Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase, nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và một số đặc tính của laccase

Phổ ứng dụng của laccase được mở rộng bằng việc kết hợp laccase với các chất trung gian mediator làm chúng có khả năng oxy hóa những hợp chất không có bản chất phenol non-phenol.. Ngoài

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

MỤC LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC CÁC BẢNG 5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 6

MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Laccase 9

1.2 Các nguồn thu laccase (EC 1.10.3.2) 9

1.2.1 Laccase vi sinh vật 9

1.2.2 Laccase từ thực vật 10

1.3 Cấu tạo của laccase 11

1.3.1 Khối lượng phân tử 11

1.3.2 Cấu trúc không gian 12

1.4 Đặc tính của laccase 14

1.4.1 Các chất ức chế hoạt tính laccase 14

1.4.2 Tính đặc hiệu cơ chất 15

1.4.3 Nhiệt độ và pH tối ưu 15

1.4.4 Điểm đẳng điện (pI) 16

1.4.5 Km và Vmax 16

1.4.6 Các isozym 19

1.5 Cơ chế xúc tác của laccase 20

1.6 Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến khả năng sinh tổng hợp laccase 23 1.6.1 Nguồn cacbon 23

1.6.2 Nguồn nitơ 24

1.6.3 Nguồn khoáng 24

1.6.4 Chất cảm ứng 26

1.6.5 Chất kìm hãm 27

1.6.6 Nhiệt độ 27

1.6.7 pH 28

1.7 Ứng dụng của laccase 28

1.7.1 Ứng dụng của laccase trong chất tẩy trắng sinh học 28

1.7.2 Ứng dụng của laccase trong việc làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường bằng phương pháp sinh học 30

1.7.3 Ứng dụng tạo nguồn nguyên liệu mới 32

1.7.4 Những ứng dụng trong một số lĩnh vực khác 33

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 34

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34

2.1.2 Hóa chất 34

2.1.3 Thiết bị sử dụng 34

2.1.4 Môi trường 35

2.2 Phương pháp 36

2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 36

2.2.2 Phương pháp hóa sinh – phương pháp xác định hoạt tính laccase38 2.2.3 Phương pháp định tên nấm mốc 38

2.2.4 Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính laccase 45

3.1.1 Phân lập các chủng nấm mốc bằng phương pháp tách khuẩn lạc 45 3.1.2 Tuyển chọn các chủng nấm có hoạt tính laccase bằng phương pháp sàng lọc trên đĩa thạch 45

3.1.3 Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính laccase bằng phương pháp nuôi cấy chìm 50

3.2 Định tên chủng BB19_3 52

3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp laccase 55

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống 55

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon 56

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose 57

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ 58

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nitơ 59

3.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của chất cảm ứng 59

3.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng 60

3.3.8 Khảo sát ảnh hưởng của CuSO4 61

3.3.9 Khảo sát ảnh hưởng của pH đầu 62

3.3.10 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi 63

3.4 Tối ưu hoá môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp laccase từ BB19_3 64

3.5 Khảo sát động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp laccase từ chủng BB19_3 trên môi trường nuôi cấy với điều kiện tối ưu 68

3.6 Khảo sát nồng độ (NH4)2SO4, ethanol kết tủa laccase 70

3.7 Xác định một số đặc tính của laccase từ BB19_3 72

3.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính laccase 72

3.7.2 Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính laccase 73

3.7.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tính bền của laccase 74

3.7.4 Ảnh hưởng của pH tới tính bền của laccase 75

KẾT LUẬN 76

KIẾN NGHỊ 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

PHỤ LỤC 83

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABTS 2,2’-azino-bis (3-etylthiazolin-6 sunfonat)

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid

ITS Internal transcribed spacer

Bảng 2.2 Ma trận giả định thực hiện tối ưu

Bảng 3.1 Số lượng các mẫu và chủng nấm mốc thu được từ quá trình phân lập

Bảng 3.2 Kết quả sàng lọc các chủng nấm mốc phân lập được trên các môi trường khác nhau

Bảng 3.3 Số lượng các chủng có hoạt tính laccase qua các bước sàng lọc

Bảng 3.4 Hoạt độ laccase của các chủng nấm mốc phân lập được

Bảng 3.5 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp laccase ngoại bào của các chủng nấm mốc

Bảng 3.6 Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp laccase

Bảng 3.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sự sinh tổng hợp laccase

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ nguồn nitơ đến khả sự tổng hợp laccase Bảng 3.9 Ảnh hưởng của các chất cảm ứng khác nhau đến sự sinh tổng hợp laccase

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng sinh tổng hợp laccase

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến khả năng sinh tổng hợp laccase Bảng 3.12 Các mức thí nghiệm

Bảng 3.13 Ma trận thực nghiệm và kết quả

Bảng 3.14 Kiểm tra sự tương ứng của mô hình theo tiêu chuẩn Fisher

Bảng 3.15 Ma trận điều kiện tối ưu

Bảng 3.16 Khảo sát nồng độ muối (NH4)2SO4 thích hợp thu chế phẩm laccase Bảng 3.17 Khảo sát nồng độ ethanol thích hợp thu chế phẩm laccase

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Chu trình xúc tác của laccase

Hình 1.2 Cấu trúc bậc ba của laccase từ Melanocarpus albomyces

Hình 1.3 Cơ chế oxy hóa các tiểu phần phenol của lignin bởi laccase

Hình 1.4 Cơ chế oxy hóa các tiểu phần không có bản chất phenol phenolic) của lignin bởi laccase và ABTS

(non-Hình 1.5 Mô hình oxy hóa trung gian các cơ chất của laccase

Hình 3.1 Kết quả sàng lọc trên môi trường MEA có sử dụng axit tanic làm chất chỉ thị

Hình 3.2 Kết quả sàng lọc trên môi trường RBBR của chủng BB13_2

Hình 3.3 Kết quả sàng lọc lần 2 với cơ chất đặc hiệu là Syringaldazine và ABTS

Hình 3.4 Kết quả chạy điện di kiểm tra sản phẩm DNA sau tinh sạch

Hình 3.5 Đặc điểm hình thái hệ sợi của BB19_3 dưới kính hiển vi điện tử (độ phóng đại 400 lần)

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp laccase

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến khả năng tổng hợp laccase

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng veratryl alcohol tới sự sinh tổng hợp laccase

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 đến khả năng sinh tổng hợp laccase Hình 3.10 Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp laccase của chủng BB19_3

Hình 3.11 So sánh các tác nhân kết tủa laccase

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính laccase

Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính laccase

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tính bền của laccase

Hình 3.15 Ảnh hưởng của pH tới tính bền laccase

MỞ ĐẦU

Laccase (EC 1.10.3.2) là một polyphenol oxidase chứa nguyên tử đồng trong trung tâm xúc tác và thường được gọi là polyphenol oxydase đa đồng Laccase có khả năng xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất phenol thành các gốc quinin và sau đó oxy hóa chúng thành quinon Phản ứng oxy hóa gắn liền với sự khử phân tử oxy tạo thành nước Khả năng oxy hóa hợp chất phenol của laccase đánh dấu bước phát triển của ngành công nghệ enzym [38, 40] Trong tự nhiên, laccase thu được từ nhiều nguồn khác nhau như từ vi khuẩn, nấm mốc, thực vật và các loại côn trùng, nhưng laccase được phân bố

chủ yếu ở thực vật bậc cao và nấm mốc như Trametes versicolor, Coprinus

cinereus, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarinus [31]

