Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo polygalacturonase nhằm ứng dụng trong sản xuất pectic oligosaccharide (POS

Các nghiên cứu về enzym thường bắt đầu bằng việc phân lập và tuyển chọn từ tựnhiên - nơi có nhiều cơ chất đặc hiệu cho enzym xúc tác, từ đó, thuần hóa chủng phân lậphoặc có thể biến

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè.

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.Nguyễn Thị Xuân Sâm – Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã định hướng và hướng dẫn cho tôi nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Vũ Kim Dung, thuộc Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh

- Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội - người đã luôn giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị, các bạn học viên, sinh viên phòng thí nghiệm Vi sinh- Hóa sinh -Sinh học phân tử đã nhiệt tình giúp đỡ cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu.

Hà Nôi, ngày 24 tháng 3 năm 2014

Lê Thị Huyền

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các kết quảnghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các số liệu, tính toán là hoàn toànchính xác và chưa được công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào

Mọi dữ liệu, hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều đượcthu thập và sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên

Hà Nội, ngày 24 tháng 03 năm 2014

Lê Thị Huyền

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iiMỤC LỤC iiiDANH MỤC HÌNH VẼ vi

1.1.2 Endo polygalacturonase (EPG) 6

1.2 Đại cương về Aspergillus niger 8

1.2.1 Đặc điểm hình thái A niger 8

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym 9

1.2.3 Sinh tổng hợp trên môi trường rắn 12

1.3 Nguồn cơ chất pectin 13

1.3.1 Cấu tạo và tính chất của pectin 13

1.3.2 Nguồn thu pectin 16

1.4 Pectic oligosaccharide (POS) 16

1.4.1 Cấu tạo Pectic oligosaccharide 16

1.4.2 Tính chất hóa lý của Pectic oligosaccharide 17.

oligosaccharide……… 17

1.4.4 Hoạt tính sinh học của Pectic oligosaccharide 18

1.5 Cải biến chủng Apergillus niger bằng phương pháp đột biến 20

1.5.1 Giới thiệu chung về phương pháp đột biến 20

1.5.2 Một số nghiên cứu về đột biến tạo chủng vi sinh vật sinh tổng hợp pectinase 23

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 25

2.1.1 Chủng vi sinh vật 25

2.1.2 Môi trường 25

2.1.3 Hóa chất và enzym 25

2.1.4 Thiết bị 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Phân lập chủng theo khả năng phân hủy cơ chất pectin trên đĩa thạch 27

2.2.2 Xác định tên nấm sợi bằng hình thái 28

2.2.3 Đếm số lượng bào tử trực tiếp dưới kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng cầu 28

2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp Endo polygalacturonase của A niger lựa chọn 28

2.2.5 Định lượng đường khử tổng số theo phương pháp DNS

……….29

2.2.6 Xác định hoạt độ Polygalacturonase 30

2.2.7 Xác định hoạt độ Endo polygalacturonase 30

2.2.8 Thu Endo-polygalacturonase kỹ thuật 31

2.2.9 Khảo sát đặc tính của Endo-polygalacturonase 32

2.2.10 Thủy phân cơ chất pectin bằng endo polygalacturonase…

……… 32

2.2.11 Xác định thành phần POS bằng sắc ký bản mỏng (TLC) 32

2.2.12.Phương pháp đột biến chủng nấm mốc 32

2.2.13.Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp endo

-polygalacturonase theo quy hoạch bậc hai Box-Benken 34

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng A niger có khả năng sinh tổng hợp Endo

polygalacturonase cao 37

3.1.1 Phân lập 37

3.1.2 Tuyển chọn các chủng A.niger có hoạt tính polygacturonase cao 38 3.1.3 Tuyển chọn các chủng A.niger có hoạt tính endo polygacturonase cao 41

3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp enzym 43

3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng pectin 43

3.2.2 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy 44

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 45

3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 46

3.3 Nghiên cứu cải tạo chủng A niger CNTP 5037 sinh tổng hợp Endo

polygalacturonase cao 48

3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian chiếu xạ tới tỉ lệ sống 48

3.3.2 Sàng lọc và lựa chọn chủng đột biến sinh Endo polygalacturonase 48 3.3.3 Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp enzym của chủng đột biến ĐB5037.06 52

3.5.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền enzym 58

3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 59

3.6 Thăm dò khả năng chuyển hóa pectin tạo POS 61

KẾT LUẬN 63TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 72

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vị trí phân cắt của pectinesterase 4

Hình 1.2 Sản phẩm phân cắt của polymetyl galacturonase 4

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của Endo polygalacturonase 5

Hình 1.4 Sản phẩm phân cắt của Exo polygalacturonase 5

Hình 1.5 Sản phẩm phân cắt của Polymetylgalacturonate lyase 6

Hình 1.6 Sản phẩm phân cắt của Polygalacturonate lyase 6

Hình 1.7: Cơ chế hoạt động của Endo polygalacturonase 6

Hình 1.8 Cấu tạo A niger 9

Hình 1.9 Cấu tạo của Pectic polysaccharide 14Hình 1.10 Công thức của Homogalacturonan 12Hình 1.11: Cấu tạo củaD - Galacturonic acid và mộtPectic oligosaccharide 17

Hình 2.1: Đồ thị đường chuẩn galacturonic acid 30Hình 3.1 Khuẩn lạc, hệ sợi và bào tử chủng CF1 trên môi trường Czapeck (sau 3 ngày

nuôi, 300C) 38Hình 3.2 Vòng thủy phân cơ chất pectin của dịch chiết enzym một số chủng nấm mốc

thử nghiệm (0,1ml/lỗ, 5 giờ, 50oC) 40Hình 3.3 Sự giảm độ nhớt dịch thủy phân pectin enzym của các chủng mốc thử

Hình 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng pectin đến khả năng sinh tổng hợp enzym 44Hình 3.5 Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp endo polygalacturonase

của chủng A niger CNTP 5037 45Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh tổng hợp endo polygalacturonase

46Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endo

polygalacturonase của chủng A niger CNTP 5037 47

Hình 3 8 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu để nuôi cấy thu PG 55

Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzym 58Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của enzym 59Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym 60

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của enzym 61

Hình 3.13 Khảo sát quá trình thủy phân pectin tạo POS bởi dịch chiết enzym từ

A.niger ĐB 5037.06 62

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Đặc tính của Endo polygalacturonase.7

Bảng 1.2: Đặc điểm hình thái của A niger 9Bảng 1.3: Hàm lượng pectin trong các loại trái cây 16Bảng 1.4: Sản xuất POS theo phương pháp khác nhau từ các nguồn pectin 18

Bảng 2.1 Hóa chất chính, enzym 26Bảng 2.2 Máy, thiết bị 26Bảng 2 3 Các biến số và khoảng chạy của chúng 34Bảng 2.4: Ma trận thực

nghiệm……….35

Bảng 3.1 Nguồn gốc và đặc điểm của các chủng nấm mốc phân lập 37

Bảng 3.2 Kết quả đo giá trị (D- d) của 37 chủng chủng nấm

mốc……… 39

Bảng 3.3: Hoạt độ Polygalacturonase của các chủng thử nghiệm 40

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian chiếu xạ tới tỉ lệ sống của A niger 48Bảng 3.5: Kết quả 50 Chủng đột biến có tỉ lệ D/d cao hơn so với chủng tự nhiên 49Bảng 3.6: Kết quả kiểm tra khả năng tổng hợp enzym của chủng đột biến 50Bảng 3.7 Khả năng sinh tổng hợp PG của các chủng cải tạo qua 5 thế hệ 51Bảng 3.8: Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hoạt độPG thu được trong

các điều kiện nuôi cấy khác nhau 52Bảng 3 9: Kết quả phân tích phương sai mô hình ưu bằng phần mềm DX7.1.5 53Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ ammonium sulfat bão hòa đến hiệu suất thu nhận

