003
2.2.5 Định lượng curcumin
Tách chiết curcumin theo phương pháp của Paramapojn và Gritsanapan (2009) Phân tích HPLC để xác định hàm lượng curcumin được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng chương trình ChromQuest (ver 4.2.34)
2.2.6 Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số
Tách chiết polysaccharide theo phương pháp của Sun và cs (2005) Xác định hàm lượng polysaccharide dựa vào đường chuẩn D-
Trang 8glucose (4-20 mg/ml) theo Chaplin và cs 1994 và tính toán theo hệ số
chuyển đổi sang polysaccharide là 3,168 theo Li và cs 2007
2.2.7 Xác định sesquiterpene
Tách chiết sesquiterpene theo phương pháp của Jang và cs 2004
Phân tích HPLC để xác định sesquiterpene được thực hiện trên máy
Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) bằng chương trình
ChromQuest (ver 4.2.34)
2.2.8 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu
Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu được xác định theo phương
pháp khuếch tán đĩa thạch của Lehrer và cs (1991)
2.2.9 Xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần Số liệu thực nghiệm được
tính trung bình mẫu ± sai số chuẩn và phân tích Ducan’s test (p<0,05)
bằng chương trình SAS
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nuôi cấy callus nghệ đen
Kết quả tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro trên các môi
trường khác nhau sau 90 ngày nuôi cấy được ở bảng 3.1 Các môi
trường có bổ sung BA và 2,4-D đều kích thích tạo callus, trong khi đó
môi trường không bổ sung chất ĐTST lại không tạo callus Môi trường
có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L BA hoặc 2,0 mg/L 2,4-D và
2,0 mg/L BA là thích hợp nhất (tỷ lệ tạo callus từ 40,1-46,01%), callus
có màu trắng, xốp và có khả năng sinh trưởng tốt (Hình 3.1A) Ở các
môi trường còn lại tỷ lệ tạo callus thấp (8,2-15,74%), callus có màu
trắng và mọng nước (Hình 3.1B)
Table 3.13 Effects of aeration rate on cell growth
Aeration rate (L/min) Fresh weight (g) Dry weight (g)
Figure 3.9 Growth of Zedoary cell in 10 L bioreactor
3.4 The accumulation of some bioactive compounds in Zedoary cells
3.4.1 Essential oil
Concentration of essential oil derived from Zedoary cells cultured
in 10 L bioreactor was showed in table 3.14 Overall, concentration of essential oil (% dry weight) of cells increased from 2 to 14 culture days and reached a peak 2.57% (1,61% in natural Zedoary rhizomes)
Table 3.14 Concentration of essential oil in Zedoary cells
Time (days) Concentration of essential oil (%)
Trang 9Table 3.11 Effects of inoculum size on cell growth
Inoculum size (g) Fresh weight (g) Dry weight (g)
This research showed that, the increase of agitation speed 100-150
rpm/min resulted in the increase of cell biomass as well as can got
peak 561 g fresh weight (50,84 g dry weight) However, at the higher
agitation speed (>150 rpm/min) cell growth decreased with 437 g fresh
weight (37,42 g dry weight) at 200 rpm/min (table 3.12)
Table 3.12 Effects of agitation speed on cell growth
3.3.2.3 Effects of aeration rate
Increasing aeration rate from 1.5 to 2.5 L/min resulted in a
increase of cell growth and reached a peak at 603 g fresh weight
(53.25 g dry weight) However, increasing aeration rate from 3 to 3.5
L/min, cell growth were decreased With aeration rate of 3.5 L/min,
fresh weight of cell was 441 g fresh weight (33,17 g dry weight)
(Figure 3.9 và Table 3.13)
Bảng 3.1 Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro
2,4-D (mg/L)
BA (mg/L)
% mẫu vật tạo callus
Sinh trưởng của callus Hình thái callus
0,0 0,0 - - - 0,5 0,5 15,74 c ++ Trắng, mọng nước 1,0 1,0 46,01 a ++++ Trắng, xốp 2,0 2,0 40,10 b ++++ Trắng, xốp 3,0 3,0 10,20 d +++ Trắng, mọng nước 4,0 4,0 8,20 cd + Trắng, mọng nước ++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh trưởng kém; - : không xuất hiện callus
Hình 3.1 Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro (A) callus trắng và xốp,
0,25 0,25 + Trắng và mọng nước 0,50 0,50 ++++ Vàng sáng, rắn và rời rạc 1,00 1,00 ++ Trắng và xốp
2,00 2,00 ++ Trắng và mọng nước 4,00 4,00 - Hóa nâu và chết ++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh trưởng kém; - : không sinh trưởng
B
A
Trang 10Hình 3.2 Callus có màu vàng, rắn và rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy
Callus sơ cấp có màu trắng, xốp và sinh trưởng mạnh được cấy
chuyển lên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA từ 0,25-4 mg/L
Kết quả cho thấy, các callus sinh trưởng trên môi trường có 2 mg/L
2,4-D và 2 mg/L BA dần dần hóa nâu và chết sau khi cấy chuyển Các
callus trên môi trường có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L BA phát triển thành
dạng callus thứ cấp tốt nhất trên môi trường có chứa 0,5 mg/L 2,4-D
và 0,5 mg/L BA (Bảng 3.2) Các môi trường còn lại không có tác dụng