Laccase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp bao gồm tẩy trắng giấy, tẩy màu của thuốc nhuộm vải và loại bỏ hợp chất phenol trong rượu [36] Phổ ứng dụng của laccase được mở rộng bằng việc kết hợp laccase với các chất trung gian (mediator) làm chúng có khả năng oxy hóa những hợp chất không có bản chất phenol (non-phenol) Ngoài ra, laccase còn có một số ứng dụng khác trong việc phát hiện và loại bỏ các hợp chất phenol gây ô nhiễm môi trường, ứng dụng trong việc xử lý phụ phẩm của sản phẩm nông nghiệp để tạo nguyên liệu cho các quá trình khác

Laccase có rất nhiều ứng dụng nên vấn đề đặt ra là cần phải tìm được các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp laccase cao, góp phần làm giảm giá thành trong các quá trình sản xuất liên quan đến laccase Vì vậy,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc

có khả năng sinh tổng hợp laccase, Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và một

số đặc tính của laccase”

Nội dung của đề tài :

- Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính laccase cao

- Tìm điều kiện thích hợp cho nấm mốc sinh tổng hợp laccase

- Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

- Khảo sát động thái quá trình lên men sinh tổng hợp laccase

- Khảo sát khả năng kết tủa và nghiên cứu một số đặc tính laccase

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Laccase

Laccase (EC 1.10.3.2) là enzym chứa một hoặc nhiều nguyên tử đồng

có khả năng xúc tác các phản ứng oxy hóa các hợp chất phenol thành quinin

và sau đó oxy hóa tiếp thành quinon (Gimbert) Laccase xúc tác trong phản ứng oxy hóa với thế oxy hóa khử có thể lên tới 0,8V Số lượng đồng trong laccase biến động từ hai đến bốn nguyên tử tùy thuộc vào từng loại laccase Tất cả laccase từ thực vật, vi sinh vật đều là glycoprotein (với mức độ glycosyl hóa từ 22%- 45%) và có bốn nguyên tử đồng trong mỗi phân tử [25] Laccase từ những nguồn khác nhau thì rất khác nhau ở mức độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử và đặc tính động học [41]

1.2 Các nguồn thu laccase (EC 1.10.3.2)

Laccase là một trong số ít những enzym được biết đến từ thế kỷ XIX Năm 1883, Yoshida (Nhật) lần đầu tiên phát hiện laccase khi ông chiết nó từ

dịch chiết của cây gỗ lacquer Rhus vernicifera và năm 1896 laccase đã được

Bertrand và Laborde tìm thấy từ nấm mốc [27, 38]

Phần lớn các nguồn thu laccase đều có trong các chủng nấm mốc có khả năng phân hủy lignin, được biết đến nhiều nhất là trong các loài nấm đảm

Ngoài ra, trong thực vật như là Rhus vernicifera cũng có khả năng sinh ra

laccase Ở một số loài vi khuẩn cũng có hoạt tính laccase [19]

1.2.1 Laccase vi sinh vật

* Laccase từ nấm mốc:

Laccase được phân lập từ Ascomyceteous, Deuteromycetous, và nấm Basidiomeeteous nhưng các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào Basidiomeeteous [7]

Hoạt tính của laccase thể hiện ở sự phân hủy lignin và chúng được tìm thấy nhiều trong các chủng nấm đặc biệt là nấm mục trắng có khả năng phân hủy lignin cao [24] Đã có hơn 100 loại laccase được tinh chế từ nấm mốc và xác định được các đặc tính xúc tác và các đặc tính sinh hóa đặc hiệu của chúng Các chủng nấm mốc có khả năng sinh laccase tốt nhất được biết đến

như là Botrytis cinerea, Pleurotus ostreatus, Pycnoporus cinnabarinus

Trametes versicolor, Coprinus cinereus và Melanocarpus albomyces.Vai trò của laccase từ nấm mốc ngoài khả năng phân giải lignin, còn có một số chức năng liên quan đến sự hình thành sắc tố, sự hình thành bào tử, tính gây bệnh

và sự giải độc [28]

Laccase có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển quả thể của nấm Năm 1999, Gianfreda cho rằng hoạt tính của laccase tăng trong suốt quá trình hình thành quả thể Đồng thời, laccase cũng xuất hiện trong quá trình

phát triển sợi nấm của Amillaria mellea, khi bổ sung chất ức chế laccase thì quá trình phát triển của Amillaria mellea bị giảm hẳn [19]

Laccase thực vật đầu tiên được tìm thấy từ Rhus vernicifera Sau đó,

laccase được thu nhận từ bắp cải, củ cải, củ cải đường, táo, măng tây, khoai tây, quả lê và các loại rau quả khác [27]

Laccase thực vật đóng vai trò trong sự hình thành thân gỗ Ngoài ra nó còn có vai trò polyme hóa các monolignol hình thành các dimer và trimer trong quá trình lignin hóa (Bertrand và cộng sự, 2002) Vai trò này của

laccase cũng được Mayer và Staples năm 2002 đề cập đến trong

Anacardiaceae [10]

1.3 Cấu tạo của laccase

1.3.1 Khối lượng phân tử

Laccase có khối lượng phân tử (MW) từ 60 kDa đến 80 kDa, tuy nhiên

vẫn có một vài ngoại lệ như laccase từ Monocillium indicum có khối lượng phân tử là 100 kDa, từ Agaricus bisporus là 100 kDa và từ Aspergillus

nidulans có khối lượng phân tử là 110 kDa [37]

Có nhiều công bố chỉ ra rằng mỗi loài nấm mốc riêng biệt có thể cho nhiều loại isozym (bảng 1.1) Sự thay đổi điều kiện trong quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp laccase có thể cho những isozym khác nhau của cùng một chủng nấm mốc [11 ,16]

Bảng 1.1 Khối lượng phân tử và số lượng isozym laccase từ một số

chủng nấm mốc [31]

Chủng

Số lượng isozym

Khối lượng phân tử (Kda)

Tài liệu tham khảo

Podospora anserina 3 70/80/390 Thurston, 1994

Neurospora crassa 1 65 Germann và cộng sự, 1988

Agaricus bisporus 2 65/100 Perry và cộng sự, 1993

Botrytis cinerea 2 72 Thurston, 1994

Phlebia radiata 1 64 Saloheimo và cộng sự, 1991

Armillaria mellea 1 80 Curir và cộng sự, 1997

Monocillium indicum 1 72 Thakker và cộng sự, 1992

Pleurotus ostreatus 3 54/59/57 Palmieri và cộng sự, 1997;

Phanerochaete

flavido-albans

1 94 Perez và cộng sự, 1996

Rhizoctonia solani 4 50-100 Wahleitner và cộng sự, 1996

Pleurotus ostreatus 2 67/16-17 Giardina P và cộng sự, 2007

Pleurotus ostreatus 4 80-82 Mariana Mansur và cộng sự

1.3.2 Cấu trúc không gian

Tất cả các laccase đều là glycoprotein, enzym này có chứa 4 ion đồng trên mỗi đơn phân tử, phân bố ở 3 vị trí liên kết khác nhau: 1 ion dạng 1(T1),

2 ion dạng 2(T2) và 1 ion dạng 3(T3) Mọi ion đồng đều đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác T1 có vai trò là nơi nhận điện tử đầu tiên từ cơ chất, sau đó điện tử được vận chuyển qua bộ ba axit amin (His-Cys-His) đến

vị trí T2/T3 Tại T2/T3 oxy nhận điện tử và bị khử tạo nước [33]