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol tới hiệu suất thu nhận PG 56Bảng 3.12 Ảnh hưởng của các phương pháp thu nhận đến hiệu suất thu hồi PG 57

DANH MỤC CHŨ VIẾT TẮT

ENPO- PMG-K1 Endo polymetyl galacturonase

EXO-PMG-K3 Exo– polymetyl galacturonase

MỞ ĐẦU

Tài nguyên sinh học Việt Nam khá đa dạng và phong phú Do đó, việc khai thácnguồn tài nguyên này cũng được thực hiện thường xuyên dưới các dạng nghiên cứu đadạng sinh học của mỗi loài sinh vật để tìm tòi các gen mới phục vụ cho nghiên cứu vàứng dụng trong đời sống

Các nghiên cứu về enzym thường bắt đầu bằng việc phân lập và tuyển chọn từ tựnhiên - nơi có nhiều cơ chất đặc hiệu cho enzym xúc tác, từ đó, thuần hóa chủng phân lậphoặc có thể biến đổi hệ gen của chủng để đạt được mục tiêu mong muốn

Endo polygalacturonase là enzym có nhiều ứng dụng quan trọng thuộc họ pectinase.Endo polygalacturonase (EPG) xúc tác thủy phân liên kết α-(1, 4) – D – galacturonictrong phân tử pectin để tạo thành pecic oligosaccharide và acid galacturonic

EPG đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau thực vật, nấm mốc, nấmmen, vi khuẩn Tuy nhiên, đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất và có khả năng tổng

hợp EPG cao là Aspergillus niger Với ưu điểm dễ nuôi cấy, sinh trưởng và phát triển nhanh, sản xuất enzym trong một thời gian ngắn A niger được sử dụng để nuôi cấy thu

enzym EPG

EPG đã được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như sản xuất nước quả, rượuvang, lên men trà, cà phê và sản xuất tinh dầu EPG cũng được ứng dụng trong ngànhcông nghiệp khác như: công nghiệp dệt, xử lý nước thải, sản xuất thức ăn chăn nuôi Hiện nay, một hướng mới đang được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu đó là

sử dụng EPG thủy phân giới hạn cơ chất pectin tạo Pectic oligosaccharide (POS) Đây làmột prebiotic thế hệ mới có rất nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho con người

Cơ chất pectin để tạo POS có thể sản xuất từ phụ phẩm nông nghiệp như vỏ quảcam, bưởi, chanh dây, cà rốt,…Việt Nam là nước nhiệt đới, khí hậu thích hợp cho sự pháttriển của các loại qủa này, do đó, nguồn phụ phẩm nông nghiệp giàu pectin khá dồi dào

Việc tìm kiếm chủng A niger có khả năng tổng hợp EPG cao để chủ động tạo ra

nguồn enzym ứng dụng trong thực phẩm và đặc biệt để thủy phân cơ chất pectin của ViệtNam tạo POS là một công việc rất có ý nghĩa

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài:

"Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp Endo polygalacturonase nhằm ứng dụng trong sản xuất pectic oligosaccharide (POS)"

-Nội dung nghiên cứu:

+ Phân lập và tuyển chọn chủng A niger có khả năng sinh tổng hợp Endo

+ Thu nhận enzym kỹ thuật

+ Xác định đặc tính và thăm dò khả năng ứng dụng enzym nghiên cứu vào thuỷphân pectin tạo pectic oligosaccharide (POS)

Ngoài ra, chúng còn có vai trò quan trọng hàng đầu trong việc phá vỡ và làm mềm

mô thực vật, hỗ trợ quá trình cân bằng sinh thái trong việc phân hủy và tái chế chất thải

từ nguyên liệu thực vật

Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy một ứng dụng quan trọng nữa củapectinase trong việc thuỷ phân pectin tạo ra các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơnnhư các pectic olygosacchride (POS) có thuộc tính prebiotic mang lại sức khỏe cho conngười, hỗ trợ và giúp phòng chống bệnh tật

Pectinase không chỉ tìm thấy ở thực vật bậc cao mà còn có ở các vi sinh vật như vikhuẩn, nấm men và nấm sợi Pectinase là một họ bao gồm nhiều loại enzym, xúc tác chocác kiểu phản ứng khác nhau và có tính đặc hiệu cao ở vi sinh vật

Hiện nay, việc phân loại pectinase dựa vào tính đặc hiệu, cơ chế tác dụng, kiểu phản ứng

và pH tối ưu của enzym Năm 1966, Koller và Neukom chia pectinase thành một sốenzym chính như sau:

- Pectinesterase (PE)

Pectinesterase hay còn được gọi với một số tên khác như pectinmethylesterase(PME), pectase, pectin methoxylase, pectin demethoxylase và pectolipase, thuộc nhómenzym thủy phân Enzym PE xúc tác quá trình thủy phân liên kết este để tách nhómmetoxyl (OCH3) trong phân tử pectin, giải phóng ra methanol và acid pectic hoặc acid

pectinic Pectinesterase được ứng dụng làm trong nước quả trong sản xuất rượu vang,sâm panh.

Hình 1.1 Vị trí phân cắt của pectinesterase

- Polygalacturonase (PG)

PG là enzym xúc tác sự thủy phân liên kết α-(1-4) glycoside trong phân tử pectin.Polygalacturonase là một phức hệ enzym gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặchiệu cao với cơ chất Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng người ta phân PG thànhcác nhóm nhỏ sau:

 Polygalacturonase (PG):

Là các enzym tác động chủ yếu lên acid pectinic và acid pectic

Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không đáng

kể Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl cao

Các Polygalacturonase này cũng được chia làm hai nhóm dựa vào vị trí liên kếtglycoside bị thủy phân

+ Endo–polygalacturonase(EPG): Là enzym dịch hóa, chỉ phân cắt liên kết α-1,4

glucoside đứng cạnh nhóm COOH

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của Endo Polygalacturonase+ Exo–polygalacturonase(PG-K4): Enzym này chỉ có ái lực mạnh đối với liên kết

glucoside ở cuối mạch của axit pectinic metoxyl (OCH3)

Hình 1.4 Sản phẩm phân cắt của Exo Polygalacturonase

- Transelimilase

Enzym này thủy phân pectin tạo ra mối liên kết kép trong gốc axit galacturonic giữanguyên tử C4-5 Bao gồm 2 nhóm:

- Polymetylgalacturonate lyase (PMGL):

Hình 1.5 Sản phẩm phân cắt của Polymetylgalacturonate lyase

Đối với chủng A niger, dải pH thích hợp cho hoạt tính polygalacturonase nằm trong

khoảng 3,5-5,5 và pH tối ưu là 4,5

Endo polygalacturonase hoạt động trong vùng axit yếu Do đó, khi tăng giá trị pHlên cao hơn 5,5 hoạt độ của enzym sẽ giảm mạnh

Bảng 1.1: Đặc tính của endo polygalacturonase [4]