kích thích sinh trưởng callus (callus sinh trưởng kém hoặc hóa nâu và
chết) sau 4 tuần cấy chuyển Các calus thứ cấp có màu vàng sáng, rắn
và dễ vỡ vụn (Hình 3.2) thu được trên môi trường MS có bổ sung 0,5
mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA tạo nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào
huyền phù
3.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác
3.2.1 Ảnh hưởng của cỡ mẫu
Với cỡ mẫu 2 g, sinh khối đạt cao nhất sau 16 ngày là 4,12 g tươi
(0,37 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,06 Với 3 g tế bào nuôi cấy thì
sinh trưởng của tế bào đạt cực đại chỉ sau 14 ngày là 5,61 g tươi (0,41
g khô) và chỉ số sinh trưởng là 1,87 Khi tăng cỡ mẫu lên 4-5 g, sinh
khối đạt cực đại sau 12 ngày, tương ứng là 6,12 g tươi (0,46 g khô) và
7,22 g tươi (0,51 g khô) nhưng chỉ số sinh trưởng thấp chỉ đạt 1,54 và
1,44 Mặc dù cỡ mẫu 2 g sau 14 ngày cũng có chỉ số sinh trưởng có
cao (2,0), nhưng chất lượng tế bào kém hơn (tế bào có màu vàng nhạt,
dịch huyền phù ít đồng nhất) so với khi sử dụng 3 g (tế bào có màu
3.3 Cell suspension culture of Zedoary in bioreactor
3.3.1 Assessment of cell growth
Study showed that cell mass got maximum on the 14th with 241.67
g fresh weight (22.28 g dry weight), then decreased The fresh cell biomass was 132.67 g fresh weight (10.08 g dry weight) after 18 days
of culture
Figure 3.7 Growth of Zedoary cells in 10 litter bioreactor
Figure 3.8 Fresh weight biomass (A) and dry weight biomass (B)
Based on observating the growth curve of Zedoary cell, we study effects
of some culture conditions on cell biomass accumulation after 14 days
3.3.2 Effects of culture conditions
Trang 11from 20-60 g/L, the cell biomass also increases and reaches a
maximum of 8.40 g fresh weight (0.62 g dry weight) However, when
the fructose up to 70 g/L, the cell growth slowed (7.65 g fresh weight
and 0.57 g dry weight)
Table 3.10 Effects of fructose on cell growth
Cell culture of Zedoary on MS medium supplemented with 3%
sucrose, 0.5 mg/L BA and 1.5 mg/L 2,4-D, shaking speed 120
rpm/min The maximum biomass was gotten after 14 days with 10.44
g fresh weight (Figure 3.4 and 3.5)
0 0.2 0.4 0.6 0.8
0 2 4 6 8 10 12
Culture time (days)
Fresh cell weight Dry cell weight
Figure 3.4 Growth of Zedoary cells in flask of 250 ml
Figure 3.5 Cell culture of Zedoary in flask of 250 ml
vàng đậm và tươi, dịch huyền phù đồng nhất) Vì thế, theo nhận định của chúng tôi cỡ mẫu 3 g là thích hợp hơn cả
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên tích lũy sinh khối của tế bào nghệ đen
0,38 b 1,51 5,65 b
0,40 b 1,41 6,09 c
0,47 b 1,22
10 3,50 b
0,33 b 1,75 4,92 b
0,40 a 1,64 6,04 a
0,42 b 1,51 7,02 b
0,48 b 1,40
tế bào sinh trưởng chậm lại, đặc biệt bị ức chế mạnh ở 180 vòng/phút, sinh khối cao nhất chỉ là 4,75 g tươi (0,35 g khô), dịch huyền phù tế bào chuyển sang màu nâu nâu sau 14 ngày nuôi cấy
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh sinh trưởng tế bào
Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ BA 0,25 và 0,5 mg/L có
hiệu quả tương đương (p<0,05), khối lượng tươi của tế bào từ
2,06-2,08 g (0,45-0,46 g khô) và chỉ số sinh trưởng xấp xỉ 2,1 là cao nhất
Trang 12Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA lên sinh sinh trưởng tế bào
Khả năng sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong môi trường có bổ
sung 2,4-D từ 0,25-2,5 mg/L sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở
bảng 3.6 Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ 2,4-D 1,5 mg/L có
ảnh hưởng lớn nhất, khối lượng tươi của tế bào đạt 6,75 g (0,52 g khô)
và chỉ số sinh trưởng là 2,25, cao hơn các môi trường còn lại
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh sinh trưởng tế bào
Tế bào nghệ đen được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BA và
2,4-D nồng độ từ 0,25-2,5 mg/L Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy được
culture were showed in figure 3.8
Table 3.8 Effects of sucrose on cell growth
Results showed that, cell growth were slowly at low concentration
of 20 g/L sucrose (7,22 g of fresh weight and 0.55 g dry weight) The medium contained 30 g/L sucrose, cell growth increase dramatically (10.44 g fresh weight and 0.66 g dry weight) with growth index of 3.48, the suspension solution was bright yellow and rather homogenous At the sucrose concentration of 40-70 g/L, cell growth decreased, especially at 70 g/L (6.75 g fresh weight and 0.6 g dry weight)
3.2.4.2 Effects of glucose
Results indicated that cell biomass was rather low when culturing cells on medium contain 20-30 g/L glucose At the glucose of 40-60 g/L cell biomass got maximum (7.32 g fresh weight and 0.59 g dry weight), with growth index of 2.44 At the glucose of 70 g/L, the cell growth was depressed
Table 3.9 Effects of glucose on cell growth