Một số enzym thiếu nguyên tử đồng ở vị trí T1 vì vậy một số tác giả không công nhận đó là laccase thực sự Tuy nhiên một số tác giả khác gọi

chúng là yellow-laccase bởi vì những enzym thiếu điện tích hấp thụ mạnh ở bước sóng 600nm

Hình 1.1 Chu trình xúc tác của laccase [33]

Ba loại đồng ở trung tâm hoạt động của laccase có thể được nhận biết qua phân tích phổ tia cực tím (UV) và phổ cộng hưởng thuận từ điện tử (EPR) T1 hấp thụ mạnh ở bước sóng 600nm của đầu dò EPR, T2 không có màu nhưng được phát hiện bằng đầu dò EPR, T3 chứa cặp đôi nguyên tử đồng hấp thụ yếu ánh sáng yếu ở vùng UV nhưng không phát hiện được bằng đầu dò EPR [38]

Cấu trúc bậc ba của laccase từ Melanocarpus albomyces chủ yếu là các

dải β Chúng được phân ra ba vùng chính A, B và C Cả ba vùng đều có vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác của laccase Vị trí liên kết cơ chất được đặt ở giữa vùng B và vùng C Trung tâm của ba nguyên tử đồng được đặt ở bề mặt chung của vùng A và vùng C

Hình 1.2 Cấu trúc bậc ba của laccase từ Melanocarpus albomyces [28]

Vùng A, B và C tương ứng là màu đỏ, màu xanh da trời và màu xanh lá cây Bốn nguyên tử đồng màu vàng và các carbohydrate là màu xám

1.4 Đặc tính của laccase

1.4.1 Các chất ức chế hoạt tính laccase

Một số anion có tác dụng ức chế hoạt tính laccase như halogenua, azide, xyanua và hydroxit, Các ion này bám vào ion đồng T2/T3 ở trung tâm hoạt động của laccase, sẽ phá vỡ hệ thống vận chuyển điện tử và kìm hãm hoạt tính laccase [19] Trong môi trường pH kiềm, các hidroxit sẽ kìm hãm tiếp xúc của laccase và cơ chất, đồng thời ngăn ngừa sự tự oxy hóa của cơ chất nên hoạt tính laccase sẽ bị giảm Mức độ kìm hãm bởi halogenua thay đổi tuỳ loại isozym của laccase bởi có thể do liên quan đến kích cỡ của cấu trúc bậc

ba [40] Các chất ức chế khác có thể là các ion kim loại nặng như Hg2+ hay axit béo, sulfhydral, hydroxyglycine và các cation ammonium [19] Những

hợp chất này có thể ảnh hưởng đến laccase qua các nguyên tử đồng II, làm thay cấu trúc không gian của laccase

1.4.2 Tính đặc hiệu cơ chất

Tính đặc hiệu cơ chất của laccase thường rất thấp bởi laccase có phổ cơ chất giống với tyrosinase Nhưng laccase có hoạt tính ortho và para-diphenol trong khi tyrosinase chỉ có hoạt tính o-diphenol Chính vì vậy, chỉ có tyrosinase có hoạt tính cresolase (oxy hóa L-tyrosine) và chỉ có laccase có khả năng oxy hoá syringaldazine [38]

Bên cạnh đó, tính đặc hiệu cơ chất thấp còn thể hiện ở dải cơ chất rộng của laccase Năm 1994, Thuston cho rằng hydroquynon, catechol, guacicol và 2,6-dimethoxyphenol (DMP) đều là những cơ chất tốt cho laccase Para-phenylenediamin là cơ chất thông dụng và syringaldazine là cơ chất duy nhất chỉ dành cho laccase vì vậy laccase có thể oxy hoá cả các polyphenol methoxy và rất nhiều các hợp chất khác

Laccase từ những loại vi sinh vật khác nhau thì cũng có dải cơ chất

khác nhau Laccase từ Neuropora crassa chỉ oxy hoá hiệu quả para và diphenol (Germann và cộng sự, 1988) Laccase từ Pyricularia oryzae thích

ortho-hợp với phloroglucinol như là một cơ chất oxy hóa monophenol (Alsubaey và

cộng sự, 1996) Những laccase từ Cerrena unicolor oxy hoá các hợp chất phenol ở vị trí meta với quy mô lớn nhất trong khi laccase từ Trametes

versicolor oxy hoá hiệu quả các hợp chất phenol ở vị trí ortho [31]

1.4.3 Nhiệt độ và pH tối ưu

pH tối ưu của laccase phụ thuộc rất nhiều vào cơ chất Khi sử dụng

ABTS là cơ chất thì pH tối ưu thường axit hơn và được xác định trong khoảng

pH 3-5 Với Syringaldazine, pH tối ưu thay đổi trong khoảng từ 4-7, nhưng chủ yếu tập trung trong khoảng pH 6-7 [40] Sự khác nhau về thế oxy hóa khử giữa cơ chất và ion đồng T1 có thể làm tăng khả năng oxy hóa cơ chất và làm

tăng giá trị pH Nhưng anion OH- kết hợp ở ion đồng T2/T3 cho kết quả kìm hãm hoạt động của laccase Cho đến khi có sự phá vỡ bởi sự trao đổi điện tử bên trong giữa T1 và T2/T3 ở trung tâm hoạt động thì liên kết này bị phá vỡ Hai tác động trái ngược có thể là nguyên nhân quan trọng trong sự quyết định

pH tối ưu của laccase [40] Vai trò của T1 với pH tối ưu của laccase đã được Palmieri và cộng sự (1998) chứng minh, người ta đã phát hiện ra rằng sự vắng mặt của T1 trong laccase sẽ đẩy pH tối ưu về vùng trung tính hơn [32]

Nhiệt độ tối ưu của laccase rất khác nhau từ tùy từng chủng Tính bền

nhiệt của laccase thay đổi đáng kể tùy thuộc từng loài vi sinh vật Thông thường, laccase bền ở nhiệt độ 30-50°C và nhanh chóng mất hoạt tính ở 60°C

[28] Laccase chịu nhiệt cao nhất là từ vi khuẩn: laccase từ Streptomyces

lavendulae bền ở 70°C trong 100 phút và Bacillus subtilis CotA bền ở 80°C

trong 112 phút Laccase từ nấm mốc thì kém bền hơn, chỉ bền ở 70°C trong

1h và 80°C trong 10 phút Laccase từ Marasmius quercophilus bền ở nhiệt độ

60°C trong 1 giờ Một phương pháp khác được sử dụng làm tăng độ bền của laccase là cố định enzym lên bột thủy tinh [28]

1.4.4 Điểm đẳng điện (pI)

pI (isoelectric point) là pH mà tại đó phân tử protein trung hoà về điện tích Tại điểm đẳng điện, phân tử protein enzym kém bền nhất và dễ bị kết tủa Mỗi phân tử protein có một điểm đẳng điện riêng Người ta thường lợi dụng tính chất này để tách protein, enzym bằng phương pháp điện di hoặc kết tủa tại điểm đẳng điện Điểm đẳng điện của laccase là từ 2,6-6,7 trong đó pI

từ 3,3-4,0 là phổ biến nhất [33]

1.4.5 K m và V max

Phản ứng xúc tác của bất kỳ enzym nào đều được xác định qua động học Michaelis Menten Km và Vmax Những hằng số này được xác định trên một số lượng lớn laccase khác nhau và với nhiều cơ chất khác nhau (bảng