EPG

Phân tửlượng (kDa) pI

Top(oC) pHop

từ vi sinh vật Đã có nhiều báo cáo được công bố về sinh tổng hợp cảm ứng enzym

pectinase trên các đối tượng như Fusarium oxysporum, Aspergillus japonicus, Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer, Aspergillus awamori, Aspergillus pulverulentus, Penicillium viridicatum, Trichoderma reesei, Sclerotinia sclerotiorum…[55] Một nghiên

cứu của Jamile Zenni và các cộng sự năm 2010 đã thử hoạt tính polygalacturonase trên

107 mẫu vi sinh vật được phân lập từ các nguồn phế thải nông nghiệp và bộ sưu tập visinh vật sẵn có trong phòng thí nghiệm Dựa trên các kết quả thu được qua các bước sànglọc đã cho kết quả 18 chủng sinh polygalacturonase cao Việc xác định hoạt độ enzym

PG thu được đã đưa ra kết luận: Sản xuất PG từ nấm mốc có tiềm năng và hoạt độ cao

hơn từ vi khuẩn Loài Aspergillus niger được cho là chủng khởi đầu cho sự phân hủy

pectin của các loại hạt và ngũ cốc Chúng có thể phát triển ở hàm lượng nước thấp Loài

thứ hai là Pennicillium, phát triển ở hàm lượng nước cao hơn Hai loài này thường có

nhiều ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới[27]

Hầu như tất cả các chế phẩm pectinase thương mại được sản xuất từ nguồn nấm

mốc và A.niger là loài nấm được sử dụng cho sản xuất pectinase công nghiệp

[33,38,54,45,49]

Hiện nay, endo polygalacturonase được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhưsản xuất nước quả, rượu vang, lên men trà và cà phê, sản xuất tinh dầu và trong ngànhcông nghiệp khác như công nghiệp dệt, xử lý nước thải, sản xuất thức ăn chăn nuôi Endopolygalacturonase sử dụng trong công nghiệp chế biến nước táo do enzym này làm giảm

độ nhớt 77% và tăng độ trong dịch quả 84% [60] Ngày nay một sản phẩm thủy phân từenzym là pectic oligosaccharide (POS), được chứng minh có giá trị như là mộtprebiotic[18,22,34 ]

1.2 Đại cương về Aspergillus niger [1]

Hiện nay, A niger được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm và một số ngành kinh tế khác để thu acid hữu cơ và enzyme A niger phân bố rất nhiều trong tự nhiên A niger ở trong đất, xác thực vật, hoa quả và đặc biệt có nhiều ở vùng khí hậu ấm áp.

A niger được nghiên cứu kỹ trong các phòng thí nghiệm và qua các quá trình sản

xuất Chủng này trong quá trình phân hủy các chất glucide và các chất khác có khả năngtích lũy ở môi trường một lượng acid hữu cơ và enzym khá lớn

1.2.1 Đặc điểm hình thái A.niger

A niger phát triển mạnh ở môi trường thạch malt và tạo bào tử dài khoảng 7-10 µm,

trong một số trường hợp có thể dài tới 1mm về chiều dài và có thể hơn 20 µm về đườngkính Trên cuống bào tử có vô số những bào tử, những bào tử này có thể nhìn thấy rõ quakính hiển vi Cuống bào tử có hai phần, phần thứ nhất dài và to, kích thước khác nhau,khoảng 10-20 µm về chiều dài, phần thứ hai ngắn hơn khoảng 2-3 µm có màu nâu nhạthay hoàn toàn đen

Hình 1.8 Cấu tạo A niger [1]

A niger có trụ nấm tách biệt và có hyalin Các bào tử có nguồn gốc xuất phát từ các

tế bào chân đáy trên trụ đỡ và kết thúc bằng một túi nấm ở đầu Túi này là một sự hình

thành đặc trưng cho giống nấm Aspergillus Hình thể và màu sắc của các bào tử nấm khác nhau giữa các loài A.nigercó bào tử màu đen.

Đặc điểm hình thái của A niger được xác định thông qua đặc điểm đại thể và vi thể

Khóm nấm mốc màu đenhoặc nâu đen lấm tấm như

bã cafe

Bông hình cầu có màu đen Bọnghình cầu Thể bình 1 hoặc 2 tầng,

ở đa số loài thể bình 2 tầng Váchcuống conidi trơn Hạt đính hìnhcầu đến gần cầu, có gai rõ

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp polygalacturonase

Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật chịu sự tác động của rất nhiềuyếu tố Các nhà khoa học đã xác định được rằng sự tổng hợp nên endo polygalacturonase,exo polygalacturonase và polymethylgalacturonase thường xảy ra đồng thời với sự sinh

trưởng của A niger Do đó, các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của A niger

tác động tới quá trình sinh tổng hợp enzym

Môi trường dinh dưỡng là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình sinh tổng hợp.Chúng bao gồm nguồn cacbon, nito, phosphor… và các thành phần đó cũng ảnh hưởng

rất lớn đến sự sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và A niger nói riêng Môi trường

dinh dưỡng còn ảnh hưởng đến hoạt độ enzym trong chế phẩm Việc chọn môi trườngđặc hiệu sẽ đảm bảo được sự tổng hợp định hướng enzym Ngoài ra, các yếu tố như nhiệt

độ, pH, cơ chất cảm ứng cũng ảnh hưởng rất lớn đến sự tổng hợp endopolygalacturonase

Ảnh hưởng của nhiệt độ[1,27,38,54]

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật, mỗi vi sinh vật có thểsinh trưởng trong một phạm vi nhiệt độ nhất định Tùy theo quan hệ với vùng nhiệt độ có

thể chia thành 3 nhóm trên cơ sở phạm vi nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất Apergillus niger là

loại nhóm vi sinh vật ưa ấm, nhiệt độ tốt nhất cho nó sinh trưởng và phát triển là 300C

Ảnh hưởng của pH[1,27,38,54]

pH môi trường có ảnh hưởng quyết định tới sự sinh trưởng của nhiều vi sinh vật.Cho nên việc xác định pH thích hợp ban đầu và việc duy trì pH là cần thiết trong suốtthời gian sinh trưởng của tế bào Các giá trị pH cần cho sự sinh trưởng và sinh sản của vi

sinh vật ứng với giá trị pH cần cho sự hoạt động của nhiều enzym A niger sinh trưởng

và phát triển trong môi trường pH từ 3,5- 5,5 Sự sinh trưởng cực đại của A niger và sự

tổng hợp polygalacturonase mạnh nhất diễn ra ở điều kiện nhiệt độ 300C và pH 4,1

Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng và nguồn cac bon

Hệ pectinase một mặt là enzym bản thể,nhưng mặt khác lại là enzym cảm ứng nhưcác enzym thủy phân khác Do đó, một trong các yếu tố quan trọng của sự sinh tổng hợp

EPG là chọn đúng cơ chất đặc hiệu cho A niger.