1.2) Giá trị Km trung bình thường là 2500 µM tùy vào từng nguồn enzym và

cơ chất Giá trị Km thấp nhất khi sử dụng cơ chất là Syringaldazine Sự so sánh các giá trị Km chỉ ra rằng laccase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau có tính đặc hiệu với cơ chất [40] Giá trị Vmax cũng rất khác nhau với từng loại enzym Có thể thấy rõ sự khác nhau của Vmax ở những laccase khác nhau khi

sử dụng cùng một cơ chất (bảng 1.2) Trong thực tế, Km là hằng số đặc trưng cho ái lực giữa cơ chất và enzym Km nhỏ thì ái lực lớn và vận tốc phản ứng cũng lớn Vmax là giá trị thể hiện tốc độ vận chuyển điện tử vào trong enzym sau khi gặp cơ chất

Bảng 1.2 Một vài đặc tính của laccase từ một số chủng vi sinh vật [28,33]

Cơ chất K m

(µM)

V max (phút -1 )

3,3;

3,6

- 3,5

-

-

- 3,7

3,5 6,7

- 4,0

Trametes pubescens

LAP2

Coprinus cinereus Lcc1

Trametes trogii POXL3

Panaeolus sphinctrinus Coprinus friesii

Trichophyton rubrum

Panaeolus papilionaceus Rhizoctonia solani

Lcc4

Pycnoporus cinnabarinus Lac1 Trametes villosa

sự, 2002 Heinzkill và cộng sự, 1998

Xu và cộng sự,

1996 Record và cộng

sự, 2002

Xu cộng sự,

1996 Palmieri cộng

sự, 1997 Martins cộng

sự, 2002

-

- 3,6

CotA

Pleurotus ostreatus

POXA2

Chaetomium thermophilum Pleurotus ostreatus

POXC

Myceliophthora thermophila Lcc1 Streptomyces cyaneus Pleurotus sajor-caju

Lac4

Palmieri cộng

sự, 1997 Chefetz cộng

sự, 1998 Palmieri cộng

sự, 1997 Bulter cộng sự,

2003 Arias cộng sự,

2003 Soden cộng sự,

3,3;

3,6 2,9 4,0 6,7

Gaeumannomyces graminis LAC2 Trametes pubescens

LAP2

Chaetomium thermophilum Botrytis cinerea

sự, 2002 Chefetz cộng

sự, 1998 Slomczynski cộng sự, 1995 Soden cộng sự,

2002 Garzillo cộng

sự, 1998 Palmieri cộng

sự, 1997 Palmieri cộng

sự, 1997 Palmieri cộng

Soden cộng sự,

2002 Galhaup cộng

sự, 2002 Chefetz cộng

sự, 1998 Edens cộng sự,

1999 Palmieri cộng

sự, 1997 Garzillo cộng

-

- 5,1 2,9 6,7 4,0 3,6

Myceliophthora thermophila Lcc1 Trametes villosa

sự, 2002 Schneider cộng

sự, 1999 Martins cộng

sự, 1997 Palmieri cộng

sự, 1997 Palmieri cộng

sự, 1997 Soden cộng sự,

pH, bền nhiệt độ, pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu, và ái lực với cơ chất [7] Ngoài

ra, giữa các isozym có thể khác nhau về tính chất vật lý Sự mã hóa các chuỗi

gen của laccase khác nhau đều được tìm thấy từ một loài nấm phân giải lignin.Chuỗi gen mã hóa protein thường từ 515- 619 amino axit

Ở nấm mốc, một chủng có thể có một hoặc nhiều isozym của laccase Các isozym khác nhau ở trình tự amino acid và động thái với các cơ chất

chuẩn của laccase Laccase từ Rhizoctonia solani và laccase từ Fusarium

proliferatum đều có bốn isozym [23] Các isozym của laccase khác nhau về

mức độ glycosyl hoá và loại carbohydrate Ví dụ, Trametes versicolor có năm

loại isozym chỉ khác nhau về thành phần carbohydrate [10] Thành phần carbohydrate của laccases có thể chiếm 10 đến 45% trọng lượng phân tử so với protein [41], và khoảng 15 đến 20% trọng lượng phân tử so với nấm mốc [38]

1.5 Cơ chế xúc tác của laccase

Laccase là phenoloxidase thực thụ, có tính đặc hiệu rộng với các hợp chất thơm và amin Enzym này oxy hóa hợp chất có bản chất phenol cũng như các tiểu phần của lignin có cấu trúc phenol bằng cách tách một điện tử hình thành gốc tự do Các gốc tự do sau đó có thể tái trùng hợp tạo thành polyme hoặc tiếp tục depolyme hóa

Laccase chỉ tác dụng vào tiểu phần phenol của lignin dẫn đến sự oxy hóa của Cα, cắt liên kết Cα-Cβ và liên kết aryl-alkyl Laccase có khả năng khử một phân tử oxy tạo thành hai phân tử nước trong khi thực hiện sự oxy hóa các hợp chất thơm như polyphenol, methoxyl- substituted và các amin thơm [5] Quá trình oxy hóa một điện tử này dẫn đến việc hình thành gốc tự

do ở vị trí oxy trung tâm, sau đó tiếp tục được chuyển hóa thành quinon dưới

sự xúc tác của laccase Quinon và các gốc tự do có thể tiếp tục quá trình polyme hóa (hình 1.3)

Hình 1.3 Cơ chế oxy hóa các tiểu phần phenol của lignin bởi laccase [5]

Cho đến năm 1990, laccase mới chỉ được biết đến với vai trò phân giải các hợp chất phenol của lignin Nhưng hiện nay các nhà khoa học đã nhận thấy dải cơ chất của laccase có thể mở rộng đối với các tiểu phần khác không

có bản chất phenol của lignin (non-phenolic) khi có mặt chất trung gian (mediator) thích hợp (hình 1.4) Các chất trung gian thường là chất màu 2,2’-azino-bis 3-etylthiazolin-6 sunfonat (ABTS) ABTS đóng vai trò là chất vận chuyển điện tử trung gian và nó có khả năng oxy hóa các tiểu phần không có bản chất phenol (non-phenolic)

Hình 1.4 Cơ chế oxy hóa các tiểu phần không có bản chất phenol

(non-phenolic) của lignin bởi laccase và ABTS [5]

Cơ chế xúc tác của hệ thống laccase - mediator bắt đầu bằng việc laccase oxy hóa chất trung gian chuyển chất trung gian về dạng oxy hóa; sau

đó các hợp chất trung gian đã được oxy hóa tiếp tục thực hiện phản ứng oxy hóa khử với cơ chất tạo sản phẩm (hình 1.5) Hiện nay, có hơn 200 mediator

đã được tìm thấy trong đó ABTS, HBT (1-hydroxybenzotriazole), guaiacol, syringaldazine là các mediator được sử dụng rộng rãi nhất

Hình 1.5 Mô hình oxy hóa trung gian các cơ chất của laccase [15]

Nói chung laccase thường hoạt động phối hợp với các enzym khác, làm tăng hiệu quả của quá trình phân giải Các nghiên cứu vẫn đang được tiếp tục tiến hành để làm sáng tỏ vai trò của laccase trong quá trình phân giải này, đặc biệt là trong quá trình phân giải lignin

1.6 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp laccase

Laccase thường được tạo ra trong suốt pha sau của quá trình trao đổi chất của nấm mốc trên cơ chất tự nhiên hay trong môi trường nuôi cấy chìm [18] Rất nhiều thông số của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp laccase đã được nghiên cứu Những thông số này bao gồm nguồn Cacbon, nguồn Nitơ và các nguyên tố vi lượng Gayazov & Rodakiewicz-Nowak (1996) cho rằng quá trình sinh tổng hợp laccase diễn ra nhanh hơn trong điều kiện nuôi cấy hiếu khí Xavier và cộng sự (2001) cho rằng quá trình sinh tổng hợp laccase nhiều hay ít không phụ thuộc vào lượng sinh khối [39] Việc tổng hợp và những tác động của laccase phải được kiểm soát trong suốt quá trình sinh trưởng bởi vì nó đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành các thể vùi và thể màu Năm 2001, Nüske và cộng sự đã thành

công trong việc nuôi cấy các chủng nấm mục trắng Nematoloma frowardii,

Clitocybula dusenii sinh tổng hợp laccase trong các thiết bị lên men có cánh

khuấy 5 lít, 30 lít và 300 lít [38]

1.6.1 Nguồn cacbon

Mỗi chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp laccase với các nguồn cacbon thích hợp rất khác nhau

Nguồn cacbon có thể sử dụng như: monosaccharid, oligosaccharid,

polysaccharid (tinh bột hay cellulose) Ví dụ Peniophora sp sử dụng tốt nguồn cacbon là saccarose [23] Pycnoporus sanguineus lại có thể sử dụng

nguồn cacbon thích hợp là 4% rỉ đường và 2% saccarose [22]

được nhận biết ở chủng Phanerochaete chrysosporium (Burdsal) và Lentinus

edodes (Berk) Tuy vậy, người ta cho rằng tỷ lệ cacbon và nitơ cao là cần thiết

cho quá trình sinh tổng hợp laccase Laccase cũng có thể được tạo ra sớm hơn khi các chủng nấm mốc được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung cơ chất

và nồng độ nitơ cao và những thay đổi này không ảnh hưởng đến hàm lượng sinh khối [22]

Như vậy, nguồn nitơ rõ ràng có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp laccase tuy nhiên tùy thuộc vào từng chủng mà khả năng sinh tổng hợp laccase cao ở nồng độ nitơ nhiều hay ít Vì vậy, với mỗi chủng vi sinh vật khác nhau cần có nghiên cứu để tìm ra nồng độ nitơ thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp laccase

1.6.3 Nguồn khoáng

Trong quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp enzym, nguồn khoáng là một trong những thành phần rất quan trọng, không thể thiếu Nó giúp nấm mốc có thể sinh trưởng, phát triển và sản sinh ra enzym cần thiết Tùy vào loại enzym

mà sử dụng những nguồn khoáng khác nhau

Các nguyên tố đa lượng nấm mốc thường sử dụng là: S, P, K, Ca, Mg,

Fe Chúng thường chiếm từ vài phần nghìn đến vài phần trăm so với trọng lượng khô của sợi nấm

Phospho chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của nấm, nó tham gia cấu tạo nên nhiều chất hữu cơ rất quan trọng trong tế bào nấm: nucleotit, protein, phosphoprotein, phosphatit Lưu huỳnh tham gia vào thành phần một số axit amin: cystin, cystein, methyonin,… trong nhiều coenzym: axit lipoic, adenozin, biotin… Kali tham gia vào quá trình trao đổi gluxit Magiê mang tính chất là một cofactơ đối với nhiều enzym, nó tham gia vào quá trình hoạt hóa khoảng 80 enzym trong tế bào (ADNase, esterase, cacboxylase, enolase, nhiều enzym chuyển hóa protein, các enzym oxy hóa khử…) Thiếu Mg2+ có thể dẫn đến việc ức chế quá trình hình thành bào tử ở nấm Canxi chiếm khoảng vài phần trăm trong phần khoáng của tế bào nấm

Ca không tham gia vào thành phần các chất hữu cơ nhưng nó đóng vai trò trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng( như giữa các nucleotit, protein, axit nucleic)

Các nguyên tố đa lượng thì được đưa vào ở dạng muối vô cơ: KH2PO4,

K2HPO4, MgSO4, KCl, FeCl…

Các nguyên tố vi lượng là những nguyên tố được nấm mốc đòi hỏi vói những lượng rất nhỏ nhưng không thể thiếu, bao gồm: Mn, Mo, Zn, Cu, Co,

Ni, B… Các nguyên tố vi lượng thường có liên quan mật thiết với các quá trình xúc tác sinh học trong tế bào nấm mốc Một số nguyên tố tham gia vào cấu trúc của các enzym kim loại Các nguyên tố vi lượng được đưa vào thành phần môi trường cùng với nước

Hoạt độ laccase sẽ tăng cao khi có mặt của các nguyên tố Cu2+, Mn2+ và

Mg2+ Đặc biệt đối với laccase thì nguyên tố đồng có ý nghĩa rất quan trọng

trong quá trình tổng hợp laccase Nhưng sẽ bị kìm hãm khi bởi EDTA và sodium azide (NaN3) [30]

1.6.4 Chất cảm ứng

Quá trình tổng hợp laccase phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy

và khi môi trường thích hợp cho việc tạo thành nhiều sinh khối thì có thể không thích hợp cho việc tạo ra nhiều laccase [39] Laccase được tạo ra với nồng độ thấp khi các chủng nấm mốc được nuôi trong môi trường basal bình thường [29] Nhưng laccase sẽ được tạo ra với nồng độ cao hơn khi môi trường được bổ sung các chất cảm ứng như xylidene, lignin hay veratryl alcohol [39]

Eggert và cộng sự thấy rằng việc bổ sung thêm 10 µM xylidene sau 24h nuôi cấy sẽ có tác dụng cảm ứng cao nhất cho quá trình tổng hợp laccase và

nó làm tăng hoạt độ của laccase lên 9 lần Tuy nhiên, ở nồng độ xylindene cao hơn lại có tác dụng ngược lại, đôi khi độc đối với nấm mốc Laccase còn có tác dụng bảo vệ nấm mốc chống lại các hợp chất độc như monophenol hoặc polyphenol [14]

Năm 1999, Lee và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất cảm ứng

veratryl-alcohol đến quá trình tổng hợp laccase ở Trametes versicolor Sự

tăng hoạt tính của laccase khi sử dụng 2,5-xylidine và veratryl alcohol làm chất cảm ứng đã được Mansur và cộng sự nghiên cứu và công bố năm 1997 Một số nghiên cứu cũng đã chứng minh khi bổ sung ethanol vào môi trường nuôi cấy sẽ làm giảm sự hình thành melanin Các monome không bị polyme hóa tạo melanin sẽ có tác dụng cảm ứng cho quá trình tổng hợp laccase Chính vì vậy mà ethanol được sử dụng rộng rãi như một chất cảm ứng gián tiếp trong quá trình sinh tổng hợp laccase

Theo Assavanig và cộng sự (1992), việc thêm một lượng nhỏ đồng vào môi trường nuôi cấy sẽ kích thích quá trình tổng hợp laccase Năm 2000,

Palmieri và cộng sự đã công bố rằng nếu thêm 150 µM CuSO4 vào môi trường basal làm tăng hoạt tính laccase lên 50 lần so với nuôi ở môi trường Basal khi chưa có bổ sung 150µM CuSO4 [32]

Ngoài việc bổ sung các chất cảm ứng, Tween 20 hoặc Tween 80 cũng thường được sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy, bởi Tween 20 hoặc Tween 80 là chất hoạt hóa bề mặt làm tăng khả năng vận chuyển oxy không khí và enzym, làm cho enzyme dễ được hòa tan vào môi trường [23]