Pectin được bổ sung vào môi trường sẽ cảm ứng sự tổng hợp EPG Như vậy sự cómặt pectin trong môi trường dinh dưỡng là điều kiện bắt buộc Chất pectin cảm ứng cóthể dùng bột cà rốt, bột linh lăng, bột táo, cam,…

A niger được nuôi cấy trên nguồn các nguồn cacbon như pectin, tinh bột, inulin, tạo

PG cao còn khi môi trường chỉ chứa monosaccharie và glycerin hoàn toàn không thuđược enzym này Bổ sung glucose vào môi trường có lactose và pectin sẽ gây hiện tượng

Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ cũng có vai trò rất quan trọng trong sự sinh tổng hợp PG bởi vi sinh vật

Nguồn nitơ vô cơ chủ yếu ở dưới dạng muối nitrate và muối amon Đối với A niger sử

dụng phosphate amon là hiệu quả hơn cả Khi sử dụng nguồn nitơ này, dịch canh trường

bị acid hóa đến pH 2,5-3,0 Ở pH này có sự tích lũy PG tốt hơn

Tuy nhiên, muối nitrat của kim loại kiềm sẽ ức chế sự tổng hợp PG Khi sinh trưởngtrên môi trường có thêm muối nitrat của kim loại kiềm sẽ làm pH tăng 5,5-5,8 nên khả

năng tiêu thụ nitơ nitrat của A niger sẽ giảm.

Các dạng nitơ hữu cơ (nước chiết từ bột lọc, pepton, cám,…) phối hợp với nguồnnitơ vô cơ có tác dụng tốt đến sự tổng hợp EPG

Muối amon sulphate trong môi trường có ảnh hưởng đến sự tổng hợp PG của A niger trên môi trường có cà rốt 11% Khi thêm từ 1 – 2,5% amon sulphate hoạt độPG của chủng A niger có thể tăng từ 7 – 10%

Tỷ lệ tối thích giữa C và N cho sự tổng hợp enzym nằm trong giới hạn 7:1 đến 13:1

Ảnh hưởng của các yếu tố khác

Ngoài nguồn cacbon, nitơ, các nguyên tố vô cơ có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp

PG bởi A niger mà trước tiên là trạng thái sinh lý của A niger Nói chung hàm lượng

phospho trong môi trường phải không được ít hơn 8 – 10 mg Khi sử dụng nguồn nitơ của

phosphate diamon thì nhu cầu về phospho của A niger hoàn toàn được thỏa mãn.

Môi trường sản xuất PG có tỷ lệ tối ưu giữa nitơ và cacbon, pectin và gluxit bã củcải là 3-4%, bột ngô 0,5%, (NH4)2HPO4 0,7%, MgSO4 0,05%

Khi nuôi A niger trên môi trường có củ cải, cám mỳ, muối vô cơ sẽ tạo ra phức hệ

enzym protease, cellulose, pectinase

1.2.3.Sinh tổng hợp trên môi trường rắn[41,35]

Khả năng sinh tổng hợp polygalacturonase trên môi trường nuôi cấy rắn của các

chủng A niger đã được một số tác giả công bố.Maciel MHC và cs (2011) nuôi trên môi

trường rắn chứa phụ phẩm bã cọ (palm) thu được hoạt độ 66,19 U/g cơ chất sau 4 ngàynuôi[35]; Akhter N và cs (2011), nuôi trên môi trường chứa 9,68% pectin và hàm ẩm

60% thu được 144,42 U/g môi trường nuôi[41].

Trong phương pháp lên men rắn, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường rắn.Các phụ phẩm nông nghiệp được xem là các cơ chất tốt nhất cho quá trình lên men rắn,

do đó phương pháp này thường được sử dụng để sản xuất enzym Một số cơ chất được sửdụng bao gồm bã cam, bã táo, bã cà rốt, bã mía, cám gạo, rơm, trấu,… Phương pháp nàythường thích hợp cho các quá trình nuôi cấy nấm mốc, một số xạ khuẩn và vi khuẩn,…

A niger khi phát triển sẽ lấy những chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng oxy của không khí để hô hấp Đồng thời A niger sau khi cấy sẽ phát triển trên bề mặt và dần dần lan xuống phía dưới theo các kẽ hở giữa các cấu tử thành phần môi trường A niger sử dụng oxy của không khí để hô hấp đồng thời thải khí cacbonic ra môi trường xung quanh và tỏa nhiệt Đặc biệt, khi nuôi A niger trong quá trình sinh trưởng sẽ sinh ra

các khuẩn ty, lên men bề mặt ở trạng thái tĩnh nên sẽ không làm gãy các khuẩn ty này và

không ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym của A niger.

Để đảm bảo cho vi sinh vật phát triển đều trên bề mặt môi trường và sử dụng đượcnhiều chất dinh dưỡng cho việc sản sinh enzym, lớp môi trường rắn phải đủ mỏng, đủxốp, chiều dày chỉ khoảng 2 – 5 cm

Phương pháp lên men rắn có nhiều ưu việt hơn so với phương pháp lên men chìm:

Môi trường lên men rẻ tiền, lượng enzym tạo thành ở môi trường rắn cao hơnnhiều lần so với dịch nuôi cấy theo phương pháp chìm.

Canh trường lên men dễ dàng sấy khô và ít bị tổn hao hoạt tính enzym

Không cần các thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi cấy trên khay và buồng giữ ở nhiệt

độ, độ ẩm thích hợp

Quá trình sản xuất ít tiêu hao năng lượng

1.3 Nguồn cơ chất pectin

1.3.1 Cấu tạo và tính chất của pectin

Pectin là một polysaccharide phức tạp, có cấu trúc rất đa dạng và được cấu tạo từ sựliên kết của các mạch phân tử axit α - D – Galacturonic (C5H9COOH) đã được este hóamột phần hay toàn bộ với metylic (CH3OH) Phân tử pectin cũng có thể được biểu diễndưới dạng một phân tử lớn có cấu trúc mạch thẳng do các axit galacturonic liên kết vớinhau theo liên kết α(1-4) glucoside Ngoài ra, trong phân tử pectin có chứa một số cácgốc đường khác như L-rhamnose, D-galactose, D -xylose, và L-arabinose

Pectin hòa tan trong tự nhiên là este methylic của axit pectic Tuy nhiên, trong thực

tế không phải bao giờ tất cả các nhóm –COOH ở vị trí C6 của axit Galacturonic cũng bịmethyl hóa, mà đôi khi một số nhóm -COOH bị decarboxyl hóa khử (khử CO2), còn một

số nhóm –COOH ở vị trí H lại gắn lên một nguyên tử kim loại, có khi lại ở dạng nguyênthủy COOH

Tùy thuộc nguồn gốc pectin mà mạch axit galacturonic dài hay ngắn và do đó khốilượng phân tử của chúng cũng khác nhau, dao động trong khoảng 20.000 – 200.000 đơn vị.Pectin là thành phần vô cùng phức tạp và gồm có ba loại chính: Homogalacturonan(HGA), Rhamnogalacturonan (RG) I và II Sơ đồ minh họa các cấu trúc của HGA và RG-

I, II được đưa ra trong hình:

Hình 1.9 Cấu tạo củapectic polysaccharideTrong 3 loại pectic polysaccharide trên, homogalacturonan là thành phần chiếm tỷ

lệ lớn và có mặt ở nhiều loại thực vật nên được nghiên cứu sâu và rộng hơn các thànhphần khác

Homogalacturonan: là chuỗi bao gồm các phân tử D-galacturonic acid nối với nhaubằng liên kết α(1 - 4) và thường bao gồm 100-200 gốc galA HGA được tổng hợp trong

bộ máy gongi sau đó được đưa vào thành tế bào, ở đó có khoảng 70-80% các gốc galAđược metyl este hóa ở C-6 cacboxyl Sự dịch chuyển của các nhóm metyl este bên trongthành tế bào dẫn đến kết quả HGA có khả năng liên kết chéo bởi canxi và hình thành cáctập hợp và các gel đại phân tử Các gốc trong HGA có thể O-acetyl hóa chủ yếu ở đầu C-