1.6.5 Chất kìm hãm

Trong quá trình nuôi cấy một số chất có ảnh hưởng kìm hãm đến hoạt tính của laccase Năm 1984, Bollag và Leonowicz chỉ ra rằng azide, axit thioglycolic và axit diethyldithiocarbamic đều kìm hãm mạnh laccase, trong khi EDTA ảnh hưởng đến hoạt tính laccase ở mức độ thấp hơn [11]

Năm 1996, Eggert và cộng sự cho rằng việc sử dụng nồng độ glucose quá cao trong quá trình nuôi cấy cũng ảnh hưởng kìm hãm đến quá trình sinh tổng hợp laccase Năm 1998, Monteiro và De Carvalho cho thấy việc tăng hàm lượng glucose trong môi trường sẽ làm chậm quá trình tổng hợp laccase Lượng glucose hoặc saccarose quá nhiều trong môi trường nuôi sẽ làm giảm

sự tổng hợp laccase Một cách đơn giản và hiệu quả là sử dụng cellulose như một nguồn cacbon trong quá trình nuôi cấy [11]

1.6.6 Nhiệt độ

Thurston (1994) cho rằng nhiệt độ tối ưu trong việc sự sinh tổng hợp laccase là 25°C trong điều kiện có ánh sáng, và ở 30°C trong điều kiện tối Thông thường nấm mốc được nuôi cấy ở nhiệt độ 25-30°C là nhiệt độ thích hợp sinh tổng hợp laccase Khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao hơn 30°C hoặc thấp hơn 25°C thì hoạt tính của laccase bị giảm [22]

1.6.7 pH

Cho đến nay vẫn chưa có nhiều thông tin về sự ảnh hưởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp laccase, nhưng khi nấm mốc được nuôi cấy trong môi trường với pH tối ưu (pH 5) thì nấm mốc sinh trưởng và sinh tổng hợp laccase cao nhất [38] Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra rằng pH đầu từ 4,5 đến 6 nhưng mức độ này không được kiểm soát trong hầu hết các quá trình nuôi cấy [6]

1.7 Ứng dụng của laccase

Laccase là enzym được ứng dụng rất rộng rãi trong các phản ứng oxy hoá công nghiệp vì chúng có thể oxy hoá nhiều cơ chất khác nhau Hơn nữa, chúng sử dụng oxy phân tử sẵn có để làm chất nhận điện tử, thay vì dùng các cofactor đắt tiền như NADP+, góp phần giảm chi phí trong các quá trình liên quan đến laccase

Trong công nghiệp, ứng dụng của laccase chủ yếu là làm trắng sợi cellulose và loại bỏ các hợp chất phenol gây ô nhiễm môi trường bằng phương pháp sinh học và một vài ứng dụng khác như: điện cực sinh học, công nghiệp hóa chất, công nghiệp mỹ phẩm

1.7.1 Ứng dụng của laccase trong chất tẩy trắng sinh học

* Trong công nghiệp sản xuất giấy, nguyên liệu dùng để sản xuất là gỗ

và các hợp chất như chlorinated phenol, catachol và guaiacol Thành phần gỗ chứa khoảng 15-30% lignin Lignin là một polyme phenylpropanoid cứng của thực vật có chức năng ổn định và bảo vệ cấu trúc Nó là một polyme có cấu trúc không gian ba chiều được tổng hợp ngẫu nhiên từ các thành phần coniferyl, p-coumaryl và sinapyl alcohol Chính thành phần lignin này là nguyên nhân làm bột giấy có màu đen Cấu trúc này cần được biến đổi hoá lý trước khi được loại bỏ trong công nghiệp giấy [22] Việc phân huỷ lignin trong quá trình làm bột giấy và tẩy trắng rất quan trọng trong việc sản xuất

giấy Để loại bỏ các hợp chất này, người ta thường sử dụng hoá chất oxy hóa mạnh chứa clo, dẫn đến việc tạo thành các hợp chất độc và gây đột biến hoặc ung thư đồng thời khiến cho quá trình xử lý nước thải rất khó khăn và nếu không được xử lý tốt sẽ gây ảnh hưởng lớn đến môi trường [9]

Laccase còn có thể tẩy màu bột giấy khi dùng cùng các chất trung gian (mediator) khác Laccase-mediator sẽ tiếp tục oxy hoá các tiểu phần không có bản chất phenol của lignin Mặc dù hệ thống laccase-mediator được dùng nhiều, vẫn còn nhiều vấn đề liên quan đến việc tái sử dụng và giá thành Khả năng laccase tạo các gốc tự do hoạt hóa trong lignin có thể được áp dụng trong việc biến đổi cấu trúc sợi gỗ [12]

* Trong công nghiệp dệt nhuộm, sợi vải cũng cần được làm trắng

Tương tự như trên, laccase có thể được sử dụng rất hiệu quả Các hóa chất có trong thuốc nhuộm, đặc biệt là chất nhuộm azo, rất khó phân hủy trong môi trường tự nhiên do chúng có cấu trúc phức tạp và có tính ức chế vi sinh vật rất cao Lượng thuốc nhuộm này dưới tác động của các điều kiện yếm khí sẽ chuyển thành các dạng amine độc hại đối với sinh vật Ngoài tác động nhìn thấy được về mặt màu sắc, đa số các loại thuốc nhuộm là các tác nhân gây ung thư và đột biến gen Loại bỏ những hợp chất này luôn là một vấn đề rất cần được quan tâm Vì vậy việc sử dụng laccase trong việc tẩy màu của ngành công nghiệp dệt nhuộm là phương pháp thân thiện với môi trường và giảm giá thành đầu tư ban đầu so với các phương pháp sử dụng hóa chất truyền thống Laccase còn có thể tạo ra các vết mòn mong muốn trên vải bò bằng cách tẩy trắng chất nhuộm tím [22] Laccase còn được sử dụng làm bóng vải bông, vải sợi nhân tạo và xử lý quần áo bò Quá trình mài có sử dụng laccase giúp vải

bò có độ mềm mại cần thiết, độ hút ẩm tăng lên và bề mặt vải đẹp hơn về mặt cảm quan [36]

Như vậy, vai trò của laccase làm chất tẩy trắng sinh học có ý nghĩa to lớn và là một biện pháp thay thế đang được nghiên cứu và ứng dụng trên quy

mô công nghiệp

1.7.2 Ứng dụng của laccase trong việc làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Trong suốt thế kỷ qua, các hoạt động trong công nghiệp, nông nghiệp

đã thải ra ngoài môi trường một khối lượng chất thải khổng lồ, đã làm cho môi trường bị ô nhiễm một cách nặng nề Trong đó nguy hiểm nhất là các hydro cacbon thơm đa vòng polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH), polychlorinated biphenyls (PCBs), pentachlorophenols (PCP), benzen, toluen,

và 1,1,1-trichloro-2,2-bis4-chlorophenylethane (DDT)…, là các chất có cấu trúc hết sức bền vững và có tác hại lớn đối với môi trường tự nhiên và con người Laccase có thể dùng để phân hủy những hợp chất này thành những chất dễ phân hủy hơn trong môi trường tự nhiên và làm giảm khả năng ô nhiễm môi trường

Mặt khác, laccase cũng được dùng làm chất tẩy màu trong việc xử lý chất thải sinh hoạt [4] Thêm vào đó, laccase có thể tẩy màu nước thải từ việc sản xuất dầu oliu bằng cách loại bỏ các hợp chất phenol Việc laccase tham gia vào quá trình phân huỷ lignin đưa ra khả năng sử dụng laccase trong xử lý lignocellulose [28]