3 nhưng cũng có thể xảy ra ở C-2.Galactose của HGA có thể được thay thế ở vị trí C-3với các gốc đường xylose tạo thành xylogalacturonan (XGA) có nhiều ở vỏ hạt đậu,pectin táo, dừa và cà rốt

GalA cũng có thể được thay thế bởi apiose ở vị trí C-2 hoặc C-3 tạo ra

apiogalacturonan (trong bèo tấm Lemna minor và Spiodela polyrhise) Các dạng cấu trúc

này có thể làm thay đổi các tính chất chức năng của dạng HGA

Hình 1.10 Công thức của HomogalacturonanRhamnogalacturonan I: cấu tạo từ chuỗi mạch thẳng là sự lặp lại của liên kết giữaaxit galacturonic và rhamnose: αDGalpA(1-2)-αLRHap(1-4) với các mạch bên là cácphân tử đường trung tính như arabinan, galactan và các phân tử axit galacturonic bị acetylhóa hoặc methyl este hóa.

Rhamnogalacturonan II: là thành phần lớn thứ ba và phức tạp nhất của pecticpolysaccharides RG-II được cấu tạo chuỗi mạch thẳng là sự lặp lại của liên kết α(1 -4)DGalpA như Homogalacturonan, nhưng mạch bên chứa rất nhiều phân tử đườngrhamnose và các phân tử khác như: apiose, 2-O-methylxylose, 2-O-methylfucose, 2-keto-3-deoxy-mano-octulosonic (Kdo)

Tỷ lệ các nhóm axit galacturonic được este hóa so với tổng số axit galacturonicđược gọi là mức độ este hóa, ký hiệu là DE (Degree of esterication) Mức độ este hóa ảnhhưởng lớn đến các tính chất của pectin, đặc biệt là tính hòa tan và khả năng tạo gel Khả năng este hóa của pectin chia làm 2 nhóm:

- Pectin este metyl hóa cao: (high metyl este-HM) với số gốc axit của pectin đượcmetyl hóa lớn hơn 50%

- Pectin este metyl hóa thấp: (low metyl este-LM) với số gốc axit của pectin đượcmetyl hóa nhỏ hơn 50%

Khả năng este hóa cao nhất có thể đạt được ở các dịch chiết nguyên liệu thô tựnhiên khoảng 75%

Pectin được ứng dụng rộng rãi thực phẩm, dược phẩm và các ngành công nghiệm.Trong lĩnh vực thực phẩm nó chủ yếu được sử dụng như chất làm đặc, chất tạo gel và chất

ổn định Bên cạnh đó, pectin được sử dụng cùng với dược phẩm để điều trị một số bệnh

như rối loạn tiêu hóa, bệnh tiểu đường, huyết áp cao và cholesterol trong máu cao [7].Cácdẫn xuất pectin cũng được sử dụng trong sản xuất vắc-xin [6].

1.3.2 Nguồn thu pectin

Pectin có nguồn gốc từ thực vật, có nhiều trong vỏ quả táo, cam, chanh, quýt, mận,đào và thân, lá cây, Pectin có mặt trong thành tế bào của tất cả các thực vật bậc cao vàchiếm khoảng 22-35% khối lượng khô của tế bào

Bảng 1.3: Hàm lượng pectin trong các loại trái cây [6]

Trái cây

Hàm lượngpectin (% trọng

Hàm lượngpectin (%trọng lượngtươi)

Táo(Malus spp.) 0,5-1,6 Chanh dây(Passiflora edulis) 0,5

Bã táo 1,5-2,5 Cà chua (Lycopersicon esculentum) 0,2-0,6Bột củ cải

đường(Betavulgaris) 1,0 Chuối(Musa acuminata) 0,7-1,2

Cà rốt(Daucus carota) 0,2-0,5 Khế (Averrhoa carambola) 0,66

Ổi(Psidium guajava) 0,77-0,99 Vỏ trắng chanh dây 2,1-3,0

Bộtchanh(Citrus lemon) 2,5-4,0 Đào (Prunus persica) 0,1-0,9

Vải(Litchi chinesis) 0,42 Dứa(Ananas comosus) 0,04-0,13

Xoài(Mangifera indica) 0,26-0,42 Dâu tây(Fragaria ananassa) 0,6-0,7

Vỏ cam(Citrussinensis) 3,5-5,5 Me(Tamarindus indica) 1,71

Đu đủ(Carcia papaya) 0,66-1,0

1.4 Pectic olygosaccharide (POS)

1.4.1 Cấu tạo pectic oligosaccharide

Pectic oligosaccharide (POS) là hợp chất cacbonhydrat, được cấu tạo từ 2-10 phân

tử D - galacturonic acid nối với nhau bằng liên kết α(1 - 4) glucoside[23]

Hình 1.11: Cấu tạo củaD - galacturonic acid và một pectic oligosaccharide

1.4.2 Tính chất hóa lý của pectic oligosaccharide

POS là những oligosacharide được cấu tạo bởi sự liên kết của một số ít galacturonicacid với phân tử lượng không lớn lắm và chúng có một số tính chất của một axit hữu cơ.Chúng dễ tan trong nước và khi thủy phân bằng axit hoặc enzym sẽ làm đứt các liên kếtglucoside của POS, giải phóng các đơn phân Galacturonic acid và oligosacharide mạchngắn hơn[6]

1.4.3 Phương pháp sản xuất pectic oligosaccharide

Pectic oligosaccharide là một prebiotic có nguồn gốc từ pectin Hiện nay, có một sốphương pháp sản xuất pectic oligosaccharide bao gồm phương pháp hóa học, vật lý vàsinh học (bảng 1.5)

- Phương pháp hóa học: gồm 2 phương pháp

 Tổng hợp hóa học: tiến hành glycosyl các mono và disaccharide thích hợp sauđó thực hiện phản ứng nối các Tri-hexagalacturonates đã được metyl este hóachọn lọc [34]

 Phương pháp xử lý hóa chất: sử dụng axit (hydrochloric acid, acid sulfuric, axittrifloacetic, axit formic hoặc axit nitric) đun nóng từ 50 đến 90°C để phân cắtpectin tạo POS [21]

- Phương pháp vật lý:

Một số tác nhân vật lý được sử dụng như: nhiệt, vi sóng, bức xạ γ và sóng siêu âm[19] Ví dụ, chiếu xạ pectin thu được các mảnh oligosaccharide với hiệu suất cao Tuynhiên, khi chiếu xạ sẽ làm tăng nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng lên đến hơn 100°C, điều

này sẽ làm lượng protein hoặc peptide còn lại trong mẫu có thể gây ra phản ứng Maillard,

do đó, có thể hình thành các phân tử không mong muốn và độc hại [21]

- Phương pháp sinh học:

Pectic có thể được phân cắt thành các mảnh pectic oligosaccharide nhờendopolygalacturonase [29] Do enzym hoạt động trong điều kiện êm dịu, thân thiện với môitrường, cường lực xúc tác của enzym mạnh,… và giới hạn phản ứng phụ (như caramen)nên phương pháp thủy phân giới hạn pectic bằng enzym là phương pháp đơn giản, hiệuquả và khắc phục được nhược điểm của phương pháp vật lý và hóa học