Trong sản xuất nông nghiệp, những chất hợp chất phenol gây ô nhiễm còn có thể bắt nguồn từ thuốc diệt cỏ hay những chất ngâm tẩm gỗ Một số hợp chất hóa học sử dụng làm chất diệt côn trùng rất độc như PCP độc với phần lớn vi sinh vật ở nồng độ 50ppm, nhưng tại những điểm ô nhiễm, hàm lượng PCP có thể lên tới trên 1600ppm, khiến cho chúng rất khó bị phân hủy sinh học [8] PCP còn là hợp chất không tan trong nước, khiến cho chúng càng khó bị loại bỏ khỏi môi trường tự nhiên DDT là chất diệt côn trùng hữu

cơ có gốc clo, DDT có thể xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa, thậm chí

nhiều nghiên cứu đã cho thấy dư lượng DDT khó phân hủy trong không khí, nước, đất, trầm tích

Những hợp chất gây ô nhiễm môi trường này không tan trong nước và

có xu hướng bị các chất hữu cơ trong đất hấp thụ, vì thế chúng tích tụ lại trong tự nhiên, trong đất, trong không khí hoặc theo các sông ngòi và làm ô nhiễm môi trường những khu vực rộng lớn Các hợp chất này có cấu tạo bao gồm ít nhất 2 vòng thơm liên kết tạo góc hay đính trực tiếp với nhau khiến cho chúng khó bị phân hủy tự nhiên Những hợp chất có trên ba vòng thơm thường hết sức độc đối với vi sinh vật và vì thế cũng rất khó phân hủy thành dạng khoáng

Việc loại bỏ các hợp chất phenol gây ô nhiễm môi trường là một vấn đề hết sức quan trọng, những hợp chất này là những độc tố và sự có mặt của chúng trong nước sinh hoạt và nước tưới tiêu đồng ruộng là một mối nguy hiểm đối với sức khoẻ con người Thông qua hàng loạt những cuộc nghiên cứu về nấm mốc có khả năng phân hủy lignin, các nhà khoa học đã thấy rằng chúng sinh ra các enzym ngoại bào có tính đặc hiệu cơ chất thấp Có nghĩa là chúng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất khác nhau có cấu tạo tương tự lignin, trong đó bao gồm cả những hợp chất gây ô nhiễm môi trường nói tới ở trên (PAH, PCBs, DDT ) Nấm mục trắng có laccase giúp cho chúng phân hủy và khoáng hóa một số các hợp chất này trở thành dạng không độc hại Những nghiên cứu về vấn đề này đã được thực hiện trong phòng thí nghiệm, cho thấy rằng nấm mục trắng rất có tiềm năng trở thành đối tượng sinh học trong xử lý ô nhiễm môi trường

Tuy những chất độc hóa học nói trên có thể hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, nhưng nấm mốc vẫn có thể sống được trong môi trường có nồng độ cao đa số các chất này [8] Nấm mục trắng có khả năng phân hủy lignin và cả các hợp chất giống lignin, bốn loài thuộc nhóm nấm này đã được nghiên cứu

kỹ trong lĩnh vực làm sạch môi trường là Phanerochaete, Trametes,

Bjerkandera và Pleurotus

Ưu điểm của laccase ở nấm mốc là enzym ngoại bào nên giới hạn hấp thụ cơ chất vào trong tế bào không phải là một vấn đề lớn Những nghiên cứu

trước đây chủ yếu tập trung P chrysosporium và T versicolor nhưng hiện nay

đối tượng đã được mở rộng hơn nhiều nhằm tìm kiếm những chủng nấm mốc mới có khả năng sinh tổng hợp laccase cao, có thể ứng dụng vào từng lĩnh vực khác nhau và có giá thành hợp lý [4]

Trong thực tế, laccase có thể phân hủy những hợp chất độc không cực, không tan mà những hệ enzym nội bào khác không thể thực hiện được [27] Khi vòng thơm của các hợp chất hóa học gây ô nhiễm môi trường đã bị laccase của nấm mục trắng phá vỡ, những loài nấm khác và vi khuẩn có thể tấn công để biến chúng thành những hợp chất vô hại đối với môi trường

1.7.3 Ứng dụng tạo nguồn nhiên liệu mới

Laccase còn có ứng dụng trong việc tạo ra các nguồn nguyên liệu mới như bioethanol Đối với một nước nông nghiệp như Việt Nam, lượng phế thải nông nghiệp như rơm rạ, thân, cành lá, bã mía, bẹ ngô có khối lượng rất lớn Hiện nay, lượng phế thải nông nghiệp này một số được làm thức ăn cho trâu

bò, một số được xử lý bằng cách đốt bỏ hoặc tận dụng để đun bếp, chạy lò hơi Nhưng nói chung đây đều là những phương pháp gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và chưa sử dụng hết công suất Với nguồn chất thải này, người ta có thể sử dụng laccase và hệ enzym phân hủy lignin để chuyển hóa các nguyên liệu giàu cellulose trên tạo glucose và lên men sản xuất ethanol sạch (green ethanol) thay thế cho xăng, dầu (dự kiến cuối thế kỷ XXI bị cạn kiệt) để chạy ô tô, xe máy, động cơ đốt trong…

Theo chiến lược phát triển năng lượng của Việt Nam, đến năm 2010 nước ta sẽ sản xuất khoảng 300,000 ~ 400,000 tấn xăng có chứa 10% ethanol

và cho đến năm 2020 sẽ thay thế 20% lượng xăng bình thường bằng xăng

sinh học và cồn

1.7.4 Những ứng dụng trong một số lĩnh vực khác

Việc tách tinh bột từ ngũ cốc và củ cũng thuận lợi hơn khi sử dụng enzym thích hợp Tinh bột ngũ cốc được tách ra với hiệu suất cao khi laccase được bổ sung cùng với cylanase vào huyền phù tinh bột trước khi đem đi ly tâm và rửa Laccase còn làm tăng tốc độ trích ly chất màu bằng pectinase khỏi

vỏ củ, quả hoặc rau Về lĩnh vực thực phẩm, laccase còn được sử dụng kết hợp với các enzym thủy phân cellulose, hemicellulose trong công nghiệp lên men, làm tăng hiệu suất quá trình đường hóa và chất lượng sản phẩm (nhất là trong trường hợp sử dụng nguyên liệu thay thế như sắn ) [23] Laccase có tiềm năng trong việc ổn định rượu, nước hoa quả ép và bia bằng cách loại bỏ các polyphenol Laccase cũng có thể được dùng trong các sản phẩm bánh nướng [22]

Laccase còn được sử dụng để ủ thức ăn gia súc có nguồn gốc thực vật nhằm tăng cường khả năng tiêu hóa chất xơ, giúp cho vật nuôi tăng trọng một cách đáng kể [36]

Do laccase có thể xúc tác phản ứng chuyển điện tử trực tiếp không cần cofactor, chúng cũng được nghiên cứu sử dụng trong điện cực sinh học thăm

dò sự có mặt của hợp chất phenol, oxy hoặc azide Ngoài ra, laccase có thể được cố định trên cực dương (cathode) của pin sinh học có khả năng cung cấp năng lượng cho một hệ thống máy phát nhỏ [13] Một ứng dụng mới của laccase là trong công nghiệp mỹ phẩm Ví dụ trong thuốc nhuộm tóc, laccase được bổ sung có tác dụng thay thế H2O2 làm tác nhân oxy hóa Điều này giúp hạn chế các dị ứng hơn khi sử dụng thuốc nhuộm thông thường [36]

Ta có thể thấy được tiềm năng ứng dụng của laccase là rất lớn vì thế phân lập những chủng nấm mốc có khả năng này là một đề tài nhiều hứa hẹn