Bảng 1.4: Sản xuất POS theo phương pháp khác nhau từ các nguồn pectin

4 Táo Kết hợp PG 162 U/l và PE 27 U/l, pH

4,5; 40oC,12 giờ

M.V Nikolic và cs 2007

2009

6 Cam EPG 79,57 U/g, pH 5,5; 40oC, 2 giờ A.M.M Combo và cs

2012

1.4.4 Hoạt tính sinh học của pectic oligosaccharide

Một số nghiên cứu về hoạt tính prebiotic của pectic oligosaccharide cho thấy POScó tính chất của một prebiotic như được lên men chọn lọc bởi vi sinh vật có lợi đườngruột và sản phẩm của sự lên men này có ảnh hưởng tích cực đối với sức khỏe của vật chủ

Năm 2002, E Olano-Martin và cộng sự đã khẳng định POS có khả năng kích thích

sự tăng sinh của vi khuẩn Bifidobacterium lactis, B infantis, B pseudolongum, B adolescentis, Lactobacillus casei shirota, L.acidophilus, L casei subsp cremoiris LC5, làm giảm sự phát triển của vi khuẩn Bacteroides distasonis,Bacteroides ovatus, Bacteroides fragilis, Clostridium perfringens, Enterococcus faecalis và ức chế sự sinh trưởng của Bifidobacterium bifidum Bb12, L pentosus, L plantarum 0207, Bacteroides thetaiotaomincrom, Clostridium ramosum, Clostridium inocuum [46] Người ta cũng đã

chứng minh được POS có khả năng chống ung thư ruột kết, kháng khuẩn, ức chế lipidhấp thụ trong gan, ức chế sự bám dính của vi khuẩn vào các tế bào biểu mô và kích thích

sự tăng trưởng của Bifidobacteria, Eubacterium trực tràng [36],…

Thử nghiệm bổ sung 15-25% POS vào sữa của trẻ sơ sinh cho thấy POS giúp trẻtiêu hóa tốt hơn, hệ vi sinh đường ruột thay đổi và hạ thấp pH phân Vì vậy, POS có thể

sử dụng để bổ sung vào các sản phẩm sữa cũng như các loại sản phẩm thực phẩm khác[57]

Một số nghiên cứu ảnh hưởng của POS in vivo và in vitro khác cũng đã được tiếnhành Kết quả cho thấy POS có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất, tăng trưởng của vikhuẩn trong ruột kết, giảm nguy cơ ung thư, điều hòa hệ thống miễn dịch và giảmcholesterol [8] Vì vậy, POS có thể ức chế sự bám dính của vi khuẩn với các tế bào biểu

mô, do đó, POS được sử dụng như chất hỗ trợ điều trị Ví dụ, axit digalacturonic ngăn

ngừa sự bám dính của các tế bào vi khuẩn Escherichia coli in vitro [8].

Olano Martin và cộng sự cũng cho thấy rằng POS có vai trò bảo vệ bằng cách ức

chế độc tố Shiga tiết ra bởi Escherichia coli O157: H7 Ngoài ra, một số tác dụng chống

ung thư đã được báo cáo POS có khả năng thúc đẩy quá trình apoptosis của các tế bàoung thư tuyến HT-29 Các kiểm tra trên dòng tế bào dòng tủy và các tế bào ung thư tuyếntiền liệt cũng cho thấy tác dụng này [46]

1.5. Cải biến chủng bằng phương pháp đột biến

Hiện nay có nhiều phương pháp nâng cao khả năng tổng hợp enzym của chủng visinhvật bao gồm các kỹ thuật tái tổ hợp DNA, khuếch đại biểu hiện thông qua tăng tần số

bản sao gen, khuếch đại biểu hiện bằng cách sử dụng promoter mạnh…Đối với chủng

A.niger, đột biến được sử dụng như một phương pháp thông dụng nhằm nâng cao khả

năng tổng hợp enzym

1.5.1 Giới thiệu chung về phương pháp đột biến [2]

Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền ở cấp độ phân tử(DNA) dẫn đến sự biến đổi đột ngột của một hoặc một số tính trạng

Có thể chia đột biến thành các dạng: đột biến điểm và đột biến đoạn

Đột biến điểm thường gặp:

- Mất, thêm một cặp nucleotide

- Thêm một cặp nucleotide

- Thay thế một cặp nucleotide

- Đảo vị trí cặp nucleotide

Các dạng đột biến này làm thay đổi trình tự axit amin hoặc làm đọc sai mã di truyền

kể từ vị trí xảy ra đột biến làm thay đổi chức năng của protein

 Đột biến nhiễm sắc thể

Tương tự đối với đột biến đoạn, đột biến nhiễm sắc thể(NST) là sự biến đổi về cấutrúc, hình thái hoặc số lượng NST Đột biến có thể xảy ra ở một cặp NST nào đó hoặc ởtoàn bộ các cặp NST Loại đột biến này phát sinh có thể là do các tác nhân mạnh trongngoại cảnh (tia phóng xạ, hóa chất, sự biến đổi đột ngột của nhiệt độ) hoặc những rối loạntrong quá trình trao đổi chất nội bào, dẫn đến sự phân li không bình thường của các cặpNST Các dạng đột biến thường gặp:

 Đột biến số lượng nhiễm sắc thể

Sự biến đổi số lượng NST có thể xảy ra ở một hay một cặp NST tạo nên thể dị bộihay xảy ra trên toàn bộ các cặp NST hình thành thể đa bội

 Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể

Là những biến đổi bất thường về cấu trúc, hình thái hay số lượng NST Đột biến cấutrúc NST có các dạng: mất đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn Nguyên nhân chủ yếu

là do tác nhân ngoại cảnh hay trong tế bào Có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học.Các thể mất đoạn, thêm đoạn làm thay đổi chất liệu di truyền, thường gây tác hạicho cơ thể, nhất là cơ thể người Các thể đảo đoạn, chuyển đoạn không làm thay đổi chấtliệu di truyền, thường không ảnh hưởng đến kiểu hình

b, Các phương pháp gây đột biến[2]

Các tác nhân làm tăng tần số đột biến cao hơn mức tự nhiên được gọi là các tácnhân gây đột biến Các tác nhân vật lý như tia phóng xạ, tia X, tia tử ngoại gây đột biến.Nhiều hóa chất là tác nhân gây đột biến như đồng đẳng của các benzơnitric, HNO2, cácchất alxyl hóa mạch,… Các đột biến này được gọi là các đột biến nhân tạo hay đột biếncảm ứng Đối với các vi sinh vật, các tác nhân gây đột biến chủ yếu là tia tử ngoại và một

số hóa chất

 Phương pháp gây đột biến bằng các tác nhân vật lý:

Tia X, tia phóng xạ α, β,… các chùm tia nơtron hoặc proton, tia tử ngoại đều là cáctác nhân gây đột biến Trừ tia tử ngoại có khả năng xuyên thấu yếu nên chỉ tác động lêncác sinh vật đơn bào, các giao tử, các tia khác có tác dụng đột biến lên tất cả các dạng visinh vật

Tác dụng đột biến của các tia phóng xạ có hai đặc điểm:

 Không ngưỡng tác dụng tức thì, không có liều lượng vô hại

 Số lượng đột biến tỷ lệ với liều lượng chiếu xạ

Phóng xạ ion hóa: các tia phóng xạ như: α, β, γ, χ, các chùm tia neutron hoặcprotonlàm bắn các điện tử gây ion hóa và biến đổi DNA

Phóng xạ không ion hóa: tia tử ngoại UV hoặc nhiệt làm tăng mức năng lượngnguyên tử Trong tế bào, các chất hữu cơ có vòng chủ yếu như purin và pirimidine hấpthu trực tiếp tia tử ngoại

Tia UV là một trong số các tác nhân vật lý gây đột biến đã và đang được ứng dụngrộng rãi nhất hiện nay Tia UV có bước sóng ngắn nên khó tạo ion, nó chỉ tác động lênnhững chất trực tiếp hấp thụ nó

Trong tế bào, DNA là thành phần mẫn cảm nhất với tia UV DNA hấp thụ tia UVmạnh nhất ở bước sóng 2537A0

Dưới tác dụng của tia UV, cytosin đã gắn thêm phân tử nước vào liên kết C=C củamạch vòng và thymine bị đứt liên kết C = C mạch vòng nối 2 phân tử thành thyminedimer Đó chính là nguyên nhân gây ra những sai sót trong quá trình nhân đôi của DNA

và trên sợi DNA có những tổn thương cục bộ

Tác dụng của tia UV không thể hiện bằng mối quan hệ tuyến tính mà bằng mốitương quan hàm số mũ giữa hiệu quả và liều lượng Ở những liều chiếu xạ thấp, tác dụngđột biến không tăng, khi tăng liều chiếu lên thì tần số đột biến tăng vọt và đạt tới mức cựcđại.Khi tần số đột biến đạt đến mức cực đại thì dù có nâng liều chiếu lên lần nữa thì tần

số đột biến cũng không thay đổi

Sở dĩ có mỗi quan hệ không tuyến tính giữa tần số đột biến và liều lượng chiếu xạ

là do tia UV cùng 1 lúc gây nên những hiệu quả khác nhau trong tế bào, có thể làm tổnthương DNA, ngăn cản sự tổng hợp DNA và ức chế quá trình tổng hợp protein Đâychính là nguyên nhân gây chết tế bào Nếu tác dụng của tia UV lên tế bào chỉ gây lênnhững tổn thương không quá lớn trong phân tử DNA thì sẽ gây ra đột biến

Hiệu quả gây đột biến chịu tác động của ít nhất 3 yếu tổ cơ bản như: Thời gianchiếu xạ, lần sao chép tiếp theo của DNA, mức độ tổn thương của DNA và hoạt tính củaenzym sửa chữa trong tế bào nấm.

c, Cơ chế sửa sai

 Sửa chữa bằng quang phục hoạt

Quang phục hoạt là quá trình loại bỏ các dimer pyrimidin do tia tử ngoại trực tiếpgây nên, nhờ tác động của ánh sáng Sau khi chiếu xạ vi sinh vật bằng tia UV, nếu đưa raánh sáng thì phần lớn sai hỏng được phục hồi

Dưới tác dụng của ánh sáng chiếu vào, tế bào tạo ra photolyase, enzym này đượchoạt hóa nhờ photon ánh sáng có bước sóng 320-370nm Sau đó, dưới tác dụng đơn phânhóa các pyrimidin làm cho cấu trúc của phân tử DNA được phục hồi trở lại

 Sửa chữa bằng cắt bỏ

Kiểu sửa chữa này liên quan đến sự cắt bỏ những dimer trên DNA, gồm nhiều giaiđoạn và có sự tham gia của nhiều loại enzym

 Sửa chữa sau tái bản

Sự tổng hợp sửa chữa DNA xảy ra nhờ tái tổ hợp là cơ chế tránh dùng sợi mang saihỏng (dimer) làm khuôn (nên còn gọi là sửa chữa nhờ tái tổ hợp)

1.5.2 Một số nghiên cứu về đột biến cải tạo chủng

Antier và cs đã tiến hành đột biến Aspergillus niger bằng UV để thu được

pectinase có kiểu hình kháng deoxyglucose [50] Sử dụng môi trường có nồng độethylene glycol khác nhau, độ ẩm thấp, giúp phân lập được các thể đột biến có khả năngsản xuất pectinase trên các môi trường như vỏ cà phê [49] Loera và Viniegra - González

sử dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh để đánh giá sự phát triển của sợi nấm để thu đượccác thể đột biến liên quan đến tốc độ tăng trưởng và khả năng tổng hợp pectinase [45]

Loera và cs nhận thấy một số thể A niger đột biến qua sinh sản hữu tính có khả năng sinh

tổng hợp pectinase tăng gấp đôi so với các chủng cha mẹ Vì vậy, chọn lọc các thể độtbiến kháng deoxyglucose và tái tổ hợp qua sinh sản hữu tính, cùng với phân tích hình ảnh

các khuẩn lạc, là một phương pháp hiệu quả để tăng cường khả năng sản xuất pectinase[45].

Nghiên cứu đột biến A niger có khả năng sản xuất pectinase cao và sử dụng hiệu

quả phế phẩm nông nghiệp là hướng nghiên cứu được rất nhiều nhà khoa học quan tâm

Uzoma đã tiến hành đột biến chủng A niger bằng UV và chọn lọc trên môi trường chứa 2

deoxy D glucose đã thu được chủng có khả năng tổng hợp pectinase cao nhất trong môitrường cám lúa mì (348,54 IU/mg protein) Chủng đột biến này có khả năng sản xuấtpectinase cao hơn chủng cha mẹ trong cả phương thức lên men rắn (SSF) và chìm (SMF)tương ứng 465% và 230% [44] Cải thiện di truyền để nâng cao khả năng sản xuấtpectinase bằng các kỹ thuật đột biến và dung hợp tế bào trần cũng đã được thực hiệnthành công Cao và cs đã dùng giá trị P/C (tỷ lệ đường kính của vòng thủy phân [P] vớiđường kính của khuẩn lạc [C]) trên đĩa pettri để xác định các thể đột biến siêu tổng hợppectinase Tác giả sử dụng rifampin để cô lập các đột biến tự phát của alkalophilic

Bacillus sp NTT33 và thu được hai thể đột biến có khả năng tổng hợp polygalacturonase

cao hơn chủng tự nhiên 82,4% [28]

Hadj – Taieb và cs thực hiện đột biến Penicillium occitanis bằng axit nitoric, thu

được chủng có khả năng sản xuất endopolygalacturonase và exopolygalacturonasecaohơn 15 lần Cũng trên chủng này Jain và cs đã tiến hành đột biến với N-methyl- N -nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), ethyl methane sulphonate và UV đã thu được các chủngcó khả năng tổng hợp cellulose và pectinase cao hơn chủng gốc [51]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Chủng vi sinh vật

- Các chủng nấm mốc phân lập và tuyển chọn được có trong luận văn bao gồm:+ 30 chủng phân lập từ các mẫu vỏ quả cam, bưởi, cà rốt, chanh dây, bã cà phêmua từ một số chợ ở Hà Nội;

+ 4 chủng A niger từ các bộ sưu tập giống của Viện Cơ điện nông nghiệp và

Công nghệ sau thu hoạch, Viện CNSH-CNTP, Đại học Bách Khoa Hà Nội, Viện Côngnghệ sinh học Lâm nghiệp (CĐN4, PDG,BK01, LN);

+ 26 chủng từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp thực phẩm cung cấp (kíhiệu: CNTP 5002 – 5055)

- Môi trường sinh tổng hợp polygalacturonase rắn:

Tỉ lệ cám : trấu = 7: 2, pectin 12%, độ ẩm 60%, có bổ sung khoáng với thành phần(g/l): ure 3,0; (NH4)2SO4 12,6; KH2PO4 6,5; FeSO4 0,29; pH 5,0-5,5[22]

2.1.3 Hóa chất và enzym

Các hóa chất và enzym được cung cấp bởi các hãng uy tín trên thế giới B ảng 2.1thống kê những hóa chất sử dụng chính Các dung dịch cần thiết được pha theo đúng cáchthức mà mỗi phương pháp yêu cầu từ các hóa chất tinh khiết này.