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

Các chủng nấm được phân lập từ các rừng nhiệt đới của Việt Nam như Rừng quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình), Vườn quốc gia Ba Bể (Bắc Kạn), Vườn quốc gia Ba Vì (Ba Vì) và Pusamcap (Lai Châu)

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất đa lượng, vi lượng dùng làm môi trường nuôi cấy Một số hóa chất khác như RBBR, syringaldazine, o-toluidine, ABTS, veratryl alcohol (VA), cao nấm men, pepton, dịch chiết malt, Tween 80, cồn tuyệt đối Hóa chất sinh học phân tử sử dụng trong tách chiết DNA, định tên chủng nấm, tinh sạch DNA của Merck, Sigma (Đức), MPBio (Mỹ), Trung Quốc, Việt Nam

2.1.3 Thiết bị sử dụng

- Tủ cấy vi sinh vật (clearn benchop)

- Nồi hấp tiệt trùng

- Tủ lắc ổn nhiệt Shellab

- Máy đo màu quang điện UV-Vis

- Máy đo pH MP220 Toledo

- Máy ly tâm lạnh allegra 64R

- Máy nghiền siêu âm

- Máy khuấy từ gia nhiệt (Magnetic stirrer)

- Kính hiển vi điện tử Nikon E800

- Máy PCR

- Thiết bị điện di

- Máy soi gel

Và một số thiết bị thông thường khác

: Nhật : Nhật : Mỹ : Thuỵ Điển : Thuỵ Sĩ : Mỹ : Mỹ : Đức : Nhật : Nhật : Hàn Quốc : Đức

2.1.4 Môi trường

* Môi trường rắn

a) Môi trường sử dụng trong phân lập: môi trường MEA (g/l) [MT1]

- Dịch chiết malt : 20g - Chloramphenicol : 100mg

Bổ sung nước cất đến tổng thể tích là 1000ml, điều chỉnh pH= 6,5 Khử trùng hỗn hợp ở điều kiện 110°C trong 30 phút

b) Môi trường khoáng (Basal medium) rắn (g/l) [MT2]

Thành phần môi trường khoáng, điều chỉnh pH 6,5 bổ sung thêm 20g Agar

c) Môi trường rắn có chứa chất chỉ thị

Môi trường MEA bổ sung 0,5% axit tanic [MT3]

Môi trường khoáng rắn bổ sung 0,05% RBBR [MT4]

d, Môi trường giữ giống: môi trường PDA (g/l) [MT5]

- Dịch chiết khoai tây : 1000ml

b, Môi trường sinh tổng hợp laccase (g/l) (Basal medium) [MT7]

2.2.1.1 Phương pháp phân lập các chủng nấm mốc từ tự nhiên

Cân 10g mẫu cho vào cối vô trùng, có chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng, nghiền nhỏ, lấy 1ml dịch (kể cả cặn) cho vào ống falcon có chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng Tiếp tục lấy 1ml dịch này cho vào ống falcon thứ

2 có chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng Lấy từ mỗi ống falcon 100µl, nhỏ lên bề mặt đĩa thạch có chứa môi trường MEA, trang đều, nuôi ở tủ ấm 30°C, kiểm tra kết quả sau từ 3-5 ngày, tùy thuộc vào tốc độ phát triển của các chủng nấm mốc trong đĩa

Tiếp tục lựa chọn những khuẩn lạc nấm mốc có hình thái khác nhau, cấy chuyển sang đĩa peptri có chứa môi trường MEA khác, tiếp tục nuôi trong

tủ ấm 30°C, trong thời gian 3-5 ngày Tiến hành lập lại quá trình này cho đến

khi thu được mẫu chỉ chứa khuẩn lạc của một chủng nấm mốc duy nhất, không bị nhiễm tạp

Các chủng mới phân lập được cấy vào ống thạch nghiêng chứa môi trường PDA và bảo quản trong tủ lạnh 4°C

2.2.1.2 Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase

* Thử trên môi trường đặc hiệu có chứa axit Tannic [MT3]

Cấy chủng phân lập được từ trong ống thạch nghiêng PDA lên đĩa peptri chứa môi trường MEA có 0,5% axit tanic, nuôi trong tủ ấm ở 30°C trong thời gian 5Æ10 ngày Những chủng dương tính là những chủng có khả năng làm môi trường có màu nâu đậm xung quanh hệ sợi

* Thử trên môi trường đặc hiệu có chứa RBBR [MT4] [26]

Cấy chủng phân lập được từ trong ống thạch nghiêng PDA lên đĩa peptri chứa môi trường MEA, nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 30°C cho đến khi khuẩn lạc phát triển đầy đủ hình thái Bằng phương pháp cắt thạch, cắt một phần môi trường có chứa khuẩn lạc với đường kính 0,9cm đặt vào vị trí chính giữa đĩa peptri có đường kính 9cm chứa môi trường có chứa 0,05% RBBR Các đĩa sau khi cấy chủng được nuôi trong tủ ấm 30°C trong 5Æ10 ngày Những chủng dương tính là những chủng có khả năng làm mất màu hoặc nhạt màu môi trường chứa chất thử đặc hiệu RBBR

* Thử trên môi trường khoáng rắn sử dụng Syringaldazine và ABTS làm

cơ chất đặc hiệu [28]

Tiến hành cấy chủng phân lập được từ trong ống thạch nghiêng PDA lên đĩa peptri chứa môi trường khoáng rắn, nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 30°C cho đến khi khuẩn lạc phát triển đầy đủ hình thái Sau đó sử dụng cơ chất là ABTS 0,216mM và Syringaldazine 0,01% nhỏ lên khuẩn lạc Những chủng

dương tính là những chủng xuất hiện màu xanh với ABTS và màu hồng với Syringaldazine

2.2.1.3 Phương pháp lên men sinh tổng hợp enzym (phương pháp nuôi cấy chìm)

Hoạt hoá chủng nấm trong môi trường hoạt hoá ở nhiệt độ 30ºC, tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 24 – 36 giờ

Sau đó tiến hành nuôi cấy sinh tổng hợp laccase bằng phương pháp nuôi cấy chìm trên môi trường sinh tổng hợp [MT7] ở nhiệt độ 30ºC, tốc độ lắc

200 vòng/phút trong 4-10 ngày tùy từng chủng

2.2.2 Phương pháp hóa sinh – phương pháp xác định hoạt tính laccase

Hoạt tính của laccase được xác định nhờ vào phương pháp đo mật độ hấp thụ quang (OD)

Nguyên tắc: Phương pháp này được Harkin và Obst (1973) đưa ra, dựa trên

sự oxy hóa Syringaldazine (3,5-16dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyde azine) thành sản phẩm oxy hóa hấp thụ mạnh ở bước sóng 530nm [21]

Tiến hành thí nghiệm với 2 mẫu kiểm chứng và mẫu thí nghiệm như sau

Mẫu kiểm chứng (ml) Mẫu thí nghiệm (ml)

ε: hệ số chuyển đổi của cơ chất 65mM-1cm-1 (Felby, 1998) [17]

d: đường truyền ánh sáng của cuvet (cm)

∆A.min-1: Sự thay đổi hấp thụ trong mỗi phút ở bước sóng 530nm

Định nghĩa đơn vị hoạt độ:

Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzym cần thiết để xúc tác oxy hóa Syringaldazine tạo thành 1µmol sản phẩm trong 1 phút ở 30°C trong dung dịch đệm phosphat 0,1M pH 6,5 (Harkin và Obst, 1973)