Eppendorf AG, Đức Máy ly tâm nhỏ Minispin plus

Mettle Toledo, Thụy Sỹ Máy đo pH, Cân điện tử

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

A PHƯƠNG PHÁP VI SINH

2.2.1 Phân lập chủng theo khả năng phân hủy cơ chất pectin trên đĩa thạch

 Lấy mẫu

Các mẫu quả hỏng như cam, bưởi, táo, cà rốt, chanh dây,… được thu thập từ chợ ở

Hà Nội Các mẫu được đựng trong túi đã được vô khuẩn để tránh nhiễm tạp

 Phân lập:

Cân 1g mẫu (phần bị hỏng do nấm mốc), nghiền với 1ml nước cất vô trùng, phaloãng và trang 0,1ml trên đĩa chứa môi trường Czapeck Nuôi ở nhiệt độ 300C sau 3 ngày,cấy chuyển các khuẩn lạc riêng rẽ khác nhau về hình thái sang các đĩa Czapeck khác, quátrình này được lặp lại cho đến khi khuẩn lạc thuần nhất

 Sàng lọc chủng sinh pectinase bằng kĩ thuật bán kính vòng thủy phân

Nấm sợi được nuôi trên môi trường lỏng Czapeck-pectin, ở 300C, sau 3 ngày ly tâmloại sinh khối, thu dịch enzym ngoại bào Lấy 0,1 ml dịch enzym ngoại bào tra vào lỗtrên đĩa thạch chứa 2% pectin Để đĩa ở 500C sau 5 giờ, cho lugol vào đĩa, nhuộm trong 5phút, đổ bỏ lugol và rửa bằng dung dịch NaCl 1% Đo đường kính vòng thủy phân pectin.Chọn những chủng có giá trị D-d cao

 Sàng lọc chủng sinh tổng hợp polygalacturonase trên môi trường cám-trấu

Hoạt hóa chủng : A nigerđược hoạt hóa trên môi trường Czapeck, nuôi ở 30oC,trong 72 giờ

Sinh tổng hợp Endo polygalacturonase trong môi trường cám-trấu (tỷ lệ 7:2), pectin10%, giống cấp là 2.106 bào tử/g, nuôi ở 300C trong thời gian 3 ngày

Chiết enzym từ sinh khối bằng đệm citrat phosphate, pH 4 tỷ lệ 5:1 (v/w) Xác địnhhoạt độ polygalacturonase của dịch chiết Chọn những chủng cho giá trị hoạt độpolygalacturonase cao

 Chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp endo polygalacturonase

Khả năng sinh tổng hợp endo polygalacturonase dịch chiết enzym ngoại bào củacác chủng nuôi trên môi trường cám- trấu được xác định thông qua sự giảm độ nhớt dịchpectin Những chủng có khả năng làm giảm độ nhớt của dịch pectin cao được lựa chọn.

2.2.2 Sàng lọc chủng dựa trên hình thái[7]

Dùng que cấy nhọn đầu lấy một ít bào tử cấy 3 điểm cách đều nhau trên đĩa thạchCzapeck Nuôi ở 300C trong 3-5 ngày Không lật ngược các đĩa Nhận xét về kích thước,màu sắc, hình thái,… của khuẩn lạc Làm các tiêu bản nấm sợi, quan sát hình thái họcdưới kính hiển vi ở vật kính 10

2.2.3 Đếm số lượng bào tử trực tiếp dưới kính hiển vi sử dụng buồng đếm hồng cầu

Lắc đều dịch tế bào nấm mốc và dùng micropipette cho 1 giọt huyền phù bào tử có

độ pha loãng thích hợp lên phần chia ô của buồng đếm (có kích thước 0,1mmx1/400mm2)khe ở mép buồng đếm, tránh tạo bọt khí Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơchế mao dẫn Đậy lá kính lên trên, đưa buồng đếm lên kính hiển vi và để yên trong vàiphút Chỉnh kính hiển vi với vật kính x40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm Chỉnhsao cho một vùng chứa trọn một ô lớn (4 x 4 = 16 ô nhỏ) Đếm số tế bào trong 5 ô vuônglớn đại điện cho 25 ô vuông lớn trong ô trung tâm Số lượng tế bào trong 1ml mẫunghiên cứu được tính bằng công thức:

N = [(a/b) x 400/0.1] x 103 x n

Trong đó:

N: số lượng tế bào trong 1ml mẫu nghiên cứu

a: số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ)

b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn

400: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm

0.1: Chiều cao của ô nhỏ

103: hằng số chuyển đổi mm3 thành ml

n: độ pha loãng mẫu

2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp

Polygalacturonase của A niger lựa chọn

Hoạt hoá chủng: chủng nghiên cứu được hoạt hoá trên môi trường Czapeck ở 30oCtrong hộp petri, sau 72 giờ nuôi thu bào tử trong khoảng 40ml nước (107 bào tử/ml) dùnglàm giống cho nghiên cứu sinh tổng hợp enzym.

Sinh tổng hợp enzym: thí nghiệm xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy

đến quá trình sinh tổng hợp Endo polygalacturonase của chủng nghiên cứu được tiếnhành trong bình tam giác 250 ml chứa 10g môi trường cám-trấu với 2ml giống hoạt hoá.Ảnh hưởng của hàm lượng pectin được tiến hành với hàm lượng 8, 10,12, 14 % Ảnhhưởng của nhiệt độ được khảo sát ở các mốc nhiệt 25, 30, 35, 40oC Ảnh hưởng của hàm

ẩm được khảo sát ở các mức 50, 60, 70 và 80% Sau các khoảng thời gian nuôi nhất định,sinh khối được chiết bằng 100ml đệm citrat pH4, lọc và thu dịch chiết đi xác định hoạt độenzym Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần

B PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ – SINH

2.2.5 Định lượng đường khử tổng số theo phương pháp DNS [15]

Đường khử được xác định theo phương pháp của Miller [15] Bổ sung 5 ml thuốcthử DNS (5,3 g DNS, 9,9 g NaOH, 153 g K-Na-tartrat, 4,15 g sodium-metabisulphate,

708 ml nước cất) vào 1 ml mẫu đường, đun sôi trong 10 phút, làm lạnh nhanh, đo độ hấpthụ ở bước sóng 575 nm, dựa vào đồ thị đường chuẩn Galacturonic acid suy ra hàm lượng(oligo) galacturonic acid có trong mẫu

x = y  b a (mg/ml)

Trong đó: x là hàm lượng galacturonic acid có trong mẫu (mg/ml),

y: giá trị mật độ quang (OD)